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Il ruolo del sistema maggiore di istocompatibilità:
dal laboratorio alla clinica dal laboratorio alla clinica
Marco AndreaniLIBT - Roma
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Variabilità nella Genetica UmanaCosa ci rende unici
La variabilità inter-individuale in 3 miliardi di bp nel genoma umano è dello 0.5%
Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) Copy Number Variations (CNV)
Variabilità nella Genetica UmanaCosa ci rende unici
• 0.1% of inter-individual variability
• 30 x 106 SNP are known• 1% are functional (3x105)
• 0.4% of inter-individual variability
• Insertion, Deletion, Inversion, Duplication
Sistemi genetici polimorficiRuolo Biologico e Clinico
Polimorfismo Rilevanza Biologica Rilevanza Clinica
Geni HLA class I e II classici
• Presentazione dell’antigene• Alloreattività• Immunità Innata• Evoluzione
• Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive• Gravidanza
Geni HLA non classici (HLA-G)
Tolleranza Immunologica • Trapianti• Gravidanza
Antigeni Minori di Alloreattività • TrapiantiAntigeni Minori di Istocompatibilità
Alloreattività • Trapianti• Gravidanza
Natural Killer Receptors(KIR)
Immunità Innata • Trapianti• Malattie Infettive
Geni delle citochine e dei loro recettori
Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive
Gruppi sanguigni Immunità Naturale • Medicina Trasfusionale
Molecole di Adesione (CTLA-4)
Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive
Altri (PTX3, PTTN2, etc.) • Attivazione cellulare • Trasduzione del Segnale
• Autoimmunità• Malattie Infettive
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocom patibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Regione HLA
Cromosoma 6
HLA di Classe I (A,B C)
HLA di Classe II (DR, DQ, DP)
Insieme di proteine di membrana che consente ai linfociti di riconoscere le cellule come proprie (self) oppure come estranee
HLA Classe I (A, B, C)
Location of amino acid variability that results in multiple different HLA class I molecules
Exon 2
α1 α2
Exon 4
α3
Exon 1
Leader
Exon 3
HLA Classe II (DRB1, DQB1, DPB1)
Location of amino acid variability that results in multiple different HLA class II molecules
Exon 2
β1/α1 β2/α2
Exon 1
Leader
Exon 3
Processazione e presentazione dell’antigene
Antigeni endogeniper HLA classe I
Insieme dei processi che hanno come risultato:
• frammentazione delle proteine antigeniche• associazione dei frammenti proteici (peptidi) alle m olecole MHC• trasporto del complesso peptide-MHC sulla superficie cellulare dove può essere riconosciuto dal recettore dei linfociti
Antigeni esogeniper HLA classe II
Presentazione dell’antigene da parte di molecole HLA
Riconoscimento diretto e indiretto
Antigen Presentation
Maturazione ed espansionedelle cellule T
Attivazionedelle celluleB
Interazione tra HLA e cellule NK
Diversità allelica
Caratteristica del sitema HLA
Sequenze di alcuni alleli HLA*A
Annual Increase of the Number of HLA Antigens/Alleles
http://hla.alleles.org/inc/images/graph_hires.png
Per contrastare la flessibilità degli agenti patogeni
Più di un tipo di molecola MHC in ciascun individuo Sistema POLIGENICO
Obiettivo: protezione della popolazione dall’estinzione, utilizzando due strategie:
Sistema POLIGENICO
Estese differenze nelle molecole HLA tra individuiSistema POLIMORFICO
HLA-A10HLA-B12HLA-Cw5
HLA-A26HLA-B8
