IMUNOLOGIA - docente.ifsc.edu.brdocente.ifsc.edu.br/rosane.aquino/MaterialDidatico/CulturaCelulas/... · O trabalho laboratorial em Imunologia envolve três tipos principais de risco

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IMUNOLOGIA

ManualdeapoioàsSessõesLaboratoriais

Fevereiro,2017

CarlosSinogas

IMUNOLOGIA2016/17 2

ÍNDICEPROCEDIMENTOSDESEGURANÇA..........................................................................................................................................3

Riscoquímico/radiológico/biológico........................................................................................................................3RegrasePlaneamento..........................................................................................................................................................4Procedimentosgerais............................................................................................................................................................5

REGISTOSERELATÓRIOS............................................................................................................................................................6ANTICORPOSMONOCLONAIS.....................................................................................................................................................7

Introdução..................................................................................................................................................................................7Imunização.................................................................................................................................................................................7FusãoCelular............................................................................................................................................................................8SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológica..................................................................................................................8ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutoras.....................................................................................................9CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonais......................................................................................9EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais...........................................................................10

PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS.............................................................................................................................................111. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES..............................................................................................................112. TESTEÀIMUNIDADENATURAL...........................................................................................................................163. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL........................................................................................................................................194. RECOLHADESANGUE...............................................................................................................................................20PreparaçãodoSoro.............................................................................................................................................................20PreparaçãodeEritrócitos................................................................................................................................................21

5. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(Humanas)...............................................................................226. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–Precipitaçãodiferencial.......................................................237. IMUNOPRECIPITAÇÃO-Qualitativa....................................................................................................................24Testedoanel..........................................................................................................................................................................24Testeemlâmina...................................................................................................................................................................25

8. IMUNOPRECIPITAÇÃO–Quantitativa................................................................................................................26Curvadeprecipitação........................................................................................................................................................26

9. IMUNODIFUSÃO...........................................................................................................................................................27Imunodifusãosimples........................................................................................................................................................27Imunodifusãodupla(Ouchterlony).............................................................................................................................28

10. HEMAGLUTINAÇÃO....................................................................................................................................................2911. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(Rápido)...................................................................................................3012. IMUNOELECTROFORESE..........................................................................................................................................3113. ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)............................................................................................32“Checkerboard"....................................................................................................................................................................32Teste..........................................................................................................................................................................................35RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA..............................................................................................................38

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PROCEDIMENTOSDESEGURANÇAOtrabalholaboratorialemImunologiaenvolvetrêstiposprincipaisderiscoqueimportaconsiderar.Oriscoquímico,oriscobiológicoeoriscoradiológico.Quasetodosospaísestêmregrasprópriasparaabordarestetipodequestõesquesecolocamàexperimentaçãolaboratorial.Tambémoslaboratóriosondeotrabalhosedesenvolveadoptampráticasapropriadasaotipodetrabalhoqueaísedesenvolve.

Nãosepretendendodiscutiremdetalheosprocedimentosdesegurançalegalmenteexigíveis,apontam-seapenasalgumasregrasgeraisepráticaslaboratoriaisaseradoptadas.

Apesardequalquerdostrêsriscosindicadoscolocaremproblemasespeciais,querequeremprecauçõesdetipodiferente,existeumconjuntodeprecauçõeseprocedimentosdesegurançaaplicáveisatodosequedeverãoserobservadosnotrabalholaboratorialdoâmbitodaimunologia.

Asregrasqueadianteselistamconstituemumquadrogeralnoqualosprocedimentosespecializados,decorrentesdassituaçõesparticularesqueseindicam,deverãoserenquadrados.

Riscoquímico/radiológico/biológicoOsprodutosquímicosempreguesnosensaiosimunológicosdistribuem-sepordiversostiposassociadosadiferentesriscosparaooperador.Quandoapropriado,osriscosconhecidosdosreagentesaempregarserãoindicados,devendoentãoseradoptadasasregrasespecíficasmaisaconselhadas,comosejaousodeluvasouóculos,trabalhoemhotte,etc.

AspráticasprevistasnoâmbitodestadisciplinanãofarãousogeneralizadodereagentesperigososoudegranderiscoconhecidoparaaSaúdeHumana.

Detodososriscosassociadoscomostrabalhosdeimunologia,omaisemotivo,quenãonecessariamenteomaissério,éaradioatividade.Aocontráriodosoutrosreagentesquímicos,oscompostosradioativos,porestefato,nãopodemservistosesãoisentosdecheiro,nãosemanifestandoosseusefeitosnoimediato.Asregrasparaamanipulaçãodeprodutosradioativossãobastantemaisrigorosasetornam-semuitomaisrestritivasaotrabalhoadesenvolver.Àsexigênciasparamanipulaçãodestesprodutosnotrabalho,acrescemprocedimentosparticularesparaaeliminaçãodosresíduosemonitorizaçãodaspessoaseambientesenvolvidos.

Ostrabalhosaexecutarnoâmbitodestadisciplinanãofarãousodereagentesououtroscompostosradioativos.

Todasasamostrasdeprodutosbiológicosdevemserconsideradaspotencialmenteinfecciosas,emparticularasquesãoprovenientesdoHomem,emqueumaeventualbarreiradeespécienatransmissãodosagentesinfecciososnãoexiste.Asoutrasespéciesanimaismaisusadasemtrabalhosdeimunologia,oscoelhos,oscaprinoseosroedores,sãomamíferosafastadosdoHomemquenãorepresentamqualquerameaçasignificativaparaaspessoasquetrabalhamnoslaboratóriosdeimunologia.

