Upload
trinhdan
View
218
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
İmmünolojik Açıdan
Transplantasyon Öncesi
Olmazsa Olmazlar
Dr. Fatma Savran Oğuz
İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi
Doku Tipleme Laboratuvarı
Sunum Planı
• İmmün yanıt
• HLA alelleri
• Anti HLA antikorları
– CXM (CDC-CXM, Flow CXM)
– PRA
– Luminex
– Virtual XM
• Non HLA antikorları
21. yüzyılda transplantasyonun önündeki en büyük engel transplante organın sağ
kalımını sınırlayan « immun yanıt»tır.
Donor spesifik antikorların varlığı (DSA) antikor ilişkili rejeksiyonu başlatan ve
allograft sağ kalımı etkileyen ana faktördür .
21. yy da Bireysel Tedavi
İmmün Tanıma
HLA moleküllerince sunulan yabancı peptidin T hücrelerince
tanınmasıdır.
–TCR
–Yabancı peptid
–MHC molekülü
hücresel hem de hümoral immün cevabı
ortaya çıkarırlar.
• T lenfositlerin tam olarak aktive olabilmesi için, antijen sunan hücre yüzeyinde bulunan,
• MHC/antijen kompleksinin, T cellreseptör (TCR)/CD3 tarafından tanınması ve ko-stimulatör yolakların aktive olmaları gereklidir .
İmmün Tanıma II
T hücreleri ve ASH arasındaki etkileşim;
B7
CD40
CD28
CD11a/CD18
ICAM-1
Hücre yüzey
molekülleri
İntersellüler
adezyon
molekülleri
Ligand-reseptör çifti ko-stimulatör
olarak görev görür.
B7/CD28/CTLA-4 ko-stimulatör yoludur.
CD28, B7 ligandına bağlanarak T hücrelerini aktive eder
• Bu aktivasyon T hücre çoğalması, sitotoksik lenfositlerin oluşumu ve
lenfokin/sitokinlerin üretimi ile sonuçlanarak immun reaksiyonları
potansiyalize eder
İmmun Yanıtın İnhibisyon ve
Regülasyonu;
• -TCR sinyalizasyonu inhibe ederek,
• - IL-2 üretimini bloke ederek,
• -T hücre siklusunu baskılayarak,
• -CD4+ CD25+ regülatör T lenfosit (Treg)
oluşumunu sağlayarak ,
• -T hücre anerjisine ve T hücre
apoptozisine yol açarak sağlanır.
HLA Molekülleri
HLA antijenlerinin temel rolü : - öz tanıma- sağkalım
Serolojik tanımlama:
Antijen grupları, antikorlarla verdikleri reaksiyon
değerlendirilerek belirlenir.
Moleküler tanımlama:
Aleller dizilimlerindeki (sekans) benzerliklere göre
gruplanır. Bu dizilim serolojik reaksiyonlar ile de ilişkilidir.
HLA Tiplendirme Yöntemleri
• Düşük rezolüsyonlu
– Allel grubunu belirler
– ör: HLA-A*01
• Orta rezolüsyonlu
– Sonuçta birkaç allel seçeneği birlikte verilir
– ör: HLA-A*01:01/01:02/01:03
• Yüksek rezolüsyonlu
– Allelik düzeyde tiplendirme
– ör: HLA-A*01:01
Ön ek ile gen ayrım çizgisi Null”(eksprese edilmeyen ) bir allel
ayırıcı Alan ayırıcısı
HLA ön eki
GEN
Allel grubu
Spesifik HLA proteini
Kodlanmayan bölgelerdeki Farklılıklar
Sinonim mutasyonu olan allel
• HLA gen bölgesi yüksek oranda polimorfik bir bölge olup, Sınıf I HLA alleleri (n=8.124)
ve sınıf II HLA alleleri (n= 2409) olmak üzere toplam 10.533 farklı alel içermektedir
(www.hla.alleles.org, 2013).
• HLA allellerinin sıklıkları ve dağılımları popülasyonlar arasında, etnik kökene göre
farklılık gösterir.
HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ HLA-DP
2313 3011 1985 1850 5995 480
Farklı HLA proteinleri
• Pekçok hasta HLA uyumsuz veriden nakil olmaktadır
• Her uyumsuz HLA antijeni antikor oluşumuna yol açmaz
• graft rejeksiyonuna neden olmaz
1. non-immunogenik HLA uyumsuzluğunu ön görebilmek mümkün müdür?
2. Özellikle sensitize hastalar için kabul edileblir veya edilemez uyumsuzlukları
antikor testleri yapmadan tespit etmek mümkün müdür?