HLA-Cw5
HLA-A25HLA-B40HLA-Cw2
HLA-A11HLA-B16HLA-Cw8
HLA-A23HLA-B12HLA-Cw1
HLA-A3HLA-B5
HLA-Cw7
The classical HLA class Ia molecules are highly polymorphic
Difference from class I HLA molecule
HLA-A2HLA-B27HLA-Cw6
HLA-A24HLA-B8
HLA-Cw4
HLA-A25HLA-B12HLA-Cw1
HLA-A19HLA-B15HLA-Cw2
HLA-A19HLA-B14HLA-Cw8
HLA-A28HLA-B17HLA-Cw5
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Variazioni HLA nelle popolazioni
L’alto grado del polimorfismo del sistema HLA fornisce strumenti per lo studio della diversità
nelle varie popolazioni:
• Storia• Migrazioni• Evoluzione• Genetica• Suscettibilità o resistenza alle malattie
Variazioni HLA nelle popolazioni
The Hardy -Weinberg Equilibrium
Utilizzarono l’algebra per spiegare come le frequenze allelichepossono predire le frequenze genotipiche e fenotipiche
Una popolazione resta in equilibrio solo se in essa si verificano alcune condizioni restrittive: • non devono verificarsi mutazioni• non deve verificarsi una migrazione netta di alleli verso l´interno• non deve verificarsi una migrazione netta di alleli verso l´interno
della popolazione (immigrazione) o verso l´esterno (emigrazione)• la popolazione deve essere ampia (teoricamente infinita)• non si deve verificare selezione naturale, vale a dire tutti i genotipi
devono possedere le stesse capacità adattative e riproduttive
Two Allele Model
Alleles Frequency
A a
B b
A B
A a*a a*b
B a*b b*b
Phenotypes Frequency
A a*a
AB 2*a*b
B b*b
Formularono indipendentemente questa formula matematica
Software packages
• Arlequin• Gene[rate]• Pypop• http://hla-net.eu• www.allelefrequencies.net• www.allelefrequencies.net
HLA population data storage and analysis
• Software should be able to handle ambiguous data, e.g. Gene[rate]
Variazioni HLA nelle popolazioni
Progetto IME Formidabile opportunità di studio
Possibilità di studio della segregazione aplotipica in quanto disponiamo di dati relativi all’intera famiglia
Variazioni HLA nelle popolazioni
Variazioni HLA nelle popolazioni
SYRIA 0.61%
Confronto tra la frequenza dell’allele HLA-B*53 in diverse popolazioni
IRAQI KURDISTAN
NIGERIA
2.1%
16.9%
Global Distribution of Frequent African HLA-B Alleles
Image from Solberg et al.(2008) see www.pypop.org/popdata for more info
Uno studio su bambini in Africa condotto da Hill A (Nature 1991) ha mostrato che gli alleli
erano più frequenti in popolazioni provenienti dall’Africa
HLA-B53 DRB1*1302-DQB1*0501
Variazioni HLA nelle popolazioni
erano più frequenti in popolazioni provenienti dall’Africa Occidentale rispetto a quanto osservato in altri etnie; variabili indipendentemente associate alla protezione nei confronti della Malaria
Entrambi questi alleli sono frequenti nella popolazione Nigeriana
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
*07
*08
*13
*14
*15
*18
*27
*35
*37
*38
*39
*40
*41
*42
NIGERIA HLA-B Frequency
Variazioni HLA nelle popolazioni
*42
*44
*45
*46
*47
*48
*49
*50
*51
*52
*53
*54
*55
*56
*57
*58
*59
*67
*73
*78
*81
*82
*83
NIGERIA HLA-DRB1 Frequency
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
*01
*15
*16
*03
*04
*11
*12
*13
*14
*07
*08
*09
*10
• Genetica e funzione del sistema maggiore di istocompatibilità• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Influenza dei HLA sulla genetica delle popolazioni• Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Il laboratorio di Immunogenetica ha il compito di i ndividuare un donatore HLA compatibile per un paziente proposto a l trapianto