Emqualquerdoscasosconvémterpresentequeasprincipaisviasdetransmissãodeinfecçõesocorrememgolpesabertosououtrassoluçõesdecontinuidadenapeledasmãosdooperador,porpicadacomagulhascontaminadasouporinalaçãodeaerossóis.Époristoqueéfortementerecomendadoque,quandosetratedetrabalhodiretocomamostrasbiológicas,nãoexistamgolpesnasmãosdooperadorquenãotenhamsidopreviamenteprotegidoseconvenientementeimpermeabilizados.

Otrabalhoadesenvolvernaspráticasdadisciplinanãofarãousodesorosououtrosmateriaisbiológicosdeorigemhumana,casoemqueprecauçõesespeciaisteriamdesertomadasparaminimizaroriscodeassociadoaosagentesinfecciosostransmissíveispelosanguehumano,comoosagentesdaSIDAoudasHepatites.Emtodoocasoésempreaconselhávelconsiderartodososmateriaisbiológicosaempregarcomopotencialmenteinfecciososparaooperadoreadoptaraspráticasmaisadequadasaocenáriodo"piorcaso".

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AdicionalmenteháqueconsiderarqueotrabalhopráticodecorreránolaboratóriodeMicrobiologia,ondemicrorganismosdediferentestipossãomanipuladosporoutraspessoas.Apossibilidadedecontaminaçãodassuperfícieseoutrosmateriaistambémdeveráserconsiderada.

RegrasePlaneamentoParaalémdosriscosparaooperador,queatrássereferem,asexperiênciasqueserealizarãosãocertamentenovidadeparaalgunsdosestudantes,comexperiêncialaboratoriallimitadaerotinasdeboaspráticaslaboratoriaisnãoestabelecidas.Importa,porisso,prevenir.

Éboapráticaobservar,cumprirefazercumprirasregras,procedimentosecomportamentosqueseindicam:

Bata

Ousodeumabatacomprida,limpaedevidamenteajustadaaocorpoéindispensávelsemprequeseopereemlaboratório.Abataprotegeooperadoreoseuvestuáriodeeventuaisacidentes.Idealmenteabatadeveráserusadaapenasnolaboratório,sendovestidaàentradaedespidaàsaída.Destaforma,alémdeprotegeroexperimentador,abataminimizaotransportedepotenciaisagentesinfecciososparaoexteriordolaboratório.

Mãos

Àentradaeàsaídadolaboratórioéprecisolavarbemasmãoscomabundanteáguaesabão,tambémparaminimizarpotenciaiscontaminaçõescruzadas.Dependentedotipodeprodutosamanipular,ousodeluvasimpermeáveis,máscarasououtrasproteções,poderáserexigível.Mesmoquandonormalmentenãorecomendado,ousodeluvaspoderásernecessárioemsituaçõesdesoluçãodecontinuidadenapeledasmãosdooperador.

Comerebeber

Éexpressamenteproibidocomer,beber,fumar,manipularlentesdecontatoouaplicarcosméticosduranteaexecuçãodeexperiênciaslaboratoriais.Usarsemprepipetasmecânicas,nuncapipetarcomaboca.Éaconselháveladquirirohábitodemanterasmãoslongedaboca.

Bancadadetrabalho

Olocaldetrabalhodeveráestarsempredevidamentelimpo,paraoqueseimpõeprocederàlimpezadabancadaantesdeiniciadosostrabalhos,paranãopermitiracontaminaçãodasprópriasexperiênciascommicrorganismosdesessõesanteriores,edepoisdasmanipulaçõesterminadasparaminimizarapotencialpropagaçãodeagentesinfecciososcontaminantesdosmateriaisbiológicoscomqueseoperou.

Livrosecadernos

Sóépermitidolevarparaabancadaomaterialdeapoioestritamenteindispensávelàexecuçãodotrabalho,comooprotocoloexperimental,umblocodenotasouumcadernoeumlápis.Todososrestantespertencesdooperador,comopastas,casacosousacosdeverãoseracondicionadosemlocalpróprio,antesdeiniciadaaexperimentação.

Materiais

Todooequipamentoematerialdelaboratórioamovível,utilizadoduranteaexperimentação,deveráserrepostonolocalindicadodepoisdeconcluídaasuautilização.Particularmenteosmateriaisquetenhamcontatadocomamostrasdeorigembiológicadeverãoserrejeitadosemlocalpróprioparadescontaminação.

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Acidentes

Qualqueracidentedeveráserdeimediatoreportadoaoresponsávelpelasessãodetrabalho.Líquidosououtromaterialbiológico,inadvertidamentetransferidosparaforadoscontentoresaquesedestinamdeverãoserdeimediatodesinfectadoscomoapoiodoresponsável.

Planeamento

Nãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdosprocedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodososrecursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepelaprevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.

Procedimentosgerais

Todososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodacontaminaçãodomaterialemusoeaformaçãodeaerossóisourespingos,numaperspectivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeumconjuntoderegrasaobedeceréapresençadebomsensonostrabalhosarealizar.Émuitoimportanteusaracabeçaantesdasmãos.

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REGISTOSERELATÓRIOSÉconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamosapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturaparaeventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosfacilitarãoaaprendizagem,ainterpretaçãodosresultadosobtidosearedaçãoposteriordorelatóriodotrabalho.

Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossíveloprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjectivodorelatorredigirumdocumentocompreensívelparaoleitoresusceptíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaemidênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintessecções:

Título Identificadordoconteúdodorelatório

Resumo Pequenotextodequeconstemosobjectivosalmejadoseasconclusõesobtidas

Objectivo Razãodeserdotrabalhorealizado

Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciarelatada

Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho

Materialereagentes

Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado

Protocoloexperimental

Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadososprocedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesviosrelativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito

Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos

Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos

Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjectivo,decorrentedosresultadosobtidos

Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasuarepetiçãoououtrasconsideradasadequadas

Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho

Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,algumasdassecçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoeconclusões",porexemplo

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ANTICORPOSMONOCLONAIS

Introdução

Anticorposmonoclonaissãoimunoglobulinashomogéneascomespecificidadedefinida,possíveisdeproduziremlargasquantidades.PodemserobtidasporimortalizaçãodelinfócitosB,clonadoseexpandidosemculturascelularescontínuas(anticorposmonoclonaispropriamenteditos)ouporrecombinaçãodeDNA,expressonoutraslinhascelulareseucarióticas(anticorposmonoclonais“engineered”).

