INFORME ANUAL 1994

LINEA 4BIOLOGIA MOLECULAR Y BIOTECNOLOGIA DE PLANTAS

4.1 Mecanismos moleculares involucrados en la adaptacion de las plantas al deficit de agua4.2 Las hormonas como reguladoras del balance hfdrico en plantas4.3 Caracterizacion estructural y funcional de osmolitos y protefnas inducidas por el estres hfdrico4.4 Estudio de la regulacion de la expresion genetica durante el estres hfdrico4.5 Caracterizacion de genes inducidos por acido abscfsico en cultivo de celulas en suspension

de frijol (Phaseolus vulgaris)4.6 Caracterizacion de genes inducidos por acido abscfsico (ABA) y acido jasmonico UA)

en un cultivo de celulas en suspension de frijol (Phaseolus vulgaris L.)4.7 Cultivo de tejidos vegetales4.8 Caracterizacion de una mutante albina de Arabidopsis thaliana obtenida par insercion

de un T-DNA4.9 Caracterizacion de mutantes fotosinteticas de Arabidopsis y mafz4.10 Regulacion metabolica de la fotosfntesis4.11 La levadura como un modelo para el aislamiento de genes involucrados en la respuesta

de la planta a estres salino y osmotico4.12 Analisis genetico-molecular de la induccion de la termotolerancia en levaduras y plantas

superiores4.13 Arquitectura de la pared celular en plantas superiores

PROGRAMA 4.1Mecanismos moleculares involucrados en laadaptacion de las plantas al deficit de agua

Los organismos vivos responden a los cambios enel medio ambiente de formas diversas. Las plan-tas, por tener caracterfsticas especiales, comopueden ser, entre otras, la falta de movimiento ysus estrategias de crecimiento y desarrollo, pre-sentan particularidades en sus respuestas que lashacen diferentes, de manera global, alas ya des-critas para otros organismos vivos. Por otro lado,desde el nacimiento de la agricultura, el hombreha buscado diferentes formas para la obtencionde variedades vegetales que puedan contendercontra los cambios en el medio ambiente queprovocan importantes perdidas en los cultivos.

Por 10 mencionado resulta interesante elconocer con mayor profundidad los mecanismos

que utilizan los vegetales para adaptarse a loscambios ambientales.

Hemos dirigido nuestros esfuerzos a entendercomo las plantas responden al deficit de agua,ya que los mecanismos necesarios para lograr elbalance de agua adecuado deben participar enun gran numero de procesos biologicos, asf comoen la respuesta a otras condiciones de estrescomo serfan el calor, el frfo y la osmolaridad (sa-linidad).

Para el estudio de este problema biologicoelegimos dos plantas dicotiledoneas como mo-delos experimentales, Phaseolus vulgaris !J Arabidopsisthaliana. La primera tiene gran importancia agrfco-la en nuestro pafs y sus cultivos se yen afectadosdrasticamente por los periodos de sequfa. Lasegunda es una planta que aunque carece deimportancia agrfcola presenta ventajas notablescomo modelo experimental.

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Estamos interesados de manera primordial enlos mecanismos moleculares involucrados en estarespuesta; sin embargo, trataremos de enmar-carlos dentro de algun proceso fisiol6gico quenos permita integrarlos alas funciones celulares.

EI objetivo general de este proyecto es elconocer los mecanismo moleculares que contro-Ian la respuesta de la planta al deficit de agua.Dado que este es un fen6meno complejo, nues-tro enfoque analiza aquel tipo de respuestas queinvolucran la sfntesis de protefnas de novo y cuyaregulaci6n de alguna manera depende de ciertashormonas vegetales conocidas, como 10son elacido abscfsico (ABA) y el acido jasm6nico (JA).

-Cambios en la composici6n de la pared celularvegetal durante el deficit de agua

M. HERNANDEZ Y A. A. COVARRUBIAS

1991/l/DBMP

-Aislamiento y caracterizaci6n de genes especf-ficas que participan en la respuesta a deficit deagua en frijol

A. A. COVARRUBIAS, R. M. SOL6RZANO, J. M. COLMENERO Y

M. CASTILLO-FICA

1991/I/DBMP

-Aislamiento y caracterizaci6n de genes paraprotefnas de pared celular de P vulgaris

B. GARCfA Y A. A. COVARRUBIAS

I 992/P/DBMP

PROGRAMA 4.2Las hormonas como reguladoras del balancehfdrico en plantas

Los niveles de acido abscfsico (ABA) se elevanen respuesta al deficit de agua, 10 cual tienecomo consecuencia el cerrado de 10s estomasevitando de esta manera que la planta siga per-diendo agua por transpiraci6n. Multiples obser-vaciones sugieren que el ABA tam bien pudieraparticipar en la regulaci6n osm6tica de la celulavegetal. Es de nuestro interes el entender la fun-ci6n del ABA como un mediador celular de cier-tos mecanismos inducidos par el deficit de agua.