HLA-A: 01:01 29:01 HLA-A: 02:05 03:01
HLA-B: 08:01 35:03 HLA-B: 08:01 40:01
HLA-Cw: 07:01 04:01 HLA-Cw: 03:03 07:02
Mother Father
Tipizzazione HLA e trapianto di cellule staminali emopoietiche
Tipizzazione HLA ad alta risoluzione di una famiglia dove è possibile evidenziare HLA-DRB1*: 07:01 03:01 HLA-DRB1*: 13:01 08:01
HLA-DQA1*: 02:01 05:01 HLA-DQA1*: 01:03 04:01
HLA-DQB1*: 03:03 02:01 HLA-DQB1*: 06:03 04:02
HLA-DPB1*: 09:01 04:01 HLA-DPB1*: 04:01 15:01
1 2 3 4
HLA-A: 29:01 03:01 HLA-A: 01:01 03:01 HLA-A: 29:01 03:01 HLA-A: 01:01 02:05
HLA-B: 35:03 40:01 HLA-B: 08:01 40:01 HLA-B: 35:03 40:01 HLA-B: 08:01 08:01
HLA-Cw: 04:01 07:02 HLA-Cw: 07:01 07:02 HLA-Cw: 04:01 07:02 HLA-Cw: 07:01 03:03
HLA-DRB1*: 03:01 08:01 HLA-DRB1*: 07:01 08:01 HLA-DRB1*: 03:01 08:01 HLA-DRB1*: 07:01 13:01
HLA-DQA1*: 05:01 04:01 HLA-DQA1*: 02:01 04:01 HLA-DQA1*: 05:01 04:01 HLA-DQA1*: 02:01 01:03
HLA-DQB1*: 02:01 04:02 HLA-DQB1*: 03:03 04:02 HLA-DQB1*: 02:01 04:02 HLA-DQB1*: 03:03 06:03
HLA-DPB1*: 04:01 15:01 HLA-DPB1*: 09:01 15:01 HLA-DPB1*: 04:01 15:01 HLA-DPB1*: 09:01 04:01
2 4 1 4 2 4 1 3
Child 1 Child 2 Child 3 Child 4
dove è possibile evidenziare la segregazione aplotipica
Ambiguità
� Alleliche
� Genotipiche
Ambiguità
� Alleliche : Dovute a polimorfismi che si trovano fuori della regione analizzata
HLA ambiguity results from the amplification and Sa nger sequencing based typing (SBT) of partial genes
Allele ambiguity
A*01:01:01:01 vs A*01:01:01:02N (Intron 2)
•DRB1*12:01 vs DRB1*12:06 (Exon 3)
Exon 2 Intron 2
Ambiguità
� Genotipiche: Dovute a combinazioni uguali di alleli diversi (cis-trans) in campioni eterozigoti
Genotype ambiguity - results from an inability to establish phase (cis/trans
ambiguity) between closely linked polymorphisms identified by the typing system
HLA ambiguity results from heterozygoussequencing by Sanger SBT
A*01:01:01:01+24:02:01:01 ------------- Y-------Y----- -------------R- ------Y------ -------------MS
A*01:14 + 24:46 ------------- Y-------Y----- -------------R- ------Y------ -------------MS
A*24:02:01:01 -------------- C------T------ ------------A- ------C------ ------------AC
A*24:46 -------------- C------T------ ------------A- ------C------ ------------CG
Sample: 702-11TReference: IMGT/B 3.3.0 2011-01-14
Summary
The allele pairs listed below are compatible with the consensus sequence.
B*18:01:01 B*44:02:01:01B*18:01:01 B*44:02:01:02SB*18:01:01 B*44:19N Exon 1B*18:09 B*44:09 Exon 2B*18:12 B*44:12 Exon 2
Ambiguità Genotipiche o Cis/Trans
B*18:17N B*44:02:01:01 Exon 1B*18:17N B*44:02:01:02SExon 1B*18:17N B*44:19N Exon 1B*18:20 B*44:51 Exon 3B*18:43 B*44:55 Exon 2
Allele 1 Allele 2A*0201 A*0301Allele 1 Allele 2A*02010101 A*03010101A*0226 A*0307A*0234 A*0308A*02010101 A*03010102NA*02010102L A*03010101A*02010102L A*03010102N
Allele 1 Allele 2A*02010101 A*03010101A*0226 A*0307A*0234 A*0308A*02010101 A*03010102NA*02010102L A*03010101A*02010102L A*03010102N
Allele 1 Allele 2A*02:01:01:01 A*03:01:01:01A*02:26 A*03:07A*02:34 A*03:08A*02:01:01:01 A*03:01:01:02NA*02:01:01:02L A*03:01:01:01A*02:01:01:02L A*03:01:01:02N
Year IMGT Release2000 1.5Year IMGT Release2005 2.8Year IMGT Release2010 2.28Year IMGT Release2011 3.3.0
The discovery of new HLA alleles has resulted in an increase in heterozygous allele combinations that ar e
