IMUNOKEMIJSKE METODE

Protitelesa ali imunoglobulini so proteini, ki jih organizem proizvede kot odziv na telesu tujo

molekulo, imenovano antigen. Antigeni so po svoji naravi proteini, polisaharidi, nukleinske

kisline, pa tudi manjše molekule. Metode, pri katerih izkoriščamo za identifikacijo proteinov

interakcijo protiteles z antigeni, ki so povzročili njihov nastanek, imenujemo imunokemijske

metode. Lastnost teh metod je njihova visoka specifičnost in občutljivost.

Protitelesa proizvajajo limfociti B, pridobimo pa jih lahko iz seruma imuniziranih živali z

afinitetno kromatografijo. Ker na ta način pridobimo heterogeno zmes protiteles, taka

protitelesa imenujemo poliklonska protitelesa. Druga možnost pa so monoklonska protitelesa,

ki jih pridobimo iz monoklonske hibridomske celične linije, ki nastane s spajanjem

mielomskih celic (oblika B celičnega tumorja) z limfociti B. Proces poteka v prisotnosti

polietilenglikola, ki povzroča fuzijo membran. Klon tako nastalih hibridnih celic oz.

hibridomov podeduje nesmrtnost po mielomski celični liniji, po limfocitu B pa sposobnost

tvorbe protiteles. Take celice se neomejeno delijo, proizvajajo pa specifična protitelesa, ki so

usmerjena proti eni antigenski determinanti (epitopu).

V skupino imunokemijskih metod uvrščamo tudi prenos proteinov na membrano (glej

poglavje Barvanje in detekcija elektroforetskih lis) in točkovni prenos (glej Naloga

Točkovni prenos).

Precipitacijske tehnike

Pri precipitacijskih tehnikah ugotavljamo reakcijo med protitelesi in topnim antigenom, pri

tem pa nastane viden imunski kompleks (precipitat). Le-ta nastane na mestu, kjer se vzpostavi

optimalno razmerje med antigeni in protitelesi (t. i. cona ekvivalence).

Pri dvojni imunodifuziji (imunodifuziji v dveh dimenzijah) poteče reakcija v tanki plasti

agarja, ki ga nalijemo na predmetnico. Vanj izdolbemo vdolbinici, v eno nanesemo raztopino

antigena in v drugo raztopino protiteles. Ploščico inkubiramo 1 – 2 dni v vlažni komori. Obe

raztopini difundirata v gel in tam, kjer se vzpostavi njuno optimalno razmerje, se med seboj

povežeta in tvorita precipitacijsko linijo. Le-te lahko naredimo vidne z barvilom za barvanje

proteinov (npr. Commassie blue). Metoda lahko zaznava koncentracije med 0,1 in 10 mg/mL

protiteles ali antigenov, z njo pa lahko enostavno spremljamo protitelesne odgovore pri

imuniziranih živalih. Z omenjeno metodo lahko določamo tudi istovrstnost, delno istovrstnost

(navzkrižno reaktivnost) in neistovrstnost antigenov ali protiteles.

Antigene, ki so prisotni v bolj kompleksnih mešanicah proteinov, kot so serum ali bakterijski

in alergeni ekstrakti, lahko analiziramo z imunoelektroforezo, pri kateri gre za kombinacijo

elektroforeze in gelske difuzije. Antigene najprej ločimo elektroforetsko, nato pa v gel

naredimo režo, v katero nanesemo protitelesa. Po 18-urni inkubaciji opazimo več t. i.

precipitacijskih lokov, kjer je prišlo do nastanka kompleksov med antigeni in protitelesi.

Tehniko se uporablja za analizo čistosti proteinskih vzorcev (npr. izoliranih monoklonskih

protiteles) ter za določanje sestave in antigenskih lastnosti proteinov.