Em1975KöhlereMilsteindescobrirameempregarampelaprimeiravezatecnologiadoshibridomas:fizeramcombinaromaterialgenéticodecélulasnormaisprodutorasdeanticorposcomodecélulasdeorigemmalignadamesmalinhagem.Iniciaramentãoumanovametodologiaquedesdeentãonãoparoudeevoluireconduziuaodesenvolvimentodatecnologiaparaaproduçãodequantidadesvirtualmenteinesgotáveisdeanticorposcomníveisdepurezanuncaantesatingidos.Trata-sedeumatecnologiadeaplicaçãohorizontalemtodasasáreascientíficasdaBiologia,cujoimpactosóécomparávelaodatecnologiadarecombinaçãodoDNA.

OsanticorpossãoproteínasproduzidasporlinfócitosB,destinadasaintervirnosprocessosdedefesaimunitáriadosorganismossuperiores:asimunoglobulinas.Têmcomoprincipalcaraterística,numaperspectivadeaplicaçãocientífica/biotecnológica,acapacidadedeseligaremaoantigénioquereconhecem.Atualmente,paraasuaobtenção,recorre-sequaseexclusivamenteàchamadatecnologiadoshibridomasparaapreparaçãodeanticorposmonoclonais.

Oshibridomassão,comoonomeindica,célulashíbridas,imortalizadasemculturadetecidos,produtorasdeanticorposmonoclonaiscomespecificidadeúnicaepré-determinadapeloprocessodasuapreparação.

Noprocessoclássicoparaaobtençãodehibridomasutilizam-secélulasdebaçodemurganhosimunizadoscomoantigénioquesepretendereconhecer.Esteslinfócitosativadossãofundidoscomcélulasdemielomadamesmaorigemanimal,mutantesnãoprodutoresdeimunoglobulinas,napresençadepolietilenoglicol.Ascélulasentãofundidassãocultivadasemmeioseletivo(contendoHAT)emcondiçõesquedeterminamapenasasobrevivênciadoshíbridosformadosentrelinfócitosecélulasdemieloma.Oshibridomascomascaraterísticaspretendidas,nomeadamentenoqueserefereàespecificidadeantigénica,taxasdeproduçãoecrescimentoetipodeimunoglobulinasãoselecionadospormétodosimuno-enzimáticosepreservadosporclonagemecongelamento.Acaraterizaçãodoanticorpoproduzidoeodesenvolvimentodoprocessoparaasuaproduçãoemlargaescaladependemdosobjectivosfinaisdoinvestigador.

ImunizaçãoOprocessodeimunizaçãodestina-seaconseguirlinfócitosBativadosparaparticiparnafusãocelular.Aespécieanimaleórgãosdondepodemserobtidos(baço,timo,nóduloslinfáticos,sangueperiférico),bemcomoosprotocolosdeimunizaçãodoanimaldependemdaorigemdoantigénio,dasuaimunogenicidadeedodestinoadaraosanticorposapreparar.

OmurganhoBalb/C,espécieanimaldereferência,éaquemaisfrequentementeéutilizadanaobtençãodeanticorposmonoclonais,porsetratardeumanimalpequeno,defácilmanutençãoemanipulaçãonolaboratório,comumsistemaimunitáriobastantebemconhecidoeparaoqualexistemdisponíveislinhascelularesdemielomaadequadasàobtençãodehibridomashistocompatíveiseenxertáveisnoanimal.

Oesquemadeimunizaçãoaadoptardependetambémdotipoeorigemdoantigénioedotipodeanticorpospretendidos.EmgeralumaadministraçãoúnicadeantigénionomurganhoconduzàobtençãodeumamaiorpercentagemdeIgMrelativamenteaIgG.Noqueserefereaoslinfócitosprodutoresespecíficosobtêm-seemmaiorabundâncianobaçonasequênciademúltiplasadministraçõesdeantigénio.Paraantigéniossolúveisdeelevadopesomolecular,éregraproceder-seaumaimunizaçãoemdosesrepetidasdeantigénio,separadasentresicercadetrêssemanasaummês.

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Aeficáciadoprocessodeimunizaçãoéavaliada2semanasapósumadasúltimasadministrações,poranálisedotítulodosorodoanimalemanticorposcapazesdereconheceroantigénio.AexpansãoclonaldoslinfócitosB,induzidapelapresençadoantigénio,determinaumaconcentraçãomáximadaquelascélulas,produtorasdeanticorposespecíficos,nobaçodoanimal2a3diasapósaadministraçãodoantigénio.

Paraoutrotipodeantigénios,previsivelmenteeliminadosdoorganismopormecanismosemqueosistemaimunitárionãodesempenhaopapelprincipal,comosãooscasosdemoléculashidrofóbicas,hidrofílicasdebaixopesomolecularoufracaantigenicidade,énecessáriorecorreràadiçãodeoutroscompostosqueiniciemarespostaimunitária(haptenos,“carriers”).

FusãoCelularAfusãoentreascélulasdeumamistura,destinadaaimortalizaroslinfócitosprodutoresdeanticorpos,podeocorrerespontaneamente,mascomumamuitobaixaprobabilidade.Paraaumentaressaprobabilidadeintroduzem-seoutrosagentesnamisturadecélulas.