-Caracterizaci6n de genes involucrados en larespuesta a ABA en frijol

R. M. SOL6RZANO, J. M. COLMENERO Y A. COVARRUBIAS

1991/l/DBMP

- Estudios sobre el papel de acido abscfsico enla germinaci6n de A thaliana

A. A. COVARRUBIAS Y A. GARCIARRUBIO

I 991/PIDBMP

PROGRAMA 4.3Caracterizaci6n estructural y funcionalde osmolitos y protefnas inducidaspor el estres hfdrico

Entre las estrategias adaptativas de las plantas ala sequfa, las plantas de "resurrecci6n" represen-tan un caso unico ya que toleran una deshidra-taci6n severa, al igual que los embriones de lasemillas.

Se ha encontrado un grupo de protefnas indu-cidas durante la sequfa en hojas y en callos de laplanta de resurrecci6n africana Craterostigma planta-gineum. Las clonas de cDNA que corresponden ala mayarfa de estas protefnas, han sido aisladaspor hibridizaci6n diferencial. La secuencia delDNA de algunos de estos genes revela que codi-fican para protefnas de posible funci6n osmo-protectora. Recientemente algunos de estosgenes han sido transferidos a tabaco para estu-diar el efecto fisiol6gico de estas protefnas al serexpresadas en plantas sensibles a la sequfa. Asi-mismo, se han localizado algunas de las protef-nas inducidas durante la sequfa en Craterostigma,par medio del microscopio electr6nico, en elcitosol y en el estoma y los tilacoides de los clo-roplastos.

Par otro lado, se sabe que en los microorga-nismos, algunos invertebrados y plantas quesobreviven a la sequfa, se acumulan solutoscompatibles can el metabolismo como respues-ta a la desecaci6n, ejerciendo un efecto osmorre-gulador. En las plantas de "resurrecci6n" lososmorreguladores mas conocidos son sacarosa,que se acumula en C plantagineum, y trehalosa pre-

INFORME ANUAL 1994

sente en la planta nativa de Mexico, Selaginella lepi-dophJ,Jlla.Este disacarido tiene ademas una funci6ncomo protector de estructuras subcelulares enausencia de agua. En otras plantas de toleranciamoderada a la sequfa 0 salinidad, se acumulaprolina 0 glidn-betafna en respuesta al est resosm6tico. Por ultimo, se ha encontrado que enlas semi lias de algunos cereales los embrionesmaduros acumulan polioles como parte delmecanismo molecular para mantener viables alas semillas durante la latencia. La sobreexpre-si6n en plantas transgenicas de algunos de estoscompuestos podrfa contribuir al mejoramientopara la tolerancia a la sequfa.

-Caracterizaci6n de la serial de transporte al clo-roplasto en la protefna 3-06 de Craterostigma

A. CARTAJENA Y G. ITURRIAGA

1991/1/DBMP-Aislamiento del gene de la Trehalosa -6-P sin-tasa de Selaginella lepidophJ,Jlla

R. ZENTELLA Y G. ITURRIAGA

1993/P/DBMP-Obtenci6n del gene que codifica para la betafnaldehfdo deshidrogenasa de Amaranthus hJ,Jpochon-driacus

J. LEGARIA Y G. ITURRIAGA

I993/P/DBMP-Sobreexpresi6n de la aldosa reductasa de ceba-da en plantas transgenicas

J. w. AYALA Y G. ITURRIAGA

I993/P/DBMP- Mutagenesis de protoplastos de tabaco con T-DNA para la selecci6n de mutantes que tolerenel estres osm6tico

j. w. AYALA, R. GAXIOLA Y G. ITURRIAGA

I993/P/DBMP

PROGRAMA 4.4Estudio de la regulaci6n de la expresi6ngenetica durante el estres hfdrico

El mecanismo por el cual el estres hfdrico estransducido en expresi6n genetica aun es desco-

nocido. Se sabe que el fitorregulador acido abs-dsico (ABA) esta involucrado en este proceso.Los genes que responden al estres sintetizandoprotefnas osmoprotectoras deben ser activadospor factores de transcripci6n que coordinen laexpresi6n simultanea de los genes durante lasequfa. Como un primer paso en la disecci6nmolecular de la transducci6n de la serial delestres hfdrico, se decidi6 aislar genes que codifi-quen para factores de transcripci6n de la plantaCraterostigma. Uno de dichos genes, Cpm I 0, se re-gula por ABA y codifica para un factor con altahomologfa a la oncoprotefna Myb de los verte-brados. EI papel que juega CpmlO en la sequfaesta siendo dilucidado. En la actualidad, se es-tan caracterizando algunos de estos genes a ni-vel molecular

- Estudio molecular y fisiol6gico de los genesmyb en Craterostigma

R. GHARAIBEH, F. HERNANDEZ Y G. ITURRIAGA

I 99l/I/DBMP

PROGRAMA 4.5Caracterizaci6n de genes inducidos par acidoabscfsico en un cultivo de celulas ensuspensi6n de frijol (Phaseolus vulgaris)

La colonizaci6n por las plantas de varios nichosecol6gicos ha sido posible gracias ala evoluci6nde mecanismos para contender con condicionesadversas. Estos mecanismos incluyen la activa-ci6n, en su mayor parte a nivel transcripcional,de genes cuyos productos intervienen en la pro-tecci6n de la planta mientras Ja situaci6n deestres perdura, a la vez que ayudan a su recupe-raci6n al reanudarse las condiciones favorables.Distintos grupos de genes son activados bajodiferentes condiciones de estres, sin embargo,estos conjuntos est<3n, al menos parcial mente,traslapados. Se ha reportado que los regulado-res del crecimiento vegetal, acido absdsico(ABA) y acido jasm6nico (lA) median la conver-si6n de varios tipos de estres en cambios en

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expresi6n genetica en plantas. Los tratamientosde varias especies vegetales con ABA 0 jA danlugar a la aparici6n de varias protefnas comunes,por 10 que se cree que ambas hormonas podrfanformar parte de la misma cadena de transmisi6nde la senal de estres.

