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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
DOUTORADO
Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos
Selaginella convoluta (Arn.) Spring:
uma abordagem fitoquímica aliada a
estudos ômicos
FERNANDA PRISCILA SANTOS REGINALDO
Natal/RN, 2021
Selaginella convoluta (Arn.) Spring:
uma abordagem fitoquímica aliada a estudos
ômicos
Tese apresentada por Fernanda Priscila Santos Reginaldo para obtenção
do GRAU DE DOUTOR em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em
Medicamentos
Departamento de Farmácia
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Orientador (a): Prof. Dr. Raquel Brandt Giordani
Co-orientador: Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro
Co-orientador: Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura
Natal/RN, 2021
“Para ser grande, sê inteiro: nada teu exagera ou exclui.
Sê todo em cada coisa. Põe quanto és no mínimo que fazes”.
Fernando Pessoa
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. As análises de metaboloma
foram desenvolvidas nos laboratórios do NuBBE (Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e
Ecofisiologia de Produtos Naturais) na Universidade Estadual Paulista (Unesp -
Araraquara, SP). As análises de proteoma foram desenvolvidas em colaboração com o
Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas da Universidade de Brasília (UnB).
Um estágio doutoral na Universidade de Granada, Espanha com enfoque em
desenvolvimento de sistemas farmacêuticos baseados em argilas para otimização da
eficácia de moléculas bioativas foi realizado.
A bolsa de estudos CAPES contemplou todo o período de desenvolvimento deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa de estudos;
Ao Programa de Pós-graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em
Medicamentos pela oportunidade de formação de qualidade.
A Pro-Reitoria de pesquisa ‒ UFRN pelo auxílio financeiro que possibilitou meu
estágio doutoral no exterior.
A minha orientadora, Prof. Dr. Raquel Brandt Giordani, agradeço a confiança e
as oportunidades dadas, as quais me proporcionaram um grande crescimento profissional.
Muito obrigada por sempre nos ensinar com seu exemplo de diplomacia e
profissionalismo.
Ao Prof. Dr. Alberto José Cavalheiro pela orientação durante meu estágio doutoral
no NuBBE – Unesp; O mentor que mudou meu olhar sobre a ciência, que me orientou e
tanto me ensinou pacientemente, contribuindo imensamente para o meu crescimento
profissional. Muito obrigada.
Aos técnicos do NuBBE – João Bronzel, Juliana Rodrigues e Nivaldo Boralle por
toda paciência, disponibilidade e ajuda em cada análise.
A todos os colegas do NuBBE pela troca de experiência e os divertidos cafés da
tarde que nos renderam muito insights sobre Ciência.
A todos os colaboradores desta tese: Prof. Dr. Ian Castro-Gamboa, Dr. Rafael
Freire, Prof. Dr. Fernando Hallwass, Prof. Dr. Arthur Germano Fett-Neto, Prof. Dr.
Marcelo Valle de Sousa, Prof. Dr. Paulo Costa Carvalho, Marlon Dias Mariano Santos e
Euzébio Guimarães.
A Prof. Dr. Fernanda Nervo Raffin por toda paciência e orientação no
desenvolvimento de sistemas farmacêuticos; tenho muita admiração; para mim é um
grande exemplo de professora, pesquisadora, humildade e simplicidade; muito obrigada
por tudo.
Ao Prof. Dr. Cesar Viseras Iborra por permitir minha estada em seu laboratório
na Universidade de Granada, Espanha e aprender um pouco sobre o desenvolvimento de
sistemas farmacêuticas baseados em argilas; a todo seu grupo de pesquisa ‒ especialmente
agradeço: Rita, Ana e Fátima.
Ao Prof. Túlio Moura pela co-orientação no desenvolvimento de sistemas
farmacêuticos.
A todos os professores da Faculdade de Farmácia da UFRN que participaram da
construção da minha vida acadêmica. Muito obrigada.
A todos os co-autores das publicações relacionadas a esta tese, pela dedicação e
parceria. Muito obrigada.
A Paula Bueno pela amizade, troca de experiências e colaboração nas análises de
quimiometria.
A Estela Lourenço pela amizade e colaboração nas análises de potencial bioativo
in-silico.
A Isabelly Costa pela amizade, paciência, companheirismo e parceria nos
experimentos.
A Letícia Gondim pela tão linda amizade e troca de experiências.
Aos amigos que o PNBio me concedeu: Bárbara, Themístocles, Emerson, Larissa,
Ariane e Ivan. Muito obrigada por tudo.
A todos os colegas do PNBio.
A Bruno Ekawa pelo carinho, companheirismo, apoio e incentivo. Muito
obrigada.
A minha família por todo carinho e incentivo – especialmente agradeço: aos meus
pais e também a minha irmã Silvania, a quem tanto admiro como ser humano e
profissional; exemplo de perseverança, inteligência e coragem. Muito obrigada por
acreditar em mim, sempre me incentivar e ajudar na construção da minha carreira
acadêmica. Obrigada por tudo.
RESUMO
O gênero Selaginella, o maior gênero de Lycopodiophyta compreende cerca de
700-750 espécies, das quais várias espécies são reconhecidas por suas atividades
farmacológicas. Nosso overview sobre os aspectos fitoquímico e bioativos apontaram que
futuros estudos devem fornecer dados para melhor explorar o potencial biológico das
moléculas bioativas de Selaginellaceae, desenvolver estudos sobre a toxicidade e, por
último, concentrar esforços em elucidar mecanismos de ação para propriedades
biológicas já relatadas. A família conseguiu sobreviver a múltiplas pressões bióticas e
abióticas durante os últimos 400 milhões de anos. Diversas espécies do gênero
Selaginella adquiriram um interessante traço evolutivo: tolerância à dessecação (TD).
Selaginella convoluta é uma planta tolerante à dessecação nativa do semiárido brasileiro.
Plantas TD possuem mecanismos de resistência à seca altamente eficazes que permitem
sua sobrevivência em condições extremas. Neste estudo, investigamos S. convoluta em
dois estados de hidratação: (i) planta no estado desidratado ‒ conforme encontrada em
campo na Caatinga; e (ii) planta no estado hidratado ‒ reidratação adquirida em
laboratório. Os dados de proteoma apontaram que partes aéreas (PA) e raízes (RZ)
parecem ter diferentes estratégias em resposta aos diferentes estados de hidratação; no
entanto, PA e RZ parecem ter uma resposta bem orquestrada para regular a tolerância à
dessecação. A presença de enzimas envolvidas na biossíntese de metabólitos
especializados como fenólicos, terpenoides, bem como metabólitos contendo
nitrogênio/enxofre foram apontadas através da análise do proteoma. O perfil metabólico
baseado em RMN apontou a presença de metabólitos como carboidratos e fenólicos
relacionados aos eventos de tolerância à dessecação, corroborando com os dados de
proteoma. Como um achado inédito, o alcaloide anotado mais importante foi a anabasina.
