1

バラのバラの

根頭がん腫病根頭がん腫病

抵抗性機構の解明と抵抗性機構の解明と

抵抗性台木の育成抵抗性台木の育成

従来の検定方法の問題

自然環境に影響される

再現性が低い

栽培環境の影響を受けやすい

接種方法が一定しない

In vitro検定法の確立

2

Needle Upper

Lower Slice

In vitroへの導入

針刺し接種法(Needle)上端塗布法(Upper)下端塗布法(Lower)そぎきり塗布法(Slice)

MS培地

BAP10-6～10-5 Ｍ

GA3 10-7～10-6 Ｍ

接種方法

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 2 3 4 5 6

Weeks after inoculation

Disease incidence (%)

Needle

Upper

Lower

Slice

Comparison among four inoculation methods on disease incidence.

針刺し接種法が安定した発病率を示し，最も適している。

3

6 weeks after inoculation

In vitro検定法の実際In vitro検定法の実際

Agrobacterium tumefaciensGOU1

Rosa multiflora R. multiflora 'K2'

R. canina 'Pfänder'

R. canina 'Inermis'

R. coriifolia froebelii

R. canina 'Heinsohns Rekord'

R. canina 'Superbe'

R. rugosa

R. eglanteriaR. 'Kuiper'

R. 'Uniform'R. 'Veendam'

R. canina

R. virginiana

R. canina 'Brögs Stachellose'

In vitro検定法に供試した品種の一覧

Pink Wonder

Evelien

White DreamLifirane

Livia

Purple Rain

PEKcougelCharming

Madame VioletBridal Pink

Dukat

Concerto

Fashion Parade

Joy

Pasadena

Tineke

Golden Emblem

Rise ‘n’ Shine

SoniaRoulette

Alba Meillandina

Dolores

Little Marvel

Rote Rose

切り花および鉢花品種 台木用品種

4

0

25

50

75

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

Dis

ease

inci

denc

e (%

)

Whi

te D

ream

Pu

rple

Rai

n M

adam

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olet

D

ukat

Fa

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Pasa

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G

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n E

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aLi

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Mar

vel

Eve

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Pink

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'Uni

form

' R

. can

ina

'Vee

ndam

' R

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inia

na'B

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Stac

hello

se'

切花用品種

台木用品種

Disease incidence 6 weeks after inoculation in rose rootstocksPink Wonder，Lifiraneが抵抗性を示し，PEKcougelは著しく高い抵抗性を示した

0

1

2

3

4

5

6

7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

Tum

or s

ize

Lifir

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Duk

at

Brid

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ink

Gol

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Ti

neke

Eve

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Rot

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y M

adam

e V

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lba

Mei

lland

ina

Fash

ion

Para

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aLi

ttle

Mar

vel

Livi

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C

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Kco

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R

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osa

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ina

'Uni

form

' 'P

fänd

er'

切花用品種

台木用品種

Disease incidence 6 weeks after inoculation in rose rootstocks

切花品種と比較して，台木用品種は小さな癌腫（ゴール）を形成した

5

病徴形成抵抗性 弱い病徴発達抵抗性 弱い

病徴形成抵抗性 弱い病徴発達抵抗性 強い

病徴形成抵抗性 強い病徴発達抵抗性 弱い

病徴形成抵抗性 強い病徴発達抵抗性 ？

Rosa multiflora Dukat

R. canina

Lifirane

PEKcougel

病徴形成抵抗性と病徴発達抵抗性

Classification of resistance to crown gall disease among rose cultivars

Resistance to tumor formation Resistance to tumor developmentHigh Low Middle

Pink Wonder

Evelien

White Dream

Lifirane Livia

Purple Rain

PEKcougel

Charming

Madame Violet

Bridal Pink

Dukat

Concerto

Fashion ParadeJoy

PasadenaTineke

Golden Emblem

Rise ‘n’ ShineSonia

RouletteAlba Meillandina

DoloresLittle Marvel

Rote Rose

Low Middle High

Concerto

Bridal Pink

PEKcougel Dukat

Lifirane

Charming

Golden Emblem

Tineke

Evelien

White Dream

Purple Rain

Madame Violet

Fashion Parade

Pasadena

Sonia

Alba Meillandina

Little Marvel

Livia

Joy

Rise ‘n’ Shine

Roulette

Dolores

Rote Rose

Pink Wonder

6

Classification of resistance to crown gall disease among rose rootstocks

Resistance to tumor formation Resistance to tumor developmentLow Low Middle to High

