Információhordozó makromolekulák
DNS, RNS, gének, klónozás
Az Escherichia coli sejtet alkotó molekulák
A sejt össztömegéhez viszonyítva (%)
Szárazanyag tartalom (%)
Különböző molekulafélék (specieszek) száma
víz 70 1
fehérjék 15 50 3000
DNS 1 3,3 1
RNS 6 20 >3000
poliszaharidok 3 10 5
lipidek 2 6,6 20
Monomer alegységek és intermedierek
2 6,6 500
Szervetlen ionok 1 3,3 20
Az élő sejteket makromolekulák építik fel, amelyek kisebb egységek (Mr<500) polimerizációjával jönnek létre.
Aminosavak → fehérjék Mr=5000-106
nukleotidok → nukleinsavak Mr<109
Egyszerű cukrok → poliszaharidok Mr=106
(Glicerin+ zsírsavak → lipidek Mr=750-1500)
Nukleinsavak
Információhordozó makromolekulák
Fehérjék
Az információáramlás iránya: a molekuláris biológia központi dogmája
Információáramlás a makromolekulák között
Centrális dogma
DNS RNS fehérje
genom transzkriptóma proteóma
transzkripciótranszláció
replikáció
reverz transzkripció
prionok
Mindhárom típusú információhordozó makromolekula lényegében ugyanazt az információt tárolja. Miért van szükség ugyanannak az információnak három különböző alakban való megjelenésére?
A nukleinsavak felépítése
Nukleinsavak
Enyhe lúg (enzim)
Nukleotidok
Erélyes lúg (enzim)
Nukleozidok + H3PO4
Enzim
Heterociklusosok + pentóz
(purin, pirimidin) (ribóz vagy dezoxiribóz)
A DNS és RNS láncoknak iránya van!
Konvenció: ATGC ≠ CGAT
5’→3’irány
pH 7-en a foszfát csoportok ionizáltak → negatív töltés!
A DNS kémiailag sokkal stabilabb mint az RNS.
Az RNS lúggal könnyen hidrolizál a 2’ OH csoport jelenléte miatt (szomszédcsoport hatás).
A DNS molekulában a tárolt információ a bázisok sorrendjében rejlik.
A bázisok sorrendjének meghatározása a DNS szekvenálás.
Régen többféle módszert is alkalmaztak (pl. a kémiai lebontást → Maxam-Gilbert).
Ma már kizárólag a Sanger-féle láncterminációs módszert ill. annak automatizált változatait használják.
Ezzel a módszerrel határozták meg a humán genom szekvenciáját is.
Automata DNS szekvenátor működési elve
A GÉN FOGALMA
Morgan, XX. század eleje: A gén a kromoszóma egy része (darabja), amely meghatározza az élőlény egy tulajdonságát (fenotípus).
Beadle és Tatum, 1940: egy gén - egy enzim hipotézis
egy gén – egy fehérje hipotézis
egy gén – egy polipeptid
Avery, 1944: A gének anyaga DNS.
Mai definíció: A gén egy olyan DNS szakasz, amely egy géntermék (polipeptid vagy RNS) szintéziséhez szükséges információt tárolja.
A szűken vett definíció csak a struktúrgént jelenti (polipeptid vagy RNS elsődleges szekvenciáját kódoló DNS), a tágabb definícióba beleértjük a regulátor szekvenciákat (promóterek, enhancerek, stb.) is.
Start kodon
ATG (Met)
Stop kodon
TAA, TAG, TGA
Srtuktúrgén
ORF: open reading frame
Eukarióták esetén intronokat is tartalmaz
5’ „nemkódoló” szakasz
promóter, enhancer, riboszómakötőhely, stb
3’ „nemkódoló” szakasz
poliadeniláció, transzkripciós
terminátor, stb.
A gén
RNS gének
Vannak gének, amelyek olyan RNS-ek szekvenciáját kódolják, amelyek nem fordítódnak le fehérjévé.
Riboszómális RNS (rRNS): A legintenzívebben átíródó gének közé tartoznak minden szervezetben (nucleolus = sejtmagvacska).
Transzfer RNS (tRNS): A fehérjeszintézishez (transzláció) nélkülözhetetlenek.
Kis nukleáris RNS (snRNS): RNS molekulák „érése” (splicing)
Kis nukleoláris RNS (snoRNS): 60-300 nt, rRNS processzálás, alternatív splicing, telomeráz RNS, stb.
Mikro RNS (miRNS): ~22 nt, Hosszabb prekurzorokból keletkeznek, génkifejeződést szabályozzák: RNS interferencia (Orvosi Nóbel díj, 2006)
Ezeknek a géneknek a felépítése jelentősen eltér a fehérjét kódoló gének felépítésétől, ezért sokkal nehezebb őket megtalálni a genomban.