Ascélulasdobaçodosanimaisimunizadossãorecolhidasemisturadascomcélulasdemieloma,damesmaespécieanimal,nãoprodutorasdeanticorposeportadorasdasmutaçõesHGPRT-ouTK-.Ascélulasdamistura,quandonapresençadeagentesfusogénicos,comoproteínasdovírusSendai,PEGoucampoeléctrico(electrofusão,electroporação),fundemosseusconteúdos,determinandooaparecimentodehíbridosintra-einterespecíficos.Aimortalizaçãodoslinfócitos,emparticularquandosetratadecélulasdeorigemhumana,podetambémserconseguidaportransformaçãocomvírustumorigénicos(EBV).

SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológicaApósoprocessodefusãoobtém-seumamisturadecélulasdediversostipos:linfócitosecélulasdemielomanãointervenientesemqualquerfusão,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumlinfócito,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumacélulademielomaehíbridosresultantesdafusãodecélulasdemielomacomlinfócitos.Nascondiçõesdeculturasubsequentesnãosobrevivemoslinfócitosoriginaiseoshíbridosentrelinfócitos,pornãoteremcapacidadeparacresceremculturanaausênciadosconvenientesfatoresdecrescimento.Ascélulasdemielomaeoshíbridosresultantesdefusõesentreestastambémnãopoderãosobreviver,dadoque,apesardepossuíremacapacidadedecresceremcultura,sãoportadorasdemutaçõesdasenzimasHGPRToudaTKe,napresençadeaminopterina,nãoconseguemsintetizarosprecursoresparaasíntesedoDNA.Sópodemcresceremculturaoshíbridosentrecélulasdemielomaelinfócitosquehajamadquiridoacapacidadedecresceremcultura,dosprimeiros,eacapacidadedesintetizarosprecursoresdoDNAatravésdasviasmetabólicasqueutilizamaHGPRTeaTK,provenientesdoslinfócitos.Sãooshibridomas.

Osmétodosimunológicosparaadeteção,quantificaçãoecaraterizaçãodasimunoglobulinasincluemaimunoprecipitação,ensaiosimuno-enzimáticos,imuno-radiométricosedeimuno-fluorescênciaecromatografias.Particularmentenoqueserefereàseleçãoinicialdoshibridomasresultantesdafusãoimpõe-seaadopçãodemétodosderápidaexecução,aplicáveisacentenasdeamostrasedecustosreduzidos.

Deentreoshibridomasresultantes,háqueidentificaraslinhascelularesprodutorasdeanticorposespecíficosdoantigénio.OsmétodosmaisfrequentementeutilizadosnestaseleçãoimunológicasãoaELISA("EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay"),RIA("RadioImmunoAssay"),IRMA("ImmunoRadio-MetricAssay"ou"Sandwich")eImuno-fluorescência.Ométododeprimeiraescolha,aELISA,baseia-senumafixaçãodoantigénioaumsuportesólidoseguidadoreconhecimentodestepelosanticorposproduzidospeloshibridomas.Apresençadosanticorposespecíficoséreveladaporoutrosanticorpos,específicosdaespécie(domíniosconstantesdasimunoglobulinas),econjugadoscomenzimascapazesdealterarascaraterísticascromáticasdeumsubstrato.Sãoselecionadasasculturascujossobrenadantesapresentemreaçãoenzimáticapositivanoensaio.

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ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutorasUmavezidentificadasasculturasprodutorasdosanticorposconvenientesháquepreservá-lase,frequentemente,caraterizá-lasantesdasuautilizaçãoparaaproduçãodosanticorposmonoclonais.

Apartirdomomentoemquepelaseleçãoimunológicasãodetectadoshibridomasprodutores,estasculturasdeverãosercongeladas,mesmoantesdaclonagem,paraevitarasuaperda.

Sendooshibridomascélulaspoliploides,têmumatendêncianaturalparasegregaroscromossomasquepossuememexcesso,razãopelaqualseriaconvenientemanterumapressãoseletivaparapreservaroDNAresponsávelpelasíntesedosanticorpos.Nãoexistindoqualquerantibióticooumetabolitoquepossaexercerestapressãoseletiva,amanutençãodaexpressãoéconseguidaatravésdaclonagem,processoparaisolamentoeexpansãodeumaculturaapartirdeumasócélula.

Ométodomaisexpeditoparaaclonagemdoshibridomaséaclonagempordiluiçãolimite,emqueaculturaédiluídaedistribuídapormicroplacasemconcentraçõesinferioresaumacélulaporpoço.Outrosmétodos,comoaclonagememagarosesãomenosfrequentementeutilizadosporquemaislaboriosos.

Oshibridomas,talcomooutrascélulaseucarióticasestabelecidasemcultura,podemconservar-seporcongelaçãoemazotolíquido,ondesemantémviáveisduranteváriosanos.

CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonaisAcaraterizaçãodoanticorpoobtidoconstituiumrequisitoessencialparaasuaconvenienteutilização.

Aisotipagem,queconsistenadeterminaçãodotipodeimunoglobulinapresente,obtêm-seporreaçãoimunológicacomanticorposdeoutraespécieanimalespecíficosdosdiferentestiposdecadeiasconstantesdemurganho(IgA,IgM,IgG1,IgG2,...).

Aespecificidadeepitópicarelativadediferentesmonoclonaiscontraomesmoantigéniodetermina-seporensaioimunológicoemquecomumaquantidadefixadadeantigéniosefazemreagirmisturasdeanticorposemdiferentespercentagensrelativas.Doisanticorposreconhecerãodiferentesepitoposseumamisturadosdoisoriginaumsinalsuperioraodequalquerdelesisolado,nasaturaçãodoantigénio.

Tambémaafinidaderelativadeumanticorpoparaoantigéniopoderáserrelevante.Determina-sefazendoreagiroantigénio,radioativamentemarcado,comumadeterminadaquantidadedeanticorpo.Oantigéniofixadoporunidadedemassadoanticorporefleteaafinidadeentreosdois,nascondiçõesexperimentaisusadas.Estaquantidadedeantigénio,quandoreferidaaunidadedevolumedosobrenadantedaculturadorespectivohibridoma,constituiumindicativodaprodutividadedestacultura.