Testi imunskega določanja

Teste imunskega določanja (angl. Immunoassay) so razvili v zadnjih 50 letih, s pojavom

monoklonskih protiteles pa se je ta tehnologija še dodatno razmahnila in izpodrinila klasične

imunske metode. Značilnost omenjenih testov je, da vključujejo standardne pripravke, ki

omogočajo kvantitativno vrednotenje, imunske komplekse pa označimo z radioaktivnim,

encimskim ali fluorokromnim označevalcem. Občutljivost testov imunskega določanja je zato

približno 1000 x večja kot pri klasičnih imunskih testih. Najbolj znana sta radioimunski (RIA)

in encimskoimunski test (EIA). Teste imunskega določevanja izvajamo v tekoči ali na trdi

fazi, delimo pa jih na kompetitivne in nekompetitivne. Kompetitivni testi temeljijo na

tekmovanju med vezavo protiteles na določeno znano količino označenega antigena na eni in

neznano količino neoznačenega antigena (vzorca) na drugi strani (Slika 37). Isti princip

obstaja za merjenje antigena z označenim in neoznačenim (vzorčnim) protitelesom. Pri

nekompetitivnih testih imamo samo eno komponento (vzorec).

Radioimunski test

Radioimunski test (angl. RIA – radioimmuno assay): je izredno občutljiva laboratorijska

metoda za določanje antigenov, hormonov, zdravil ipd. v organizmu. Za njeno izvedbo

potrebujemo snov, ki jo določujemo, v kemijsko čisti obliki. Nanjo vežemo radioaktivni

označevalec (izotop). Beljakovinske molekule navadno označujemo z jodom 125 (I125),

nebeljakovinske pa s tricijem (H3). Prvi je sevalec gama, drugi pa beta, radioaktivnost, ki jo

oddajata pa merimo s scintilacijskimi števci in jo izrazimo v števkih na minuto.

Encimsko imunski test

Encimsko imunski test (angl. ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay): je ena izmed

najbolj uporabnih metod za določanje prisotnosti antigenov ali specifičnih protiteles v

testiranih vzorcih. Kadar v vzorcu določamo specifična protitelesa, govorimo o posredni

(indirektni)ELISI, kadar pa določamo prisotnost antigena, govorimo o sendvič ELISI. Testi

se izvajajo v mikrotitrskih ploščah.

Pri testu ELISA za določanje protiteles na mikrotitrsko ploščo najprej vežemo plast antigena

(Slika 36). Nevezan antigen speremo, nato pa v vdolbinice dodamo vzorec, ki vsebuje

protitelesa proti vezanemu antigenu. V zadnji stopnji vezana protitelesa označimo s

sekundarnimi protitelesi ali drugimi specifičnimi ligandi (npr. proteinom A), ki imajo

kovalentno vezan encim. Po dodatku kromogenega substrata pride do nastanka obarvanega

produkta.

Slika 36: Shema izvedbe testa ELISA za določanje protiteles. (1) vezava antigena, (2)

spiranje, (3) vezava testnih protiteles, (4) spiranje, (5) vezava liganda, (6) spiranje, (7)dodatek

kromogenega substrata, (8) razvijanje barve.

Pri testu ELISA za določanje protiteles (t. i. sendvič ELISI) je potrebno pripraviti vsaj dve

monoklonski protitelesi, ki prepoznata različna epitopa na površini antigena (Slika 37).

Imunska reakcija poteka v dveh stopnjah. V prvi stopnji na površino mikrotitrske ploščice

adsorbiramo protitelo, ki mora biti tako specifično, da v izbranem vzorcu selektivno veže le

antigen, ki nas zanima. Protitelo mora imeti tudi veliko afiniteto za antigen, da je test čimbolj

občutljiv. Nato dodamo izbran vzorec (antigen), v drugi stopnji pa z encimom označeno drugo

protitelo, ki je prav tako specifično za antigen (detektorsko protitelo).

