IL MIGLIORAMENTO IL MIGLIORAMENTO GENETICO ANIMALE E GENETICO ANIMALE E

LA GENETICA LA GENETICA MOLECOLAREMOLECOLARE

Il miglioramento genetico delle produzioni animali, Il miglioramento genetico delle produzioni animali, realizzato sino ad ora, realizzato sino ad ora, èè frutto dellfrutto dell’’elaborazione e elaborazione e applicazioni della applicazioni della teoria della genetica quantitativateoria della genetica quantitativaalle popolazioni animali di interesse zootecnico.alle popolazioni animali di interesse zootecnico.

Schemi operativi di selezione basati sui Schemi operativi di selezione basati sui L.G.L.G. e controlli e controlli funzionalifunzionali

Diffusione Diffusione I.S.I.S.

Modelli statistici sofisticatiModelli statistici sofisticati

1900: con la riscoperta delle Leggi di 1900: con la riscoperta delle Leggi di MendelMendel si inizia a si inizia a

comprendere la natura genetica della trasmissione dei comprendere la natura genetica della trasmissione dei

carattericaratteri

1900: Galton introduce il procedimento statistico per lo 1900: Galton introduce il procedimento statistico per lo

studio dellstudio dell’’ereditereditàà dei caratteri quantitativi dei caratteri quantitativi

1918: Fisher attua il collegamento tra la genetica 1918: Fisher attua il collegamento tra la genetica

mendelianamendeliana e le l’’approccio statistico della scuola approccio statistico della scuola

biometricabiometrica ponendo le basi della moderna ponendo le basi della moderna teoria della teoria della

genetica quantitativagenetica quantitativa

LA TEORIA DELLA GENETICA QUANTITATIVALA TEORIA DELLA GENETICA QUANTITATIVA

I caratteri quantitativi sono ad ereditI caratteri quantitativi sono ad ereditàà poligenicapoligenica e la e la variazione continua variazione continua èè dovuta alldovuta all’’azione degli alleli di azione degli alleli di numerosi numerosi lociloci distribuiti nel genoma degli animali e agli distribuiti nel genoma degli animali e agli effetti dei fattori ambientali.effetti dei fattori ambientali.

I singoli geni e alleli esercitano su questi caratteri I singoli geni e alleli esercitano su questi caratteri effetti molto piccoli e di tipo additivo.effetti molto piccoli e di tipo additivo.

NON NON èè possibile conoscere il GENOTIPO possibile conoscere il GENOTIPO direttamente dal FENOTIPO.direttamente dal FENOTIPO.

Modelli matematicoModelli matematico--statistici per stima valore statistici per stima valore genetico dei riproduttori.genetico dei riproduttori.

NellNell’’allevamento animale il miglioramento genetico allevamento animale il miglioramento genetico èèattuato con:attuato con:

selezioneselezione: sfrutta la variabilit: sfrutta la variabilitàà genetica additiva e genetica additiva e consente di ottenere un miglioramento cumulativo consente di ottenere un miglioramento cumulativo permanente e trasmissibile. Miglioramento razze permanente e trasmissibile. Miglioramento razze animali. animali.

incrocioincrocio: utilizza la variabilit: utilizza la variabilitàà non additiva che sta non additiva che sta alla base dellalla base dell’’eterosieterosi e non e non èè trasmissibile. Migliora trasmissibile. Migliora le produzioni.le produzioni.

La La selezione selezione fenotipicafenotipica èè efficace per caratteri produttivi:efficace per caratteri produttivi:

-- si manifestano precocementesi manifestano precocemente

-- facilmente misurabilifacilmente misurabili

-- si esprimono in entrambi i sessisi esprimono in entrambi i sessi

-- non sono troppo influenzati da fattori ambientalinon sono troppo influenzati da fattori ambientali

In tal caso: In tal caso:

-- elevata intensitelevata intensitàà di selezionedi selezione

-- buona accuratezza stima valore genetico degli animalibuona accuratezza stima valore genetico degli animali

-- brevi intervalli di generazionebrevi intervalli di generazione

quindi quindi rapido progresso geneticorapido progresso genetico..

Pochi i caratteri produttivi con tali caratteristiche.Pochi i caratteri produttivi con tali caratteristiche.