Oconhecimentodascaraterísticasfísico-químicas,comoamassamoleculare/ouopontoisoeléctricopoderãoserimportantesparaodesenhodorespectivoprocessodepurificação.

Partindodelinhascelularesdehibridomasprodutores,osanticorposmonoclonaispodemobter-seporculturadecélulas“invitro”epurificaçãoapartirdosobrenadante(comrendimentosdaordemdos100µg/mL)ouapartirdeascitesesorosdeanimaisportadoresdetumoresinduzidospelainjeçãodosrespectivoshibridomas(rendimentosdaordemdos2mg/mL).

Sãométodosdeeleiçãoparaapurificaçãodeanticorposmonoclonaisascromatografiasdeafinidade,nomeadamentecomaProteínaASepharose,sesetratardeimunoglobulinastipoG,oucomoantigéniofixadoaumsuportesólido.

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EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais


PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS

1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES

Introdução

Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.

Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadeinicialdosestudantesparaamanipulaçãoadequadadasmicropipetas,paraumraciocíniooperacionalsobrediluições(emespecialquandoexpressasempotênciasde10)enasformasdeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.

Materialereagentes

¾ Soluçãosaturadadeazul-de-metileno¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos¾ Espectrofotómetro

Procedimento(porgrupo)

Diluiçõesdecimais

1. Marquemicrotubosde1a82. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8Solvente(mL) 0 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,5Corante(mL) 1,5 0,15 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,

namesmacuvete.Últimaamostra:controlo).

Diluiçõescentesimal

1. Marquetubosdeensaiode1a62. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6Solvente(µL) 0 1500 1500 1500 1500 1500Corante(µL) 1500 15 0 0 0 0Soluçãoprecedente(µL) 0 0 15 15 15 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos


5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete.Últimaamostra:controlo)

Diluiçõesdetrêsemtrês

1. Marquetubosdeensaiode1a10)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Solvente(mL) 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1,5Corante(mL) 1,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamais

diluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete)

Diluiçãoúnica(TPC)

¾ Considerandosotrabalhosanteriores,desenheumprotocoloparaarealizaçãodetesteadiluiçõesmilesimais.¾ Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenofaçaoscálculosparaprocederàpreparaçãode5mLde

cadaumadasseguintessoluções,indicandoosvolumesausar:a. Diluiçãode5x102b. Diluiçãode5x10-2

Preparaçãodesoluções(TPC)

¾ Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosamisturarparaasuapreparaçãonolaboratório:

a. NaOH0,1Nb. SO4H20,1Nc. NaCl0,1Md. NaCl100mMe. Glicerol10%(fórmulaC3H8O3)f. Glucose10%(fórmulaC6H12O6)g. Etanol70%(fórmulaC2H6O2)

Pesosatómicos:H=1;C=12;O=16;Na=23;S=32;Cl=35.


RegistodeObservaçõeseResultados

PIPETAGENSEDILUIÇÕES

Operador: Data: ____/____/____

Diluiçõesdecimais

Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações

1 2 3 4 5 6 7 8

Diluiçõescentesimais

Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações

1 2 3 4 5 6

Diluiçõesdetrêsemtrês Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentração

calculada Observações

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


Gráfico

Observações:


SOLUÇÕES

Operador: Data: ____/____/____

Componentes Peso/volume

Diluição5X102

Diluição5X10-2

NaOH0,1N(100mL)

H2SO40,1N(100mL)

NaCl0,1M(100mL)

NaCl100mM(100mL)

Glicerol10%(100mL)

Glucose10%(100mL)

Etanol70%(100mL)

Observações


2. TESTEÀIMUNIDADENATURAL

Materialereagentes

¾ SuspensãodeMicrococos¾ Sorofisiológicoestéril¾ Lisozimapó¾ Espectrofotómetroetubos¾ Pipetasemicropipetas¾ Placasdepetricomagarnutritivo

Procedimentoexperimental

TesteàLisozima(1grupoporturma)1. Preparar8diluiçõesdecimaisdelisozima,emmicrotubos:

Tubo L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10Lisozimapó(mg) 100 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) 1000 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900Diluição 2. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboL93. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana4. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma5. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadaamostraa540nm(tempo0)6. Incubara37ºC7. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.8. Expressarosresultadosemgráfico.


TesteàSaliva(restantesgruposdaturma)1. Recolhercercade2.5mLdesalivaemplacadepetriesterilizada2. Preparardiluiçõesdecimaisdesaliva,emmicrotubos:Tubo S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6Saliva(µL) 1000 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) - 900 900 900 900 900 900Diluição 3. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboS54. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana5. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma6. Avaliarmortebacterianaporcultura:

a. Tomarparaeppendorfsnovos100µLdostubospar(S0;S2;S4;S6);b. Incubara37ºCdurante30minutosc. Inocularporespalhamentoemplacadeagarnutritivo;d. Incubara37ºCdurante,pelomenosumanoite;e. Contarcolónias

7. Avaliaramortebacterianapordensitometria:a. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadadiluição(S0;S1;S2;S3;S4;S5;S6)a

540nm(tempo0)b. Incubara37ºCc. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.