Türkiye’deki sağlıklı bireylerle yapılan
çalışmalarda, en sık rastlanan doku
grupları
HLA-A; A2, A24 ve A3
HLA-B; B35, B51, B44
HLA-DRB1; DR11, DR4 ,DR13
• Bazı doku grupları toplumlarda yaygın, bazıları
nadir rastlanan bir kalıtım şekli gösterir
0
5
10
15
20
25
30
35
40
19,4
17,93
10,3
9,95
20,65
13,53
13,21
11,18
9,55
30,17
9,72
HLA-DQB1*02:01
HLA-DQB1*03:01
HLA-DRB1*07:01
HLA-DRB1*11:01
HLA-DRB1*11:04
HLA-C*07:01
HLA-C*04:01
HLA-B*35:01
HLA-B*51:01
HLA-A*24:02
HLA-A*02:01
HLA Alel Sıklıkları
HLA-A1 HLA-A2 HLA-A3
anti-HLA-A1
Her bir HLA antijeni, polimorfik amino asid
residüleri tarafından tanımlanan epitopları
sunar ve bunlara karşı da antikor oluşur.
Anti-HLA antikoru
Antijen havuzu, fenotip paneli=Panel reaktif antikor (PRA)
Spesifik bir donöre ait hücreler = Cross-match
Anti-HLA: HLA antijenine karşı oluşmuş antikor.
DSA: Donör spesifik antikor
Cross-match
PRA testi
Bir hastanın antikor durumundaki değişikliği
tespit etmenin en iyi yolu
hastadan her ay kan alıp,
antikor testi yapmaktır.
Hastalar, tercihen diyalizlerinin ertesi günü olacak şekilde,
6 aylık aralıklarla
anti-HLA antikor tayini için
kan vermek üzere yönlendirilmelidir.
Anti-HLA antikor testi için önerilen aralıklar,
3 ayda bir ya da 6 ayda bir
Antikor testleri
Hastaya kan takılması
halinde HLA laboratuarı
mutlaka bilgilendirilmelidir.
Örnek verme esnasında,
Enfeksiyon olması testi etkiler.
Kan takıldıktan 1 ay sonra antikor testi için
kan verilmelidir.
Nakil sonrası dönemde,
anti-HLA antikor tayini
pek çok laboratuarda rutin bir uygulama
olmamakla birlikte,
merkezler özellikle nakil sonrası
1., 7.,14.,21.,28. gün, 3.ay , 6. ay ve 12. aydaki
serum örneklerini toplamak konusunda
hassas olmalılardır.
• Hücresel yöntemler
– CDC
– Flow sitometri
• Solid faz immünoassay (soluble HLA molekülleri solid
yapıda matrikse bağlıdır)
– ELISA
– Luminex (C4 d assay, C1 q assay)
• Luminex teknolojisi düşük düzeydeki HLA spesifik antikor tayininde hem CDC hem de flow sitometriden daha sensitiftir
Anti HLA antikor tayini ve CXM
yöntemleri
CDC-XM
Yöntem olarak Serolojik HLA tiplendirilmesindeki ile aynıdır
Alıcının serumu bu kez vericinin lenfositleri ile inkübe edilir
DTT’li ve DTT’siz olarak iki ayrı plak hazırlanır
DTT IgM antikorlarını uzaklaştırır
CDC-XM, nakil sonrası
saatler/günler
içerisinde meydana gelen ve
allogreft rejeksiyonu
ile greft kaybı açısından
artmış risk ile ilişkili olan
düşük seviyedeki DSA’ları
tespit etmek için
yeterli hassasiyete sahip değildir.
Gebel HM et al. Am J Transplant, 2003
Daha hassas olan flow sitometri cross-match (FC-XM),
bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde kullanılan hücre tabanlı mevcut en iyi test olarak
kabul edilmektedir.
Flow Sitometri Cross-Match
Neden FCXM?
• Düşük düzeydeki HLA Sınıf I antikorlarını
• Sınıf II antikorlarını
• Antikorun hedef hücresini T- XM ve B XM
• Tüm IgG alt gruplarını saptar.
• Ig-G Antikorlar alt grupları vardır:
• IgG1 ve 3 kompleman aktivasyonunu güçlü
• IgG2 ve 4 zayıf aktive ederler.
• 1. ve 3. grup IgG reaktif özellikli
• 2. ve 4. grup IgG tolerans regüle ediciantikorlar denilir.
