INDUÇÃO DE -AMILASES DIGESTIVAS EM LARVAS DO CARUNCHO Zabrotes subfasciatus

(Coleoptera: Bruchidae)

Carlos Peres Silva – CBB - UENF

Introdução – Ciclo de vida do Bruquídeo

Introdução – Importância Econômica

Inibidores de -amilase

- Proteínas com função de defesa em plantas.

- Podem ser encontrados em cereais, em leguminosas e em outras famílias de

vegetais.

- Estes inibidores podem apresentar massa molecular de 5 kDa, 13 kDa, 26 kDa e

50 kDa.

- Trabalhos recentes têm mostrado que inibidores de -amilases são

particularmente tóxicos para bruquídeos pragas do velho mundo, C. maculatus, C.

chinensis e Bruchus pisorum .

- No feijão comum, foi demonstrada a presença de quatro inibidores de -amilase,

chamados AI-0, AI-1, AI-2 e AI-3.

Introdução

O inibidor de -amilase encontrado em P. vulgaris é o responsável pela resistência desse feijão a

carunchos do gênero Callosobruchus (Gatehouse et al., 1984; Ishimoto e Kitamura, 1989; Huesing et al.,

1991).

Eficácia de inibidores foi observada através da produção de sementes transgênicas, como no caso de

ervilhas que se tornaram resistentes a seu bruquídeo praga Bruchus pisorum (Shade et al., 1994; Schroeder

et al., 1995).

Indução de amilases digestivas de insetos em resposta à ingestão de um inibidor protéico (Silva et al.,

1999; Silva et al., 2001a; Silva et al., 2001b).

O fenômeno de indução de enzimas digestivas em resposta à ingestão de inibidores foi recentemente

descoberto como conseqüência dos estudos sobre adaptação de larvas de lepidópteros a plantas

trangênicas, que super-expressavam inibidores de proteinases (Jongsma et al., 1995; Broadway, 1996).

A despeito do grande impacto dessa descoberta, ainda não se conhece os

detalhes dos mecanismos através dos quais os insetos reconhecem a

presença dos inibidores no trato intestinal e como é desencadeado o

processo de expressão de enzimas digestivas insensíveis aos inibidores

(Broadway, 1997 Jongsma e Bolter1997; Mazumdar – Leighton e Broadway, 2001).

Hipótese

As larvas de Zabrotes subfasciatus possuem meios

de detectar fragmentos da molécula do inibidor de -

amilase 1 ingerido e reconhecer os fragmentos por

receptores nas microvilosidades do epitélio intestinal.

Figura 2 – Gel SDS-PAGE com os padrões de -amilase das larvas de Zabrotes subfasciatus crescidas em Phaseolus vulgaris e Vigna unguiculata. As amostras contêm o equivalente a 0,7 intestinos de larvas com idade de 13 a 17 dias após ovoposição (linhas da esquerda para direita) que foram corridas em gel de poliacramida SDS-7,5%. Após a migração e uma etapa de renaturação, as atividades de -amilase foram ensaiadas. Zp, larvas crescidas em sementes de P. vulgaris; Zv, larvas crescidas em sementes de V. unguiculata.

In vitro and in vivo digestion of common bean starch granules

Efeito de dietas diferentes na expressão de -amilase na larva de Z. subfasciatus

Figura – Gel SDS-PAGE com os padrões de -amilase das larvas de Zabrotes subfasciatus crescidas em sementes de diferentes espécies de leguminosas. As amostras contendo o equivalente a 0,7 intestinos foram corridas em gel de poliacramida SDS 7,5%. Após a migração e o passo de renaturação, a atividade de -amilase foi ensaiada. Raia a, larvas crescidas em semente de Epace 10; raia b, larvas crescidas em sementes de Phaseolus vulgaris; raia c, larvas crescidas em sementes de Phaseolus lunatus, raia d, larvas crescidas em sementes de Vigna unguiculata.

Indução através de experimento de transferência de larvas

Figura 3 – A indução de -amilase nas larvas de Zabrotes subfasciatus alimentadas em cotilédones de Phaseolus vulgaris e Vigna unguiculata, analisada por SDS-PAGE e ensaio em gel. As larvas de 14 dias de idade foram removidas das sementes de V. unguiculata e transferidas para galerias artificiais feitas em cotilédones de V. unguiculata (controle) e de P. vulgaris. Após 48 da alimentação, as larvas foram removidas, dissecadas e os intestinos homogeneizados para a eletroforese e ensaio em gel. Raia a, larvas controle com 16 dias crescidas em sementes de P. vulgaris.; raia b, larvas controle com 16 dias crescidas em sementes de V. unguiculata; raia c, larvas transferidas para galerias feitas no cotilédone da V. unguiculata; raia d, larvas transferidas para galerias feitas no cotilédone de P. vulgaris.

Figura 5 – -Amilase das larvas de Zabrotes subfasciatus crescidas nas cápsulas de gelatina que continham a farinha de Vigna unguiculata mais 0,4% de inibidor de -amilase 1 (raia a) e nas cápsulas de gelatina que continham somente farinha de V. unguiculata (raia b). As amostras com 0,7 equivalente de intestino foram corridas em gel de poliacrilamida SDS-7,5%. Cápsulas de gelatina foram oferecidas para oviposição e após 20 dias as larvas foram removidas, dissecadas e os intestinos homogeneizados para a eletroforese e ensaio em gel.

Figura 6 – Indução de -amilase em larvas de Zabrotes subfasciatus removidas de sementes de feijão de corda e transferidos para cápsulas de gelatina contendo uma mistura de farinha de Vigna e 2% de PHA (raia 1) e o controle contendo somente farinha de Vigna (raia 2). Após 48h de alimentação, as larvas foram retiradas dissecadas e os intestinos homogeneizados para posterior ensaio em gel.