En nuestro grupo se ha iniciado la caracteriza-ci6n molecular de la respuesta de un cultivo decelulas en suspensi6n de frijol, Phaseolus vulgaris, ala acci6n de ABA y jA, asf como de la interrela-ci6n que guardan estos compuestos en la cade-na de senales desde que se produce el est reshasta que se dispara la expresi6n de los genesespecfficos.

Cuando se anade a un cultivo de celulas ensuspensi6n de frijol (Phaseolus vulgaris) ABA 10-4 M,se induce claramente la acumulaci6n de cincoprotefnas de 14, 22, 36, 60 y 70 KD. Estas protef-nas estan siendo caracterizadas. Por otra parte,se han construido genotecas de DNA comple-mentario a partir de RNA mensajero de cultivosinducidos por jA 10-5 M 0 ABA 10-4 M. Mediantehibridaciones diferenciales se han identificadovarias clonas especfficas de los tratamientos conlas hormonas. Estas clonas habran de ser carac-terizadas ffsica y funcionalmente. Posteriormente,se aislaran clonas gen6micas correspondientes alas DNAc con el fin de estudiar la regulaci6n de laexpresi6n genetica en el mismo sistema de celu-las en suspensi6n, asf como en plantas transge-nicas.

-Caracterizaci6n y purificaci6n de las protefnasinducidas por ABA y jA en un cultivo de celulasen suspensi6n de frijol

L. RODRfGUEZ, E. SANTARROSA, P LE6N Y M. ROCHA

1991/l/DBMP-Obtenci6n y caracterizaci6n de clonas de DNAde genes inducidos por ABA y jA

M. J. CARMONA, ). M. COLORADO, B. GARCIA, P LE6N Y M.ROCHA

I992/P/DBMP

PROGRAMA 4.6Caracterizaci6n de genes inducidos par acidoabscfsico (ABA) y acido jasm6nico UA) en uncultivo de celulas en suspensi6n de frijol(Phaseo/us vu/garis L.)

La colonizaci6n par las plantas de varias nichosecol6gicos ha sido posible gracias a la evoluci6nde mecanismos para contender con condicionesadversas. Estos mecanismos incluyen la activa-ci6n, en su mayor parte a nivel transcripcional,de genes cuyos productos intervienen en la pro-tecci6n de la planta mientras la situaci6n deestres perdura, a la vez que ayudan a su recupe-raci6n al reanudarse las condiciones favorables.Distintos grupos de genes son activados bajodiferentes condiciones de estres, sin embargoestos conjuntos estan, al menos parcial mente,traslapados. Se ha reportado consistentementeque los reguladores del crecimiento vegetal ABAy jA median la conversi6n de varios tipos deestres en cambios en expresi6n genetica enplantas Los tratamientos de varias especiesvegetales con ABA 0 jA dan lugar a la aparici6nde varias protefnas comunes, por 10 que se creeque ambas hormonas podrfan formar parte de lamisma cadena de transmisi6n de la senal deestres.

En nuestro grupo se ha iniciado la caracteriza-ci6n molecular de la respuesta de un cultivo decelulas en suspensi6n de frijol, Pliaseolus vulgaris, a laacci6n de ABA y lA, asf como la relaci6n que guar-dan estos compuestos en la cadena de senalesdesde que se produce el est res hasta que se dis-para la expresi6n de los genes especfficos.

Dos han sido las estrategias que hemosseguido para lograr nuestro objetivo: por unaparte se ha empezado a caracterizar y purificarprotefnas que aparecen al anadir las hormonasal medio de cultivo; por otra, hem os construidogenotecas de DNA complementario (DNAc). Conrespecto a la caracterizaci6n de protefnas indu-cidas par ABA, hemos identificado un grupo deprotefnas que son exportadas al medio de culti-

INFORME ANUAL 1994

vo. Dos de ellas han sido purificadas y se estangenerando anticuerpos en raton. Por otro lado,siguiendo diversas metodologfas, estamoscomenzando a identificar, aislar y caracterizardonas especfficas de la induccion por 1A. poruna parte utilizando la metodologfa llamada"differential display" se han identificado y dona~do varios segmentos de genes inducidos por lahormona, estos se estan utilizando como sondaspara la identificacion en las genotecas de DNAcde las donas respectivas. Estas donas habrande ser caracterizadas ffsica y funcionalmente.Posteriormente, se aislaran donas genomicaspertenecientes a las de DNAc con el fin de estu~diar la regulacion de la expresion genetica en elmismo sistema de celulas en suspension. asfcomo en plantas transgenicas. Por otra parte,hemos donado varios segmentos generados porla reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)correspondientes a la enzima lipoxigenasa. invo~lucrada en la sfntesis de lA, y estamos iniciandosu caracterizacion.