FrequentiFrequenti i caratteri che:i caratteri che:

-- si esprimono si esprimono in un solo sessoin un solo sesso (uova, latte)(uova, latte)

-- si evidenziano si evidenziano tarditardi (problemi articolari)(problemi articolari)

-- si evidenziano si evidenziano dopo macellazionedopo macellazione (spessore lardo, (spessore lardo, tagli magri, qualittagli magri, qualitàà della carne)della carne)

-- sono sono difficili da misuraredifficili da misurare (resistenza alle malattie, (resistenza alle malattie, indice di conversione alimentare)indice di conversione alimentare)

-- sono particolarmente sono particolarmente influenzatiinfluenzati da fattori da fattori ambientaliambientali (fertilit(fertilitàà e resistenza alle malattie)e resistenza alle malattie)

-- ereditabilitereditabilitàà molto bassamolto bassa

La La GENETICA MOLECOLAREGENETICA MOLECOLARE supera questi supera questi problemi perchproblemi perchéé fornisce gli strumenti per fornisce gli strumenti per analizzare la variabilitanalizzare la variabilitàà genetica quantitativa genetica quantitativa direttamente a livello del DNA.direttamente a livello del DNA.

A tal fine A tal fine èè necessario trovare necessario trovare marcatori del marcatori del DNADNA che siano associati a geni che codificano che siano associati a geni che codificano caratteri di interesse selettivo.caratteri di interesse selettivo.

I MARCATORI GENETICII MARCATORI GENETICIm1m1m2m2

m3m3 m3m3

m2m2m1m1

SonoSono porzioniporzioni didi DNA:DNA:

non non codificanticodificanti

distribuitidistribuiti uniformementeuniformemente sulsul genomagenoma

ad ad ereditereditàà mendelianamendeliana semplicesemplice

TIPI TIPI didi MARCATORI GENETICIMARCATORI GENETICI..rilevabili a vari livelli..rilevabili a vari livelli

MMORFOLOGICOORFOLOGICO o SOMATICO:o SOMATICO:colorecolore del del mantellomantello

BIOCHIMICO:BIOCHIMICO:gruppi sanguignigruppi sanguigni

proteine (del plasma, del latte etc.)proteine (del plasma, del latte etc.)

DNA:DNA:SNP, RFLP, AFLP, RAPD, microsatelliti,SNP, RFLP, AFLP, RAPD, microsatelliti,…………

MARCATORI BIOCHIMICI E IMMUNOLOGICIMARCATORI BIOCHIMICI E IMMUNOLOGICI

1961: 1961: NeimannNeimann--SorensenSorensen e e RobertsonRobertson studiarono studiarono ll’’associazione tra gruppi sanguigni e diversi associazione tra gruppi sanguigni e diversi caratteri produttivi nei bovini da latte.caratteri produttivi nei bovini da latte.

Questi studi non ebbero molto successo per il Questi studi non ebbero molto successo per il limitato numero di marcatori disponibili e per limitato numero di marcatori disponibili e per ll’’utilizzo di popolazioni animali senza un utilizzo di popolazioni animali senza un appropriato disegno sperimentale.appropriato disegno sperimentale.

I MARCATORII MARCATORI del DNAdel DNA

CaratteristicheCaratteristiche favorevolifavorevoliNon influenzati dallNon influenzati dall’’ambienteambiente

NeutraliNeutraliStabiliStabili

NumerosiNumerosiPolimorfici (sequenze non codificanti) Polimorfici (sequenze non codificanti)

Campioni di qualsiasi tessutoCampioni di qualsiasi tessutoAnalisi indipendenti da sesso ed etAnalisi indipendenti da sesso ed etàà

Facili da monitorareFacili da monitorareAnalisi automatizzabiliAnalisi automatizzabili

RFLPRFLP((Restriction Fragment Length Restriction Fragment Length PloymorphismPloymorphism))

Sono stati i primi marcatori ad essere utilizzati Sono stati i primi marcatori ad essere utilizzati (1978). Molto frequenti e distribuiti su tutto il genoma (1978). Molto frequenti e distribuiti su tutto il genoma animale erano ideali per costruire mappe animale erano ideali per costruire mappe gentichegentiche ed ed identificare identificare loci loci responsabili della variabilitresponsabili della variabilitàà genetica genetica quantitativa (quantitativa (Quantitative Trait Loci Quantitative Trait Loci –– QTLQTL).).

