Bol. San. Veg. Plagas, 28: 599-607, 2002

Incidencia de los virus del rizado amarillo del tomate en cultivosde tomate de la Comunidad Valenciana, España

L. R U B I O , I. F O N T , C. JORDÁ, J. SERRA, N. D U R A N , P. M O R E N O , J. GUERRI

La incidencia de dos especies del virus del rizado amarillo del tomate: TYLCV-Is yTYLCV-Sar durante el año 2001 en cultivos de tomate de la Comunidad Valenciana seestudió mediante hibridación molecular y duplex-PCR. En todas las zonas de cultivosanalizadas se detectaron plantas infectadas por TYLCV-Is, mientras que TYLCV-Sarapareció solo en dos plantas de una parcela al sur de la Comunidad Valenciana. Estos re-sultados y otros obtenidos en prospecciones anteriores sugieren que la población deTYLCV analizada es de origen reciente.

1 Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (FVIA), Apdo. Oficial, Moneada,Valencia, España.

2 Unidad de Patología Vegetal, Departamento de Ecosistemas Agroforestales,E.T.S.I.Agrónomos, Universidad Politécnica de Valencia. Camino de Vera, s/n. 46022-Valencia, España.

3 Servicio de Sanidad Vegetal, Ctra. Alicante-Valencia, km. 276,5, Silla, Valencia,España.

Palabras clave: TYLCV-Sar, TYLCV-Is, epidemiología, hibridación molecular,duplex-PCR.

INTRODUCCIÓN

El rizado del tomate es una enfermedad queocasiona todos lo años graves daños en culti-vos de tomate en muchos países de regionestropicales y subtropicales, incluyendo España(CZOSNEK Y LATERROT, 1997; MORIONES y

NAVAS-CASTILLO, 2000). Esta enfermedad estacausada por varias especies virales pertene-cientes al género Begomovirus de la familiaGeminiviridae (RYBICKI et al, 2000), que reci-ben el nombre del rizado amarillo o de la hojacuchara del tomate, en inglés Tomato yellowleaf curl virus (TYLCV). Los Begomovirus secaracterizan por poseer las partículas viralesgeminadas, compuestas por dos icosaedros(Figura 1 A) que encierran una (genoma mo-nopartito) o dos (genoma bipartito) moléculas

circulares de ADN monocatenario de unos2.800 nucleótidos (MORIONES y NAVAS-CASTI-

LLO, 2000). Todos los aislados de TYLCV eu-ropeos presentan genoma monopartito. Lasplantas afectadas por estas virosis presentanuna reducción de la superficie de los foliólosde las hojas, rizado internervial, amarilleo yenrollado de los bordes hacia arriba, que les daun aspecto acucharado (CONTI et al., 2000)(Figura 1 C y D), de ahí que estos virus se co-nozcan coloquialmente como virus de la cu-chara. Cuando la infección es temprana, lasplantas presentan un tamaño reducido, bajaproducción y calidad del fruto. Estos virus sontransmitidos por la mosca blanca del tabaco,Bemisia tabaci (Gennadius) (Sternorrhyncha:Aleyrodidae) (Figura IB) de una manera per-sistente circulativa (MEHTA et al, 1994). Se ha

Figura 1.—A) Partículas virales de TYLCV observadas al microscopio electrónico, B) Adulto de Bemisia tabaci(Gennadius) C) Planta de tomate infectada por TYLCV-Is, D) Planta de tomate infectadad por TYLCV-Sar.

descrito transmisión transovárica hasta al me-nos dos generaciones en TYLCV (GHANIM etal., 1998), aunque actualmente esto está endiscusión.