Flow XM
• Alıcının serumu ile inkübe edilen verici
lenfositlerine önce B ya da T hücresine
spesifik floresan işaretli marker eklenir
daha sonra 2. bir floresan boyaya sahip
anti Ig G ilave edilirT FCXM (+) olan testte
IgG-FITC histogramının
negatif ve pozitif
kontrolün IgG-FITC
histogramları ile
karşılaştırması
---- Negatif kontrol, -
--- Pozitif kontrol, ----
CM
T hücre ve B hücre pozitif –kontrendikasyon
anti sınıf I HLA antikorlarını gösterir; anti sınıf II HLA
antikoru da var olabilir?
T hücre pozitif- kontrendikasyon
Yalnızca B hücre pozitifliği-tartışmalı
- Sınıf II HLA-DSA
- Düşük seviyede Sınıf I HLA-DSA
- Enfeksiyon varlığı (1 ay sonra test tekrarlanır)
- HLA dışı antikorlar
- Spesifik olmayan bağlanmalar (yanlış
pozitiflik)
-Otoantikorlar (grefte zarar vermezler)
T hücre B hücre Yorumlama
Negatif Negatif HLA antikoru YOK veya çok düşük titre
Negatif pozitif Öncellikle Sınıf II antikoru
Negatif Zayıf pozitif Zayıf Sınıf I veya II antikoru
pozitif pozitif Kuvvetli Sınıf I antikoru veya Sınıf I ve
Sınıf II birlikte
pozitif Negatif non-HLA reaksiyonu ?
Flow Sitometrik XM reaksiyon paternleri
Transplantation Immunology methods and protocols 2013
Solid Faz Immunoassay-Luminex
Test serumu önce sınıf I ve sınıf II HLA antijeni kaplı mikroboncuklarlainkübe edilir
Test serumundaki mevcut HLA antikorları boncukların üzerindeki antijenlere bağlanır
Non HLA antikorlar ve immün kompleksler
Luminex sisteminde tespit edilmez.
DSA saptanması
• Tek antijen boncuk (SA bead) dayalı Solid faz yöntemleri
• Virtual Cross Match uygulaması
• SA bead’ ler ile saptanan tüm DSA’ lar klinik etkisi ??
• DSA’ ların patojenitesi arasında farklılık varsa
Zararlı / Zararsız ayırımı nasıl yapılacak?
• Fonksiyone graft
• Rejeksiyon Öngörü ?
• Graft kaybı
• DSA karakterizasyonu yapılabilir mi?
• Kompleman bağlayıcı DSA
• IgG alt sınıflaması
• Çalışma tasarımları ve sonuçlardaki heterojenitenedeni ile bu tekniklerin klinik uygulamalarda
nasıl kullanılacağına dair bir konsensus yok
Amico P. American Journal of Transplantation 2015
Luminex Modifikasyonları
• C4d assay– Kompleman fikse eden ve etmeyen antikorların
ayrımında kullanılır.
– Kompleman aktivasyonu gerekir ve komplemanregüle edici faktörlerden etkilenir
– CRP ligandlarına bağlandıktan sonra, kompleman 1 q'yu aktive eder, böylece klasik yoldan kompleman aktivasyonu gerçekleşebilir . CRP aynı zamanda kompleman aktivasyonunu regüleeden inhibitör protein olan faktör H'yi de aktive edebilmektedir .
– C4d+ antikorların varlığının böbrek ve kalp graft ömrü ile ilişkili olduğunu gösteren yayınlar mevcut
– C4d antikorlarının böbrek graflerinde AMR ile ilişkisi ??
– De nova DSA kötü graft survi ilişkisinin MFI ve C4d den bağımsız olduğu gösterilmiş
Luminex Modifikasyonları
• C1q assay
– Komplemana bağlanan ve klasik yolağı aktive
etme yeteneğine sahip antikorlar saptanır.
Kompleman aktivasyonu gerekmez
– Kompleman regüle edici faktörlerden
etkilenmez.
Standart miktarda hC1q hasta serumuna eklenir; sonra SAB’ler
eklenir; en son PE konjuge anti hC1q antikorları eklenir
Luminex Modifikasyonları
• C1q assay
– Daha çok IgG antikoru saptar (CDC’ den )
– Kompleman fikse eden IgM’ leri de saptar.
Kardiyak ve renal transplant rejeksiyon ve C1q antikor
ilişkisini gösteren yayınlar var.
HLA uyumu graft rejeksiyonu sonrası yüksek
sensitizasyonu önler
Transplantasyon sonrası De novo DSA ile kötü
graft sağkalım ilişkisi
Uygun olmayan Antijenler
• Anti-HLA antikorlarının tespitin de tek HLA
molekülleri ile kaplı solid faz immün (SFI)
test lerin kullanıma girmesi antikor tespitinde
öz güllüğü ve hassasiyeti artırmıştır.