Slika 37: Shema testa ELISA za določanje antigena. Leva slika prikazuje kompetitivni test

ELISA (1), desna pa t. i. sendvič ELISA test (2).

Encimi, ki jih pri ELISI najpogosteje uporabljamo, so: hrenova peroksidaza (HRP), alkalna

fosfataza (AP) in -D-galaktozidaza (-GAL). Nastale komplekse po dodatku kromogenega

substrata določimo spektrofotometrično. Kromogen je namreč brezbarvni substrat, na

katerega deluje encim, zaradi česar se pojavi obarvan produkt. Količina razgrajenega substrata

je sorazmerna količini encima, vezanega na kompleks Ag – Ab. Če si pripravimo umeritveno

krivuljo z znano koncentracijo standarda, je metoda primerna tudi za kvantitativne meritve.

Naloga: TOČKOVNI PRENOS

Točkovni prenos oz. odtis (angl. dot blot) je zelo soroden prenosu Western ((glej poglavje

Barvanje in detekcija elektroforetskih lis), od njega pa se razlikuje po tem, da proteinov ne

ločujemo s pomočjo elektroforeze, temveč jih na membrano nanesemo neposredno v obliki

točke oz. kroga. Pri črtovnem prenosu (angl. slot blot) vzorec nanesemo v obliki črte. Na

vajah s pomočjo točkovnega prenosa določi goveje IgG v vzorcih mleka.

Uvod

Zaradi nižje cene kravjega mleka proizvajalci ovčjega in kozjega sira ter dobavitelji mleka

mešajo ovčje ali kozje mleko s kravjim. Kontrola avtentičnosti ovčjega in kozjega mleka je

zato potrebna zaradi kontrole surovin pa tudi za zaščito potrošnika, saj mora biti deklaracija

na proizvodu skladna z njegovo kvaliteto. Dodatek kravjega mleka lahko ugotovimo s

pomočjo protiteles, ki specifično vežejo goveje IgG. Na nitrocelulozno membrano bomo

najprej vezali proteine iz vzorca, prosta mesta pa blokirali. Nato bomo dodali raztopino

protiteles, označenih s hrenovo peroksidazo, ki reagirajo z govejimi IgG. Po dodatku substrata

bodo vezana protitelesa na membrani vidna kot obarvne lise.

Material:

nitrocelulozna membrana,

vzorci (kravje, ovčje in kozje mleko),

2 % raztopina Tweena v pufru PBS,

kunčja protitelesa proti govejim IgG,

substrat (3-amino-9-etil karbazol v dimetilformamidu),

0,05 M acetatni pufer, pH 5,

pufer PBS,

bidestilirana voda.

Postopek:

Priprava vzorca

1. Vzorec mleka 10x redči s pufrom PBS.

Točkovni prenos

1. Na nitrocelulozni membrani s kemičnim svinčnikom označi 3 mesta v razdalji najmanj 1,5

cm.

2. Nad oznake previdno (da ne poškoduješ membrane) nanesi po 5 μL vzorca mleka. Počakaj

približno 5 minut da se membrana posuši.

3. Za blokiranje prostih mest membrano zmoči v destilirani vodi in jo namoči v 2 % raztopini

Tweena ter na stresalniku inkubiraj 15 minut.

4. Membrano potopi v raztopino protiteles, redčenih 1 : 1500 s pufrom PBS in 15 minut

inkubiraj na stresalniku.

5. Membrano 3x speri z bidestilirano vodo.

6. Membrano potopi v raztopino barvnega reagenta (raztopina aminoetil karbazola in

acetatnega pufra), ki mu tik pred uporabo dodaš 30 μL H2O2. Inkubiraj toliko časa, da se

membrana na mestu, kjer se nahaja antigen, rdeče obarva. Raztopino barvnega reagenta nato

previdno odlij in membrano speri z bidestilirano vodo ter jo posuši na zraku.

Rezultat:

Komentiraj lise na membrani!