Tradicionalmente, los diferentes aisladosde TYLCV se han incluido en dos grupos otipos: Tomato yellow leaf curl virus tipo Sar-dinia (TYLCV-Sar) y Tomato yellow leafcurl virus tipo Israel (TYLCV-Is) y fueronasí denominados por haberse encontrado porvez primera en Cerdeña e Israel respectiva-mente. En 1999, El Comité Internacional deTaxonomía de Virus (ICTV) debido a impor-tantes diferencias en los datos de secuenciasnucleotídicas, decidió agruparlos en dos es-pecies diferentes: Tomato yellow leaf curl

virus especie Sardinia (TYLCV-Sar) y To-mato yellow leaf curl virus especie Israel(TYLCV-Is) (ICTV; FAUQUET et al, 1999).Un año después, estas dos especies fueronrenombrados como Tomato yellow leaf curlSardinia virus (TYLCSV) y Tomato yellowleaf curl virus (TYLCV) respectivamente(FAUQUET et aL, 2000). En el transcurso deeste trabajo adoptaremos la nomenclatura deTYLCV-Sar y TYLCV-Is para que resultemás fácil su identificación.

Las dos especies de TYLCV compartenlas características propias de TYLCV, aun-que muestran algunas diferencias en el rangode huéspedes y en la intensidad de los sínto-mas que inducen (Figura 1 C y D). TYLCV-

Figura 2.—Hibridación molecular de una sondaespecífica del virus del rizado amarillo del tomate

TYLCV-Is sobre improntas de secciones transversalesde peciolo de plantas de tomate.

Is causa daños en tomate más agresivos queTYLCV-Sar. En cuanto a los huéspedes natu-rales de TYLCV podríamos citar entre otros:Lycopersicon esculentum Mill., Euphorbiasp. (DAVINO et al, 1994), Capsicum annuum(REINA et al, 1999), Phaseolus vulgaris (NA-VAS-CASTILLO et al, 1999), Solanum luteum,Mercuralis ambigua (SÁNCHEZ-CAMPOS etal., 2000), Solanum nigrum L. BEDFORD, etal.,. 1998), Conyza sumatrensis (Retz.) E.Walker, Convulvulus sp., Cuscuta sp., Che-nopodium murale L., Datura stramonium L.,Dittrichia viscosa (L) W Greuter, y Malvaparviflora L. (JORDÁ et al, 2001).

En las últimas décadas se ha observadouna rápida expansión de TYLCV, como con-secuencia de la explosión demográfica y co-lonización de nuevas áreas geográficas delvector (BROWN et al, 1995). En España sedetectó por primera vez la especie TYLCV-Sar en 1992 (MORIONES et al, 1993), queocasionó importantes daños en Murcia; ex-tendiéndose posteriormente a otras áreas decultivo (NORIS et al, 1994; REINA et al,1994). En 1997 apareció en Almería la espe-cie TYLCV-Is (NAVAS-CASTILLO et al, 1997),que también se fue extendiendo por todas laszonas afectadas compartiendo nicho ecoló-gico con TYLCV-Sar e incluso parece des-plazarlo en algunas zonas (SÁNCHEZ-CAMPOSet al, 1999). En 1999, se detectó en plantasde judía de cultivos comerciales de Almeríala existencia de un virus recombinante entrelas dos especies de TYLCV, el cual presen-

Figura 3.—Mapa de la Comunidad Valenciana endonde se indican los lugares donde se detectaron

TYLCV-Is y TYLCV-Sar.

taba una mejor adaptación biológica que losvirus parentales (MONCI et al, 2001). Actual-mente el TYLCV se encuentra distribuidopor las principales zonas productoras de to-mate de España (JORDÁ et al, 2001).