Rosa multiflora Rosa multiflora R. virginiana R. multiflora 'K2' R. multiflora 'K2' R. rugosaR. canina 'Pfänder' R. canina 'Inermis'R. canina 'Inermis' R. canina 'Heinsohns Rekord'R. coriifolia froebelii R. 'Kuiper'R. canina 'Heinsohns Rekord' R. canina 'Brögs Stachellose'R. canina 'Superbe' R. eglanteriaR. rugosa R. 'Veendam'R. eglanteria R. coriifolia froebelii R. 'Kuiper' R. canina 'Superbe'R. 'Uniform' R. caninaR. 'Veendam' R. 'Uniform'R. canina R. canina 'Pfänder'R. virginiana R. canina 'Brögs Stachellose'

Disease incidence 6 weeks after inoculation with four strains of A. tumefaciens

Rootstocks and cultivarsA208 GOU1 C58clrif-R G-Ag-27

Average

R. canina 60 75 40 70 61 NSR. canina 'Pfänder' 90 90 70 90 85 NS

R. virginiana 53 73 47 53 57 NS

R. coriifolia froebelii 40 90 30 50 53

*

PEKcougel 0 0 5 0 1 NS

Bridal Pink 50 45 40 30 41 NS

Dukat 60 87 53 27 57

*

Lifirane 20 7 20 20 17 NS

Fashion Parade 45 85 50 30 53 *

Average 46 61 39 41* * * *

A. tumefaciens strains

菌の系統「GOU1」は高い病原性を示した

7

Ｔｉ

vir領域

virD2

virB

Acetosyringone

Agrobacterium tumefaciensHost Plant Cell

virAvirG

virD2 receptors

virE2

virE2 receptors

菌の接着抑制が抵抗性と関係？

走査型電子顕微鏡による

Agrobacterium tumefaciensの

植物細胞への付着の観察

8

茎

菌液: 4.8×106個/ml30~60秒浸漬

MS培地

0，48，72時間後

観察

浸漬法を用いた接種

0h 48h 72h

Dukat（無接種）

PEKcougel(無接種）

抵抗性のPEKcougelの細胞表面は顆粒状物質が多く存在しているが，罹病性のDukatの細胞表面は顆粒状物質が少なく，細胞表面が露出している

9

Dukat

0h 48h 72h

上段：接種区下段：無接種区

罹病性のDukatの細胞表面は顆粒状物質が少なく，細胞表面が露出しているため，接種区では菌が細胞壁に多数付着している。菌が植物細胞壁に垂直に取り付き，感染していることが判る

PEKcougel 上段：接種区下段：無接種区

0h 48h 72h

抵抗性のPEKcougelの細胞表面は顆粒状物質が多く存在しているため，これが菌の細胞壁への付着を阻害している。菌は細胞壁の顆粒状物質に引き付けられるように付着しており，なかには顆粒状物質に菌体が覆われて不動化しているものもあった

10

Dukat（接種）

0h 48h 72h

PEKcougel（接種）

抵抗性のPEKcougelと罹病性のDukatを比べると，両者の違いが一目瞭然です。Dukatでは菌が細胞壁の露出部分に頭部を先にして垂直に付着して感染しているのに対して，PEKcougelでは顆粒状物質めがけて菌が集合し，感染が完了していない。また，顆粒状物質よって菌が捕捉されているものもみられた

まとめ

1．菌由来の繊維状構造体は植物体由来の顆粒状物質と結合しやすい

2．抵抗性の強弱により顆粒状物質の形成量が異なる

3. 顆粒物質が多く存在する場合は顆粒物質と繊維状構造体により菌の付着阻害や不動化が起こる

抵抗性のPEKcougelと罹病性のDukatとの間には，顆粒状物質の量的な差が認められ，バラ品種の顆粒状物質の生合成能力の違いが根頭がんしゅ病抵抗性と大きく関係していることが判る。