8. Expressarresultadosemgráfico.9. Avaliaraconcentraçãorelativadebactericidinasnasalivaporcomparaçãocomocontrolopositivo

delisozima


Registoderesultados

TESTEÀIMUNIDADENATURAL

LISOZIMA Absorvência

Tempo(min)

L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10

0

10

20

30

40

SALIVA Absorvência

Tempo(min)

S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6

0

10

20

30

40

Crescimentobacteriano(nºcolónias)

S0 S2 S4 S6

Observações


3. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL

Materialereagentes

¾ Galinhas¾ Excipienteoleoso(AdjuvantedeFreund,Parafinalíquida)¾ Soluçãodeantigénio(BSAa10mg/mLemSF)¾ Seringaseagulhashipodérmicas


Preparaçãodaemulsãoparaimunização

1. Adicionar5mLdesoluçãodeantigénioemtubodeensaio2. Adicionar5mLdeadjuvanteoleoso3. Misturarvigorosamente,comauxíliodeumaseringacomagulha4. Verificaroestadodaemulsãocomumagotasobreasuperfíciedeáguafria

(nãodevemisturar-sedeimediato)

Imunização

Dia1 Recolheramostradesangueparateste

Injetar1mLdeemulsãoporviasubcutâneaemdiversospontos(4a6picadas)



Repetirainjeçãodamesmaquantidadedeantigénioemulsionadoemadjuvanteincompleto

Dia45 Recolhersangueparaanálise

Dia60 Recolhersangueparaanálise

Registartodososdadosdeidentificaçãodosanimais,volumesdesangueesoro,datasdasoperaçõeseoutrasocorrências

Observações


4. RECOLHADESANGUE

PreparaçãodoSoro

Materialereagentes.

¾ Animaisimunizadose/ounãoimunizados(galinhas)¾ Seringasestéreis¾ Centrífuga¾ Microtubos¾ Azidadesódioa10%


1. Picaraveiajugularouaveiadaasaetomaramostradesangueporaspiração(máximo2mL)2. Compensaroanimalcomsorofisiológicoestéril,senecessário3. Marcarotuboehomogeneizarosanguerecolhido.4. Aguardarde20a30minutosatemperaturaambiente5. Arrefecernofrigoríficodurante1hora6. Centrifugar4000rpmdurante10min7. Pipetaraté1mLdesoroporcadamicrotubodevidamenteidentificado8. Adicionarazidadesódioa0,02%final(sock100X)9. Conservarcongeladoa-20ºC.

Observações


PreparaçãodeEritrócitos

MaterialeReagentes

¾ Soluçãoanticoagulante(ACD):o Acidocítrico–4.0g/Lo Citratodesódio–22,6g/Lo D-Glucose–22.0g/L)o Autoclavar

¾ PBS-A¾ Seringas(2,5mL)eagulhaspararecolhadesangue¾ Centrífugadebaixarotação


1. Pipetar300µLdesoluçãoACDparatubosEppendorf(2porgalinha)2. Tomarosanguevenosodaveiajugularoudaasadagalinha(até2,0mLporave)3. Removeragulhadaseringa4. AdicionarimediatamenteacadatuboACDcercade0,9mLdesangue5. Homogeneizarsuavementeporrotação6. Transferirosangueparatubodecentrífugacontendo10mLdePBS-A(pipetaPasteur)7. Centrifugar500gX10minutos8. Removerosobrenadante9. Lavarmaisduasvezesascélulascom10mLdePBS-A,homogeneizandosuavemente10. Ressuspenderosedimentodecélulascom5mLdePBS-A11. Avaliarhematócrito(10%v/v)12. Conservara4ºC

Observações


5. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(HUMANAS)

ColoraçãodeWright

Materialereagentes

¾ Sanguetotalcapilar,fresco¾ SoluçãodeWright(corante)¾ Soluçãotampão(6.63gKH2PO4;2.56gNa2HPO4;H2Oad.1L)¾ Lâminasdemicroscópionovas(lavadasedesengorduradas)

Procedimentoexperimental(individual)

(Trabalhoindividualaefetuarcomoprópriosangue)1. ColocarIgotadesanguefrescoa1/3daextremidadedalâmina2. Espalharuniformementeaamostracomauxíliodeoutralâmina(veresquema)3. Deixarsecaraoar4. CobriroesfregaçocomsoluçãocorantedeWright5. Deixaratuardurante2minutos6. Adicionarigualvolumedesoluçãotampão7. Homogeneizarmovimentandoocorantecomjactodeardepipeta8. Deixaratuardurante3a4minutos

(asmargensdeverãoapresentarumacoravermelhadaeocentroumbrilhometálicoesverdeado)9. Removerocoranteporlavagememáguacorrente.Lavaralâminacomáguadestilada10. Deixarsecaraoar.Observaraomicroscópio.Registarobservações,desenhandoeidentificandoos

diferentestiposdecélulas

Observações


6. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–PRECIPITAÇÃODIFERENCIAL

MaterialeReagentes

¾ Soroapurificar¾ SoluçãosaturadadeSulfatodeamónioemágua¾ PBS-A(pH7,2)

o 0,8%NaClo 0,02%KH2PO4o 0,144%Na2HPO4.2.H2O

¾ Microtubos¾ Mangadediálise

Procedimentoexperimental(porgrupo)

1. Pipetar500µLdesoroapurificarparamicrotubo2. Adicionar400µLdesulfatodeamóniosaturado(40-45%)3. Misturareconservarnogelodurante30minutos4. Centrifugar5minnaeppendorf5. Pipetarerejeitarosobrenadante6. Escorrerbemotubo7. Dissolverosedimentocom250µLdePBS8. DialisarcontraPBS-Acontendo0,02%deazidadesódio,pelomenosduranteumanoite9. Recuperaroconteúdodamangadediálise10. Congelara-20ºC.