Non hanno trovato larga applicazione perchNon hanno trovato larga applicazione perchéé il metodo il metodo di identificazione (di identificazione (SouthermSoutherm BlottingBlotting) ) èè lungo e lungo e laborioso e perchlaborioso e perchéé, in genere, presentano solo due , in genere, presentano solo due alleli.alleli.

VNTR o VNTR o MinisatellitiMinisatelliti((Variable Number of Tandem RepeatsVariable Number of Tandem Repeats))

Identificati nel 1987, presentano un alto numero Identificati nel 1987, presentano un alto numero

di alleli, però presentano le stesse difficoltdi alleli, però presentano le stesse difficoltàà di di

individuazione degli RFLP.individuazione degli RFLP.

Insieme agli RFLP sono stati utilizzati nelle prime Insieme agli RFLP sono stati utilizzati nelle prime

fasi di costruzione delle mappe genetiche. fasi di costruzione delle mappe genetiche.

SSR o MICROSATELLITISSR o MICROSATELLITI((SimpleSimple SequenceSequence RepeatsRepeats -- 19891989))

Ripetizioni in tandem di corte (1-5) sequenze di nucleotidi:

(AC)n o (GT)n o (CAC)n o (GATA)ndi- di- tri- tetra- nucleotidi

distribuite nel genoma animale in numero elevatissimo in regioni anonime (non hanno funzione nota).

Il polimorfismo è molto elevato e deriva dal numero diripetizioni (n) del motivo di base del microsatellite.

Sono conservati entro specie e risultano essere specie-specifici.

Microsatelliti o SSR (Simple Sequence Repeats)

Visualizzazione microsatellitiVisualizzazione microsatelliti

3 paia di 3 paia di cromosomicromosomiomologhiomologhi

SangueSanguePeli Peli SemeSeme

1)1) ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNADNA

Individuo AIndividuo A IndividuoIndividuo B Individuo CIndividuo C campione di controllocampione di controllo

2) PCR 2) PCR POLYMERASE CHAIN REACTIONPOLYMERASE CHAIN REACTION

3) 3) ELETTROFORESIELETTROFORESI

RAPDRAPD ((RandomRandom AmplifiedAmplified PolymorphicPolymorphic DNADNA --1990) identificano marcatori per mezzo di corti 1990) identificano marcatori per mezzo di corti oligonucleotidioligonucleotidi come inneschi nella PCR.come inneschi nella PCR.

Sono marcatori dominanti, a differenza degli RFLP Sono marcatori dominanti, a differenza degli RFLP e dei microsatelliti che sono in genere e dei microsatelliti che sono in genere codominanticodominanti, e non presentano un, e non presentano un’’altissima altissima riproducibilitriproducibilitàà perchperchéé influenzati dalle influenzati dalle ondizioniondizioni di di analisi.analisi.

ALTRI MARCATORI GENETICIALTRI MARCATORI GENETICI

AFLPAFLP ((AAmplifiedmplified FragmentFragment LengthLength PolymorphicsPolymorphics --1995) combinano l1995) combinano l’’analisi di restrizione con la PCR analisi di restrizione con la PCR e permettono, utilizzando diverse combinazioni di e permettono, utilizzando diverse combinazioni di enzimi e primers, di analizzare enzimi e primers, di analizzare contemporaneamente un elevato numero di contemporaneamente un elevato numero di lociloci. .

Variazioni di singole basiVariazioni di singole basi

Frequenza elevata (polimorfismi da mutazioni Frequenza elevata (polimorfismi da mutazioni puntiformi una ogni 500puntiformi una ogni 500--3000 nucleotidi)3000 nucleotidi)

SNPSNP((Single Nucleotide PolymorphismsSingle Nucleotide Polymorphisms))

