シークエンシングワークフロー

サンプル調製 末端修復 A-TAILING アダプター

ライゲーションサイズセレクション& サイズ確認

ライブラリー定量

クラスター増幅

シークエンシング

ライブラリー調製

リアルタイムライブラリー増幅

エンドポイントライブラリー増幅または

illumina社用ライブラリー調製キット

KAPA HyperPlus Kit

KAPA HyperPrep KitFFPEなどの微量DNAサンプルからの

ライブラリー調製に最適“1ng～”

ハンズオン・タイムの劇的な短縮

“ Evolved ／ 進化版 ”断片化装置フリー

自動化に適したワークフロー

1ng～1μgで自在のDNAサンプルインプット量

KAPA HyperPlus Kit

2

KAPA HyperPlus Kitillumina社用ライブラリー調製キット

“ Evolved ／ 進化版 ”

KAPA HyperPlus キットは、物理的な断片化と同等レベルのバイアスの少ない

新開発DNA断片化酵素と、1本のチューブ内で行えるシンプルでスリムなワークフロー

によって、業界を一歩リードするライブラリー作製効率の高さを実現しました。

• 断片化装置フリー• 約2.5時間での“DNA断片化とライブラリー調製”• 1ng ～1μg で自在のDNAサンプルインプット量• 限界まで減らしたビーズ精製ステップ• PCRフリーのワークフローが可能に• 増幅バイアスの低減でシークエンスカバー率を向上• 自動化に最適

3

KAPA HyperPlus Kit

合計時間：～2.5時間

断片化（10～45分）

末端修復およびAテーリング（30分）

ライブラリー増幅（オプション）（30分）

ビーズ精製（30分）

ビーズ精製（30分）

アダプターライゲーション（15分）

Ⅰ社 キットN合計時間：～2.5時間

タグメンテーション

ライブラリー増幅（必須）

ビーズ精製

ビーズ精製

C社 超音波破砕機＋ KAPA Hyper Prep

合計時間：～3.5時間

断片化

末端修復およびAテーリング

ライブラリー増幅（オプション）

ビーズ精製

ビーズ精製

アダプターライゲーション 1本のチューブ

1本のチューブ

KAPA HyperPlusキットは、バイアスの少ない酵素による断片化を取り入れたことで、「自動化が難しく、高価な装置によるDNAの物理的な断片化」の必要がありません。

• チューブ1本でのワークフローによりDNA断片化とライブラリーの作製が約2.5時間で可能

• FFPEのような困難なサンプルも含め、幅広いDNAタイプとインプット量に対応

• ヒトエキソームや微生物の全ゲノムシークエンスなど、多様なアプリケーションに適用可能

断片化装置フリー。自動化に適したワークフロー

bp

蛍光（シグナル強度） 200

150

0

35 100 150 200 300 400 500 600 1000 2000 10380

100

50

ライブラリー断片サイズ分布

C. difficile 10ng

E. coli 10ng

Human 10ng

B. pertussis 50ng

B. pertussis 10ng

C. difficile 50ng

P. falciparum 50ng

E. coli 50ng

Human 50ng

5 分 15 分 45 分

700

800

600

500

400

300

200

100

0

再現性ある断片サイズ

断片化時間

平均サイズ（bp）

% GC

10ng 30分

100ng 15分

10ng 15分

100ng 30分

• 断片化時間の違いによりライブラリーインサートサイズを150～800 bpで調節可能• インサートサイズは、さまざまなGC含量とDNAインプット量において再現可能

DNAサンプルインプット量やサイズに依存しない、再現性あるライブラリー断片サイズ分布

HyperPlusキットを使用して、インプット量の異なる大腸菌ゲノムDNAを37℃で15分または30分断片化。ライブラリー増幅後にSPRI®ビーズで1回精製した後、サンプルをAgilent High Sensitivity DNA AssayTMキットで解析しました。

設定した断片化パラメータで、GC含量の異なる複数種のサンプルであっても、一貫したライブラリーインサートサイズが得られます。

10ngまたは50ngの百日咳菌（GC 68％）、クロストリジウム ディフィシル（GC 29％）、大腸菌（GC 51％）、熱帯熱マラリア原虫（GC 20％）、ヒトゲノムDNAを5分、15分、45分で断片化。得られたインサート断片の平均サイズはそれぞれ～700、～350、～200bp。断片化反応は37℃で実施。

