IMOBILIZACIJA AKTIVNIH TVARI ZA BIOLOŠKO PREPOZNAVANJE

• ENZIMI• ANTITIJELA• RECEPTORI• MIKROORGANIZMI• ŽIVOTINJSKE ILI BILJNE STANICE• ŽIVOTINJSKA I BILJNA VLAKNA

KLJUČNI PROCES PRI IZRADI BIOSENZORA –IMOBILIZACIJA BIOLOŠKE TVARI - NAJČEŠĆE

ENZIMI

• IMOBILIZACIJA NE SMIJE NARUŠITIAKTIVNOST BIOLOŠKI AKTIVNE TVARI

• IMOBILIZACIJSKO SREDSTVO SLUŽI KAO NOSIOC BIOLOŠKO AKTIVNE TVARI

• SLUŽI KAO SREDSTVO KOJE POVEZUJE ANALIT I MJERNI PRETVORNIK

•

VRSTE IMOBILIZACIJE

Imobilizirani enzim

uklopljeni vezani

ugradjeni u gelili polimerna vlakna

inkapsulirani kovalentno vezaniadsorbirani na nosac

na nosac na enzim(poprecno vezanje)

VRSTE IMOBILIZACIJA

• FIZIČKE METODE IMOBILIZACIJE

• KEMIJSKE METODE IMOBILIZACIJE

FIZIČKE METODE IMOBILIZACIJE

• ADSORPCIJA• OSTVARUJE SE VEZANJEM NA NOSIOC:

– VAN der WALSOVIM PRIVLAČNIM SILAMA– DIPOL-DIPOL INTERAKCIJE– VODIKOVOM VEZOM

Jakost vezivanja ovisi o:pH, temperaturi, ionskoj jakosti otopine, polaribilnosti

Mehanizmi adsorpcije

• Adsorpcija i desorpcija su pod kontrolom prijenosa mase (za slučaj otopine koja se ne miješa)

• n- množina tvari molekula koje se adsorbiraju• Co- koncentracija proteina u otopini• D- difuzijski koeficijent

tDCdtdn π/0=

• Photo-micrograph of a alcohol dehydrogenaseadsorbed to glass beads.

KEMIJSKA IMOBILIZACIJA

• UKLAPANJE U GELU

• KOVALENTNA IMOBILIZACIJA ENZIMA NA POVRŠINI ELEKTRODE

• IMOBILIZACIJA ENZIMA U KARBON PASTI

• IMOBILIZACIJA ENZIMA U ELEKTROKEMIJSKI FORMIRANIM VODLJIVIM ORGANSKIM POLIMERIMA

UKLAPANJE U GELU

• IMOBILIZACIJA ENZIMA = IMOBILIZACIJI PROTEINA• NAJČEŠČE SE PRIMJENJUJE KEMIJSKA IMOBILIZACIJA

ENZIMA I INERTNOG PROTEINA POMOĆU GLUTARALDEHIDA

• PROTEINI:

• ALBUMIN (BSA, CSA)• ŽELATINA• ALGINAT

MATRIČNI POLIMERI

• POLIVINILAMIN• POLIAKRILAMID• POLIVINILPIROLIDON• ANORGANSKI POLIMERI• VODLJIVI POLIMERI

IMOBILIZACIJA ALBUMINA

kolagen NH2 + COH (CH2 ) 3 COH + H2N enzim

enzimCH3)2(CHNkolagen CH N

IMOBILIZACIJA ENZIMA UKLAPANJEM U UMREŽENU FOTOPOLIMERNU STRUKTURU

POLIVINILPIROLIDONA (PVP)

+

N. ........

..

.

.N...

SO 3H

HO 3S HO 3Shv

SO 3H

N3

N3

.

.

.

ON.

ON.

ON.

ON

.

.

.

ON.

ON.

ON.

ON

NH

NH

.

.

.

O N.

O N.

O N.

O N

SO 3H

HO 3S

PolivinilpirolidonNitren4,4-Diazostilben-2,2-disulfonska kiselina

fotoumrezeni PVP

IMOBILIZACIJA U FOTOPOLIMERU-POLIAKRILAMIDU (PAA)

N

O

O

OC

O

CCH2

CH3

+ H2N enzyme

CH3

CH2 C

O

C NH enzyme

enzymeNHC

O

CCH2

CH3

+ CH2 C

O

CH NH2

CH2 OCCH 2HN )( n CHC

CH3

CONH

enzyme

)( m

VODLJIVI POLIMERI

• POLIMERIZACIJA ISTOSMJERNOM STRUJOM-ELEKTROKEMIJSKO GENERIRANJE

• POLIPIROL POLITIOFEN

n

N

H

n

S

• POLIANILIN

c

N

H

n

MEHANIZAM NASTANKA VODLJIVIH POLIMERA

• polipirol

N

H

o ks id a c ija n a p o v rs in i e le k tro d e

H

N

-e

N

HH

N

+

N

H

+ +

+

H

N

+ 2 H +

N

H

H

N

N

H

H

N o ks id a c ija n a p o v rs in i e le k tro d e

e - +

N

H

H

N

+

H

N

++

N

H

H

N

N

H

+

N

H

H

N+

H

N

+

N

H

H

N N

H

+2 H+

u k la p a n je a n io n a iz e le k tro litao ks id a c ija p o lim e ra ;p ro p a g a c ija la n c a ;

N

H

H

N

+

m

N

H

H

N

1 .

2 .

3 .

4 .

5 .

6 .

Anorganski polimeri

• Pd-gel

FeCH

CHHC

HCCH

CH CH

CHHC

HC CH

CHFe

Pd

Pd

Cl Cl

ClCl Cl Cl

ClCl

Pd

Pd

FeCH

CHHC

HCCH

CH Pd

ClCl

Pd

Cl Cl

Anorganski gel dobiven uporabom silana-kovalentna imobilizacija

OH

OH

OH

Cl

Cl

Cl

+ Si (CH2)n 2CH X

O

O

O

Si )2(CH n X

• Kovalentna imobilizacija pomoću silana odvija se u dva stupnja:

• 1. Aktivacija površine mjerne elektrode• 2. Vezanje enzima na aktivna mjesta mjerne elektrode

• Metalne elektrode prekrivene slojem oksida (Pt/PtO, Au/AuO) reagiraju s diklordimetilsilanima Cl2Si(CH3)2_

nastaju MOSi veze

Electron micrograph of a calcium-alginate bead.

Vodljivi polimeri koji se dobivaju kemijskim postupcima

• -poliacetilen

• -polifenilen

• -poli(fenilen sulfid)

• -poli(fenilkinon)

Ostale imobilizacije

• -imobilizacija u karbon pasti

• -imobilizacije u zeolite i keramičke materijale (clays)

IMOBILIZACIJA AKTIVNOG TKIVA

• – NEDOSTATAK:• SPORI ODZIV SENZORA OD NEKOLIKO

SATI

• – PREDNOST:• DUGOTRAJNA ENZIMSKA AKTIVNOST

Elektrode pogodne za imobilizaciju enzima