En 1996 se detectó por primera vezTYLCV-Sar de forma puntual en las provin-cias de Alicante y Valencia (JORDÁ, 1996) yen años posteriores se detectó TYLCV-Is(JORDÁ, datos no publicados); a partir de en-tonces el incremento en el número de cultivosde tomate afectados por el virus del rizadoamarillo ha sido importante, presentándoseaños de una mayor incidencia que otros. Estehecho es especialmente relevante en cuantoque el tomate es la especie hortícola de mayor

importancia económica en España y las epi-demias de TYLCV ocasionan cuantiosas pér-didas. Para el desarrollo de estrategias efica-ces de control de la enfermedad esimprescindible conocer en cada zona de cul-tivo la distribución y epidemiología de los vi-rus causantes. En la Comunidad Valencianano se había efectuado un estudio sobre la si-tuación de los cultivos de tomate frente a di-cha enfermedad aunque, como ya hemos di-cho, había sido detectada años anteriores.Este trabajo recoge las prospecciones realiza-das respecto a la búsqueda y determinaciónde las dos especies, TYLCV-Sar y TYLCV-Is, en las principales zonas de cultivos de to-mate de la Comunidad Valenciana.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material vegetal

Entre mayo y octubre de 2001 se realizó unmuestreo en las principales zonas productorasde tomate (Lycopersicon esculentum Mill.),en invernaderos de plástico de la ComunidadValenciana (véase Tabla 1 y Figura 3). Encada zona se seleccionaron parcelas con plan-

tas de tomate que presentaban los síntomas tí-picos del rizado del tomate y en cada parcelase analizaron tanto plantas sintomáticas comoasintomáticas. También se analizaron plantasde pimiento (Capsicum annuum L.) y judía{Phaseolus vulgaris L.) en las parcelas dondeel cultivo del tomate coexistía con cultivos deuna de estas especies vegetales, ya que ambospueden ser huéspedes de TYLCV. Además,se analizaron plantas silvestres recolectadasen el interior de los invernaderos o próximosa éstos. De cada planta se recogieron variashojas apicales que se almacenaron a 4 °Chasta su análisis.

Para la obtención de las sondas y comocontroles positivos en la PCR se emplearondos aislados de TYLCV de la colección man-tenida en la Unidad Docente de Virología dela Universidad Politécnica de Valencia: elaislado 881 (TYLCV-Sar, planta de tomatede Murcia, 1992) y el aislado 2032 (TYLCV-Is, planta de tomate de Almería, 1999).

Extracción del ADN

Para la extracción del ADN total de lasmuestras objeto de estudio, se empleó el

Tabla 1.—Incidencia de plantas infectadas* con dos especies del virus del rizado del tomate (TYLCV-Is yTYLCV-Sr) en varias zonas de cultivo de la Comunidad Valenciana.

"La infección fue determinada mediante hibridación molecular.bPlantas = n° plantas analizadas, Sínt= n° plantas con síntomas, Is= n° plantas positivas para TYLCV-Is, Sar= n° plantaspositivas para TYLCV-Sar.

Valencia PerellóMarenyFoios

ValenciaMontserrat

PaiportaSilla

AlicanteSan Juan

ElcheOrihuela

CastellónMoncofarBenicarló

Total

Figura 4.—Electroforesis en gei de agarosa de productos de PCR correspondientes a TYLCV-Is y TYLCV-Sarobtenidos de muestras de tomate recogidos en !a Comunidad Valenciana (véase tabla 1 y Figura 3). Las reacciones de

PCR se realizaron con el "kit" comercial para la identificación de TYLCV (N.E.E.D., S.L.).

"kit" comercial EZNA (OMEGA BIOTEK,U.S.A.) siguiendo las instrucciones del fa-bricante.

Diagnóstico mediante Duplex-PCR

Para la detección e identificación de lasespecies de TYLCV se utilizó el "kit" co-mercial para la identificación de TYLCV(N.E.E.D., S.L.) (MARTÍNEZ-CULEBRAS P. etai, 2001). Este "kit" permite identificar elTYLCV y diferenciar las especies deTYLCV-Sar y TYLCV-Is mediante duplex-PCR en una única reacción de forma rápiday sencilla. La amplifiación se realizó en unvolumen de 25 \ú con 2.5 \ú de ADN, 21.5mi de TYLCV SET y lml de ADN polime-rasa (Netzyme; N.E.E.D., S.L.). Las condi-ciones de la PCR fueron las siguientes: 35ciclos de 1 min a 95 °C, 1 min a 56 °C y 1min a 72 °C, seguido de un periodo final deelongación de 10 min a 72 °C. Los productosde la reacción fueron analizados medianteelectroforesis horizontal en gei de agarosa al2% en tampón TBE. Los geles fueron teñi-