Distribuiti in modo casualeDistribuiti in modo casuale

GAT CAG TTGAT CAG TTCC GAT GTCGAT GTC

GAT CAG TTGAT CAG TTAA GAT GTCGAT GTC

APPLICAZIONI DEI MARCATORI APPLICAZIONI DEI MARCATORI NEL SETTORE ZOOTECNICONEL SETTORE ZOOTECNICO

•• Costruzione di mappe genetiche e fisicheCostruzione di mappe genetiche e fisiche•• MappaturaMappatura ed ed isolamentoisolamento di geni utilidi geni utili•• MappaturaMappatura di QTLdi QTL•• Diagnosi di anomalie genetiche Diagnosi di anomalie genetiche •• Analisi di paternitAnalisi di paternitàà•• Studi su filogenesi, variabilitStudi su filogenesi, variabilitàà genetica, struttura genetica, struttura

e dinamica di specie e popolazioni e dinamica di specie e popolazioni •• Stima della consanguineitStima della consanguineitàà e ausilio ai piani di e ausilio ai piani di

accoppiamentoaccoppiamento•• TracciabilitTracciabilitàà dei prodottidei prodotti

MAPPE GENETICHEMAPPE GENETICHE

Il genoma degli animali Il genoma degli animali èè costituito da un diverso numero di costituito da un diverso numero di paia di paia di autosomiautosomi e da un paio di cromosomi sessuali con un e da un paio di cromosomi sessuali con un contenuto di DNA di circa 3 miliardi di nucleotidi nei contenuto di DNA di circa 3 miliardi di nucleotidi nei mammiferi e 1,2 miliardi per le specie avicole. mammiferi e 1,2 miliardi per le specie avicole.

Il DNA codifica per circa Il DNA codifica per circa 20.00020.000--30.000 30.000 geni, i quali geni, i quali rappresentano solo il 4% del DNA contenuto nel genoma.rappresentano solo il 4% del DNA contenuto nel genoma.

Quindi i geni sono dispersi in regioni del DNA che non Quindi i geni sono dispersi in regioni del DNA che non hanno funzione codificante. hanno funzione codificante.

SPECIESPECIE N. CromosomiN. Cromosomi2n2n

Dimensione stimata del Dimensione stimata del genoma in nucleotidi genoma in nucleotidi

(paia di basi)(paia di basi)BovinoBovino 6060 3.651.500.0003.651.500.000SuinoSuino 3838 3.108.700.0003.108.700.000PecoraPecora 5454 3.251.800.0003.251.800.000CapraCapra 6060 3.197.600.0003.197.600.000CavalloCavallo 6464 3.311.000.0003.311.000.000ConiglioConiglio 4444 3.496.000.0003.496.000.000PolloPollo 7878 1.200.000.0001.200.000.000TacchinoTacchino 8080 1.200.000.0001.200.000.000

Numero di cromosomi e contenuto in DNA stimato per Numero di cromosomi e contenuto in DNA stimato per alcune specie di interesse zootecnicoalcune specie di interesse zootecnico

Durante la Durante la meiosimeiosi si si verifica lo scambio di verifica lo scambio di materiale genetico materiale genetico fra cromosomi fra cromosomi omologhi.omologhi.

Se due marcatori Se due marcatori sono lontani sono lontani èè pipiùùprobabile che un probabile che un evento di scambio li evento di scambio li separi.separi.

Se sono vicini Se sono vicini èè pipiùùfacile che rimangano facile che rimangano assieme.assieme.

Andando a rilevare quante volte, dopo la meiosi, si ha o meno Andando a rilevare quante volte, dopo la meiosi, si ha o meno separazione dei due marcatori si può stimare la loro distanza separazione dei due marcatori si può stimare la loro distanza reciproca e quindi costruire una mappa.reciproca e quindi costruire una mappa.

Esempio di mappa di Esempio di mappa di linkagelinkage

Si può quindi definire unSi può quindi definire un’’unitunitàà di mappadi mappa1% di ricombinazione genica=distanza di 1 1% di ricombinazione genica=distanza di 1 centimorgancentimorgan (cM). (cM).

1)1) Vi Vi partecipanopartecipano 32 32 gruppigruppi europeieuropei finanziatifinanziati dalladalla UE UE

2)2) ObiettivoObiettivo: : definiredefinire unauna mappamappa didi marcatorimarcatori geneticigenetici

specificispecifici per per ilil bovinobovino ((utilizzautilizza tuttitutti i tipi i tipi didi

marcatorimarcatori))

3)3) ScopoScopo delladella mappamappa èè studiarestudiare ll’’associazioneassociazione tratra

marcatorimarcatori e e carattericaratteri QTL QTL e/oe/o ETLETL

BOVMAPBOVMAP(Progetto per la (Progetto per la mappaturamappatura del genoma bovino)del genoma bovino)