根頭がんしゅ病抵抗性機構には，顆粒状物質による菌の付着阻害が関係している。

11

Ｔｉ

vir領域

virD2

virB

Acetosyringone

Agrobacterium tumefaciensHost Plant Cell

virAvirG

virD2 receptors

virE2

virE2 receptors

アセトシリンゴン生合成能力の差異が抵抗性と関係している？

抵抗性と罹病性品種の葉から抽出した

Acetosyringone誘導体のHPLCによる

定性と定量

12

Acetosyringone誘導体

13: 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone (acetosyringone)

7: 4-hydroxy-3-methoxyacetophenone(acetovanillone)

10: 3,5-dimethoxyacetophenone9: 3,5-dimethoxy-4-

hydroxycinamic acid(sinapic acid)

6: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde (syringaldehyde)

5: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoicacid (syringic acid)

4: 4-hydroxyacetophenone

1: 4-hydroxybenzoic acid2: 4-hydroxbenzaldehyde

3: 4-hydroxy-3-methoxybenzoicacid (vanillic acid)

11: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde (vanilline) 12: 4-hydroxycinamic acid

(p-coumaric acid)

8: 4-hydroxy-3-methoxycinamicacid (ferulic acid)

O O

OH

COOH

CH3

CH3

O O

OH

CHO

CH3

CH3

OH

COCH3

OCH3

O O

OH

COCH3

CH3

CH3

CH

O O

OH

CHCOOH

CH3

CH3

O O

COCH3

CH3 CH

3

OH

CHO

O

OHCH3

COOH

O

OH

CHO

CH3

OH

COOH

OCH3OH

COOH

OH

COCH3

OH

COOH

アセトシリンゴン(Acetosyringone)といっても，色々な化合物の総称である。アセトシリンゴンは

バラの細胞が傷つけられると細胞壁修復物質として生合成される。菌はアセトシリンゴンを目印に植物細胞の傷を判断し，これを誘因物質として引き寄せられる。また，アセトシリンゴンは菌のプラスミドDNA内のT-DNAのvir領域の活性化作用も持つ。

①③

④

⑤

⑥

⑦

②

⑧

⑨

⑩

①: 4-hydroxybenzoic acid, ②: 4-hydroxybenzaldehyde, ③: 4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid, ④: 4-hydroxyacetophenone + 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, ⑤: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic acid, ⑥: 3,5-dimetoxy-4-hydroxybenzaldehyde + 4-hydroxycinamic acid, ⑦: 4-hydroxy-3-methoxyacetophenone, ⑧: 4-hydroxy-3-methoxycinamic acid + 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone, ⑨: 3,5-dimetoxy-4-hydroxycinamic acid, ⑩: 3,5-dimetoxyacetophenone

アセトシリンゴンはHPCLで分離し，定量することができる

13

The leaf disc or pieces were dipped into

sterilized liquid MS medium for

72h.

The exudation from the leaf

discs or pieces was then

extracted with chloroform.

Evaporatedto dry

HPLC analysis

Leaf discs of 5mm in diameterwere cut out

from sterilized leaves.

The extraction left was

resuspended in 50% methanol

containing 0.1% acetic acid.

バラの葉からのアセトシリンゴン抽出操作方法

Chromatogram of exudation extracted from the leaf discs of susceptible roses, Dukat.4: 4-hydroxyacetophenone, 5: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic acid, 6: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde, 7: 4-hydroxy-3-methoxyacetophenone, 9: 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, 11: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, 12: 4-hydroxy-cinnamic acid

罹病性のDukatからは7種類のアセトシリンゴンが検出でき，ピークも明確に判別できた

14

Chromatogram of exudation extracted from the leaf discs of susceptible roses, R. multiflora. 4: 4-hydroxyacetophenone, 5: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic acid, 9: 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid , 11: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde

罹病性のRosa multifloraからは4種類のアセトシリンゴンが検出できた。

Chromatogram of exudation extracted from the leaf discs of susceptible roses, R. canina.4: 4-hydroxyacetophenone, 5: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic acid, 7: 4-hydroxy-3-methoxyacetophenone, 8: 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid, 11: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, 13: 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone

罹病性のRosa caninaから6種類のアセトシリンゴンが検出でき，ピークも明確に判別できた

15

Chromatogram of exudation extracted from the leaf discs of resistant roses, PEKcougel.4: 4-hydroxyacetophenone, 5: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic acid, 6: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde, 7: 4-hydroxy-3-methoxyacetophenone, 11: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, 12: 4-hydroxy-cinnamic acid,

抵抗性のPEKcougelから6種類のアセトシリンゴンが検出できたが，ピークは小さかった

Chromatogram of exudation extracted from the leaf discs of resistant roses, Lifirane.4: 4-hydroxyacetophenone, 8: 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid, 11: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, 13: 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone

抵抗性のLifiraneから4種類のアセトシリンゴンが検出できたが，ピークは小さかった

16

0

5

10

15

20

25

30

35

面積(mv*sec)

PEKcougel

Lifirane

Dukat

4-hydroxy-acetophenone

3,5-dimethoxy-4-hydroxy

benzaldehyde

4-hydroxy-3-methoxy-

acetophenone

3,5-dimethoxy-4-hydroxy-cinamic acid

4種類のアセトシリンゴンについて，罹病性のDukatと抵抗性のPEKcougel，Lifiraneを比較すると，Dukatのアセトシリンゴン含有量は明らかに多かった。

抵抗性品種PEKcougelおよびLifiraneと罹病性品種DukatにおけるAcetosyringone誘導体含量の比較

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

面積(mv*sec)

PEKcougel

Lifirane

Rosa multiflora

4-hydroxy-acetophenone

3,5-dimethoxy-4-hydroxy

benzaldehyde

4-hydroxy-3-methoxy-

acetophenone

3,5-dimethoxy-4-hydroxy-cinamic acid

抵抗性品種PEKcougelおよびLifiraneと罹病性のRosa multifloraにおけるAcetosyringone誘導体含量の比較

4種類のアセトシリンゴンについて，罹病性のRosa multifloraと抵抗性のPEKcougel，Lifiraneを比較すると，Rosa multifloraのアセトシリンゴン含有量は明らかに多かった。

17

0

10

20

30

40

50

60

面積(mv*sec)

PEKcougel

Lifirane

Rosa canina

4-hydroxy-acetophenone

3,5-dimethoxy-4-hydroxy

benzaldehyde

4-hydroxy-3-methoxy-

acetophenone

3,5-dimethoxy-4-hydroxy-cinamic acid

抵抗性品種PEKcougelおよびLifiraneと罹病性のRosa caninaにおけるAcetosyringone誘導体含量の比較

4種類のアセトシリンゴンについて，罹病性のRosa caninaと抵抗性のPEKcougel，Lifiraneを比較すると，Rosa caninaのアセトシリンゴン含有量は明らかに多かった。

Qua

ntity

of A

S de

rivat

ives

per

100

le

af d

isks

(μg)

0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.00

4 & 11 5 6 & 12 7 8 & 13 9

PEKcougelLifiraneDukatR. multifloraR. canina

Difference of the quantity of AS derivatives among resistant roses and susceptible roses.4: 4-hydroxyacetophenone, 5: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzoic acid, 6: 3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzaldehyde, 7: 4-hydroxy-3-methoxyacetophenone, 8: 4-hydroxy-3-methoxycinamic acid, 9: 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, 11: 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde, 12: 4-hydroxy-cinnamic acid , 13: 3,5-dimethoxy-4-hydroxyacetophenone