dos con bromuro de etidio (30 \ig/\) y se vi-sualizaron con luz ultravioleta. En la duplex-PCR se incluyeron controles positivos deTYLCV-Sar y TYLCV-Is así como un con-trol negativo de planta de tomate sana.

Diagnóstico mediante hibridaciónmolecular de improntas

A) Obtención de sondas

Para la síntesis de sondas específicas deTYLCV-Sar y TYLCV-Is, se hizo una ampli-ficación mediante PCR de los aislados 881 y2032 utilizando las parejas de iniciadoresM14/M15(TGCATTTATTTGAAAACG/AAAGGATCCCACATATTG) y M30/M31(GAGCACTTAGGATATGTGAGG/AGTG-GATCCCACATATTGC), correspondientes asecuencias especificas de TYLCV-Sar yTYLCV-Is respectivamente (Navas-Castilloet al., 1999). La amplifiación se realizó en unvolumen de 50 u.1 con 0,5 \ú de extracto deácidos nucleicos, 200 \xM de cada uno de losdNTPs, 100 ng de cada iniciador, lx tampón

de PCR, 1 mM MgCl2 y 2 U Taq DNA poli-merasa, utilizando 35 ciclos de 1 min a94 °C, 1 min a 50 °C y 1 min a 72 °C, seguidode un periodo final de elongación de 5 min a72 °C. Los ADNs amplificados se separaronmediante electroforesis horizontal en gei deagarosa al 2% en TAE (40mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8,0) y se visualizaron con luzultravioleta tras haber sumergido los geles en30 ng/1 bromuro de etidio durante 15 min.Los ADNs se clonaron en pGEM-T (Pro-mega) y se usaron para transformar célulasde E. coli DH5a' (SAMBROOK et al, 1989).La secuencias nucleotídicas de clones selec-cionados se determinaron y mediante el pro-grama BLAST (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) se confirmó que los clones ob-tenidos del aislado 881 correspondían aTYLCV-Sar y los clones del aislado 2032 co-rrespondían a TYLCV-Is. A partir de estosclones se sintetizaron sondas y se marcaroncon digoxigenina mediante una reacción dePCR idéntica a la descrita en el apartado an-terior, excepto que se incluyó 70 piM DIG-UTP.

B) Hibridación molecular de improntas

El análisis por hibridación molecular sellevó a cabo sobre improntas de cortes trans-versales de pecíolos de las muestras vegeta-les en membranas de nylon. Los ácidos nu-cleicos adsorbidos en las membranas sefijaron mediante irradiación con luz ultravio-leta (50 mJ) durante 50 s. Posteriormente,las membranas se prehibridaron a 65 °C enuna solución compuesta de 0,2 % SDS, 5xSSC (lx SSC: 150 mM NaCl, 15 mM citratosódico, pH 7,0), 2 % reactivo bloqueante(Roche), y 0,1 % N-lauroylsarcocina. Alcabo de dos horas, se añadió 25 ng de sondapreviamente desnaturalizada (calentando a95 °C durante 5 min) y se incubó a 65 °C du-rante unas 16 h. Tras la hibridación, lasmembranas se lavaron dos veces en 2x SSCy 0,1% SDS a temperatura ambiente durante5 min, y otras dos veces en 0,1 % SSC y 0,1% SDS a 65 °C durante 5 min. La hibrida-