Pl. az miRNS géneket csak néhány éve fedezték fel!
A DNS-ben 4 bázis (A,T,G,C) kódolja az információt.
Az RNS-ben szintén (A,U,G.C).
Három bázis (kódon) felel meg egy aminosavnak a fehérjeszintézis során.
Genetikai kód
A fehérjéket 20-féle aminosav alkotja.
A fehérjék elsődleges szerkezetében (szekvenciájában) kódolva van a háromdimenziós szerkezetük. A kód mibenléte nagyrészt ismeretlen.
Az eukarióta génekben a fehérjét kódoló szakaszokat (exonok) nemkódoló DNS szakaszok (intronok) szakítják meg. Az intronok hossza többszöröse is lehet az exonok hosszának. Az intronok az mRNS érése során vágódnak ki. Ezt a folyamatot nevezzük „splicing”-nak. A splicing a biológiai diverzitás egyik forrása (alternatív splicing).
Splicing a β globin gén kifejeződése során
A splicing mechanizmusa
RNS szerkesztés / RNA editing
Apolipoprotein B 100 (513 kDa)
Apolipoprotein B 48 (250 kDa)
Az mRNS közepén egy stop kódon keletkezik. A transzláció félúton leáll.
CAA UAAcitozin
dezaminázGln Stop
Genom
Egy élőlény teljes genetikai állománya (össz. DNS tartalom)
Pl. ember: 23 (22+2) kromoszóma + mitokondriális DNS
A különböző élőlények genomjai szerkezetükben és információtartalmukban jelentősen eltérhetnek egymástól.
1.) Méret (kbp=1000bp, Mbp=106bp)
2.) Gének száma (génsűrűség= gének száma/genom mérete)
3.) Génszerkezet (intron-exon)
4.) Topológia (lineáris vs. cirkuláris)
Az információáramlás a makromolekulák között (különösen eukarióták esetén) nagyfokú diverzitás forrása
Ember: kb. 21000 gén genom
transzkripció
alternatív splicing
mRNS RNS editing
transzláció
Fehérje poszttranszlációs módosítás
Több mint egymillió különböző géntermék proteómaBonyolult anyagcsere hálózat
Az eukarióta genom felépítése1.) Gének és szabályozó elemek:
exonok és intronok
transzkripciós szabályozó elemek (promóter, enhancer, terminátor, stb.)
replikációt szabályozó elemek (replikációs kezdőpont)
transzlációt szabályozó elemek (start, stop kodon)
rekombinációs szekvenciák
2.) Ismétlődő (repetitív szekvenciák):
highly repetitive sequences
simple sequence DNA centroméra, teloméra
satellite DNA
Az egér kromoszóma 10%-a. Kevesebb mint 10 bp ismétlődik több milliószor.
moderately repetitive transzpozonok (Alu repeat)
Az egér kromoszóma 20%-a. Néhány száz bázispár, néhány ezerszer ismétlődik.
A cDNS fogalma
Mivel az eukarióta mRNS már nem tartalmazza az intronokat, szekvenciája közvetlenül megfeleltethető az általa kódolt fehérje szekvenciájával. Az RNS azonban instabil, bomlékony, klónozási célokra nem alkalmazható.
Megoldás: Az RNS molekulából készítsünk DNS-t reverz transzkriptáz enzim segítségével. Az így készült DNS kópiát nevezzük c(opy)DNS-nek. A cDNS alkalmas baktériumsejtekben való rekombináns fehérjetermeltetésre is.
Reverz transzkriptáz: Virális eredetű enzim → retrovírusok
Emberben is van reverz transzkripció → telomeráz
Probléma: Hogyan tudunk megkeresni, azonosítani és vizsgálni egy DNS szakaszt (gént) a rendkívül nagy (pl. humán 3X109 bp) és komplex genomban?
(Tű a szénakazalban.)
Megoldás: DNS klónozás, vagyis egy kiválasztott DNS szakasz izolálása és megsokszorozása akár több milliárd példányban.
Módszer: Rekombináns DNS technika ( génsebészet, genetic engineering). A biokémia, molekuláris genetika (molekuláris biológia) legnagyobb hatású felfedezése a 20. században. Rekombináns DNS nélkül ma már elképzelhetetlen a kutatás és a biotechnológiai ipar.
A DNS klónozása
Génsebészet (genetic engineering): a DNS manipulálása (vágás/illesztés) speciális enzimekkel.
Restrikciós endonukleázok: Bakteriális eredetű enzimek. Egy adott DNS szekvenciát – ált. 4-6 bázis hosszúságú – ismernek fel a kettősszálú DNS molekulán belül és elhasítják azt.
Több ezer különböző restrikciós endonukleázt ismerünk, amelyek több mint száz DNS szekvenciát ismernek fel.
Elkészíthetjük a DNS restrikciós (fizikai) térképét.