Solid Faz İncelemeler ile anti HLA antikorları
(tek antijen) saptanır
Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı
Bir hastanın (özellikle yüksek
oranda sensitize hastaların)
hiç HLA antikoru oluşturmadığı
HLA antijenlerinin belirlenmesidir.
Eurotransplant’ta
HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ lokusları için
kabul edilebilir uyumsuzluklar
belirlenmektedir.
(Acceptable mismatch-EUROTRANSPLANT)
Acceptable mismatchKabul edilebilir uyumsuzluklar
pozitif
negatif
PRA %92
HLA: A1, A24, B7, B8 acceptable mismatch A24
HLA: A1, A2, B7, B18 acceptable mismatch B18
Hasta HLA: A1, A2, B7, B8
Kabul edilebilir uyumsuz antijenler
A2, A11, B7, B39, CW4
Kabul edilebilir uyumsuz antijenler hastanın serumunun
reaksiyon vermediği, yani antikor oluşturmadığı antijenlerdir.
%PRA
• Yüksek oranda sensitize hastalar, %85 ve üzeri oranda panel reaktif antikora sahiphastalar olarak tanımlanır.
• Eurotransplant Kalite Kontrol Programı aynı serumun %PRA değerinin farklı laboratuvarlar arasında %5-80 değişiklik gösterdiğini,
• HLA antikor spesifisitesinin ise oldukça uyumlu olduğunu ortaya koymuştur.
Yüksek oranda sensitize hasta
Paneldeki hücrelerin
%85’i ile pozitif veren
Virtual PRA
Donör popülasyonundaki antijen frekansına göre
Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı
Yüksek oranda sensitize hastalar: PRA %80-85XVPRA- cPRA –sanal PRA
Doxiadis IIN, Claas FHJ.Current Opinion Org Transplant, 2009
Sensitizasyon derecesini tanımlamanın en iyi şekli, bir
hastanın HLA antikorlarının bir donör popülasyonun da ki
hedef antijenlerin frekansına göre değerlendirilmesidir ki,
buna “sanal (virtual) PRA” denmektedir
(%PRA= % popülasyon reaktif antikorlar).
‘Gerçek PRA hesaplama Programına’http://eurotransplant.nl/cms/index.php
adresinden erişilebilmektedir.
Bir hastanın anti-HLA antikoru
geliştirdiği allellerin gen frekanslarının
bilinmesi ile geleneksel PRA değerinden
daha doğru bir şekilde anti-HLA
reaktivitesini yansıtan ‘(virtual) PRA
yüzdesi’ hesaplanabilmektedir.
Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı
Flow sitometri cross-match (FC-XM),
bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde
kullanılan hücre tabanlı
mevcut en iyi test olarak
kabul edilmektedir.
Anlamlı olmayan antikorların,
hücre yüzeyine
özgül olmayan bağlanmaları
nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar
ortaya çıkabilir
!!! !!!Wen R et al. Kidney Int, 2006
Yeni teknikler; Cross-match sonuçlarının
doğru bir şekilde öngörülmesini sağlama potansiyeline sahiptir.
VIRTUAL CROSS-MATCH BİR ÖNGÖRÜDÜR
Alıcının önceden karakterize edilmiş
antikor spesifitelerine dayanarak,
nihai cross-match sonuçlarının tahmin edilmesidir.
Tek antijen boncuklar kullanılarak
yapılan HLA- antikor testlerinden elde edilen
ayrıntılı HLA spesifitelerinin,
potansiyel bir donörün HLA doku tipi
ile karşılaştırılarak, ayrıntılı HLA spesifisiteleri
ve buna bağlı olarak kabul edilebilir/kabul
edilemez antijenlerin tanımlanarak, potansiyel bir
donörün HLA fenotipine görebu donörle yapılacak
nihai cross-match sonucunun öngörülmesine
VIRTUAL CROSS-MATCH denir.
Virtual Cross-Match
Hasta doku tiplemesiHLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP
Antikor tarama
PRA 0 Sensitize değil
negatif
Luminex/Flow tek antijen boncuklarHLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP
pozitif
Kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi
Donör HLA tiplemesiHLA-A, -B, -C, -DR, -DRw, -DQ, -DP
VIRTUAL CROSS MATCH
AKTÜEL CDC-XM --------------vXM
KORELASYON OLDUKÇA KÖTÜDÜR
Bunun sebebi, CDC-XM’in hassasiyet ve özgüllüğünün,
vXM için kullanılan antikor testlerininkindendüşük olmasıdır.