Loci: 4357Loci: 4357 Loci Loci mappatimappati: 4122: 4122

Geni: 1557Geni: 1557 Geni Geni mappatimappati: 1506: 1506

Microsatelliti: 2402Microsatelliti: 2402 Microsatelliti Microsatelliti mappatimappati: 2241 : 2241

QTLsQTLs: 46: 46

BOVMAP (INRA)BOVMAP (INRA)(Progetto per la (Progetto per la mappaturamappatura del genoma bovino)del genoma bovino)

Loci: 2409Loci: 2409 Loci Loci mappatimappati: 2134: 2134

Geni: 771Geni: 771 Geni Geni mappatimappati: 752: 752

Microsatelliti: 1521Microsatelliti: 1521 Microsatelliti Microsatelliti mappatimappati: 1269 : 1269

HORSEMAP (INRA)HORSEMAP (INRA)(Progetto per la (Progetto per la mappaturamappatura del genoma equino)del genoma equino)

Loci: 2030Loci: 2030 Geni: 543Geni: 543

Microsatelliti: 2257Microsatelliti: 2257

SHEEPMAPSHEEPMAP(Progetto per la (Progetto per la mappaturamappatura del genoma ovino)del genoma ovino)

PIGMAPPIGMAP(Progetto per la (Progetto per la mappaturamappatura del genoma suino)del genoma suino)

Loci: 4081Loci: 4081 Geni: 1588Geni: 1588

Microsatelliti: 1673Microsatelliti: 1673

PERCHPERCHÉÉ ÈÈ IMPORTANTE IMPORTANTE MAPPARE IL GENOMA?MAPPARE IL GENOMA?

1)1) Studio dellStudio dell’’organizzazione, regolazione ed organizzazione, regolazione ed espressione dellespressione dell’’insieme di geni nel genoma.insieme di geni nel genoma.

2)2) Selezione assistita da marcatori (Selezione assistita da marcatori (Marker Marker AssistedAssisted SelectionSelection -- MAS): identificazione MAS): identificazione delldell’’associazione tra marcatori e QTL /o ETL associazione tra marcatori e QTL /o ETL ((EconomicEconomic Trait LociTrait Loci) per una selezione pi) per una selezione piùùefficienteefficiente

3)3) Clonaggio di posizione: identificare e clonare un Clonaggio di posizione: identificare e clonare un gene responsabile per un ETL.gene responsabile per un ETL.

MASMAS((Marker Marker AssistedAssisted SelectionSelection))

I marcatori genetici possono essere usati per ricercare I marcatori genetici possono essere usati per ricercare

associazioni con i singoli associazioni con i singoli loci loci che contribuiscono ai che contribuiscono ai

caratteri quantitativi di importanza economica (QTL e caratteri quantitativi di importanza economica (QTL e

ETL.)ETL.)

LL’’individuazione di associazione di questo tipo permette di individuazione di associazione di questo tipo permette di

frazionare un carattere quantitativo a variazione continua frazionare un carattere quantitativo a variazione continua

in un certo numero di loci in un certo numero di loci mendelianimendeliani a variazione a variazione

discontinua, chiaramente identificabili, e di attuare una discontinua, chiaramente identificabili, e di attuare una

selezione assistita da marcatori.selezione assistita da marcatori.

Infatti se un Infatti se un alleleallele di un di un locuslocus ad effetto quantitativo e un ad effetto quantitativo e un

marcatore sono geneticamente associati, saranno trasmessi marcatore sono geneticamente associati, saranno trasmessi

dai genitori ai figli in modo congiunto.dai genitori ai figli in modo congiunto.

Pertanto utilizzando gli alleli dei marcatori per il carattere Pertanto utilizzando gli alleli dei marcatori per il carattere

in selezione si potranno scegliere gli animali portatori delle in selezione si potranno scegliere gli animali portatori delle

varianti pivarianti piùù favorevoli. favorevoli.

La MAS può influire favorevolmente su tutti i fattori che La MAS può influire favorevolmente su tutti i fattori che

determinano il progresso genetico (accuratezza della determinano il progresso genetico (accuratezza della

selezione, intensitselezione, intensitàà della selezione e intervallo di della selezione e intervallo di

generazione).generazione).