サイズ調節が可能で再現性の高い“酵素による断片化”

高

低

KAPA HyperPlus Kit

4

優れたライブラリー収量そして品質インプットDNAをシークエンス可能なアダプターライゲーション済みのライブラリーに変換する割合（変換率％）は、ライブラリー作製の主要な測定基準ですが、結局はライブラリーの多様性と品質を決定づけるものです。

• プロトコルの最適化による優れた変換率

• 幅広いDNAインプット量で優れた性能

• 高いライブラリー収量によりPCRフリーのワークフローが可能（最低50ngの初発量から）

上質なシークエンス結果を可能に

C社 超音波破砕機 + Hyper Prep

HyperPlus Ⅰ社 キットN

1009

8

7

6

5

4

3

2

1

0

95

90

85

80

SNP（一塩基多型）の検出感度 シークエンスカバー率の均一性

(%)

標的断片

Depth of Coverage80x 100x0x 40x20x 60x

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040C社 超音波破砕機 + Hyper Prep

Ⅰ社 キットN

HyperPlus

複製率（Duplication Rate）

Duplication Rate（％）

gDNA FFPE

HyperPlus

C社 超音波破砕機 + Hyper Prep

低い複製率（Duplication Rate）

HyperPlusまたはC社 超音波破砕機とHyper Prepを使ったエキソームシークエンス実験による複製率です。50ngのヒトゲノムDNAまたは50ngのFFPE DNAからライブラリーを調製し、Nimblegen SeqCap EZ HGSC VCRome パネルで取り込みました。

一塩基多型（SNP）検出感度が優れたシークエンス品質を示しています。

インプット量50ng、標準的な回収手順でライブラリーを調製してNimblegen SeqCap EZ HGSC VCRomeパネルで取り込みました。SNPは、初期設定、一塩基あたりの最小カバー深度カットオフ値10のLoFreqを使って回収。感度（真陽性率）は、真陽性を真陽性と偽陰性の合計で割った割合として算出。分析したSNP総数は25,000以上。

シークエンスカバー率の均一性の比較

すべてのライブラリーデータは、リード数を等しくするためにダウンサンプリングを行いました。HyperPlusまたはC社 超音波破砕機＋HyperPrepとR社 キャプチャーキットで調整されたライブラリーと、Ⅰ社のキットN とキャプチャーキットで調整されたライブラリーを比較。Ⅰ社 キットN のライブラリーは広がったカバー率分布を示しましたが、C社 超音波破砕機とHyperPlusのカバー率分布は類似しています。鋭いピークで裾が小さくより均一なカバー率であることを示しています。

• 高い変換率により少ない増幅サイクルと低い複製率（Duplication Rate）を実現• 優れたライブラリー多様性とより均一なシークエンスカバー率により、低頻度の突然変異を高い信頼性をもって検出

変換率範囲

変換率％

インプット量

100

90

80

60

50

30

70

1 µ g 100 ng 10 ng 1 ng

40

20

10

0

C社 超音波破砕機 +Ⅰ社ライブラリー調整キット

C社 超音波破砕機 + Hyper Prep

HyperPlus

変換率はライブラリー調整キットに大きく左右されます。

HyperPlusで調製したライブラリーと、C社 超音波破砕機で断片化したDNAをⅠ社ライブラリー調整キットおよびHyper Prepで調整した場合とを比較しました。HyperPlusは一体化したワークフローにより、インプットDNAからアダプターライゲーション済みライブラリーへの変換率が高くなっています。変換率は高インプット・低インプットいずれの場合も、KAPA HyperPlusによるものが一番高くなっています。