Os metabólitos especializados, flavonoides, biflavonoides e selaginelinas foram os
principais derivados fenólicos anotados. Assim, realizamos uma análise de LC-MS/MS
combinada com a abordagem de molecular networking (MN) para avaliar a
quimiodiversidade de flavonoides e selaginelinas. Até o momento, este foi o primeiro
estudo sobre Selaginella spp. usando a abordagem de MN que mostrou não somente uma
proposta do padrão de fragmentação para todas as selaginelinas anotadas, mas também a
predição de novas selaginelinas com base nos dados espectrais MS/MS. Diversos
potenciais biológicos de selaginelinas de Selaginella spp. foram relatados. As
selaginelinas são produzidas naturalmente em níveis baixos na planta, o que torna a
extração química desses metabólitos difícil e demorada. Nesse contexto, o metil
jasmonato (MeJA) tem sido utilizado para induzir metabólitos especializados de interesse
farmacêutico. Os nossos dados apontaram que o MeJA pode ser uma interessante
alternativa para induzir o acúmulo de selaginelinas em S. convoluta. Ainda, os estudos in
silico apontaram potenciais alvos biológicos para as selaginelinas: antineurodegenerativo,
antiproliferativo e antiparasitário. A abordagem de MN permitiu a predição de sete
selaginelinas até então não descritas na literatura, as quais contribuem como uma nova
informação química para esta espécie.
Palavras-chave: Selaginelinas. Anabasina. Proteoma. Metaboloma. Tolerância à
dessecação. Metiljasmonato.
ABSTRACT
The genus Selaginella, the largest genus of Lycopodiophyta comprise about 700-
750 species, which several species are recognized for their pharmacological activities.
Our overview of the phytochemical and bioactive aspects pointed out that future studies
should afford valuable new data on better explore the biological potential of the flavonoid
amentoflavone and their derivatives as chemical bioactive entities; develop studies about
toxicity and, finally, concentrate efforts on elucidate mechanisms of action for biological
properties already reported. The family Selaginellaceae managed to survive the many
biotic and abiotic pressures during the last 400 million years. Several species of the genus
Selaginella have been acquired an interesting evolutionary trait: desiccation tolerance
(DT). Selaginella convoluta is a desiccation-tolerant plant native from Brazilian semiarid.
DT plants have highly effective drought-resistance mechanisms that allow their survival
under extreme conditions. In this study we investigate Selaginella convoluta in two
hydration states: (i) dehydrated – harvested in the natural semiarid environment; and (ii)
hydrated – after acclimatization in lab. The proteome dataset pointed out that shoots and
roots appear to have different strategies in response to different hydration states; however,
appear to have a well-orchestrated response to regulate desiccation tolerance. The
presence of enzymes involved in the biosynthesis of specialized metabolites such as
phenolic, terpenoid, as well as metabolites containing nitrogen/sulfur were identified
through proteomic analysis. The NMR-based metabolite profiling showed the presence
of metabolites such as carbohydrates and phenolic derivatives related to desiccation
tolerance events, corroborating with the proteome data. As an unprecedented finding, the
most important annotated alkaloid was anabasine. The specialized metabolites,
flavonoids, bioflavonoids and selaginellins were the main phenolic derivatives annotated.
Thus, we performed a LC-MS/MS analysis combined with the molecular networking
(MN) approach to assess the chemodiversity of flavonoids and selaginellins. So far, this
has been the first study on Selaginella spp. using the MN approach that showed not only
a proposal of the fragmentation pattern for all the selaginellins annotated, but also the
prediction of new selaginellins based on the MS/MS spectral data. Several biological
potentials of selaginellin from Selaginella spp. have been reported. Selaginellins are
naturally produced at low levels in the plant, which makes the chemical extraction of
these metabolites difficult and time consuming. In this context, methyl jasmonate (MeJA)
has been used to induce specialized metabolites of pharmaceutical interest. Our data
showed that MeJA can be an interesting alternative to induce the accumulation of
selaginellins in S. convoluta. In addition, the in-silico studies pointed out interesting
bioactive potentials for selaginellins: antineurodegenerative, antiproliferative and
antiparasitic. The MN approach allowed the prediction of seven unprecedent
selaginellins, which contribute as a new chemical information for this species.
Keywords: Selaginellins. Anabasine. Proteoma. Metaboloma. Desiccation tolerance.
Metiljasmonato.
ÍNDICE DE FIGURAS
I.INTRODUÇÃO
Figura 1 Representação esquemática dos eventos orquestrados no mecanismo de
tolerância à dessecação.................................................................................................. 22
Figura 2 Representação esquemática de respostas à tolerância à dessecação
compartilhadas e espécie-específica baseado nos estudos de proteoma e transcriptoma de
espécies de Selaginella...................................................................................................... 26
CAPÍTULO 2
Figure 1. (A) Plant in the field found in the dehydrated state; (B) Plant acclimated in the
laboratory fully rehydrated. (C) Venn diagram of annotated proteins of S. convoluta
showing the distribution of proteins related to dehydrated /hydrated states for each part of
the plant; SD: Shoots at dehydrated state; SH: Shoots at hydrated state; RD: roots at
dehydrated state; RH: roots at hydrated state. (D) Proteins with higher abundance in the
dehydrated state compared with the hydrated state. * Protein characterized by Blastp
performed in NCBI platform - Supplementary material. (E) Analysis of a functional
network by STRING. Protein-protein interactions presented by differentially abundant
proteins of S. convoluta. EFJ07076-SD: photosystem I reaction center subunit II,
chloroplastic-like; EFJ22479-RD: heat shock cognate 70 kDa protein 2; EFJ30779-SD:
heat shock cognate 70 kDa protein 2; EFJ09686-RD: 14-3-3-like protein 16R;
EFJ30676-SD: elongation factor 1-alpha; EFJ14934-RD: 14-3-3-like protein GF14 nu
isoform X2; EFJ22122-SD: actin; MDH1-1-SH: malate dehydrogenase, glyoxysomal;
EFJ35703-SD: ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase 1, chloroplastic
isoform X3; EFJ38136-SD: peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase; EFJ23777- RD:
26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 homolog A; EFJ23890-RD: Bet_v_1
domain containing protein; EFJ17357-SD: Tubulin alpha chain; EFJ16343-SH:
Glutathione S-transferase U 19; EFJ16371-SH: Aldedh domain-containing protein.