identical in the commonly sequenced regions
Year IMGT Release2013 3.9.01A*02010101 A*03010103
A*02010102L A*03010103A*02010101 A*03010103A*02010102L A*03010103A*0224 A*0317A*0290 A*0309A*02010103 A*03010101A*02010103 A*03010102NA*02010103 A*03010103A*020102 A*030112A*0323 A*9295
A*02:01:01:02L A*03:01:01:02NA*02:01:01:01 A*03:01:01:03A*02:01:01:02L A*03:01:01:03A*02:24:01 A*03:17A*02:90 A*03:09A*02:01:01:03 A*03:01:01:01A*02:01:01:03 A*03:01:01:02NA*02:01:01:03 A*03:01:01:03A*02:01:02 A*03:01:12A*03:23:01 A*02:195A*02:01:52 A*03:01:03A*02:35:01 A*03:108A*02:237 A*03:05
2013 3.9.01
550 combinations (ex2+3)
20 combinations (ex2-4)
Ambiguità Genotipiche attesein base alla frequenza allelica
• HLA-A: 62 %
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
• HLA-B: 58 %
• HLA-C: 58 %
• HLA-DPB1: 56 %
• HLA-DQB1: 25 %
• HLA-DRB1: 60 %
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
The updated CWD catalogue
designates 1122 alleles atthe HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1and -DPB1 loci as being CWD, and
represents 14.3% of the HLArepresents 14.3% of the HLAalleles in IMGT/HLA Databaserelease 3.9.0.
In particular, we identified 415 ofthese alleles as being ‘common’(having known frequencies) and
707 as being ‘well-documented ’ on the basis of ̃140,000 sequence-based typing observations andavailable HLA haplotype data.
Nuove tecnologie
Luminex 500 beadsNext Generation Sequencing
ILLUMINASEQUENZIAMENTOPER SINTESI
THERMO FISHERION TORRENTION SEMICONDUCTORSEQUENCING
Compatibilità HLA e Trapianto di CSA
Rilevanza della compatibilità HLA
3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors
Early Stage
P<0.001
Intermediate Stage
P<0.001
Late Stage
P=0.02
Rilevanza della compatibilità HLA
(Lee, Blood 2007)
3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors
Early Stage
P<0.001
Intermediate Stage
P<0.001
Late Stage
P=0.02
Rilevanza della compatibilità HLA
(Lee, Blood 2007)
3857 MUD Tx from unrelated adult volunteer donors
Early Stage
P<0.001
Intermediate Stage
P<0.001
Late Stage
P=0.02
Rilevanza della compatibilità HLA
(Lee, Blood 2007)
Rilevanza della compatibilità HLA
Immunol Res (2008) 41:56–78Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplant ation. Role of HLA matching, functional variation in immune response genesJohn A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry Storer Æ Paul J. Martin
Rilevanza della compatibilità HLA
Immunol Res (2008) 41:56–78Genetics of allogeneic hematopoietic cell transplant ation. Role of HLA matching, functional variation in immune response genesJohn A. Hansen Æ Effie W. Petersdorf Æ Ming-Tseh Lin Æ Steven Wang Æ Jason W. Chien Æ Barry Storer Æ Paul J. Martin
T Cell Epitope Matching in Unrelated HSCTStructural versus Functional
Structural Matching Functional Matching
TCR / MHC
• Nucleotide Sequencing
• Allelic Matching or Disparity
• Sequence Identity for A,B,C,DRB1 (8/8)
• Classical Approach for SCT
• Shared T cell epitopes (TCE)
• TCE matching or disparity
• Functional Identity for TCE groups
• In use for Solid Organ TX
• Innovative for SCT
Combinazioni alleliche permissive
Rilevanza della compatibilità HLA
Combinazioni alleliche permissive
Kawase, Blood, 2007 - October 1:110(7)
Combinazioni alleliche permissive
Identification of a permissible HLA mismatch in hematopoietic stem cell transplantationMarcelo A. Fernandez-Viña et al.
