Információhordozó makromolekulák

DNS, RNS, gének, klónozás

Az Escherichia coli sejtet alkotó molekulák

A sejt össztömegéhez viszonyítva (%)

Szárazanyag tartalom (%)

Különböző molekulafélék (specieszek) száma

víz 70 1

fehérjék 15 50 3000

DNS 1 3,3 1

RNS 6 20 >3000

poliszaharidok 3 10 5

lipidek 2 6,6 20

Monomer alegységek és intermedierek

2 6,6 500

Szervetlen ionok 1 3,3 20

Az élő sejteket makromolekulák építik fel, amelyek kisebb egységek (Mr<500) polimerizációjával jönnek létre.

Aminosavak → fehérjék Mr=5000-106

nukleotidok → nukleinsavak Mr<109

Egyszerű cukrok → poliszaharidok Mr=106

(Glicerin+ zsírsavak → lipidek Mr=750-1500)

Nukleinsavak

Információhordozó makromolekulák

Fehérjék

Az információáramlás iránya: a molekuláris biológia központi dogmája

Információáramlás a makromolekulák között

Centrális dogma

DNS RNS fehérje

genom transzkriptóma proteóma

transzkripciótranszláció

replikáció

reverz transzkripció

prionok

Mindhárom típusú információhordozó makromolekula lényegében ugyanazt az információt tárolja. Miért van szükség ugyanannak az információnak három különböző alakban való megjelenésére?

A nukleinsavak felépítése

Nukleinsavak

Enyhe lúg (enzim)

Nukleotidok

Erélyes lúg (enzim)

Nukleozidok + H3PO4

Enzim

Heterociklusosok + pentóz

(purin, pirimidin) (ribóz vagy dezoxiribóz)

A DNS és RNS láncoknak iránya van!

Konvenció: ATGC ≠ CGAT

5’→3’irány

pH 7-en a foszfát csoportok ionizáltak → negatív töltés!

A DNS kémiailag sokkal stabilabb mint az RNS.

Az RNS lúggal könnyen hidrolizál a 2’ OH csoport jelenléte miatt (szomszédcsoport hatás).

A DNS molekulában a tárolt információ a bázisok sorrendjében rejlik.

A bázisok sorrendjének meghatározása a DNS szekvenálás.

Régen többféle módszert is alkalmaztak (pl. a kémiai lebontást → Maxam-Gilbert).

Ma már kizárólag a Sanger-féle láncterminációs módszert ill. annak automatizált változatait használják.

Ezzel a módszerrel határozták meg a humán genom szekvenciáját is.

Automata DNS szekvenátor működési elve

A GÉN FOGALMA

Morgan, XX. század eleje: A gén a kromoszóma egy része (darabja), amely meghatározza az élőlény egy tulajdonságát (fenotípus).

Beadle és Tatum, 1940: egy gén - egy enzim hipotézis

egy gén – egy fehérje hipotézis

egy gén – egy polipeptid

Avery, 1944: A gének anyaga DNS.

Mai definíció: A gén egy olyan DNS szakasz, amely egy géntermék (polipeptid vagy RNS) szintéziséhez szükséges információt tárolja.

A szűken vett definíció csak a struktúrgént jelenti (polipeptid vagy RNS elsődleges szekvenciáját kódoló DNS), a tágabb definícióba beleértjük a regulátor szekvenciákat (promóterek, enhancerek, stb.) is.

Start kodon

ATG (Met)

Stop kodon

TAA, TAG, TGA

Srtuktúrgén

ORF: open reading frame

Eukarióták esetén intronokat is tartalmaz

5’ „nemkódoló” szakasz

promóter, enhancer, riboszómakötőhely, stb

3’ „nemkódoló” szakasz

poliadeniláció, transzkripciós

terminátor, stb.

A gén

RNS gének

Vannak gének, amelyek olyan RNS-ek szekvenciáját kódolják, amelyek nem fordítódnak le fehérjévé.

Riboszómális RNS (rRNS): A legintenzívebben átíródó gének közé tartoznak minden szervezetben (nucleolus = sejtmagvacska).

Transzfer RNS (tRNS): A fehérjeszintézishez (transzláció) nélkülözhetetlenek.

Kis nukleáris RNS (snRNS): RNS molekulák „érése” (splicing)

Kis nukleoláris RNS (snoRNS): 60-300 nt, rRNS processzálás, alternatív splicing, telomeráz RNS, stb.

Mikro RNS (miRNS): ~22 nt, Hosszabb prekurzorokból keletkeznek, génkifejeződést szabályozzák: RNS interferencia (Orvosi Nóbel díj, 2006)

Ezeknek a géneknek a felépítése jelentősen eltér a fehérjét kódoló gének felépítésétől, ezért sokkal nehezebb őket megtalálni a genomban.