-Caracterizacion y purificacion de las protefnasinducidas por ABA y IA en un cultivo de celulasen suspension de frijol

E. SANTARROSA, L. RODRIGUEZ, P LE6N Y M. ROCHA

1991/P/DBMP

-Obtencion y caracterizacion de donas de DNAcde genes inducidos por IA

B. GARCfA, P LE6N Y M. ROCHA

1991/P/DBMP

-Caracterizacion del gene de la lipoxigenasainducido por IA

). M. COLORADO, P. LE6N Y M. ROCHA

1991/I/DBMP

PROGRAMA 4.7Cultivo de tejidos vegetales

Desarrollo de tecnicas de regeneracion y multi-plicacion de diversas variedades por cultivo invitro de tejidos vegetales

Las tecnicas de regeneracion y micropropaga~cion de plantas, estan basadas en la caracterfsticade totipotencialidad de la celula vegetal. Esta ca~racterfstica, permite generar de un fragmento detejido vegetal, un tejido desdiferenciado a partirdel cual se puede inducir el desarrrolio de unanueva planta. Existen diferentes vfas de regenera~cion de plantas, y dependiendo de los objetivosfinales. se emplea una u otra vfa. Entre las mascomunes estan: a) la regeneracion a partir demeristemos, cuya principal ventaja es la de gene~rar plantas libres de patogenos; b) regeneracionpor organogenesis a partir de callos desdiferen~ciados. Dadas la alta tasa de division celular y laconsecuente variabilidad genetica que esto pro-duce (variacion somoclonal). esta tecnica se haempleado para la generacion de nuevas varieda-des; c) regeneracion por embriogenesis somati~ca. la cual consiste en promover el desarrollo deembriones a partir de un tejido desdiferenciado.Esta tecnica tiene como ventajas el que no afec-ta el genotipo de la planta y que permite la mul-tiplicacion masiva de la planta madre.

Actualmente en el laboratorio se est a traba-jando en los siguientes proyectos: a) regeneracionde frijol a partir de meristemos, con el objetivo deobtener plantas libres de patogenos y con ellasproducir semillas certificadas con caracterfsti~cas fitosanitarias optimas; b) regeneracion y mul-tiplicacion de Valeriana edulis, con el objetivo detener una metodologfa que permita por un lado,rescatar un recurso en peligro de extincion y porotro, el desarrollar una estrategia que permita laproduccion de esta planta para satisfacer su de~manda en la industria farmaceutica; c) regenera~cion y multiplicacion por embriogenesis somaticade variedades criollas de cebolla. Este proyectotiene como objetivo el de generar plantas decebolla libres de patogenos y el de tener la me~todologfa de multiplicacion de variedades nacio~nales que permitan satisfacer la demanda inter-na de semilla certificada de cebolla.

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGiA

F. FLORES Y M. LARA

1991/I/DBMP

eRegeneraci6n y multiplicaci6n de Valeriana edulisP. CASTILLO, F. FLORES Y M. LARA

1991/I/DBMP

eRegeneraci6n y multiplicaci6n por embriogene-sis somatica de variedades criollas de cebolla.

P. L6PEZ Y M. LARA

I 993/I/DBMP

PROGRAMA 4.8Caracterizacion de una mutante albinade Arabidopsis thaliana obtenidapor insercion de un T-DNA

Uno de los problemas para el analisis molecularde un gen mutante en organismos superiores essu aislamiento de una manera sencilla. Esto sepuede hacer facilmente si la mutaci6n es gene-rada a traves de la inserci6n de un segmento deDNA bien caracterizado. En plantas se ha logra-do esto ultimo usando elementos transponiblescomo AdDs de mafz, 0 bien, el T-DNA del plas-mido Ti de Agrobacterium tumefaciens.

Mediante este ultimo enfoque se gener6 unacolecci6n de mutantes en Arabidopsis tflaliana. Una deestas mutantes fue seleccionada por nuestrogrupo para su estudio. La planta mutante pre-senta las siguientes caracterfsticas: lleva unamutacion recesiva que provoca un fenotipo albi-no, este fenotipo esta asociado a la presenciadel T-DNA; en estudios de microscopfa se en-contr6 que la mutaci6n impide el desarrollo nor-mal del doroplasto. Debido a Ips caracterfsticasmencionadas, pensamos que esta mutante es degran interes para ayudar a comprender a nivelmolecular el desarrollo del doroplasto en plan-tas superiores, de ahf que, nuestro objetivo in i-cial sea el de caracterizar al gen cuya mutaci6nprovoca el fenotipo albino, asf como el de tratarde identificar la funci6n de la protefna para lacual codifica.