Key Points
Mismatches in alleles C*03:03/C*03:04 were most frequent (68.7%) among the transplants with a single allele level mismatch in HLA-C
The 7/8 C*03:03/C*03:04 mismatch group was not significantly differentfrom the 8/8 HLA matched transplants in any transplant outcome.
Blood ; 2014 Feb 20: 123(8)
Impatto del DPB1 sul trapianto di cellule staminali
ematopoietiche
Combinazioni alleliche permissive
Combinazioni alleliche permissive
Others
TCE3 Grouping
The Algorithm: 60% permissive40% non-perm.40% non-perm.
Zino, Blood 2004
The DPB TCE Webtool
Anthony Nolan Registry
Analisi retrospettiva su 5428 UD -HSCT (10/10)
Fleishhauer Lancet Oncol 2012:13(4): 366-74
Non-permissiveTCE Mismatch
PermissiveTCE Match
DPB1 AlleleMismatched
Allelic DPB1 Match
NRM
Compatibilità DPB1 e andamento del trapianto di CSE nella talassemia
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!
Polimorfismo Rilevanza Biologica Rilevanza Clinica
Geni HLA class I e II classici • Presentazione dell’antigene• Alloreattività• Immunità Innata• Evoluzione
• Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive• Gravidanza
Geni HLA non classici (HLA-G)
Tolleranza Immunologica • Trapianti• Gravidanza
Antigeni Minori di Alloreattività • Trapianti
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!
Antigeni Minori di Istocompatibilità
Alloreattività • Trapianti• Gravidanza
Natural Killer Receptors (KIR)
Immunità Innata • Trapianti• Malattie Infettive
Geni delle citochinee dei loro recettori
Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive
Gruppi sanguigni Immunità Naturale • Medicina Trasfusionale
Molecole di Adesione (CTLA-4)
Risposta Immunitaria • Trapianti• Autoimmunità• Malattie Infettive
Altri (PTX3, PTTN2, etc.) • Attivazione cellulare • Trasduzione del Segnale
• Autoimmunità• Malattie Infettive
Quante variabili genetiche si evidenzianosequenziando con NGS le 3.5x106 bp dellaregione MHC di un paziente e di un suopotenziale MUD HLA 10/10 compatible..?
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!
3025 posizioni diverse (patziente vs. donatore)• 1492 in regioni intergeniche• 1173 in introni• 360 in esoni (59 genes)
Pröll et al. DNA Res. 2011; 18: 201
GENOME WIDE ANALYSIS SNP genotypingAffimetrix Genome-wide, Human SNP 6.0 array
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11
12
13
14
15
16
18
19
20
21
22
17
Allele BAT2 Allele BAT3
BAT2/BAT3 Haplotypes AC 9/30 (30.0) 5/190 (2.6) 1.15 x10 -8 0.007
GC 0/30 (0.0) 1/190 (0.50) 0.690 1.000
GT 21/30 (70.0) 184/190 (96.8) 5.94 x10-8 0.037
Trapianto da donatore correlato HLA identicoTrapianto da donatore non correlato HLA identico
Trapianto da donatore correlato aploidenticoUtilizzo di cellule T regolatorie
La compatibilità HLA è certamente rilevante per il successo di un trapianto, ma non è tutto…!
Utilizzo di cellule T regolatorieUtilizzo di nuovi protocolli di condizionamento
Take Home messages
L’impatto della compatibilità HLA sull’andamento del trapianto restaun elemento di grande rilevanza, anche se diversi elementi, come adesempio la progressione della malattia, devono essere consideratinella scelta della strategia trapiantologica
E’ già possibile definire una compatibilità permissiva, attraverso ilconcetto di “ epitope matching ” , con valore predittivo, per il DPB1concetto di “ epitope matching ” , con valore predittivo, per il DPB1in un contesto 10/10 (9/10)
Valore predittivo per altri alleli (DRB1, DQB1 e di classe I) sono statiin parte già evidenziati, ma certamente dovranno essere approfonditiin futuro
La possibilità di esplorare regioni genetiche fino ad ora non coinvoltenella “compatibilità” è elemento nuovo e stimolante per il futuro