Color text reflects the differentially abundant protein. Green: up-regulated; Red: down-
regulated.…………………………………………………………………………………………………………………… 5
CAPÍTULO 3
Figure 1. The Selaginella convoluta annotated metabolites with spectral similarity among
50-100% were assembled in schematic colors showing its distribution at
dehydrated/hydrated states for each part of the plant …….………………………………………………. 5
CAPÍTULO 4
Figure 1. Representative images of S. convoluta………………………………………114
Figure 2 a Cluster MN 1: Representation of MN after blank removal showing a
selaginellin cluster in S. convoluta extract. b Original selaginellins based on MS/MS
spectra.............................................................................................................................. 118
Figure 3. Biflavonoids clusters: Representation of MN after blank removal showing
biflavonoids clusters in S. convoluta extract…..............................................................120
Figure 4. Schematic Venn diagram showing the annotated metabolites by LC ‑ MS/MS
of S. convoluta related to dehydrated/hydrated states for each part of plant………………….121
CAPÍTULO 5
Figure 1. (A) Selaginellins Cluster: Representation of molecular networking after blank
removal showing the selaginellins molecular family in S. convoluta extract. Original
selaginellins based on MS/MS spectra…….…………………………………………………………………… 9
Figure 2. Heatmaps on the methanolic extract of Selaginella convoluta MeJA-treated vs
control: (A) Shoots: MeJA 50 µM; MeJA 100 µM; (B) Roots: MeJA 50 µM; MeJA
100µM…………………………………………………………………………………. 12
DISCUSSÃO GERAL
Figura 1 Resumo dos mais importantes aspectos descritos na literatura sobre uso popular,
fitoquímica e farmacologia de Selaginellaceae ................................................................ 66
Figura 2 Representação esquemática de respostas compartilhadas e específicas de
espécies de Selaginella estudadas pela abordagem de proteoma. ................................... 68
Figura 3 (A): Diagrama de venn mostrando a distribuição dos metabólitos anotados por
RMN de Selaginella convoluta; (B): anabasina – alcaloide isolado. ................................70
Figura 4 (A): Molecular networking dos dados de EM/EM obtidos no modo positivo de
ionização para Selaginella convoluta mostrando as principais famílias moleculares
associadas ao estresse hídrico; (B): Diagrama de Venn com o total de íons observados
entre as amostras. Self-loops foram excluídos. ................................................................. 71
ÍNDICE DE TABELAS E QUADROS
INTRODUÇÃO
Quadro 1 Comparação entre as técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear
(RMN) e a espectrometria de massa (EM) no contexto das análises de metaboloma.................37
CAPÍTULO 1 Table 1. Metabolites from Selaginella...................................................................... 249
Table 2. Metabolites from Selaginella........................................................................ 250
Table 3. Pharmacological potential of Selaginella.................................................... 262
CAPÍTULO 2
Table 1. Comparison of the differentially abundant proteins in S. convoluta with
experimental proteomic datasets of other desiccation tolerant Selaginella species……8
CAPÍTULO 4
Table 1. Metabolites detected in the methanolic extracts of S. convoluta by LC ‑ ESI ‑ TOF ‑ MS/MS. .............................................................................................................115
CAPÍTULO 5 Table 1 Metabolites of Selaginella convoluta affected by MeJA treatment analyzed by
LC-ESI-TOF-MS/MS and Their Fold-Change Analysis.............................................. 16
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
TD Tolerância à dessecação
RMN Ressonância Magnética Nuclear
CL Cromatografia líquida
EM Espectrometria de Massas
EM/EM Espectrometria de Massas/ Espectrometria de Massas
GNPS Global Natural Products Social Molecular Networking
MN Molecular Networking
SUMÁRIO
I.INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 20
I.1 Selaginellaceae e tolerância à dessecação ........................................................................ 22
I.2 Estudos ômicos de espécies tolerantes à dessecação ‒ Selaginellaceae ........................... 25
I.2.1 Análises de transcriptoma ........................................................................................... 26
I.2.2 Análises de proteoma .................................................................................................. 27
I.2.3 Análises de metaboloma ............................................................................................. 29
I.2.4 O que os estudos utilizando abordagens ômicas sobre as espécies de Selaginella
tolerantes à dessecação podem nos ensinar até agora? ..................................................... 31
I.3 Estudos ômicos e sua relevância para fitoquímica ............................................................ 32
I.4 Proteoma ............................................................................................................................ 33
I.5 Metaboloma ....................................................................................................................... 35
I.5.1 Ressonância magnética nuclear.................................................................................. 36
I.5.2.1 Global Natural Products Social Molecular Networking ‒ GNPS: Classical Molecular
Networking .......................................................................................................................... 38
I.5.3 Comparação das técnicas de RMN e EM sob o prisma das análises de metaboloma 39
II.OBJETIVOS .......................................................................................................................... 43
III.ARTIGOS CIENTÍFICOS ................................................................................................. 46
III.I CAPÍTULO 1: Fernanda P. Santos Reginaldo; Isabelly C. Matos Costa; Raquel B.
Giordani. Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and pharmacology. Boletín
Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas 19:3 (2020). ................ 48
III.II CAPÍTULO 2: Fernanda P. Santos Reginaldo, Luiz F. Rodrigues de Souza, Marlon D.
Mariano dos Santos, Daisy S. Chacon, Taffarel M. Torres, Ivanice B. Silva, Alan A. Roque,
José Angelo S. Zuanazzi, Carlos André O. Ricart, Mariana S. Castro, Paulo C. Carvalho,
Wagner Fontes, Marcelo V. Sousa, Arthur G. Fett-Neto, Raquel B. Giordani. Proteomic
analysis of Selaginella convoluta: can the organ-specific approach provide insights into the
orchestrated events in the desiccation tolerance? .................................................................... 51
III.III CAPÍTULO 3: Fernanda P. Santos Reginaldo, Rafael Freire, Isabelly C. M. Costa,
Ivanice Bezerra da Silva, Alan de Araújo Roque, Fernando Hallwass, Ian Castro-Gamboa,
Arthur Germano Fett-Neto, Alberto J. Cavalheiro, Raquel B. Giordani. NMR-based metabolite
profiling of Selaginella convoluta in different hydration states and the unprecedented
occurrence of anabasine in lycophytes. Phytochemistry Letters. 43: 75-79. 2021. ................ 54
III.IV CAPÍTULO 4: Fernanda P. Santos Reginaldo, Paula C. Pires Bueno, Isabelly C. Matos
Costa, Alan A. Roque, Arthur G. Fett-Neto5, Alberto J. Cavalheiro, Raquel B. Giordani.
Molecular networking discloses the chemical diversity of flavonoids and selaginellins in
Selaginella convoluta. Planta Medica 87:113–123. 2020 ....................................................... 57
III.V CAPÍTULO 5: Fernanda Priscila Santos Reginaldo, Paula Carolina Pires Bueno,
Estela Mariana Guimarães Lourenço, Isabelly Cristina de Matos Costa, Letícia Gondim
Lambert Moreira, Alan de Araújo Roque4, Euzébio Guimarães Barbosa, Arthur Germano Fett-
Neto, Alberto José Cavalheiro, Raquel Brandt Giordani. Methyl jasmonate-induced
potentially bioactive selaginellins accumulation in Selaginella convoluta. ………………. 60
IV.DISCUSSÃO GERAL ......................................................................................................... 64
V.CONCLUSÕES GERAIS ..................................................................................................... 76
VI. REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 81
I.INTRODUÇÃO
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 22
O processo evolutivo de 400 milhões de anos e a capacidade de adaptação da
família Selaginellaceae (MARTÍNEZ-CORTÉS et al., 2012) tem destacado suas espécies
como uma interessante ferramenta de pesquisa a fim de entender habilidades adaptativas.
Nesse contexto, a investigação do metabolismo de Selaginella convoluta, espécie
nativa do Brasil e endêmica do Nordeste no bioma Caatinga torna-se relevante. Aliado a
isso, a espécie é importante do ponto de vista evolutivo, uma vez que está englobada na
mais antiga linhagem de plantas vasculares da Terra. Encontra-se no gênero que possui
cerca de 700 espécies (LITTLE et al., 2007), das quais apenas algumas evoluíram com
capacidades únicas de resistência à dessecação (OLIVER et al., 2000). Ainda, não foram
encontrados dados na literatura que se concentrem em investigar a capacidade de
tolerância à dessecação da espécie S. convoluta.
Selaginella convoluta é usada popularmente no nordeste do Brasil para tratar
enfermidades relacionadas ao sistema reprodutor feminino (SETYAWAN, 2009),
evidenciando, dessa maneira, a potencialidade de obtenção de moléculas bioativas a partir
dessa espécie. Destaca-se sua importância tanto sob o prisma da fitoquímica quanto da
farmacologia, demonstrando assim, a necessidade de entender as rotas de biossíntese
envolvidas na produção desses metabólitos, bem como os fatores abióticos que modulam
estas vias.