Observações


7. IMUNOPRECIPITAÇÃO-QUALITATIVA

Testedoanel

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Glicerola10%¾ Microtubosdeensaioemvidro¾ Micropipetas


1. Equilibrartodasassoluçõesetubosa37ºC2. Pipetar200µLdesoroatestare/ouimunoglobulinasparaofundodotubo3. Adicionar20µLdeglicerol,homogeneizandocomapipeta4. Pipetar200µLdesoluçãodeantigénioparaasuperfíciedosoro,cuidadosamenteesemmisturar

asfases5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeumprecipitadoemanelnazonadainterfaceentreasduassoluções

Observações


Testeemlâmina

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Lâminasdemicroscópio¾ Micropipetas


1. Equilibrartodasassoluçõeselâminasa37ºC2. PipetarIgotadesoluçãodeantigénionocentrodeumalâmina3. PipetarIgotadesoroatestarsobreagotaprecedente4. Repetircomasimunoglobulinaspurificadas5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeprecipitado7. Registarobservação

Observações


8. IMUNOPRECIPITAÇÃO–QUANTITATIVA

Curvadeprecipitação

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar(diluídoa1:10)¾ Soluçãodeantigénio(1mg/mL)¾ PBS-A¾ Microtubos¾ Micropipetas


1. Preparardiluiçõesdoantigénio:10-0,3X10-1,10-1,3X10-2,10-2,3X10-3,PBS2. Pipetar200µLdesoroatestaremcadatubo3. Repartir200µLdecadadiluiçãoportubo4. Misturarnovortex5. Incubaremestufaa37ºCduranteumahora6. Centrifugar2minutos7. Observareregistarosníveisdeprecipitadoemcadatubo

(quantificarosprecipitadospordeterminaçãodoazotooupesagemdossedimentosapesoseco)8. Definiropontodeequivalênciadosororelativamenteaoantigénio

Observações


9. IMUNODIFUSÃO

Imunodifusãosimples

MaterialeReagentes

¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas

¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%

¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)

¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)

¾ Lâminasdemicroscópio


1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseparaerlenmeyerb. Adicionar9mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Adicionar1mLdesoluçãodeantigénio.Homogeneizar.e. Aplicarcuidadosamenteemcadalâminaumaquantidadequepermitaumaalturade

±2a3mm(5mLporlâminademicroscópio)f. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalg. CompipetaPasteurtruncadaperfuraraagarose(~1,5mmØ)em3locais

equidistantesecentrados.Removeroagarcortadoporaspiração2. Ensaio

a. Distribuirasamostrasdesorosouimunoglobulinasatestarpelosorifícios(~15µLporpoço)

b. Cobriralâminacomfilmeplásticotransparentec. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora

3. Observaraprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração(senecessário)

a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Observareregistarosresultados

Observações


Imunodifusãodupla(Ouchterlony)

MaterialeReagentes

¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas

¾ Soluçãodeantigénio10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%


¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)



1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseb. Adicionar10mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Aplicarcuidadosamenteemcadalâmina5mLdegel(±5mmdealtura)e. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalf. Perfuraraagarose,conformeàilustração(empontosequidistanteseseparadosde1

cmdoorifíciocentral).Aspiraroagarcortadocompipeta.2. Ensaio

a. Encheroorifíciocentralcomsoluçãodeantigéniob. Colocaremcadaumdosoutrosorifíciosvolumesiguaisdesoroatestare

imunoglobulinaspurificadas(nãodiluídoediluídoa1:10)c. Cobrirlâminacomfilmeplásticotransparented. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora

3. Observarlinhasdeprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração

a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Secaroagarcompapelabsorvente(compressãoprolongadacommúltiplascamadas

deabsorvente)5. Observareregistarosresultados

Observações


10. HEMAGLUTINAÇÃO

MaterialeReagentes

¾ Eritrócitosdegalinhalavados¾ Sorosatestar¾ Soluçãodeantigénio(10mg/mL)¾ PBS-A¾ Tubosdevidropequenosdefundoredondo


1. Ressuspendersuavementeoseritrócitoslavados;2. Tomar1mLdesuspensãohomogéneaparatudodecentrífuga;3. Centrifugar500GX10minutos;4. Removererejeitarosobrenadante;5. Ressuspenderascélulascom1mLdePBS-A6. Porcadasoroatestar,marcar4tubosedistribuir:

1 2 3 4

PBS-A(µL) 200 100 100 -Suspensãodeeritrócitoslavados(µL) 200 200 200 200Soluçãoantigénio(µL) - - 100 100Soroatestar - 100 - 100

Controlocélulas

Controlosoro

Controloantigénio TESTE

7. Agitarsuavementeostubosparamisturaroconteúdo8. Repousaratemperaturaambienteatéàsedimentaçãodascélulas(verificarsedimentação

completaemtubo1)9. Observareregistarosresultadosemtodosostubos

Observações


11. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(RÁPIDO)

MaterialeReagentes

¾ Amostraatestar¾ Dispositivoimunocromatográficodescartável


1. Tomarodispositivoedeixaraqueceràtemperaturaambiente2. AplicarIIIgotasdaamostraaestudarnoreceptáculodaamostra3. Observaramigraçãodaamostrapelamatriz4. Observaraformaçãodeumaouduasbandascoradas5. Registaraobservação

Observações


12. IMUNOELECTROFORESE

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa

10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV

(ouII)¾ Azidadesódio10%¾ Barbitaldesódio

(Veronal)0,2M

¾ Tampãobarbital(2X):- Barbitaldesódio0,2

M-50mL- HCl0,2M-6,0mL- H2Odestiladaad100

mLpH8,6


¾ Soluçãodescoranteo Ác.acéticoglacial10%o Metanol-50%



Preparaçãodogel

1. Pesar0.15gdeagarlavadoouagaroseparaerlenmeyer2. Adicionar5mLdeáguadestilada.Fundiremfornodemicro-ondas.Arrefeceracercade50ºC3. Adicionar5mLdeT.Barbital2X.Misturar.4. Posicionarperpendicularmenteàlâminaopenteparaformaçãodospoçosdeaplicação5. Aplicaremcadalâmina5mLdesoluçãodeagar1,5%6. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontal.Removeropente