La MAS può aumentare lLa MAS può aumentare l’’efficacia della seleziona attuata efficacia della seleziona attuata

solo sulla base delle performance, soprattutto per solo sulla base delle performance, soprattutto per

caratteristiche che si esprimono in un solo sesso caratteristiche che si esprimono in un solo sesso

(produzione latte, numero di nati) o difficilmente misurabili (produzione latte, numero di nati) o difficilmente misurabili

su animali vivi (caratteristiche della carcassa e della su animali vivi (caratteristiche della carcassa e della

carne). carne).

Esempio di MAS: gene Esempio di MAS: gene AlotanoAlotano nei suini nei suini èè responsabile responsabile

della sindrome da stress (PSS) e del difetto PSE. Si della sindrome da stress (PSS) e del difetto PSE. Si èè

scoperto la causa scoperto la causa èè una mutazione del gene CRC (una mutazione del gene CRC (CalciumCalcium

ReleaseRelease ChannelChannel).).

La risposta alla selezione effettuata con i microsatelliti La risposta alla selezione effettuata con i microsatelliti èè

pipiùù elevataelevata nelle nelle prime generazioni di selezioneprime generazioni di selezione. A seguito . A seguito

delldell’’aumento delle frequenze aumento delle frequenze allelichealleliche fino alla fissazione fino alla fissazione

degli alleli favorevoli del QTL, la degli alleli favorevoli del QTL, la varianzavarianza genetica residuagenetica residua

della popolazione della popolazione diminuiscediminuisce e con questa la possibilite con questa la possibilitàà di di

risposta nel lungo periodo.risposta nel lungo periodo.

LL’’impiego della MAS comporta impiego della MAS comporta un guadagno di tempoun guadagno di tempo, ,

arrivando prima alla fissazione del QTL nella popolazione.arrivando prima alla fissazione del QTL nella popolazione.

La riduzione della risposta alla MAS nel lungo periodo non La riduzione della risposta alla MAS nel lungo periodo non

si ha se si ha se èè applicata nelle fasi o in gruppi di animali in cui applicata nelle fasi o in gruppi di animali in cui

non si applica selezione non si applica selezione fenotipicafenotipica (es. preselezione tori (es. preselezione tori

destinati al destinati al progenyprogeny test).test).

ANALISI PATERNITANALISI PATERNITÀÀ CON CON MICROSATELLITIMICROSATELLITI

In corrispondenza di ogni marcatorIn corrispondenza di ogni marcatore, con 4 alleli per locus, e, con 4 alleli per locus, la la probabilitprobabilitàà che due individui abbiano la stessa combinazione di che due individui abbiano la stessa combinazione di alleli alleli nelnel medesimomedesimo locus locus sarsaràà del 12,5%del 12,5%

SSe aumentiamo il numero dei marcatori la probabilite aumentiamo il numero dei marcatori la probabilitàà che due che due individui presentino la stessa combinazione di alleli per tutti individui presentino la stessa combinazione di alleli per tutti i i loci diventa piccolissima.loci diventa piccolissima.

Numero loci Numero loci (marcatori)(marcatori)

ProbabilitProbabilitàà di di matchingmatching(stesso profilo)(stesso profilo)

11 12.5 %12.5 %

1.56 %1.56 %0.19 %0.19 %

44 0.02 %0.02 %55 0.0030 %0.0030 %

0.00000005 %0.00000005 %

2233

1010

DNA DNA fingerprintingfingerprinting

Utilizzando Utilizzando contemporanementecontemporanemente pipiùù marcatori si marcatori si ottengono profili ottengono profili alleliciallelici in grado di identificare in grado di identificare

in modo univoco gli individuiin modo univoco gli individui

impronte digitali del DNAimpronte digitali del DNA

MADRE

FIGLIO

PADRE

FIGLIOGENOTIPO: 263/277

GENOTIPO: 263/277

GENOTIPO: 263/263

GENOTIPO: 263/263

263

263 277

263

263 277

MADRE

FIGLIO

FIGLIO

PADRE

FIGLIO

GENOTIPO: 128/140

GENOTIPO: 128/146

GENOTIPO: 128/128

GENOTIPO: 124/128

GENOTIPO: 128/128

128 140

128 146

128

124128

128

DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA

Due alleli del microsatellite