A restrikciós fragmentumokat mesterséges hordozó (vektor) DNS-be ültetjük (ligáz enzim). Rekombináns DNS
A rekombináns DNS-t megfelelő gazdaszervezetben (pl. E. coli baktérium) több millió kópiában megsokszorozhatjuk. Klón
A rekombináns klón elegendő mennyiségű anyagot szolgáltat a DNS analízisére (pl. szekvenálás).
Restrikciós endonukleázok
A restrikciós endonukleázok biológiai funkciója
A baktériumok „immunrendszere”. Minden endonukleáznak megvan a maga metiláz enzim párja. A metilálás megvédi a DNS-t az endonukleáz hasításától. Csak a II-es típusú endonukleáz-metiláz rendszerben válik szét két külön fehérjére a két funkció. Ezért csak a II-es típusú enzimeket használják a génsebészetben.
A DNS-ligáz enzim 5’foszfát és 3’OH végeket kapcsol össze ATP hasítása közben. DNS ligázzal bármilyen eredetű DNS darabok összekapcsolhatók.
Rekombináns DNS: különböző biológiai eredetű DNS darabok összekapcsolásával keletkezett új DNS molekula.
A DNS klónozás sémája
A rekombináns DNS-t gazdaszervezetbe juttatva megsokszorozzuk.
Escherichia coli K12-es törzs, a leggyakrabban használt gazdaszervezet a génsebészetben
Gram-negatív baktérium, molekuláris szinten a legjobban jellemzett élőlény. Kiválóan alkalmas rekombináns DNS molekulák megsokszorozására.
A leggyakrabban alkalmazott vektorok: Plazmidok, bakteriofágok.
Plazmidok: Extrakromoszómális genetikai elemek a baktériumban. Kis méretű (1-200kb), cirkulárisan zárt, dupla szálú DNS molekulák, amelyek általában szuperhelikális konformációban vannak. A plazmidok önálló, a kromoszómától független replikációra képesek. A replikációs origó határozza meg a kópiaszámot, ami néhánytól néhány százig terjedhet. A plazmidok a legrégebbóta használt klónozó vektorok.
A pBR322-es plazmid, az egyik legelső E. coli vektor
A modern klónozó plazmidok számos praktikus „kényelmi” elemet tartalmaznak.
Bakteriofágok: a baktériumok vírusai.
Mivel önállóan képesek replikálódni a sejten belül és tolerálják az idegen DNS-t, alkalmasak klónozó vektoroknak.
Előnyük a plazmidokhoz képest:
1.)Természetes úton képesek bejutni a sejtbe, ezért a transzformáció sokkal hatékonyabb.
2.) Lényegesen nagyobb DNS inszertek befogadására képes (8-24 kb/λ-fág), ezért alkalmasabb klóntárak készítésére.
Hátrány: Körülményesebb, nehézkesebb a kezelésük a laboratóriumban.
A két leggyakrabban használt klónozó fág: λ-fág és M13 fág
A λ-fág életciklusa
Klónozás λ-fág vektorba
M13 fág
Kétféle célból használják a génsebészetben:
1.) Egyes szálú (ssDNS) előállítására.
2.) Fág bemutatásra (phage display).
Kezelése egyszerűbb, mint a λ-fágé.
Egyéb vektorok: pl. kozmidok, mesterséges kromoszómák
Ezek nagyméretű DNS darabok klónozására alkalmasak.
Kozmid 30-45 kb
BAC (bacterial artificial chromosome) 120-300 kb
YAC (yeast artificial chromosome) 250-400 kb
Egy adott szekvenciát (gént) hordozó klón kiválasztása kolónia/plakk hibridizációval
Ez a módszer volt az egyedüli a gének klónozására a nyolcvanas évek közepéig, amikor felfedezték a polimeráz-láncreakciót (PCR).
Polimeráz láncreakció (PCR)
Vektor és gazdatörzs (baktérium) használata nélkül megsokszorozhatjuk (amplifikálhatjuk) a DNS-t.
A sejtmagban végbemenő DNS replikáció in vitro imitálása.
Tetszés szerinti DNS szakasz megsokszorozható.
A megsokszorozandó DNS-t határoló rövid szakaszok szekvenciáját ismerni kell.
Polimeráz láncreakció
A PCR hőmérséklet profilja
A PCR-hez termostabil DNS-polimeráz enzim szükséges
Primer tervezés: az egyik legkritikusabb lépés a PCR során.
Szempontok: hossz, olvadáspont, kereszthibridizáció, másodlagos szerkezeti elemek a DNS-ben, stb.
Ma már számos számítógép program áll rendelkezésre primer tervezéshez.
PCR egyetlen igazi hátránya: ismernünk kell a DNS szekvenciáját, amit amplifikálni akarunk.