Diante disso, esta tese objetivou realizar uma abordagem fitoquímica aliada a
estudos ômicos da espécie Selaginella convoluta. Aliando o fato dessa espécie ser
endêmica na Caatinga, bioma que possui condições edafoclimáticas bastante adversas que
potencialmente influenciam de maneira peculiar na produção de metabólitos (i), a
ausência de pesquisas visando o entendimento dos eventos orquestrados na tolerância a
dessecação dessa planta (ii), e seu potencial bioativo (iii), torna essa espécie uma
importante ferramenta de estudo, contribuindo amplamente para a área de produtos
naturais.
I.1 Selaginellaceae e tolerância à dessecação
As licófitas constituem um grupo monofilético que representam um ponto-chave
na linhagem de plantas vasculares que incluem as famílias Lycopodiaceae, Isoetaceae e
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 23
Selaginellaceae, as quais surgiram há mais de 400 milhões de anos, durante o Siluriano,
dominando a flora da Terra a partir do Devoniano através do Carbonífero até o fim do
Permiano (MARTÍNEZ-CORTÉS et al., 2012). Dentre estas, Selaginellaceae, tem se
destacado pelo fato de ter resistido à extinção nos períodos Triássico e Permiano (WENG;
NOEL, 2013), sendo por isso considerada um ponto-chave no estudo de evolução, uma
vez que preserva algumas características típicas das plantas não vasculares, mas também
apresenta algumas inovações evolucionárias, tais como tecidos vasculares, folhas e caule
(FRIEDMAN, 2011; YOBI et al., 2013).
Selaginella constitui o único gênero dessa família, possuindo cerca de 700-750
espécies distribuídas no mundo inteiro (LITTLE et al., 2007). O processo evolutivo de
400 milhões de anos e a capacidade de adaptação da família Selaginellaceae
(MARTÍNEZ-CORTÉS et al., 2012) tem destacado suas espécies como uma interessante
ferramenta de pesquisa a fim de entender suas habilidades adaptativas. A família
sobreviveu a diversas pressões bióticas e abióticas o que conferiu a algumas espécies a
aquisição de um interessante traço evolutivo: tolerância a dessecação.
Tolerância a dessecação (TD) é a capacidade que um organismo possui de
promover a reativação da atividade metabólica após reidratação depois de permanecer
num estado extremamente seco (GAFF, 1971). As plantas TD mantem um conteúdo de
água intracelular extremamente baixo (podendo chegar a <10%), as funções celulares são
suspensas, e o tecido entra num estado quiescente. O tecido pode permanecer neste estado
quiescente por períodos curtos a extremamente longos e reiniciar suas funções normais
quando reidratado novamente. Diante disso, a tolerância à dessecação pode ser vista como
uma estratégia de resistência à seca (FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).
Dois tipos de organismos TD podem ser distinguidos: homoioclorófilos e
poiquiloclorófilos. A maioria dos organismos TD retém sua clorofila e as estruturas
fotossintéticas durante a dessecação, o que permite uma rápida retomada da fotossíntese
após a reidratação (horas, geralmente). Esses organismos são chamados de
homoioclorófilos. Para reduzir o risco de estresse foto-oxidativo durante a dessecação,
um grupo limitado de plantas TD – poiquiloclorófilas – desenvolveram uma estratégia
contrastante pela qual a ultraestrutura do cloroplasto é desmontada e a clorofila é
degradada durante a perda de água. Poiquiloclorofilia é uma estratégia escassa entre os
organismos TD que implica num período mais longo de estabelecimento da reidratação
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 24
(dias, geralmente) até que a atividade fotossintética seja completamente restaurada
(FARRANT et al., 2007; FARRANT, 2008; FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).
O processo de dessecação implica em danos bioquímicos/físicos que os
organismos tolerantes tem que prevenir e/ou reparar como a ruptura de ultraestruturas
(perda de integridade da membrana e mudanças na configuração de macromoléculas,
como enzimas) (HOEKSTRA et al., 2001), e estresse oxidativo devido ao acúmulo de
espécies reativas de oxigênio (DINAKAR et al., 2012). Consequentemente, essa condição
de estresse ativa diversos mecanismos para tolerar a desidratação dos tecidos, com o
intuito de garantir a integridade celular com baixo teor de água. Esses mecanismos podem
ser constitutivos ou desencadeados durante a desidratação. Geralmente, organismos TD
submetidos a ciclos rápidos e frequentes de dessecação/reidratação em seus habitats
naturais parecem basear sua estratégia de TD em mecanismos constitutivos e no
mecanismo de reparo ativado durante a reidratação (DINAKAR et al., 2012;
FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).
Os mecanismos de TD englobam desde mecanismos morfológicos, síntese de
osmólitos e proteínas induzidos pela seca, bem como a ativação de mecanismos
antioxidantes (Figura 1). O enrolamento do caule e dobramento das folhas são
mecanismos morfológicos que contribuem para a TD, uma vez que reduzem quase que
completamente a excitação da clorofila no estado dessecado, reduzindo a consequente
formação de espécies reativas de oxigênio devido à retenção do aparato fotossintético
(RAFSANJANI et al., 2015). Estudos tem destacado o potencial papel de metabólitos
como carboidratos, poliois, e aminoácidos na preservação de tecidos fotossintéticos secos
(YOBI et al., 2013). Além disso, proteínas como desidrinas, late embryogenesis abundant
[LEA], early light-induced proteins [ELIPs] e heat shock protein (HPS) parecem estar
relacionadas a TD (DINAKAR; BARTELS, 2013; FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).
Os mecanismos antioxidantes de organismos TD desempenham um papel
fundamental não apenas de assegurar a sobrevivência durante a dessecação, mas também
durante as etapas iniciais de reidratação, quando uma explosão oxidativa acompanha a
retomada da atividade metabólica (KRANNER et al., 2002; KRANNER; BIRTIĆ, 2005);
a ativação eficiente do sistema antioxidante determina a longevidade dos tecidos no
estado dessecado (KRANNER et al., 2002).
No contexto da tolerância a dessecação, podemos destacar algumas espécies do
gênero Selaginella, incluindo S. lepidophylla (ITURRIAGA et al., 2006), S. bryopteris
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 25
(DEEBA et al., 2009), S. tamariscina (WANG et al., 2010), S. sellowii (OLIVEIRA;
MORAES, 2015), e S. convoluta (GAFF, 1987) que adquiriram esse traço durante seu
processo evolutivo de TD.
Fonte: elaborado pelo autor
Dentre essas espécies, S. convoluta destaca-se como sendo uma das plantas mais
bem adaptadas ao clima semiárido da Caatinga (XAVIER et al., 2012), uma vez que
possuem a peculiaridade de ser homoioclorofílica e poiquilohídrica, interessantes
mecanismos de resistência à dessecação (AMBRÓSIO; MELO, 2001). Entretanto, ainda
não foram encontrados dados na literatura que se concentrem em investigar a capacidade
de tolerância à dessecação da espécie S. convoluta. Nesse contexto, abordagens ômicas
demonstram ser uma interessante ferramenta que pode fornecer insights sobre os eventos
orquestrados na tolerância a dessecação.