Usando como sonda un segmento del T-DNAse ha donado el gene mutante a partir de unagenoteca construida con DNA total de la planta

mutante. Una vez caracterizada la dona que con-tenfa al gene mutante se aislaron varias donasde DNA complementario (DNAc). Una de estasdonas ha sido completamente secuenciada, par-te de la dona mutante tam bien fue secuenciada.En la comparaci6n hecha con las secuenciasalmacenadas en un banco, se encontr6 que lasecuencia nucleotfdica de este gene, al cualhemos denominado 119, tenfa un alto grado desimilitud con un gene que se encontraba en unoper6n fotosintetico en la bacteria Rhodobacter cap-sulatus. Datos obtenidos de experimentos dehibridaci6n contra RNA aislado de la planta sil-vestre y de la planta albina, nos han permitidodemostrar que no hay RNA mensajero espedficode 119en esta ultima. Ademas, hemos encontra-do que la acumulaci6n del mensajero espedficoresponde a la presencia de luz. Utilizando dife-rentes sondas correspondientes a igual numerode genes, tanto fotosinteticos como no fotosin-teticos, hemos demostrado que en la plantaalbina la expresi6n de genes fotosinteticos seencuentra reprimida, esto ocurre tanto paragenes nudeares como para doroplasticos.

Por otro lado, se ha obtenido una dona gen6-mica con la cual se esta tratando de comple-mentar a la planta mutante, con el fin de demos-trar sin lugar a dudas que el fenotipo albino sedebe a la mutacion en el gene 119. Asimismo,con la ayuda de esta ultima dona se llevaran acabo estudios de regulaci6n de la expresi6ngenetica. Tambien se trataran de obtener anti-cuerpos contra el producto de 119que permitanlocalizar esta protefna a nivel subcelular. Esteproyecto se realiza en colaboraci6n con la Dra.Alejandra Mandel, de la Universidad de Califor-nia en San Diego, y con el Dr. Luis Herrera Estre-lla, del Cinvestav-Irapuato.

eAnalisis del patr6n de aparici6n de RNA men-sajero del gene 119en A thaliana en respuesta adistintas condiciones de crecimiento y en rela-cion a su expresi6n en distintos 6rganos de laplanta

INFORME ANUAL 1994

G. PEDRERO, P LE6N Y M. ROCHA

1991/P/DBMP

eAnaJisis de la regi6n de control del gene 119 enplantas transgenicas

G. PEDRERO, P LE6N Y M. ROCHA

I 992/P/DBMP

eLocalizaci6n subcelular del producto del gene119

G PEDRERO, P LE6N Y M. ROCHA

I 992/P/DBMP

eComplementaci6n de la planta mutante con elgene 119 silvestre

P LE6N, A. MANDEL, L. HERRERA-EsTRELLA Y M. ROCHA

I 992/P/DBMP

PROGRAMA 4.9Caracterizaci6n de mutantes fotosi nteticasde Arabidopsis y mafz

La obtenci6n y caracterizaci6n de mutantes hapermitido el descubrimiento de un sinnumero degenes importantes en diferentes procesos meta-b6licos asf como el entendimiento de la funci6nde dichos genes. En el caso de fotosfntesis exis-ten aun una gran cantidad de genes que no hansido aislados, especialmente aquellos involucra-dos en los procesos regulatorios. Uno de los pro-blemas para el analisis molecular de un genemutante en organismos superiores es su aisla-miento de una manera sencilla. Esto se puedehacer facilmente si la mutaci6n es generada atraves de la inserci6n de un segmento de DNAbien caracterizado. En plantas se ha logrado estoultimo usando elementos tipo transposones,como AdDs de mafz, 0 bien, el T-DNA del plas-mido Ti de Agrobacterium tumefaciens.

a) Caracterizaci6n de una mutante albina de Am-bidopsis thaliana obtenida por inserci6n de un T-DNA

Mediante el uso de T-DNA se gener6 una colec-ci6n de mutantes en Arabidopsis tnaliana; una deestas mutantes fue seleccionada por nuestro gru-po para su estudio. La planta mutante presentalas siguientes caracterfsticas: Ileva una mutaci6n

recesiva que provoca un fenotipo albino, estefenotipo esta asociado a la presencia del T-DNA;en estudios de microscopfa se encontr6 que lamutaci6n impide el desarrollo normal del c1oro-plasto. Debido alas caracterfsticas mencionadas,pensamos que esta mutante es de gran interespara ayudar a comprender a nivel molecular eldesarrollo del c1oroplasto en plantas superiores,de ahf que nuestro objetivo inicial sea el decaracterizar al gene, denominado 1-19, cuyamutaci6n provoca el fenotipo albino, asf como elde tratar de identificar la funci6n de la protefnapara la cual codifica.

Inicialmente se obtuvieron c10nas de DNAc ygen6micas de 1-19, dichas c10nas fueron secuen-ciadas. La secuencia nucleotfdica determinadafue comparada con las secuencias almacenadasen los bancos de datos. Se encontr6 que estasecuencia tenfa 55.9%de identidad con un geneque se encontraba en un oper6n fotosintetico enla bacteria Rnodobacter capsulatus. AI comparar lassecuencias de las protefnas deducidas de lasecuencias nucleotfdicas de ambos genes seencontr6 que ten fan 54.4%de identidad.