低多

5

Normalized Coverage

GC% of 100 Window Bins40 45 5010 3530252015

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0ウインドウ数（×103）

Normalized Coverage

ウインドウ数（×103）

Normalized Coverage

ウインドウ数（×103）

300

250

200

150

100

50

0

300

250

200

150

100

50

0

300

250

200

150

100

50

0

GC% of 100 Window Bins25 50 55 60 65 7045403530

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

GC% of 100 Window Bins45 70 75 80 8565605550

0.0

0.4

0.2

0.6

0.8

1.0

1.4

1.2

1.6

1.8

E. coli (51% GC) B. pertussis (68% GC)

C社 超音波破砕機 + HyperPrep HyperPlus Ⅰ社 キットN N社 断片化酵素 + N社 キットN

• タグメンテーションや他の酵素による断片化方法に比べて、少ないシークエンスバイアス• 物理的断片化と同等の性能• 少ないバイアスがより均一なシークエンスカバー率の実現とシークエンス費用の削減

C. difficile (29% GC)

GCバイアスの比較クロストリジウム ディフィシル（左）、大腸菌（中央）、百日咳菌（右）のGCバイアスを100bp binsの標準GC含量を計算して評価。Picard Collect GC Bias Metricsを使用し、C社 超音波破砕機 + HyperPrep、HyperPlus、Ⅰ社 キットN、N社 断片化酵素 + N社 キットN のワークフローに対するNormalized Coverageをbins上にプロットしました。ライブラリーは1ngのインプットDNAで調製。シークエンスバイアスがないので、すべてのbinsが均等に表されることになり、Normalized Coverageの1上に集中した水平分布で示されます。

最小バイアスのシークエンスカバー率

Cat.No. 　 包装単位 価格（税抜）

KK8510

KK8512

KK8514

KK8511

KK8513

KK8515

￥48,000

￥118,000

￥428,000

￥46,000

￥114,000

￥420,000

KAPA HyperPlus Kit 8回用

KAPA HyperPlus Kit 24回用

KAPA HyperPlus Kit 96回用

KAPA HyperPlus Kit（PCR酵素なし） 8回用

KAPA HyperPlus Kit（PCR酵素なし） 24回用

KAPA HyperPlus Kit（PCR酵素なし） 96回用

－20℃で6ヶ月

保存条件

キット内容

KAPA Frag 酵素KAPA Frag バッファー（10X）KAPA Frag コンディショニング溶液エンドリペア & A-テーリングバッファーエンドリペア & A-テーリング酵素ライゲーションバッファーDNA ライゲースKAPA HiFi HotStart ReadyMix（2X）※ライブラリー増幅プライマーミックス（10X）※

※PCR酵素なしのキットには含まれておりません。

KAPA HyperPrep Kit

6

• FFPEなどの微量DNAサンプルからのライブラリー調製に最適“ 1ng～”• サンプル調製時間の短縮 “ Total 2～3時間 ”（従来：約5時間）• 新組成バッファーによるライゲーション効率の更なる向上により、インプットサンプル“100ng～”の“PCRフリーライブラリー調製”が可能に• 全ゲノムシークエンス、ターゲットシークエンス、ChIP Seqなどの微量インプットサンプルに対応• ハイフィデリティーエンジニア酵素（KAPA HiFi）による増幅バイアスの低減でシークエンスカバー率を向上• アジレント・テクノロジー社 SureSelect XT ターゲットエンリッチメントシステムとの組み合わせ※により、WES（全エクソン解析）も可能　※ アジレント・テクノロジー社 SureSelect XTと組み合わせる際に必要な試薬についてはお問い合わせください。