I.2 Estudos ômicos de espécies tolerantes à dessecação ‒ Selaginellaceae
As abordagens ômicas podem fornecer uma compreensão abrangente do papel das
proteínas, metabólitos e genes expressos envolvidos na tolerância à dessecação. Algumas
espécies de Selaginella (ITURRIAGA et al., 2006; DEEBA et al., 2009; WANG et al.,
2010), que evoluíram com capacidade de tolerância à dessecação tem atraído a atenção
de muitos pesquisadores com interesse em compreender os mecanismos envolvidos na
Figure 1 Representação esquemática dos eventos orquestrados no mecanismo de
tolerância à dessecação.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 26
TD através de abordagens de genômicas funcionais (CUSHMAN; OLIVER, 2011). O
sequenciamento do genoma da espécies S. moellendorffii, S. lepidophylla e S. tamariscina
forneceu subsídios para a compreensão dos mecanismos envolvidos na adaptação dessa
família que conseguiu sobreviver às inúmeras pressões bióticas e abióticas durante esses
400 milhões de anos de evolução (BANKS, 2009).
I.2.1 Análises de transcriptoma
Estudos de transcriptoma foram desenvolvidos com o intuito de entender a base
molecular da tolerância à dessecação em espécies de Selaginella. No estudo de
transcriptoma de Selaginella lepidophylla, uma biblioteca de DNA complementar foi
construída e um banco de dados de expressed sequence tag (ESTs) foi gerado. Os clones
obtidos foram comparados com bancos de dados de proteínas, permitindo a anotação de
653 (62,4%) sequências. Dentre essas, 212 (20,2%) sequências apresentaram semelhança
significativa com sequências conhecidas, cujas funções ainda são desconhecidas, e 181
(17,3%) sequências não apresentaram semelhança com sequências conhecidas. Além
disso, os ESTs de S. lepidophylla foram comparados com o banco de dados de ESTs de
S. moellendorffii. Consequentemente, foi observada uma semelhança de 36-38% das
ESTs de S. lepidophylla em comparação com ESTs de S. moellendorffii; 62% mostraram
sequência única para S. lepidophylla e 63% para S. moellendorffii. Algumas atribuições
funcionais para ESTs de S. lepidophylla demonstraram proteínas relacionadas ao estresse
abiótico, que podem estar relacionadas à tolerância à dessecação. Desta forma, este artigo
destaca que S. lepidophylla pode servir como um interessante recurso genético para a
identificação de novos genes associados ao estresse ambiental e tolerância à dessecação
(ITURRIAGA et al., 2006).
Finalmente, um estudo de transcriptoma foi realizado para as espécies S. sellowii,
(tolerante à dessecação) e S. denticulata (sensível à dessecação). A análise também
incluiu dados de transcriptoma de S. lepidophylla (tolerante à dessecação), a fim de
identificar mecanismos de TD que são independentes de adaptações morfológicas. A
maioria dos genes responsivos à dessecação diferem entre as espécies. Apesar dessas
diferenças, a análise funcional revelou que as espécies tolerantes com morfologias
diferentes empregam mecanismos semelhantes para tolerar à dessecação. As funções
significativas envolvidas na TD e compartilhadas pelas espécies tolerantes foram:
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 27
indução de sistemas antioxidantes, aminoácidos e metabolismo secundário; enquanto as
respostas espécie-específica estavam relacionadas à modificação da parede celular e
metabolismo de carboidratos (Figura 2). Os resultados desse estudo fornecem evidências
de evolução convergente entre S. sellowii e S. lepidophylla devido aos diferentes
conjuntos de genes relacionados à aquisição de TD (ALEJO-JACUINDE et al., 2020).
I.2.2 Análises de proteoma
O panorama proteico das partes aéreas de S. bryopteris foi estudado em resposta
à desidratação e reidratação. Um total de 250 proteínas foram detectadas. Os resultados
mostraram que as proteínas responsivas à desidratação estavam relacionadas a processos
como transporte, direcionamento e degradação. Diante disso, os autores destacaram que
algumas dessas proteínas podem ser uma vantagem fisiológica para S. bryopteris sob
dessecação (DEEBA et al., 2009).
Em outro estudo, Deeba e colaboradores (2016) usaram a estratégia de proteoma
órgão-especifico com o intuito de obter uma visão mais abrangente dos eventos
coordenados entre raízes e partes aéreas envolvidos na tolerância à dessecação. S.
bryopteris foi submetida a 7 dias de desidratação seguida de 2h e 24h de reidratação. Nas
raízes, dentre as 59 proteínas detectadas, 58 foram reguladas positivamente durante o
estado desidratado. As proteínas identificadas foram relacionadas à sinalização, estresse
e defesa, metabolismo de proteínas e nucleotídeos, metabolismo de carboidratos e
energia, armazenamento e controle epigenético. Entre as 90 proteínas identificadas nas
partes aéreas, cerca de 49% foram reguladas positivamente durante o estado desidratado.
Um grande número de proteínas envolvidas na eliminação de espécies reativas de
oxigênio aumentou durante a desidratação. Muitas outras proteínas envolvidas em
energia, metabolismo de nucleotídeos, controle epigenético foram altamente reguladas.
Os resultados forneceram uma visão mais abrangente das diferentes respostas celulares
envolvidas na mudança do panorama proteico durante a desidratação e reidratação em
raízes e partes aéreas, mostrando uma resposta bem coreografada, conforme esperado de
uma planta da ressurreição (DEEBA et al., 2016).
Com o intuito de entender melhor o mecanismo de tolerância à dessecação,
análises fisiológicas e proteômicas foram realizadas em espécimes de S. tamariscina.
Durante o período de uma semana, após a privação de água por 0 dias (d), 1 d, 3 d, 5 d, 7
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 28
d e 12 h após a reidratação, as partes aéreas das respectivas plantas foram coletadas. Os
resultados obtidos mostraram um aumento de ABA, açúcares solúveis e prolina durante
o processo de desidratação, assim como as enzimas antioxidantes superóxido dismutase
(SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT) e glutationa redutase (GR) tiveram sua
atividade aumentada. Por outro lado, a taxa de fotossíntese e o conteúdo de clorofila
diminuíram, bem como a integridade da membrana plasmática foi perdida. Um total de
138 proteínas em resposta à dessecação foram anotadas, dentre as quais 103
representaram proteínas únicas. A análise de agrupamento hierárquico revelou que 83%
das proteínas foram reguladas negativamente após a desidratação e que as mudanças da
expressão dinâmica das proteínas responsivas à dessecação fornecem evidências de que
a modificação da estrutura celular, redução da fotossíntese, ativação do sistema
antioxidante e modificações pós-transcricionais/traducionais são essenciais para a
resposta a desidratação da planta poiquiloclorofila S. tamariscina. Além disso, a análise
comparativa de proteínas responsivas à desidratação em tecidos vegetativos de 19
espécies de plantas TD e SD sugeriu que S. tamariscina desenvolveu um mecanismo
específico de tolerância à dessecação (WANG et al., 2010).
Em Selaginella lepidophylla, os padrões de expressão de proteínas nos estados
hidratado e desidratado foram investigados. Este estudo detectou 1.700 spots, dos quais
184 foram sequenciados. Algumas das proteínas com maior abundância no estado
desidratado foram Rubisco, RCA, proteínas LEA, HSPs, proteínas 14-3-3 e proteínas com
funções relacionadas à fotossíntese, armazenamento de energia, controle de RUBISCO,
vitrificação do citoplasma, proteção da integridade da membrana, auxílio ao dobramento
de proteínas e resposta de defesa (CASTANO-DUQUE; CUSHMAN, 2010).