Como se mencion6 ya, la protefna 1-19 essemejante a una protefna codificada en un ope-r6n fotosintetico de R. capsulatus, por 10 tanto,pensamos que serfa mas sencillo caracterizar laprotefna y el gene correspondientes de la bacte-ria. Con este objetivo, haciendo uso de la meto-dologfa denominada "Reacci6n en Cadena dePolimerasa" (PCR). hemos amplificado los seg-mentos de los genes correspondientes de lasbacterias R. capsulatus y R. spnaeroides, mediante lautilizaci6n de dos primeros complementarios aambas cadenas del gene de R. capsulatus. A estossegmentos se les ha introducido un marcador deresistencia a espectinomicina, para que, porrecombinaci6n hom610ga, se mute al gene bac-teriano. Esta mutante se utilizara en distintaspruebas fenotfpicas que nos ayudaran a determi-nar la funci6n de la protefna 1-19.

Con el objeto de demostrar que el fenotipo dela planta mutante es debido a la inserci6n del T-DNA en el gene que hemos aislado, se ha intro-ducido el gene silvestre en la planta mutante por

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transformaci6n con Agrobacterium tumefaciens. En elmomento actual tenemos ya plantas regeneradasque parecen tener un fenotipo silvestre. Se rea-liz6 tam bien un mapeo de polimorfismo de frag-mentos de restricci6n (RFLP). de acuerdo a este,sabemos que 1-19 mapea en el cromosoma 4 dela planta.

b) Identificaci6n de mutantes fotosinteticas demalz a partir de mutantes generadas por eltranspos6n Mu

Plantas como el malz presentan variantes en elproceso de fotoslntesis como la denominadafotoslntesis tipo C4; en estas plantas existe unnivel mas de regulaci6n que involucra la expresi6ncelula espedfica para los genes fotosinteticos.Actualmente poco se conoce de los mecanismosde regulaci6n involucrados en la diferenciaci6n yfuncionamiento de la fotosintesis tipo C4. Lageneraci6n y caracterizaci6n de mutantes enplantas con este tipo de fotoslntesis permitira laidentificaci6n de dichos genes. EI malz comomodelo de estudio presenta algunas ventajas:par un lado, es tal vez una de las plantas masestudiadas a nivel genetico y molecular, por elotro, en esta planta se han aislado y caracteriza-do secuencias de transposici6n.

-Caracterizaci6n del gene de Rodobacter corres-pondiente a 1-19

c. TRE/O, G. DREYFUS, M. ROCHA Y P. LE6N

1991/P/DBMP/IFC

-Complementaci6n de la planta mutante con elgene 1-19 silvestre.

P. LE6N, A. MANDEL, L. HERRERA-EsTRELLA Y M. ROCHA

1991tTIDBMP/Cinvestav

- Estudio de la regi6n de control del gene 1-19G. PEDRERO, L. MARTINEZ, P. LE6N Y M. ROCHA

I 992/P/DBMP

- Clonaci6n de los genes correspondientes a 1-19de otras plantas

A. ARROYO, C. TREIO, M. ROCHA Y P. LE6N

I 994/l/DBMP

-Obtenci6n y caracterizaci6n de mutantes foto-sinteticas de malz generadas par el transpos6nmutador

M.L. GUTIERREZ, V. WALBOT, M. ROCHA Y P. LE6N

I 994/l/DBMP

- Expresi6n genica en la cofia de la ralz del maiz(Zea maids)

X. ALVARADO, R. LUIAN Y G. CASSAB

I 993/l/DBMP

-Aislamiento y caracterizaci6n de mutantes enArabidopsis tflaliana en hidrotropismo y producci6nde mudlago

D. EAPAN, G. PONCE Y G. CASSAB

1993/l/DBMP

PROGRAMA 4.10Regulaci6n metab61ica de la fotoslntesis

Aunque durante mucho tiempo ha sido reconoci-do que existe un mecanismo de autorregulaci6nde la fotosintesis por los niveles de carbono, elmecanismo a nivel molecular de esta regulaci6nes aun desconocido. EI descubrimiento recientepor el grupo de la Dra. )en Sheen de que glucosay acetato desencadenan una represi6n global delos genes fotosinteticos en maiz a nivel de trans-cripci6n fue la primera evidencia para pensar enun modelo de regulaci6n metab6lica en plantassuperiares Al parecer, este mecanismo de repre-si6n parece ser universal yes capaz de anular laregulaci6n por luz, tejido espedfico y estado dedesarrollo. Potencial mente esta regulaci6n es labase molecular de la interacci6n entre Fuente ycaptador (sink-source). Usando el sistema de ex-presi6n transitoria con genes quimericos en losque se ha fusionado la regi6n promotora de genesfotosinteticos al gene reportero CAT se demostr6que la expresi6n de siete diferentes genes foto-sinteticos de maiz son reprimidos por glucosa.Los experimentos realizados hasta el momentasugieren que la actividad de la enzima hexoqui-nasa es necesaria para detectar fa concentraci6nde glucosa intracelular y mandar la sefial para larepresi6n metab6lica. Con el prop6sito de inves-tigar este resultado mas a fondo hemos c1onado

INFORME ANUAL 1994"

dos genes de hexoquinasa de Arabidopsis thaliana atraves de complementaci6n de mutantes delevadura. Estos genes fueron secuenciados y laexpresi6n de ambos analizada bajo diferentescondiciones de crecimiento.