Electroforese

1. Adicionaracadaamostradesoro20%deglicerol50%2. EncherosdepósitosdoseléctrodoseospoçosdogelcomT.Barbital3. Aplicaraamostradesoroatestarsobotampãodebarbitalemcadapoço4. Colocaralâminanatinadeelectroforese.5. FazeraspontesentreoseléctrodoseogelcompapeldefiltroembebidonoT.Barbital6. Cobriralâminacomlarfilm,sembolhasdear7. Aplicaracorrenteeléctrica(8mAporlâmina)durante30minutos8. Removeralâminaecorar

Coloração

1. CorarogelcomazuldeCoomasie2. Diferenciaremsoluçãodescorante.3. LavaremPBS4. Observareregistarosresultados

Observações


13. ELISA(ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY)

“Checkerboard"

Materialereagentes

¾ MicroplacasparaELISA(2X8poços)

¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL(BSA)

¾ Soroatestar¾ 2°.Anticorpo

Soroanti-galinhaconjugadocomperoxidase(diluídoemTampãodebloqueio1:5000)

¾ TampãodeFixaçãopH9,6-0,159%Na2CO3-0,293%NaHCO3-0,02%NaN3

¾ TampãodeBloqueio-5%LeiteempódesnatadoemPBS-A

¾ TampãodeLavagempH7,2-0,8%NaCl-0,02%KH2PO4-0,144%Na2HPO4.2.H2O-0,05%Tween20

¾ TampãodeSubstratopH5,0-1,118%Na2HPO4-0,56%Ácidocítrico

¾ SoluçãoOPD(extemp.)OPD(O-fenileno-diamina)-20mgH2O2-10μlTampãodesubstrato--60mL

¾ 4NH2SO4


1. Marcar8tuboseppendorf(1a8)2. Fazerdiluições:

Tubo(filas) 1 2 3 4 5 6 7 8Tampãodefixação(mL) 1 1 1 1 1 1 1 1Antigénio–BSA10mg/mL(mL) 0,5 - - - - - - -Soluçãoprecedente(mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -

3. Usartodosospoços(de1a8)detrêsfilas(A...H)deumamicroplaca4. Distribuir100µLdecadadiluiçãoparaorespectivopoçodecadaumadastrêsfilasdamicroplaca

(exemplo:colunasA,B,C;poçosdasfilas1a8)5. Anotarasdiluiçõesdeantigéniodecadapoçoutilizado6. Incubar4ºCdurante,pelomenos,24horas,aoabrigodadissecação7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez8. Fazerasdiluiçõesdosoroausar:

Tubo(colunas) A B CTampãodebloqueio(μl) - 900 900Soroatestar(μl) 1000 100 -Soluçãoprecedente(μl) - - 100

9. Distribuir100µLdecadatuboparaospoçosrespectivosdastrêscolunasdamicroplaca10. Incubar37ºCdurante30minutos(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação11. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez12. Distribuir100µLdasoluçãodo2ºAnticorpoporcadapoçodamicroplacautilizado(Cadagrupo

utilizadiferentessoluçõesdiluídas-1:1000;1:2000;1:5000;1:7500;1:10000)13. Incubar37ºCdurante30minutos,aoabrigodadissecação14. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez


15. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço16. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,observandoatéaosurgimento

decornalgunsdospoços17. Adicionar50µLdeH2SO4emcadapoço18. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura

autónoma)19. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço20. DefinirasmelhoresconcentraçõesdeantigénioeanticorpoausarnotestedeELISAarealizarcom

ossorosdecadagrupo


Registoderesultados

Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)

1 2 3 4 5 6 7 8

Soro 1

Coluna

1:10

1:100

1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0

Antigénio


1 2 3 4 5 6 7 8

Soro 1

Coluna

1:10

1:100

1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0

Antigénio


1 2 3 4 5 6 7 8

Soro 1

Coluna

1:10

1:100

1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0

Antigénio

Observações


Teste

Materialereagentes

(osmesmosqueparaCheckerboard)¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ Soroatestar¾ 2ºAnticorpo-GACIG-HRPO

Diluircadasoluçãodeacordocomosresultadosdaexperiênciaanterior


1. Diluiroantigéniodeacordocomaavaliaçãoefetuadano“checkerboard”.2. Distribuir100µLdesoluçãodeantigénioporpoçodemicroplaca3. Incubar4ºCdurante,pelomenos24horas,aoabrigodadissecação4. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez5. Distribuir200µLdeTampãodeBloqueioporpoço.6. Incubardurante30minutosa37ºC7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez8. Preparardiluiçõessequenciaisde3em3decadasoroatestar:Amostra(poço) 1(B) 2(C) 3(D) 4(E) 5(F) 6(G) 7(H)T.Bloqueio 120 120 120 120 120 120 120Soroatestar - 60 Diluiçãoanterior - - 60 60 60 60 609. NospoçosdafilaAaplicar100µLdeTampãodebloqueio10. NospoçosdafilasBaHaplicar100µLdasdiluiçõesdosoroatestar(conformetabela)11. Fazerréplicas(repetirpassos8a10emcolunasdiferentes)12. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação13. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez14. Distribuir100µLdasoluçãodiluídado2°.Anticorpoporcadapoçodamicroplaca15. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação16. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez17. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço18. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,atéaoaparecimentodecor

nalgunspoços19. Adicionar50µLdeH2SO4porpoço20. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura

autónoma)21. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço22. Avaliartítuloaproximadodosoro(últimadiluiçãopositivadiferentedocontrolonegativo)


Registoderesultados

Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Observações



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

MÉDIADOSRESULTADOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Amostra:_________________________

Títulosdossoros.

Pré-imune

15dias

30dias

45dias

60dias


RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA

CarlosSinogas

Documents

IMUNOLOGIA - docente.ifsc.edu.brdocente.ifsc.edu.br/rosane.aquino/MaterialDidatico/CulturaCelulas/... · O trabalho laboratorial em Imunologia envolve três tipos principais de risco