Comparando esses estudos de proteoma é possível observar que alguns processos
envolvidos na TD parecem ser compartilhados pelas espécies estudadas e ainda alguns
parecem ser espécie-específicos (Figura 2). É possível que um estudo de análise funcional
comparativa possa esclarecer melhor essa hipótese. De modo geral, as investigações do
panorama proteico foram realizadas utilizando apenas as partes aéreas; entretanto, um
estudo utilizou a abordagem órgão-específica. Essa abordagem interessantemente
forneceu uma visão mais abrangente não somente dos eventos envolvidos na tolerância à
dessecação, mas também na reativação do metabolismo da planta durante o processo de
reidratação, apontando que raízes e partes aéreas trabalham de modo coordenado para
regular a TD. De modo geral, os estudos de proteoma de Selaginella utilizaram a clássica
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
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técnica de 2-DE; no entanto, estudos apontam suas diversas limitações. Nesse contexto,
a técnica de gel-free pode permitir uma análise de panorama proteico mais abrangente,
visto que é uma abordagem mais moderna e que supera as limitações da 2-DE (GUTSCH
et al., 2020).
Fonte: elaborado pelo autor
I.2.3 Análises de metaboloma
O metaboloma tem sido usado como uma ferramenta para fornecer uma
compreensão abrangente dos metabólitos que podem estar envolvidos na DT. Um estudo
de perfil metabólico, utilizando as técnicas analíticas GC/MS e UHLC/MS/MS2,
comparou S. lepidophylla (tolerante à dessecação ‒ TD) e S. moellendorffii (sensível à
dessecação ‒ SD), com conteúdo relativo de água em 100% e 50%. Um total de 301
metabólitos foram anotados. Diversos metabólitos foram mais abundantes em S.
lepidophylla do que em S. moellendorffii, como sacarose, mono- e polissacarídeos,
Figura 2 Representação esquemática de respostas à tolerância à dessecação
compartilhadas e espécie-específica baseado nos estudos de proteoma e transcriptoma
de espécies de Selaginella.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
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álcoois de açúcar, aminoácidos aromáticos e c-glutamil aminoácido. Ainda, poliois como
o sorbitol e xilitol foram bem mais abundantes em S. lepidophylla em comparação com
S. moellendorffii. Os dados químicos abordados focaram principalmente em metabólitos
primários, sendo que a caracterização e comparação entre as espécies no que se refere aos
metabólitos secundários não foi discutido. De modo geral, o estudo concluiu que S.
lepidophylla parece tolerar a dessecação de uma maneira constitutiva usando uma ampla
gama de metabólitos com alguns componentes induzíveis, enquanto S. moellendorffii
demonstrou apenas respostas metabólicas limitadas referentes ao estado de desidratação
(YOBI et al., 2012).
Em outro estudo de perfil metabólico, Selaginella lepidophylla foi submetida a
um ciclo de reidratação/desidratação de cinco estágios e 251 metabólitos foram
caracterizados pelas técnicas analíticas GC/MS e UHLC/MS/MS2. Vários intermediários
do ciclo de glicólise/gliconeogênese e ácido tricarboxílico, bem como vanilato (um
potente antioxidante), e muitos álcoois de açúcar foram mais abundantes no estado
hidratado. Ainda, aminoácidos ricos em nitrogênio e γ-glutamil aminoácidos, citrulina e
produtos de catabolismo de nucleotídeos, bem como 3- (3-hidroxifenil) propionato,
apigenina, e naringenina foram mais abundantes no estado desidratado. Finalmente, foi
observado que S. lepidophylla exibiu sete metabólitos não anotados que exibiram maior
abundância no estado desidratado, sugerindo que esses compostos podem desempenhar
papeis adaptativos na tolerância à dessecação (YOBI et al., 2013). Novamente, o maior
enfoque de discussão foi dado aos metabólitos primários.
A natureza da tolerância à dessecação em S. tamariscina foi avaliada comparando
a composição de açúcares solúveis e as razões de saturação de fosfolipídios entre tecidos
hidratados e dessecados da planta por cromatografia gasosa, bem como diferenças na
expressão gênica e conteúdo de ABA durante a desidratação. Os resultados mostraram
que a trealose foi o principal açúcar solúvel e o baixo teor de ácidos graxos saturados em
fosfolipídios foi mantido em tecidos hidratados e dessecados. Além disso, o conteúdo de
ABA de S. tamariscina aumentou 3 vezes, e os genes envolvidos na sinalização ABA e
na proteção celular foram regulados positivamente, enquanto os genes relacionados ao
fotossistema foram regulados negativamente durante a desidratação. Os resultados
bioquímicos e moleculares desse estudo apontaram que as moléculas protetoras
constitutivas e induzíveis contribuem para a tolerância à dessecação de S. tamariscina
(LIU et al., 2008).
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 31
De acordo com Liu et al. (2008) a trealose foi o principal açúcar que se acumulou
tanto no estado desidratado quanto no estado hidratado de S. tamariscina, enquanto Yobi
et al. (2012) relataram que a sacarose foi mais abundante em S. lepidophylla durante o
estado hidratado. Vários estudos relataram que esses carboidratos parecem desempenhar
papeis importantes em espécies de Selaginella tolerantes à dessecação, uma vez que tanto
a sacarose quanto a trealose se acumulam em tecidos dessecados e hidratados. Esses
achados apontam que essas espécies TD mantem níveis de açúcar constitutivamente altos
que não aumentam mais durante a dessecação, indicando que esses metabólitos podem
estar associados a uma resposta constitutiva a TD. No entanto, o perfil metabólico
comparativo entre S. lepidophylla (TD) e S. moellendorffii (SD) revelou que altos níveis
de trealose não são exclusivos de S. lepidophylla. De modo geral, isso pode indicar que
altos níveis de açúcar podem contribuir para a tolerância à dessecação, mas não são
suficientes, indicando que esse constitui um dos eventos que englobam a base dos
mecanismos envolvidos na TD
I.2.4 O que os estudos utilizando abordagens ômicas sobre as espécies de Selaginella
tolerantes à dessecação podem nos ensinar até agora?
De modo geral, os estudos ômicos de espécies de Selaginellaceae fornecem
diversos insights sobre os eventos envolvidos na TD. Essas espécies parecem
compartilhar respostas a TD, bem como parecem possuir respostas espécie-específicas.
Os estudos de modo geral, apontam que trealose é um carboidrato importante na TD; no
entanto, dados de transcriptoma apontaram que carboidratos da família das rafinoses
parecem também desempenhar um interessante papel em TD. Altos níveis de açúcar
podem contribuir para a tolerância à dessecação, mas não são suficientes, indicando que
o mecanismo de TD pode ocorrer de modo intrinsecamente coordenado englobando
eventos morfológicos e fisiológicos, ativação de sistema antioxidante e síntese de
proteínas; portanto, a base dos mecanismos de TD são complexos e integrados. A
complexidade de eventos envolvidos na TD demonstra claramente que seria muito difícil
transferir as características de TD para uma planta de cultivo. É possível que estudos
ômicos integrativos (transcriptoma-proteoma-metaboloma) em conjunto com a
abordagem órgão-específico possam fornecer uma visão mais abrangente dos eventos
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 32
orquestrados na TD relevando um ponto-chave, que possibilite a transferência do traço
de TD a plantas de cultivo.