Pl. az miRNS géneket csak néhány éve fedezték fel!

A DNS-ben 4 bázis (A,T,G,C) kódolja az információt.

Az RNS-ben szintén (A,U,G.C).

Három bázis (kódon) felel meg egy aminosavnak a fehérjeszintézis során.

Genetikai kód

A fehérjéket 20-féle aminosav alkotja.

A fehérjék elsődleges szerkezetében (szekvenciájában) kódolva van a háromdimenziós szerkezetük. A kód mibenléte nagyrészt ismeretlen.

Az eukarióta génekben a fehérjét kódoló szakaszokat (exonok) nemkódoló DNS szakaszok (intronok) szakítják meg. Az intronok hossza többszöröse is lehet az exonok hosszának. Az intronok az mRNS érése során vágódnak ki. Ezt a folyamatot nevezzük „splicing”-nak. A splicing a biológiai diverzitás egyik forrása (alternatív splicing).

Splicing a β globin gén kifejeződése során

A splicing mechanizmusa

RNS szerkesztés / RNA editing

Apolipoprotein B 100 (513 kDa)

Apolipoprotein B 48 (250 kDa)

Az mRNS közepén egy stop kódon keletkezik. A transzláció félúton leáll.

CAA UAAcitozin

dezaminázGln Stop

Genom

Egy élőlény teljes genetikai állománya (össz. DNS tartalom)

Pl. ember: 23 (22+2) kromoszóma + mitokondriális DNS

A különböző élőlények genomjai szerkezetükben és információtartalmukban jelentősen eltérhetnek egymástól.

1.) Méret (kbp=1000bp, Mbp=106bp)

2.) Gének száma (génsűrűség= gének száma/genom mérete)

3.) Génszerkezet (intron-exon)

4.) Topológia (lineáris vs. cirkuláris)

Az információáramlás a makromolekulák között (különösen eukarióták esetén) nagyfokú diverzitás forrása

Ember: kb. 21000 gén genom

transzkripció

alternatív splicing

mRNS RNS editing

transzláció

Fehérje poszttranszlációs módosítás

Több mint egymillió különböző géntermék proteómaBonyolult anyagcsere hálózat

Az eukarióta genom felépítése1.) Gének és szabályozó elemek:

exonok és intronok

transzkripciós szabályozó elemek (promóter, enhancer, terminátor, stb.)

replikációt szabályozó elemek (replikációs kezdőpont)

transzlációt szabályozó elemek (start, stop kodon)

rekombinációs szekvenciák

2.) Ismétlődő (repetitív szekvenciák):

highly repetitive sequences

simple sequence DNA centroméra, teloméra

satellite DNA

Az egér kromoszóma 10%-a. Kevesebb mint 10 bp ismétlődik több milliószor.

moderately repetitive transzpozonok (Alu repeat)

Az egér kromoszóma 20%-a. Néhány száz bázispár, néhány ezerszer ismétlődik.

A cDNS fogalma

Mivel az eukarióta mRNS már nem tartalmazza az intronokat, szekvenciája közvetlenül megfeleltethető az általa kódolt fehérje szekvenciájával. Az RNS azonban instabil, bomlékony, klónozási célokra nem alkalmazható.

Megoldás: Az RNS molekulából készítsünk DNS-t reverz transzkriptáz enzim segítségével. Az így készült DNS kópiát nevezzük c(opy)DNS-nek. A cDNS alkalmas baktériumsejtekben való rekombináns fehérjetermeltetésre is.

Reverz transzkriptáz: Virális eredetű enzim → retrovírusok

Emberben is van reverz transzkripció → telomeráz

Probléma: Hogyan tudunk megkeresni, azonosítani és vizsgálni egy DNS szakaszt (gént) a rendkívül nagy (pl. humán 3X109 bp) és komplex genomban?

(Tű a szénakazalban.)

Megoldás: DNS klónozás, vagyis egy kiválasztott DNS szakasz izolálása és megsokszorozása akár több milliárd példányban.

Módszer: Rekombináns DNS technika ( génsebészet, genetic engineering). A biokémia, molekuláris genetika (molekuláris biológia) legnagyobb hatású felfedezése a 20. században. Rekombináns DNS nélkül ma már elképzelhetetlen a kutatás és a biotechnológiai ipar.

A DNS klónozása

Génsebészet (genetic engineering): a DNS manipulálása (vágás/illesztés) speciális enzimekkel.

Restrikciós endonukleázok: Bakteriális eredetű enzimek. Egy adott DNS szekvenciát – ált. 4-6 bázis hosszúságú – ismernek fel a kettősszálú DNS molekulán belül és elhasítják azt.

Több ezer különböző restrikciós endonukleázt ismerünk, amelyek több mint száz DNS szekvenciát ismernek fel.

Elkészíthetjük a DNS restrikciós (fizikai) térképét.