罹病性品種は抵抗性品種に比べてHPCLで検出できたアセトシリンゴンのいずれについても明らかに含量が高かった。

18

まとめ

1．バラからは9種類のアセトシリンゴン誘導体が検出できた

2．抵抗性品種のアセトシリンゴン誘導体の含有量は罹病性品種に比べて明らかに少なかった

3. 抵抗性品種は罹病性品種に比べてアセトシリンゴン生合成能力が低く，特定のアセトシリンゴンでは検出できなかった

根頭がんしゅ病抵抗性はアセトシリンゴンの生合成能力と密接に関係しており，恐らくアセトシリンゴン生合成経路における欠失突然変異が発生した可能性が推定される。

PEKcougelの

根頭がんしゅ病

抵抗性の遺伝

19

PEKcougel : 抵抗性 Dukat : 罹病性

♀ ♂ ♀ ♂

P×P P×D D×P D×D

抵抗性品種のPEKcougelと罹病性品種のDukatを交配親として，正逆交雑を実施した

40 ～50 days after pollination

embryos culture on MS medium

交配を行って40～50日目に果実を採取し，無菌条件下で種子を摘出して胚珠培養を行った

シュートの伸長が認められた個体はシュートを増殖し，in vitro検定法で菌を接種して抵抗性の判別を行った。

20

0

25

50

75

100

PE

Kco

ugel

DD

20-1

DD

2-2

DD

4-1

DD

2-1

DD

12-1

DD

20-2

DD

24-1

DD

24-2

DD

24-3

Duk

at

Dis

ease

inci

denc

e(%

)

0

25

50

75

100

PE

Kco

ugel

PD21

-2PD

40-7

PD40

-4PD

14-1

PD27

-1PD

40-2

PD40

-8PD

21-5

PD40

-1PD

21-1

PD29

-1PD

26-3

PD28

-4PD

26-2

PD40

-6PD

28-1

PD27

-2PD

28-3

PD

31-1

0PD

28-5

Duk

at

Dis

ease

inci

denc

e0

25

50

75

100

PE

Kco

ugel

DP

17-1

DP

18-1

DP

6-1

DP

7-2

DP

9-2

DP

28-4

DP

7-1

DP

21-1

DP

18-3

DP

30-1

DP

18-2

DP

9-1

DP

7-3

Duk

at

Dis

ease

inci

denc

e

0

25

50

75

100

PE

Kco

ugel

PP

24-1

0

PP

34-1

PP

23-6

PP

23-2

PP

3-1

PP

33-1

PP

24-3

PP

24-1

1

PP

23-5

Duk

at

Dis

ease

inci

denc

e(%

) PEKcougel x PEKcougelDukat x Dukat

PEKcougel x DukatDukat x PEKcougel

PEKcougelとDukatの交雑後代の病徴形成抵抗性

PEKcougel同士の交雑個体は著しく低い発病率を示し，3個体で高い抵抗性が認められた。PEKcougelを種子親とした交雑でも著しく低い発病率を示す個体が得られた。

0

4

8

12

16

PEK

coug

el

PP34

-1

PP23

-2

PP23

-5

PP33

-1

PP

24-1

0

PP23

-6

PP3

-1

PP

24-1

1

PP24

-3

Duk

at

Tum

or s

ize

0

4

8

12

16

PEK

coug

el

DD

20-1

DD

2-1

DD

24-1

DD

20-2

DD

4-1

DD

12-1

DD

2-2

DD

24-3

DD

24-2

Duk

at

Tum

or s

ize

0

4

8

12

16

PE

Kcou

gel

PD40

-7PD

40-4

PD21

-2PD

14-1

PD26

-3PD

29-1

PD40

-2PD

21-5

PD27

-1PD

21-1

PD28

-1PD

26-2

PD27

-2PD

28-3

PD40

-1PD

40-6

PD

31-1

0PD

40-8

PD28

-4PD

28-5

Duk

at

Tum

or s

ize

0

4

8

12

16

PEK

coug

elD

P7-2

DP

17-1

DP7

-1

DP

18-1

DP9

-2

DP

28-4

DP6

-1D

P18

-3

DP

21-1

DP

18-2

DP9

-1D

P7-3

DP

30-1

Duk

at

Tum

or s

ize

PEKcougel x PEKcougelDukat x Dukat

PEKcougel x DukatDukat x PEKcougel

PEKcougelとDukatの交雑後代の病徴発達抵抗性

PEKcougel同士の交雑で得られたPP34-1は発病率が低く，形成される癌腫の大きさも小さかった。PEKcougelを種子親とした交雑で得られたPD-21-2，40-7も発病率が低く，形成される癌腫も小さく，強い根頭がんしゅ病抵抗性を示した。

21

PEKcougelの根頭がんしゅ病抵抗性の遺伝

抵抗性に関与する因子は遺伝する

抵抗性因子は単一ではない