Ya que la represi6n metab6lica parece ser unfen6meno universal dentro de las plantas supe-riares, es posible la selecci6n, caracterizaci6n ycomplementaci6n de mutantes en Arabidopsis, elcual es un sistema de mas facil manejo en com-paraci6n con mafz. Usando como metodo deselecci6n la presencia de un analogo no meta-bolizable de glucosa, 2-deoxiglucosa, hemostamizado semillas de Arabidopsis mutagenizadasya sea por etil-metano sulfonato 0 par la inser-ci6n de T-DNA Se han seleccionado plantas queen presencia de este ana]ogo permanecen verdes.Se han buscado mutantes en un total de 35 000semillas para el caso de EMS y 5 000 para elcaso de inserci6n por T-DNA Aquellas plantasque parecen ser resistentes a la presencia de 2-deoxiglucosa han sido aisladas para la produc-ci6n de semillas y su posterior caracterizaci6n.

eAislamiento de mutantes en represi6n metab6-lica

P LEON

1994/P/DBMP

eEstudio de la expresi6n de genes fotosinteticosen plantas de Arabidopsis crecidas con diferentesconcentraciones de azucares

). M. ESTEVEZ Y P LEON

I 994/I/DBMP

La levadura como un modelo para el aislamientode genes involucrados en la respuesta dela planta a estres salino y osm6tico

Aproximadamente una tercera parte de las tie-rras agrfcolas de regadfo en el planeta tienenproblemas de salinizaci6n, y la mayorfa de las

plantas cultivadas son muy sensibles a saL Esteproblema se agudiza en regiones aridas y semia-ridas donde las plantas deben enfrentar, ade-mas, condiciones de extrema sequfa. Par otraparte, la tecnologfa para modificar el suelo 0 elagua de regadfo es muy costosa. De esta mane-ra, una de las principales alternativas consisteen mejorar geneticamente la tolerancia de lasplantas cultivadas a salinidad y/o a sequfa.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es reconocidacomo un microarganismo eucariote ideal pararealizar estudios biol6gicos. A pesar de que lalevadura tiene una complejidad genetica mayorque las bacterias, comparte la mayor parte delas ventajas tecnicas que han permitido un rapi-do progreso en la genetica molecular de proca-riotes. Algunas de las propiedades que hacen ala levadura apta para estudios biol6gicos inclu-yen un rapido crecimiento, la facilidad de reali-zar replicas y aislar mutantes, un sistema gene-tico bien definido y, mas importante aun, unsistema de transformaci6n de DNA muy versatiL

Es pertinente hacer notar que la levaduracomparte con celulas vegetales algunas caracte-rfsticas marfol6gicas relevantes para el estudiode los mecanismos de osmorregulaci6n, talescomo una pared celular, vacuolar, y el hecho deque ambas son sesiles.

Un escrutinio de los procesos celulares invo-lucrados en la adaptaci6n de microorganismos yplantas a salinidad sugiere que genes de haloto-lerancia podrfan corresponder a componentescatalftico/regulatorios de cualquier respuesta deprotecci6n (sfntesis de osmolitos, transporte deiones) 0 a procesos metab6licos (sfntesis deprotefnas, reacciones biosinteticas) mas sensi-bles a estres salino. Dada la complejidad de estarespuesta y puesto que rio se han identificadolos pasos de protecci6n 0 metab6licos crfticospara la tolerancia a salinidad, no se puede reali-zar una manipulaci6n genetica de este importan-te problema bajo bases racionales.

Algunas caracterfsticas de la respuesta de lalevadura a un estres osm6tico mas general, quepudiera estar dado al exponer a celulas vivas adiferentes medios soluciones con alta osmolari-

INSTITUTO DE BId'TECNOLOGiA

dad, pudieran compartirse con la respuesta alestres salino.

Partiendo de la hipotesis de que alguno delos mecanismos basicos involucrados en estostipos de respuestas es similar entre celulasvegetales y un eucariote sencillo como la leva-dura, consideramos que el enfoque funcional decomplementacion de mutantes halo y osmosen-sibles pudiera ser una herramienta importantepara poder aislar genes heterologos, en particu-lar de plantas que participen en estos procesos.

-Genes que participan en la respuesta a estresosmotico en levaduras y plantas

A GARAY Y A A COVARRUBIAS

I 992/P/DBMP

-Genes que participan en la halotolerancia enlevaduras y plantas

R. GAXIOLA, E. BENITEZ, O. MASCORRO Y A A COVARRUBIAS

I 993/1/DBMP

PROGRAMA 4.12Analisis genetico-molecular de la induccionde la termotolerancia en levaduras y plantassuperiores

Todos los organismos vivos se caracterizan portener temperaturas optimas para su crecimientoy desarrollo. Las condiciones de temperatura,humedad, luz, ete. en el medio ambiente, varfanen el espacio y en el tiempo presentando valoresmaximos y mfnimos muy alejados muchas vecesde las condiciones optimas para el organismoen cuestion. Esto explica en gran medida la dis-tribucion geografica y estacional de las distintasespecies vivientes. Los organismos vivos hangenerado mecanismos que les permiten adap-tarse a estas condiciones cambiantes del medioambiente. En este programa se pretende estu-diar el 0 los mecanismos de adaptacion de lalevadura y las plantas a temperaturas letales.