A restrikciós fragmentumokat mesterséges hordozó (vektor) DNS-be ültetjük (ligáz enzim). Rekombináns DNS

A rekombináns DNS-t megfelelő gazdaszervezetben (pl. E. coli baktérium) több millió kópiában megsokszorozhatjuk. Klón

A rekombináns klón elegendő mennyiségű anyagot szolgáltat a DNS analízisére (pl. szekvenálás).

Restrikciós endonukleázok

A restrikciós endonukleázok biológiai funkciója

A baktériumok „immunrendszere”. Minden endonukleáznak megvan a maga metiláz enzim párja. A metilálás megvédi a DNS-t az endonukleáz hasításától. Csak a II-es típusú endonukleáz-metiláz rendszerben válik szét két külön fehérjére a két funkció. Ezért csak a II-es típusú enzimeket használják a génsebészetben.

A DNS-ligáz enzim 5’foszfát és 3’OH végeket kapcsol össze ATP hasítása közben. DNS ligázzal bármilyen eredetű DNS darabok összekapcsolhatók.

Rekombináns DNS: különböző biológiai eredetű DNS darabok összekapcsolásával keletkezett új DNS molekula.

A DNS klónozás sémája

A rekombináns DNS-t gazdaszervezetbe juttatva megsokszorozzuk.

Escherichia coli K12-es törzs, a leggyakrabban használt gazdaszervezet a génsebészetben

Gram-negatív baktérium, molekuláris szinten a legjobban jellemzett élőlény. Kiválóan alkalmas rekombináns DNS molekulák megsokszorozására.

A leggyakrabban alkalmazott vektorok: Plazmidok, bakteriofágok.

Plazmidok: Extrakromoszómális genetikai elemek a baktériumban. Kis méretű (1-200kb), cirkulárisan zárt, dupla szálú DNS molekulák, amelyek általában szuperhelikális konformációban vannak. A plazmidok önálló, a kromoszómától független replikációra képesek. A replikációs origó határozza meg a kópiaszámot, ami néhánytól néhány százig terjedhet. A plazmidok a legrégebbóta használt klónozó vektorok.

A pBR322-es plazmid, az egyik legelső E. coli vektor

A modern klónozó plazmidok számos praktikus „kényelmi” elemet tartalmaznak.

Bakteriofágok: a baktériumok vírusai.

Mivel önállóan képesek replikálódni a sejten belül és tolerálják az idegen DNS-t, alkalmasak klónozó vektoroknak.

Előnyük a plazmidokhoz képest:

1.)Természetes úton képesek bejutni a sejtbe, ezért a transzformáció sokkal hatékonyabb.

2.) Lényegesen nagyobb DNS inszertek befogadására képes (8-24 kb/λ-fág), ezért alkalmasabb klóntárak készítésére.

Hátrány: Körülményesebb, nehézkesebb a kezelésük a laboratóriumban.

A két leggyakrabban használt klónozó fág: λ-fág és M13 fág

A λ-fág életciklusa

Klónozás λ-fág vektorba

M13 fág

Kétféle célból használják a génsebészetben:

1.) Egyes szálú (ssDNS) előállítására.

2.) Fág bemutatásra (phage display).

Kezelése egyszerűbb, mint a λ-fágé.

Egyéb vektorok: pl. kozmidok, mesterséges kromoszómák

Ezek nagyméretű DNS darabok klónozására alkalmasak.

Kozmid 30-45 kb

BAC (bacterial artificial chromosome) 120-300 kb

YAC (yeast artificial chromosome) 250-400 kb

Egy adott szekvenciát (gént) hordozó klón kiválasztása kolónia/plakk hibridizációval

Ez a módszer volt az egyedüli a gének klónozására a nyolcvanas évek közepéig, amikor felfedezték a polimeráz-láncreakciót (PCR).

Polimeráz láncreakció (PCR)

Vektor és gazdatörzs (baktérium) használata nélkül megsokszorozhatjuk (amplifikálhatjuk) a DNS-t.

A sejtmagban végbemenő DNS replikáció in vitro imitálása.

Tetszés szerinti DNS szakasz megsokszorozható.

A megsokszorozandó DNS-t határoló rövid szakaszok szekvenciáját ismerni kell.

Polimeráz láncreakció

A PCR hőmérséklet profilja

A PCR-hez termostabil DNS-polimeráz enzim szükséges

Primer tervezés: az egyik legkritikusabb lépés a PCR során.

Szempontok: hossz, olvadáspont, kereszthibridizáció, másodlagos szerkezeti elemek a DNS-ben, stb.

Ma már számos számítógép program áll rendelkezésre primer tervezéshez.

PCR egyetlen igazi hátránya: ismernünk kell a DNS szekvenciáját, amit amplifikálni akarunk.