ción se reveló utilizando un anticuerpo anti-DIG-fosfatasa alcalina y sustrato quimiolu-miniscente CSPD (Roche) siguiendo las ins-trucciones del fabricante.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La técnica de hibridación molecular deimprontas permitió detectar de forma rápidae inequívoca la infección de plantas porTYLCV-Sar y TYLCV-Is (Figura 2). Elanálisis de 187 plantas recogidas durante elaño 2001 mostró que la especie TYLCV-Isestaba ampliamente distribuida en la Comu-nidad Valenciana, mientras que la especieTYLCV-Sar se encontró solamente en dosplantas de un invernadero de Elche, Alicante(Tabla 1 y Figura 3). El virus se detectó entodas las plantas que mostraban síntomas,observándose una alta correlación entre laintensidad de síntomas y la de la señal de hi-bridación. En algunas plantas asintomáticasse detectó el virus, aunque en estos casos laseñal de hibridación fue siempre débil. Deesta forma la hibridación molecular se mos-tró como técnica eficaz para el diagnósticoprecoz del virus, antes de que los síntomasse manifiesten. Debido a la gran sensibilidadde la técnica PCR y con objeto de validar lahibridación para el diagnóstico de TYLCV,se analizaron 56 muestras de tomate y 4 dejudía mediante duplex-PCR. De las muestrasinfectadas con la especie de TYLCV-Sar seobtuvieron dos fragmentos de amplificaciónde 462 y 135 pb respectivamente, mientrasque aquellas que estaban infectadas por laespecie de TYLCV-Is únicamente se obtuvoun fragmento de amplificación de 462 pb(Figura 4). Los resultados obtenidos porPCR confirmaron totalmente aquellos obte-nidos por hibridación molecular.

El predominio de TYLCV-Is con res-pecto a TYLCV-Sar observado en la Comu-nidad Valenciana, en este estudio, contrastacon la situación observada en otras zonas enaños anteriores, donde TYLCV-Is y TYLCV-Sar coexistían en una proporción similar.Esto podría deberse a varios factores. I)

TYLCV-Is podría estar mejor adaptado alhuésped (tomate) y desplazar a TYLCV-Sarcuando ambos coinfectan una planta. Esteno parece ser el caso, ya que en experimen-tos en los que se coinocularon estas dos es-pecies virales en plantas de tomate medianteAgrobacterium o B. tabaci se observó queambas podían coexistir, sin ventaja selectivapara ninguna de ellas (SÁNCHEZ-CAMPOS etal, 1999). II) Diferencias en la infectivi-dad de TYLCV-Sar y TYLCV-Is en otroshuéspedes que se cultivan en la misma zonaalternando con tomate, podrían haber ac-tuado como reservónos del virus seleccio-nando una especie de TYLCV y hacer quepredominara en epidemias posteriores. Eldesplazamiento de TYLCV-Sar por TYLCV-Is en el sur de España es atribuido principal-mente al cultivo de judía entre las tempora-das del cultivo de tomate (SÁNCHEZ-CAMPOSet al., 1999), puesto que la judía puede serinfectada por TYLCV-Is pero no porTYLCV-Sar (Navas-Castillo et al., 1999).Sin embargo, en La Comunidad Valencianala situación es diferente, ya que el cultivo detomate no se alterna con el de la judía ni concultivos de otras especies susceptibles aTYLCV. III) La flora silvestre próxima a loscultivos podría haber actuado como reservo-rio del virus en los periodos en que no secultiva el tomate. Se han descrito diferen-cias de infectividad en algunas especies sil-vestres, como Solanum luteum y 5". nigrumque solo se infectan con TYLCV-Sar, mien-tras que Mercurialis ambigua sólo lo hacecon TYLCV-Is (NAVAS-CASTILLO et al.,1997; BEDFORD et al, 1998; SÁNCHEZ-CAM-POS et al, 2000). La composición de la florasilvestre en cada zona geográfica podría serun determinante de la población de TYLCVlocal. Sin embargo, este factor no parece serimportante en las zonas estudiadas en estetrabajo, ya que en el interior de los inverna-deros la flora silvestre es prácticamente ine-xistente y en el exterior las condiciones cli-máticas de la Comunidad Valenciana en laépoca en la que se realizó la prospección noeran las propicias para que existiera una po-blación importante de B. tabaci. Ninguna de