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Presença de fragmentos do inibidor em órgãos internos das larvas de Z. subfasciatus através de

“Western bloting”

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Figura 7 – “Western-bloting” dos fragmentos do inibidor de -amilase nos diferentes órgãos das larvas de Z. subfasciatus. As amostras foram corridas em gel de poliacramida SDS 15%. Após a migração e o passo de transferência pelo método semi-seco para membrana de nitrocelulose, a membrana foi imunoensaiada. Raias 1 e 2, Cápsula encefálica; raia 3, Conteúdo luminal (CL); raia 4 e 5, Intestino; raia 6 e 7, Corpo gorduroso; raia 8, inibidor de -amilase (controle). M, fração de membrana; S, fração solúvel.

Cápsula Intestino CorpoEncefálica Médio Gorduroso

M S CL M S M S AI-1

Preparação de Microvilosidades

Larvas de Z. subfasciatus de 4º ínstar são dissecadas separando o epitélio do conteúdo luminal

Os epitélios são homogeneizados em meio hipotônico (Tampão Tris-HCl 2 mM pH7,1 contendo Manitol 50 mM)

Este homogeneizado é filtrado em uma malha de nylon

Adiciona-se ao filtrado o mesmo tampão anterior contendo CaCl2 10 mM (50 epitélios/ml)

Deixar esta mistura 10 minutos no gelo com agitações periódicas

1ª Centrifugação - 2.800 g por 15 minutos (recolhe o sobrenadante e descarta o sedimento)

2ª Centrifugação - 15.000 g por 15 minutos

Descarta o sobrenadante e ressuspende o sedimento no 1º tampão utilizado

Ligação do AI-1 às preparações de microvilosidades do epitélio intestinal das larvas de Z. subfasciatus

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M S M S M S AI-1 PHA

Figura 8 – Após a migração e o passo de transferência pelo método semi-seco para membrana de nitrocelulose, a membrana passou pelos processos já descritos anteriormente de “western-bloting”. Raia 1, microvilosidades (membrana) com adição de solução de AI-1; raia 2, microvilosidades (fração solúvel) com adição de solução de AI-1; raia 3, microvilosidades (membrana) com adição de solução de PHA (lectina de feijão comum); raia 4, microvilosidades (fração solúvel) com adição de solução de PHA (lectina de feijão comum); raia 5, microvilosidades (membrana) com adição de tampão contendo manitol; raia 6 microvilosidades (parte solúvel) com adição de tampão contendo manitol; raia 7, solução de AI-1(controle); raia 8, solução de PHA.

Demonstração através de fluorescência da ligação do inibidor acoplado ao FITC às microvilosidades

intestinais de Z. subfasciatus

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Figura 9 – Gel SDS-PAGE mostrando a fluorescência do AI-1 marcado com FITC ligado às microvilodidades do epitélio intestinal das larvas de Zabrotes subfasciatus. À mistura de 10 l da solução de microvilosidades e 10 l (1 mg/100 L)da solução contendo inibidor acoplado ao FITC foram adicionados volumes (1 a 10 L) de inibidor não marcado e após 16 horas esta amostra foi corrida em gel de poliacramida SDS a 12%.

Demonstração através de “Blot-Ligante” da presença do receptor para o inibidor de -amilase 1

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Figura 10 – "Blot Ligante" do inibidor de -amilase ao receptor. As amostras foram primeiramente corridas em gel nativo 12%, depois transferidas para membrana de nitrocelulose. Após o bloqueio da membrana, esta ficou incubada com uma solução contendo o AI-1 e em seguida anticorpo primário e o secundário. Raia 1, Sepharose ativada acoplada ao AI-1 mais solução de membrana de Zabrotes subfasciatus extraída com Triton X-100 2,5%; raia 2, Sepharose ativada acoplada ao AI-1 mais solução de membrana de Z. subfasciatus extraída com Triton X-100 2,5% (fervida por 10 minutos); raia 3, solução de membrana de Z. subfasciatus extraída com Triton X-100 2,5% (fervida por 10 minutos).

Desacoplamento térmico do complexo AI-1-receptor ligada à resina Sepharose Ativada

Figura 11 – Demonstração do desacoplamento térmico do complexo inibidor-receptor. Gel nativo, 12% corado pelo método de prata. Raia 1, Sepharose acoplada ao AI-1 mais solução de membrana de Zabrotes subfasciatus extraída com Triton X-100 2,5% após 10 minutos em banho a 60 ºC; raia 2, Sepharose acoplada ao AI-1 mais solução de membrana de Z. subfasciatus extraída com Triton X-100 2,5% após 30 minutos em banho a 60 ºC; raia 3, Sepharose acoplada ao AI-1 mais solução de membrana de Z. subfasciatus extraída com Triton X-100 2,5% após 70 minutos em banho a 60 ºC.

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Resolution of digestive -glycosidases from larval Z. subfasciatus fed on cowpea and common bean on a phenyl-agarose column

Conclusões até o momento...

Observação da indução de -amilases no bruquídeo Z. subfasciatus, quando este se alimenta

de dietas distintas.

O inibidor de -amilase 1 presente na semente de P. vulgaris induz a secreção do dímero nas

larvas de Z. subfasciatus.

A lectina PHA presente na semente de P. vulgaris induz a secreção do dímero nas larvas de

Z. subfasciatus.

O inibidor de -amilase 1 se liga às microvilosidades intestinais do Z. subfasciatus.

Há um provável receptor nas microvilosidades intestinais do Z. subfasciatus que se liga ao

inibidor de -amilase 1.