I.3 Estudos ômicos e sua relevância para fitoquímica
As plantas produzem cerca de 200.000 produtos naturais, e a enorme variedade de
substâncias produzidas por elas são potencialmente úteis no desenvolvimento de novos
medicamentos (DIXON; STRACK, 2003). Em decorrência da possibilidade dos
metabólitos secundários se tornarem um recurso terapêutico, pesquisas se concentram em
isolar esses metabólitos, testando em alvos potenciais, como fungos, bactérias, vírus,
parasitos, diversas linhagens de câncer, doenças neurodegenerativas, dentre outros. No
entanto, em muitos casos, o baixo rendimento dessas substâncias isoladas e a
inviabilidade de obtenção por meio de síntese química dificultam a utilização de
substâncias importantes na terapêutica. Diante disso, pesquisas tem se concentrado em
tentar entender os mecanismos que estão envolvidos e os fatores que influenciam as rotas
de biossíntese dos metabólitos secundários.
Nesse cenário, podemos destacar que a fitoquímica está entrando em uma nova
era: a era da genômica funcional, constituindo assim, uma maneira de tentar resolver os
percalços encontrados na pesquisa de produtos naturais visando seu uso na medicina.
Genômica é a ciência que estuda o genoma dos organismos a partir do sequenciamento
completo de seus genes, visando entender a sua estrutura, organização e função (DIXON;
STRACK, 2003). No contexto da química de produtos naturais, a genômica funcional,
tem sido bastante relevante, uma vez que é a ciência que tenta compreender as mudanças
no funcionamento do genoma em diversas etapas do desenvolvimento de um organismo,
bem como sob influência de diversos fatores ambientais (TOHGE et al., 2005).
Os aliados da pesquisa em genômica funcional, no contexto dos produtos naturais,
são os estudos ômicos, como transcriptoma e proteoma, os quais permitem determinação
da função dos genes num organismo, possibilitando o fornecimento de informações
objetivando o entendimento da modulação de rotas de biossíntese de metabólitos de
interesse farmacêutico, abrindo perspectivas de melhoramento em espécies vegetais,
permitindo ainda, a modulação de rotas de biossíntese. Outra ferramenta importante no
contexto da genômica funcional é o metaboloma, que uma vez integrado à análise de
transcriptoma pode fornecer informações precisas sobre a determinação das correlações
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 33
gene-metabólito, a identificação da função de genes desconhecidos, e ainda o gene que
responde a determinados fatores abióticos, culminando na produção de metabólito
secundário específico (MERCKE et al., 2004; TOHGE et al., 2005). Tomando em
conjunto essas considerações, as abordagens “ômicas” visam o entendimento do
metabolismo celular como um todo, de maneira integrada (ZHANG et al., 2010)
consistindo numa abordagem de fronteira para a química de produtos naturais.
I.4 Proteoma
O termo Proteoma significa a análise de todas as proteínas expressas por um
genoma (WILKINS et al., 1996). Proteoma é, assim, a análise em larga escala de proteínas
numa célula, tecido ou organismo inteiro num determinado momento, sob condições
definidas (ABDALLAH et al., 2012), é o produto direto do genoma transcrito e traduzido
gerando informações cruciais para a compreensão global do funcionamento celular
(BAGINSKY, 2009). Análise proteômica é uma poderosa ferramenta na caracterização
funcional de plantas. Devido à disponibilidade de uma vasta informação de sequências de
nucleotídeos, com base nos progressos realizados na identificação rápida e sensível de
proteínas por espectrometria de massa, as abordagens proteômicas abrem novas
perspectivas para analisar as funções complexas nas plantas (CANOVAS et al., 2004).
Para a análise proteômica as duas principais abordagens utilizadas são bottom-up
e top-down. A abordagem de bottom-up é baseada na digestão de proteínas, identificação
de peptídeos e, finalmente, atribuição de proteínas; ao passo que a abordagem de top-
down, a etapa inicial é baseada em toda a sequência da proteína, incluindo modificações
pós-traducionais (ABDALLAH et al., 2012). Enquanto, as análises quantitativas são
realizadas a nível de peptídeo para a abordagem de bottom-up, estas são realizadas a nível
de proteínas na abordagem de top-down (GUTSCH et al., 2020).
A princípio os estudos de proteoma em plantas foram baseados na técnica de
eletroforese em gel bi-dimensional (2-DE), uma abordagem top-down. Desde então, a
ferramenta de proteoma tem sido aplicada em todos os aspectos da pesquisa de plantas,
incluindo o desenvolvimento da planta, a resposta às condições ambientais (estresse
abiótico e biótico), bem como na influência nutritiva de plantas de interesse agronômico
(GUTSCH et al., 2020).
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 34
A 2-DE é uma técnica bem estabelecida, sendo o método padrão para estudar o
proteoma de uma célula, tecido, órgão ou organismo, separando as proteínas através de
eletroforese bidimensional, seguida da identificação das proteínas separadas por
espectrometria de massa. A maioria dos estudos de proteômica hoje ainda segue esta
abordagem (STEEL et al., 2005). No entanto, esta técnica possui limitações como baixa
reprodutibilidade quantitativa e baixa sensibilidade para detecção de certas classes de
proteínas. A técnica 2-DE não consegue visualizar todas as proteínas numa amostra
complexa. Um gel típico 2-DE permite a visualização de 30-50% de todo o proteoma. Em
particular as proteínas presentes em concentrações extremamente baixas ou proteínas que
não podem ser separados num gel de 2-DE, devido às suas propriedades físico-químicas
(Ponto Isoelétrico, hidrofobicidade, peso molecular) não podem ser detectadas através
desse método (GYGI et al., 2000). Visto isso, nos últimos anos, abordagens alternativas,
tais como o Gel-free tem demonstrado ser uma técnica promissora, sendo mais sensível
uma vez que consegue detectar proteínas de baixo peso molecular e possui uma melhor
reprodutibilidade. A análise proteômica por Gel-free, realizada por espectrometria de
massas, permite ainda a análise quantitativa das proteínas presentes na amostra analisada
(ZHANG et al., 2010).
A abordagem de Gel-free é uma estratégia de bottom up. Nessa abordagem as
amostras de proteínas são digeridas e as misturas de peptídeos complexos são separadas
por cromatografia líquida seguida pela análise por espectrometria de massas. A
identificação e quantificação por espectrometria de massas desses peptídeos permite a
determinação do teor de proteína na amostra inicial, uma vez que os peptídeos são
uniformes na composição física e química. Ainda, essas propriedades impactam numa
separação mais uniforme por cromatografia líquida, resultando em um certo grau de
automação. Essa abordagem acelerou o ritmo das análises de proteoma, tornando-o um
estudo de alto rendimento. As etapas da abordagem de gel-free são as seguintes: (i)
extração, redução, alquilação e digestão de proteínas; (ii) separação por cromatografia
líquida, seguida por análise espectrometria de massas sequencial; e (iii) análise de dados
(GUTSCH et al., 2020).
O processamento preciso dos dados é obrigatório para as análises quantitativas,
bem como para as análises estatísticas com o intuito de fornecer informações confiáveis
quanto as alterações das proteínas. Assim é importante realizar um processamento de
dados, seguindo etapas como eliminação do ruído de fundo para a detecção de pico,
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 35
alinhamentos de pico para combinar corretamente os picos correspondentes entre vários
dados espectrais e normalização. A identificação das proteínas é realizada por pesquisas
em bancos de dados para os quais diferentes softwares estão disponíveis (SANDIN et al.,
2014).
A abordagem de gel-free é uma técnica de desenvolvimento rápido que supera
algumas desvantagens apresentadas pela técnica de 2-DE. Além disso, o tempo
experimental necessário é curto, e a otimização da aquisição e análise de dados tornaram
possível o alto rendimento das análises de proteoma. No entanto, até o momento, a
eletroforese em gel bi-dimensional é a única abordagem top-down que permite a
visualização de modificações pós-traducionais e isoformas que fornecem informações
complementares sobre a resposta ao estresse por exemplo, sendo por este motivo ainda a
ferramenta comumente mais usada em análises de proteoma.