las plantas silvestres analizadas en este tra-bajo estuvo infectada por TYLCV-Sar oTYLCV-Is (datos no mostrados). IV) Dife-rencias en la transmisibilidad en ambas es-pecies de TYLCV por B. tabaci podría ha-ber favorecido la dispersión de una sobre laotra. Sánchez-Campos et al. en 1999 de-mostraron que la transmisión por B. tabacide TYLCV-Is es más eficiente que la deTYLCV-Sar, pero las diferencias en trans-misibilidad entre ambas especies virales noson tan pronunciadas como para explicarpor si solas el rápido desplazamiento deTYLCV-Sar por TYLCV-Is en la Comuni-dad Valenciana. V) Es posible que la pobla-ción de TYLCV que se hallaba presente enaños anteriores, que era mínima, haya remi-tido y la población de TYLCV observada enel año 2001 en la Comunidad Valenciana sedeba a introducciones recientes de materialinfectado procedente del sur de Españadonde TYLCV-Is predomina. Esta pareceser la causa más probable, ya que en la Co-munidad Valenciana el cultivo del tomate nose realiza de forma continua a lo largo delaño y en la rotación no se usan cultivos hor-tícolas que pudieran actuar como reservoriodel virus. Esto unido al descenso drástico dela población de mosca blanca en inviernopuede haber contribuido a romper el ciclode transmisión de TYLCV. Encuestas epi-demiológicas realizadas confirmaron que enalgunas parcelas apareció el rizado de to-mate después de importar plantas de otraszonas donde el virus es prevaleciente.

Dada la importancia del cultivo de to-mate en la Comunidad Valenciana y la grancapacidad de expansión de la enfermedaddel rizado amarillo del tomate, es crucialdisponer un método rápido y fiable dediagnostico de cada especie viral deTYLCV, ya que el comportamiento de lasvariedades resistentes frente a cada uno deestos aislados puede ser diferente. La hi-bridación molecular de improntas de tejidovegetal parece una técnica adecuada, sufi-cientemente sensible y con capacidad deanalizar simultáneamente un gran númerode muestras sin necesidad de preparar ex-

tractos. Esta técnica y la técnica de du-plex-PCR parecen especialmente adecua-das para estudios epidemiológicos y paraevaluar la eficacia de las medidas de con-trol. Actualmente se están usando para laevaluación de variedades de tomate resis-tentes o tolerantes a distintas especies deTYLCV.

AGRADECIMIENTOS

Parte de este trabajo ha sido financiadopor los proyectos IVIA 5018 y AGF1998-0439-005-03 del CICYT. Agradecemos alos técnicos de las cooperativas agrícolas delas poblaciones estudiadas por facilitarnos elmuestreo.

ABSTRACT

RUBIO L., I. FONT, C. JORDÁ, J. SERRA, N. DURAN, P. MORENO, J. GUERRI. 2002. In-cidencia de los virus del rizado amarillo del tomate en cultivos de tomate de la Comuni-dad Valenciana, España. Bol. San. Veg. Plagas, 28: 599-607.

The incidence of Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV)-Sar and TYLCV-Is in to-mato crops of Valencia Comunity, Spain during the year 2001 was evaluated using mo-lecular hybridization and duplex-PCR analyses. TYLCV-Is was spread in the main to-mato crops of Comunidad Valenciana, whereas TYLCV-Sar was found only in twoplants from a single orchard, located in the South. These results and other previous datasuggest that the present TYLCV population was originated recently.

Key words: TYLCV-Sar, TYLCV-Is, epidemiology, molecular hybridization, du-plex-PCR.

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(Recepción: 8 marzo 2002)(Aceptación: 12 marzo 2002)