変換率％

インプット量

0

5

10

15

20

25

30

35

40KAPA Hyper PrepI社N製品N社U製品

1 ug100 ng10 ng

End repair and A-tailing

Reaction Setup

SPRI cleanup

SPRI cleanup

Adapter ligation

Hands-ontime

5min 5min

0min 60min

0min 15min

15min 30min

0min 30min

15min 30min

～35min ～2.75h

Library Amplication

End repair

Reaction Setup

A-tailing

Adapter ligation

SPRI cleanup

SPRI cleanup

SPRI cleanup

Library Amplication

SPRI cleanup

SPRI cleanup

Totaltime

Hands-ontime

5min 5min

0min 30min

15min 30min

0min 30min

15min 30min

0min 15min

15min 30min

15min 30min

0min 30min

15min 30min

　～1.5h ～4.5h

Totaltime

一般的なライブラリー作製のワークフロー

（KAPA HTP LP Kitなど）

KAPA Hyper Prep Kitのワークフロー

• ライゲーション効率の向上による高いライブラリー収量• エンジニア酵素（KAPA HiFi）による低いDuplication Rateと 高いカバレッジを実現

KAPA Hyper Prep KitではインプットDNAを、より多くのアダプター付加済みライブラリーに変換させます。コバリスで断片化されたDNAから作成されたライブラリーは、アダプター・ライゲーション後に KAPA Library Quantification Kitにより定量されました（左図参照）。 KAPA Hyper Prep KitはDNAインプット量（10ng、100ng、1ug）に関わらず、最も高いアダプター付加済みライブラリーへの変換率を示し、より少ないサイクル数での増幅で1ugのライブラリーを作製することが出来ました。

• エンドリペアとA-テーリングの酵素反応を一元化し、SPRI精製なしでアダプターライゲーション反応へ

• One-TubeワークフローによりSPRI精製ステップを最小限に減らし、PCRフリーなら2時間以内、PCR増幅を必要とする場合でも3時間以内のハンズオン・タイムを実現

• 最小限の操作ステップにより、ライブラリー作製の一貫性と再現性を向上

ライブラリーの収量増大と シークエンス・クオリティーの向上

ライブラリー作製を3時間以内に！

KAPA HyperPrep Kitillumina社用ライブラリー調製キット

7

微量DNAサンプルからのターゲットキャプチャ

KAPA Hyper Prep Kit & SureSelect XT Kit

• 微量DNAサンプルからのエクソームキャプチャに最適 10ng～（初発DNA量10ng～で高品質データが得られる事を検証済）• FFPEおよび微量インプットサンプルのアプリケーションに対応• 96回用（KK8504）は自動化、マニュアルのどちらも使用可能　アジレント・テクノロジー社 Bravoにも対応可能（お問い合わせください）• ハイフィデリティーエンジニア酵素（KAPA HiFi）による増幅バイアスの低減でシークエンスカバー率を向上

アジレント・テクノロジー社

gDNAをCovarisで目的サイズに断片化

アダプタ付きDNA断片

ビオチン化cRNAベイトライブラリ

溶液中でハイブリダイゼーション

ストレプトアビジン磁性ビーズ

キャプチャされたDNAだけを回収、濃縮

シーケンシング

ワークフロー

使用製品

KAPA Hyper Prep ライブラリー調製キット（日本ジェネティクス）

WES（全エクソン解析）での使用例

SureSelect Target Enrichment plus Adapter TPFD-KB ILM, 96 or 96 Auto（アジレント・テクノロジー社）

NGS Kit

KAPA ライブラリー定量キット（日本ジェネティクス）

AMPure XPキット（日本ジェネティクス）

臨床データの豊富さや希少疾患( 腫瘍) への解析のため、FFPEサンプルのNGS解析が、今後、求められています。また、臨床シークエンスへの展開を考えた場合、過去の生検標本など微量なFFPE 標本からのDNAに対するNGS解析に適した方法の確立が必要になります。FFPE 標本からのDNAは、PCR duplicationが非常に多く（時には50％以上）、データの質も悪いから、、、と敬遠しておりましたが、KAPA Hyper Prep Kit のライブラリー構築の効率の良さは、驚くべきものでした。KAPA Hyper Prep Kit は、FFPEを用いての臨床シークエンスの手法に大きなインパクトをあたえることは間違いありません。特に、臨床シークエンスを考えた場合、生検のFFPEしか癌組織がないような状況が多々あり、KAPA Hyper Prep Kit だと、生検のFFPEの数スライスからのDNA（50-100ng程度）でも効率よくNGSライブラリーの構築ができる可能性があるので、非常に有望です。

