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Il protocollo sperimentalee
i calcoli in laboratorio
Fabio FusiDipartimento di Scienze Biomediche
Il protocollo sperimentale
In fo rm az ion i su ll'an im a le d i lab o ra to rio so lu z ion i p rep ara te
an n o taz ion i
risu lta ti o tten u ti
P ro toco llo sp erim en ta le
Informazioni sull’animale di laboratorio
•Specie utilizzata (ratto, topo, cavia, ecc.)•Ceppo•Ditta fornitrice•Sesso•Peso ----> età•Digiuno (sì - no)•Eventuali trattamenti (reserpinizzato, ecc.)•Anestesia•Metodica di sacrificio•Note
In fo rm az ion i su ll'an im a le d i lab ora to rio so lu z ion i p rep ara te
an n otaz ion i
risu lta ti o tten u ti
P ro toco llo sp erim en ta le
Sprague-Dawley outbred rats
Informazioni sulle soluzioni preparate
•Soluzioni fisiologiche di perfusione•Soluzioni madri•Pesata•Diluizione•Raccomandazioni per la conservazione della soluzione madre•Note (preparare fresca ogni giorno, agitare prima dell’uso, ecc.)
In fo rm az ion i su ll'an im a le d i lab ora to rio so lu z ion i p rep ara te
an n otaz ion i
risu lta ti o tten u ti
P ro toco llo sp erim en ta le
Analisi dei risultati
•Raccolta dei tracciati, stampati, ecc.•Immagazzinamento dei dati nel computer•Catalogazione•Elaborazione dei dati raccolti•Produzione di un grafico
In fo rm az ion i su ll'an im a le d i lab ora to rio so lu z ion i p rep ara te
an n otaz ion i
risu lta ti o tten u ti
P ro toco llo sp erim en ta le
Effetto della miricetina sulla curva concentrazione-risposta al K+
-2.25 -2.00 -1.75 -1.50 -1.25 -1.00
0
25
50
75
100
CTRL
Myr 30
Esperimenti: 7, 12, 19, 28 / 2 /2002
Log [K+] (M)
Ris
po
sta
%
Annotazioni
•Le annotazioni/osservazioni spesso forniscono le informazioni più importanti per la comprensione dei risultati e quindi dell’intero esperimento!
In fo rm az ion i su ll'an im a le d i lab ora to rio so lu z ion i p rep ara te
an n otaz ion i
risu lta ti o tten u ti
P ro toco llo sp erim en ta le
Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (1)
•“Fisiologica” è l’attributo che si associa a numerose soluzioni saline.
•NaCl 0.9% = isotonica
•La soluzione fisiologica serve a mantenere un organo isolato in vita ed in condizioni stabili
•Manipolazione delle proprietà di una soluzione fisiologica
Le soluzioni fisiologiche per organi isolati (2)
La soluzione fisiologica deve:
•assicurare un adeguato apporto di sostanze nutritive•O2
•37°C•corretta composizione ionica•pH•osmolarità
Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e delle proteine (g/100 ml) nel plasma di alcune specie
Uomo Ratto Porcellino d’India
Na+ 150 151 145
K+ 3.6 5.9 7.4
Cl- 102 110 105
Ca2+ 2.4 2.5 2.2
proteine 7.0 6.3 5.4
Ca2+Na+
fenilefrina
Ca2+ Ca2+
IP3
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Na+
Na+
Na+
K+
K+
K+
K+
Ca2+
K+
Na+
Concentrazioni di alcuni elettroliti (mM) e potenziali di equilibrio nel muscolo scheletrico di mammifero
Ione Concentrazione extracellulare
Concentrazione intracellulare
[Ione]o/[Ione]i Potenziale di equilibrio
Na+ 145 12 12 +67
K+ 4 155 0.026 -98
Ca2+ 1.5 1x10-7 M 15000 +129
Cl- 123 4.2 29 -90
RT [K+]o
Equazione di Nerst EK = ------- ln --------nF [K+]i
Soluzioni saline di perfusione per tessuti isolati
Ringer anfibi
Krebs Tyrode Ringer Tyrode Locke
De Jalon Reiter
NaCl 111.0 118.0 137.0 154.0 154.0 115.0
KCl 1.87 4.69 2.68 5.63 5.63 4.7
MgSO4 --- 1.18 1.05 --- --- 1.2
NaH2PO4 0.04 --- 0.42 --- --- ---
KH2PO4 --- 1.2 --- --- --- 1.2
Glucosio 11.0 11.0 5.6 5.6 2.8 10.0
NaHCO3 4.8 25.0 11.5 6.0 6.0 25.0
CaCl2 1.08 2.52 1.8 1.08 2.7 1.8