Cuando a un organismo se Ie expone a tem-peraturas supraoptimas para su crecimiento ( 10

a 15°C por arriba de la optima). muchas de susactividades celulares se yen alteradas. Uno delos cambios mas dramaticos a nivel nuclear es lainduccion de la transcripcion de un grupo degenes que normalmente no se expresan enausencia de estres. A estos genes se les denomi-na genes del "estres por calor" y codifican protef-nas mejor conocidas como las protefnas del"estres por calor" (pepe). La sfntesis de estas pro-tefnas (pepe) esta directamente correlacionadacon la sobrevivencia a este incremento de tem-peratura. Sin embargo, en condiciones muyextremas de temperatura, las celulas muestranletalidad (20 a 25°C por arriba de la optima). Seha observado que, si antes de exponer a unacelula a una temperatura letal. se Ie expone pri-mero por un periodo breve a una temperatura de"estres por calor", seguido de un lapso a la tem-peratura optima de crecimiento, la celula sobre-vive a la temperatura letal. A este fenomeno seIe ha lIamado induccion de la termotolerancia.En la levadura S. eerevisiae una de las pepe (pepeI04)es necesaria para la induccion de la termotole-rancia. Ademas del gene que codifica a pepe I 04,se ha propuesto que en S eerevisiae existen otrasgenes, aun no identificados, involucrados eneste fenomeno.

El objetivo general de este proyecto es elobtener mutantes de S. eerevisiae y A tnaliana en losgenes que confieren induccion de la termotole-rancia. Estamos interesados en mutantes quemuestren 105siguientes fenotipos: a) deficienciaen la induccion de la termotolerancia y b) termo-tolerancia constitutiva. Las metas del prayectoson la clonacion molecular de 105genes involu-crados en la induccion de la termotolerancia asfcomo la caracterizaci6n funcional de las pratef-nas codificadas por esos genes.

Otro enfoque del proyecto es la caracteriza-cion de cDNAs que codifican pepe de alto pesomolecular en mafz. Hemos 10gradC(j1 aislamientode la clona p31 que codifica para pepe9& de mafz.EI analisis de la secuencia nucleotfdica de pepe98predice una protefna que muestra una similituddel 80'7'0 con la secuencia de pepe I 04 de S eerevisiae.Estos datos sugieren que pepe98 es el gene

INFORME ANUAL 1994

hom6logo de pepcl04 en el mafz. Nuestros objeti-vos inmediatos estan encaminados a obtener lacaracterizaci6n del cDNA completo que codificaa pepc98 de mafz, asf como en caracterizar supapel fisiol6gico durante la termotolerancia ydurante otros estreses (par ejemplo: sequfa) enplantas como el mafz y Arabidopsis thaliana median-te el estudio de plantas transgenicas que sobreexpresen 0 que no expresen a pepc98. Tambienestudiaremos la funci6n de pepc98 desde un pun-to de vista bioqufmico.

-Obtenci6n de mutantes constitutivos y defi-cientes en la inducci6n de la termotoleranciaen A. thaliana

). NIETO Y C. SEGAL

I 994/I/DBMP

-Obtenci6n de mutantes constitutivos y def:-cientes en la inducci6n de la termotoleranciaen S. cerevisiae

I. NIETO Y J. L. FOLCH

I 994/I/DBMP

-pepc98: estructura genica, expresi6n y papeldurante la termotolerancia en plantas vasculares

J. NIETO Y C. SEGAL

I 993/I/DBMP

PROGRAMA 4.13Arquitectura de la pared celular en plantassuperiores

En este programa se estudia la arquitectura dela pared celular. La presencia de la pared celulares una de las caracterfsticas mas sobresalientesque distingue alas celulas animales de las celu-

las vegetales. A pesar de la importancia de la pa-red celular en determinar la funci6n de los dife-rentes tipos de celulas vegetales, todavfa se des-conoce c6mo es que sus componentes seensamblan en un tipo de celula en particular.Para poder entender c6mo es que se lIevan acabo las interacciones entre los diversos compo-nentes de la pared celular tales como protefnasestructurales (extensinasj, pectinas, celulosa,lignina, suberina, etc., utilizamos plantas defi-cientes en boro como modelo, puesto que estasplantas son afectadas principal mente en laestructura y funci6n de la gran mayorfa de susparedes celulares, esto es, se comportan comomutantes afectadas en la pared celular. Para rea-lizar este proyecto estamos utilizando metodosde bioqufmica y biologfa celular que nos permi-ten analizar los diferentes componentes de lapared celular en plantas deficientes de boro ycontrol, con la meta de entender las interaccio-nes in muro de las protefnas estructurales conotras componentes de la pared. Ademas, esta-mos investigando las posibles interaccionesentre protefnas del citoesqueleto y protefnas dela pared celular, en particular entre prafilina yextensina.

-Caracterizaci6n de la pared celular de n6dulosde plantas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) crecidasen ausencia de boro

A. REYES, C. MARIGOLD, M. FIGAS, L. CASTREJ6N Y G. CASSAB

I 993/I/DBMP

- Interacci6n de profilina con las extensinas de lapared celular

L. CASTREJ6N Y G. CASSAB

I 993/I/DBMP