理化学研究所 統合生命医科学研究センター ゲノムシーケンス解析研究チーム 中川 英刀様　前嶋 和紘様

ユーザー様の声

アジレント製品につきましては、アジレント・テクノロジー株式会社の販売となります。下記にお問い合わせください。

アジレント・テクノロジー株式会社本社／〒192-8510　東京都八王子市高倉町9-1 カストマコンタクトセンター　 0120-477-111

Cat.No. 　 包装単位 価格（税抜）

KK8500

KK8502

KK8504

KK8501

KK8503

KK8505

￥46,000

￥113,000

￥408,000

￥44,000

￥109,000

￥400,000

Hyper Prep Kit 8回用

Hyper Prep Kit 24回用

Hyper Prep Kit 96回用

Hyper Prep Kit PCR酵素なし 8回用

Hyper Prep Kit PCR酵素なし 24回用

Hyper Prep Kit PCR酵素なし 96回用

－20℃で1年間

保存条件

キット内容

• エンドリペア＆A-テーリング バッファー• エンドリペア＆A-テーリング 酵素• ライゲーションバッファー

• DNAライゲース• KAPA HiFi HotStart ReadyMix※• ライブラリー増幅プライマーミックス

※アダプターは含まれておりません。※磁気ビーズ”AMPure XP”は含まれておりません。※PCR酵素なしのキットには含まれておりません。

http://www.n-genetics.com　　info@genetics-n.co.jp

日本ジェネティクス株式会社

西日本営業所

本 社〒112-0004 東京都文京区後楽1-4-14 後楽森ビル18階Tel. 03（3813）0961 Fax. 03（3813）0962

〒600-8491 京都府京都市下京区室町通四条南入鶏鉾町493番地 ムーンバットビル6FTel. 075（353）8855 Fax. 075（353）8858

10PR1506J1K本製品はライフサイエンス分野における研究での使用を目的としています。仕様は2019年4月現在のものです。製品は改良のため予告なく変更する場合があります。

FastGene Adapter Kit

KAPA Dual-Indexed Adapter Kitデュアルインデックスアダプターキット

KK8720

KK8721

￥398,000

￥25,000

KK8722

KAPA Dual-Indexed Adapters 15μM & Sealing foils（3foils） 96インデックス×各20μL

KAPA Adapter Dilution Buffer 25mL

Cat.No. 　 価格（税抜）

単品

保存条件 -15～-25℃

KAPA Dual-Indexed Adapter Kitは、Illumina社のシークエンサー用のライブラリー調製に使用するためのアダプター溶液で構成されたキットです。各アダプターにはそれぞれ、複数のサンプルを同時にシークエンシングするためのサンプルインデックス配列（バーコード配列）が含まれています。DNAおよびRNAシークエンシングアプリケーション用のKAPAライブラリー調製キットと組み合わせて使用する事ができます。

特長以下を確認するためにqPCRやシークエンシングによる機能や品質の検証を行っています。• 最適なライブラリ調製効率• 最小限のアダプターダイマー生成• バーコードのクロスコンタミネーションのレベル

適用システムおよびアプリケーション本キットはIllumina社のシークエンサーによる以下のアプリケーション用のライブラリ調製に使用することができます。• HiSeqXにおけるヒト全ゲノムシークエンシング（human WGS）• ハイスループットのエクソーム解析、ターゲットシークエンス、RNAシークエンス• 微生物全ゲノムシークエンシングのようなその他のショットガンシークエンシング本キットに含まれるアダプター配列はメチル化されていませんので、Methyl-seqに使用する事はできません。

セレクションガイド

KAPA HyperPlus Kits 5ng以上 1μg未満（50ng未満は希釈が必要です）

KAPA HyperPrep Kits 5ng以上 1μg未満（50ng未満は希釈が必要です）

KAPA HTP or LTP "with-bead" Library Preparation Kits 1μg以下*

KAPA RNA-Seq+RiboErase HMR 要希釈　50-100ngの高品質RNAを除き、希釈が必要です

KAPA Stranded mRNA-Seq Kits 要希釈　50-100ngの高品質RNAを除き、希釈が必要です

* ほとんどのインプットサイズと断片サイズにおいて、希釈の必要がございます。

ライブラリ調整キット 15μM

KAPA Dual-Indexed Adapter KitKK8720：KAPA Dual-Indexed Adapters 15μM & Sealing foils（3foils） 96インデックス×各20μLKK8721：KAPA Adapter Dilution Buffer（25 mL）

お問い合わせください