Gas aria 95% O2
5% CO2
O2
aria
O2 95% O2
5% CO2
95% O2
5% CO2
proteine
Le concentrazioni plasmatiche degli ioni presentano specie-specificità
Specie “Ionizzato” Totale
Cavia 1.7-1.8 2.0-2.3
Ratto 1.3-1.6 2.3-2.6
Uomo 1.1-1.2 2.2-2.9
Concentrazioni (mM) di calcio “ionizzato” e totale nel plasma di alcune specie
pKa
+1pH fisiologico
-1 Sufficiente capacità tampone
Le soluzioni fisiologiche sono soluzioni tampone
La soluzione tampone:
•miscela tra un acido debole e la sua base coniugata•minimizza le variazioni di pH
Perché una coppia coniugata possa essere considerata come un tampone di rilevanza fisiologica:
Ca2+
H2PO4 + HPO4-
pK’a = 7.2
H2CO3 + HCO3-
pK’a = 3.8
CO2(acq.)CO2(gas)
Legge di Henry
Il pHImportante per la vitalità e funzionalità del tessuto
Determina il grado di ionizzazione delle molecole
AH
BOH
A- H+
B+ OH-
Attività <-----> InattivitàEnzimiLivelli di [Ca2+]i
Contrattilità muscolareMeccanismi osmoticiEcc.
L’osmolarità
L’osmolarità di una soluzione deve essere vista come l’effettiva pressione osmotica che questa soluzione può sviluppare sui tessuti.
Una osmole = 22.4 atm a 0°C (pressione osmotica di una soluzione 1 M di un non-elettrolita ideale).
L’osmolarità di una soluzione reale può essere determinata direttamente dalla misura del punto di congelamento.
swelling
Soluzione ipo-osmotica
H2O
shrinking
Soluzione iper-osmotica
H2O
La temperatura
Variabile fisiologica strettamente controllata nel vivente
Influenza sia la risposta basale di un preparato che la responsività ai farmaci (utero di ratto)
La riduzione della temperatura diminuisce il consumo di ossigeno ed il rischio di ipossia
Influenza il pH delle soluzioni
L’ossigenazione
Importante per la sopravvivenza di un tessuto
Apparato sperimentale, spessore del tessuto, consumo di ossigeno tessutale (temperatura e attività) e pressione parziale di ossigeno nella soluzione fisiologica influenzano l’ossigenazione.
La quantità di un gas disciolto in soluzione dipende da:•solubilità del gas nell’acqua•pressione del gas nella fase gassosa•temperatura•presenza di soluti nell’acqua
I calcoli in laboratorio
Dalla molarità ai grammi (1)
M 1 x 100 mM 1 x 10-3 µM 1 x 10-6 nM 1 x 10-9 pM 1 x 10-12
Come si esprime la concentrazione di una soluzione
M = n / V con V = litro
Dalla molarità ai grammi (2)
Come si calcolano i grammi da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti
M = n / V con n = g / PM
ne consegue che
M = g / PM x V
ovvero
g = M x PM x V
La pesata “approssimata”
Come si calcolano i g da pesare per preparare una soluzione a concentrazione e volume noti di una sostanza costosa
g = M x PM x V
Preparare 1 ml di una soluzione di quercetina (PM = 338) 10 mM
g = 0.01 x 338 x 0.001 = 0.00338pesata = 0.00221 g
applico la proporzione
0.00338 g : 1 ml = 0.00221 g : X ml
La diluizione
Come si prepara una soluzione a concentrazione e volume noti a partire da una soluzione più concentrata
C1 x V1 = C2 x V2
•1 indica la soluzione da preparare•2 indica la soluzione più concentrata•C e V devono essere sempre espressi con la stessa unità di misura
Il problema solvente
Molte sostanze impiegate nella ricerca di base e pre-clinica sono lipofile.
dimetilsolfossidoetanolo
dimetilformammide
metanolo
Effetto di un farmaco sulla contrazione indotta da10 µM fenilefrina
CTRL
DMSO
drug 1
0
drug 3
0
drug 1
000
25
50
75
100
***
*
Res
pons
e (%
)
-2.25 -2.00 -1.75 -1.50 -1.25
0
25
50
75
100
125
DMSOethanol
Log [K+] (M)
Res
pons
e (%
)
-2.25 -2.00 -1.75 -1.50 -1.25
0
25
50
75
100
125 DMSO30 µM myricetinethanol10 nM Bay K 8644
Log [K+] (M)
Res
pons
e (%
)