Vaidya S et al. Transplantation, 2006Nikaein A et al. Transplantation 2009
Virtual Cross-Match
AKTÜEL FC-XM --------------vXM
KORELASYON >%85
Virtual Cross-Match
Bunun sebebi, FC-XM’in hassasiyet ve özgüllüğünün,vXM için kullanılan antikor testlerininkine
benzer olmasıdır.
Vaidya S et al. Transplantation, 2006Nikaein A et al. Transplantation 2009
Nakilden 10 önce CDC XM ve Flow XM analizi yapılmalı
CDC (pozitif) hiperakut rejeksiyon
Flow XM (pozitif) graftı 1 yıl içine kaybetme riski var
ÖNERİLER
• Transplantasyon öncesi en az bir kez solid faz immunoassay ile anti HLA sınıf I ve II antikorları araştırılmalıdır.’
• ‘HLA-immünize hastalarda en az bir kez SAB (singleantigen bead) immunoassay uygulanmalıdır (özellikle Cw,DQA,DPA ve DPB’ye karşı gelişen ve diğer yöntemlerle gösterilemeyen antikorlar için) ‘
• ‘SPI yöntemle hücre bazlı yöntemlerle desteklenmeli ve SPI ile ölçülen antikor düzeyinin pozitif crossmatch’e yol açıp açmayacağı değerlendirimelidir’
• ‘Luminex teknolojisini kullanırken antijen yoğunluğu ya da boncuklar üzerindeki antijenlerin denatürasyonu gibi teknik faktörlerin sonuçları etkileyebileceği göz önünde bulundurulmalıdır
PRETRANSPLANTASYON GRUBU ÖNERİLERİ
– Antikor ve CXM sonuçlarına göre hastanın risk kategorisi belirlenmelidir
– Doğru CXM sonuçları doğru HLA tiplendirmesi ile ilişkili olduğundan donörün HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLADRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA, ve HLA-DPB tiplendirmesi yapılmalıdır
– CDC ile saptanmış DSA ve pozitif CXM (en yakın tarihli serumda) varlığında AMR ve graft kaybı riski yüksek olacağından transplantasyondan kaçınılmalıdır
– DSA pozitif ancak CDC CXM negatif hastalar yüksek riskli kabul edilmelidirler ancak transplantasyona kontrendikasyon sayılmamalıdır
– Eğer SAB ile tüm sınıf I ve II antikorlar negatifse prospektif CXM yapılmadan transplantasyon yapılabilir
– Kalp ve akciğer nakillerinde DSA pozitifliğinden kaçınılmalıdır (erken akut rejeksiyon riski); karaciğer, ince barsak ve adacık hücre nakillerinde DSA varlığı risk olarak algılanmalıdır
– HLA antikorlarının varlığı farklı zamanlarda alınan 2 serum örneğinde teyit edilmelidir
POST TRANSPLANTASYON GRUBU ÖNERİLERİ
– De novo DSA gelişimini takip edebilmek için tüm donörlerin DNA’sı ve alıcının pretransplantasyon serumu saklanmalıdır
– Düşük riskli hastalarda (nonsensitize, ilk transplantasyon)• Transplantasyon sonrası 3-12. aylar arası en az 1 kez DSA
bakılmalı
• Tedavi değişikliği planlanması, tedaviye uyumsuzluk şüphesi, graft disfonksiyonu gibi durumlarda DSA bakılmalı
• DSA pozitif ise BİYOPSİ yapılmalı
– Orta risk grubu ( Önceden DSA + ancak şu an -)• İlk 1 ay içinde DSA---------biyopsi
– Yüksek risk grubu (DSA+/XM -)• Transplantasyondan sonraki 3 ay içinde biyopsi ve DSA takibi
– Çok yüksek risk (Desensitize edilmiş)• Yakın DSA takibi ve 3 ay içinde biyopsi
Non HLA antikorları
• MICA antikorları??
• Angiotensin II tip I reseptör aktive edici IgG
• Self antijenlere karşı gelişen antikorlar
(Tubulin, Kollajen, Myosin, Vimentin )
• Anti-peroksizomal trans 2 enoly coA redüktaz
Endotel prekürsör hücreler ile FLOW XM
Cylex ImmunoKnow Cell
Function Assay
• CD4+ Hücre aktivitesini ölçmek
• Hücrenin bazal ATP ve uyarı sonrası ATP’ sini ölçüyor
Berlung D. Transp Immunol 2011
Gelecek
• Hücre içi sitokinler
• Tolerojenik Dendritik Hücreler
• T supresör hücre uyarımı
• Transkriptomik çalışmaları, ekspresyon
analizleri, RNA dizileme
• HLA tetramer boyama ile HLA spesifik
B hücre saptanması