I.5 Metaboloma
Os metabólitos são os produtos finais dos processos celulares, e seus níveis podem
ser considerados como a resposta final de sistemas biológicos às mudanças genéticas ou
ambientais. Da mesma maneira que o termo transcriptoma significa a informação dos
transcritos e proteoma de todas as proteínas, o conjunto de metabólitos sintetizados por
um sistema biológico constitui o seu metaboloma (FIEHN, 2002), sendo esse bastante
relevante na abordagem da genômica funcional, contribuindo assim, para o entendimento
das interações moleculares complexas em sistemas biológicos (HALL et al., 2002).
Analisar o conjunto de metabólitos presentes num organismo é muito complexo,
visto que esses diferem sob vários aspectos, como em relação à sua polaridade,
comportamento químico, a estabilidade e a concentração, o que torna a análise de todos
os metabólitos em um único experimento extremamente difícil. Nesse contexto, duas
principais abordagens tem sido amplamente utilizadas para investigar o metaboloma:
análise direcionada (targeted analysis) e análise não direcionada (untargeted analysis)
(SHULAEV et al., 2008; SCHUHMACHER et al., 2013).
Na abordagem direcionada, um conjunto de metabólitos de interesse são
predefinidas e monitorados, permitindo a quantificação absoluta e a identificação
definitiva através do uso de metabólitos disponíveis como padrões de referência
autênticos. Em contraste, os métodos de perfil não direcionados visam encontrar
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 36
características analíticas de todos os metabólitos detectáveis e, portanto, tem o potencial
de explorar todo o espaço metabólico, incluindo metabólitos desconhecidos (SHULAEV
et al., 2008; SCHUHMACHER et al., 2013).
A análise não direcionada engloba duas abordagens: fingerprinting metabólico e
perfil metabólico. Fingerprinting metabólico é uma estratégia definida como um
screening qualitativo de um organismo ou tecido com o objetivo primário de comparar
assinaturas metabólicas e executar análises discriminatórias (HALL, 2006; SHULAEV et
al., 2008; SCHUHMACHER et al., 2013), sem identificação ou precisa quantificação dos
metabólitos presentes na amostra. Por outro lado, o perfil metabólico é uma estratégia que
possui não somente o intuito de fornecer o panorama metabólico, mas também a
identificação e quantificação de metabólitos (SHULAEV et al., 2008).
Diversas técnicas analíticas podem ser empregadas para análises de metaboloma,
incluindo a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e a Cromatografia Líquida acoplada
à espectrometria de massas (CL-EM/EM).
I.5.1 Ressonância magnética nuclear
Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é um método considerado bastante
adequado, uma vez que permite a detecção simultânea de diversos grupos de metabólitos
secundários (compostos fenólicos, alcaloides e terpenos), além de metabólitos primários
(açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, dentre outros) (KIM et al., 2010) em extratos
não purificados de plantas.
Os espectros unidimensionais de 1H RMN são bastante utilizados para estudos de
metaboloma, visto que a técnica, é altamente automatizável, portanto reprodutível,
confiável e rápida. A aquisição de um único espectro de 1H RMN ocorre em apenas alguns
minutos. Apesar das diversas vantagens da espectroscopia de 1H RMN, uma grande
limitação dessa técnica é justamente a sobreposição de sinais, dificultando a identificação
e quantificação de metabólitos. Em metaboloma, uma alternativa para superar essa
limitação de sobreposição de sinais, seria a deconvolução de sinais via experimentos 2D
RMN. Os experimentos 2D RMN conferem uma resolução adicional que permite
potencialmente detectar e identificar mais metabólitos do que é possível com 1D RMN
(KIM et al., 2010; SCHRIPSEMA, 2010; EMWAS, A. H. et al., 2019).
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Dentre os experimentos 2D RMN, TOCSY (espectroscopia de correlação total),
também conhecido como experimento homonuclear de Hartmann-Hahn (HOHAHA),
tem demonstrado ser uma interessante ferramenta para análises de misturas complexas
em metaboloma. O TOCSY é uma extensão do experimento COSY, em que o
deslocamento químico de um determinado núcleo está correlacionado com o
deslocamento químico de outros núcleos dentro de um sistema de spin de um determinado
metabólito. O espectro TOCSY mostra os picos cruzados não apenas para hidrogênios
acoplados, mas também para hidrogênios que são conectados por uma cadeia de
acoplamentos escalares (quatro ou mais ligações covalentes de distância)
(SCHRIPSEMA, 2010).
Diante disso, podemos destacar que a técnica de RMN é uma ferramenta
interessante para análises de metaboloma, visto que permite a detecção de metabólitos
primários e secundários simultaneamente em misturas complexas, principalmente nos
casos em que seus resultados experimentais são comparados a bancos de dados teóricos.
I.5.2 Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas ‒ CL-EM/EM.
Dentre as diferentes ferramentas analíticas disponíveis para as análises de
metaboloma, a espectrometria de massa é atualmente a técnica mais popular para detecção
e identificação de metabólitos devido à sua capacidade de ser combinada com
cromatografia líquida (CL-EM) e também pela possibilidade de obtenção de fragmentos
das moléculas através do uso desta técnica em sequencial (EM/EM) (DUNN et al., 2013).
O acoplamento de cromatografia líquida à espectrometria de massas (CL-EM/EM)
facilita a identificação e quantificação de metabólitos reduzindo a complexidade da
amostra e permitindo separação de metabólitos antes da detecção. Usando a estratégia
CL-EM/EM, de centenas a milhares de metabólitos podem ser detectados num
organismo. A anotação de metabólitos em CL-EM é obtida por meio da determinação
precisa da massa, bem como pela análise espectral dos dados de EM/EM (XIA;
WISHART, 2011; XIAO et al., 2012; VINAIXA et al., 2016).
LC acoplado a ionização por electrospray (CL-ESI-EM) tem demonstrado ser um
interessante método de escolha para a detecção de metabólitos em amostras biológicas
complexas. Em CL-ESI-EM, CL de fase reversa, normalmente usando colunas C18, pode
separar compostos semi-polares (ácidos fenólicos, flavonoides, esteroides glicosilados,
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
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alcaloides e outras espécies glicosiladas). No entanto, o uso de coluna polares – interação
hidrofílica (HILIC) – pode ser usada para separar compostos polares (por exemplo,
açúcares, amino açúcares, aminoácidos, ácidos carboxílicos e nucleotídeos) (XIAO et al.,
2012).
Embora CL de fase normal também possa separar compostos polares, o uso de
fases móveis orgânicas não polares o torna mais compatível com APCI-EM em vez de
ESI-EM, sendo mais comumente aplicado a análise de lipídios não polares (por exemplo,
triacilgliceróis, esteróis e ésteres de ácidos graxos) e outros estudos lipidômicos (HAN;
JIANG, 2009; XIAO et al., 2012).
Portanto, as vantagens do acoplamento da separação por cromatografia com
detecção de espectrometria de massas incluem o aprimoramento da sensibilidade da EM,
bem como a reprodutibilidade do sinal, implicando na redução da complexidade da
amostra, reduzindo, desse modo, as interferências da matriz no processo de ionização.
I.5.2.1 Global Natural Products Social Molecular Networking ‒ GNPS: Classical
Molecular Networking
Nos processos de análises do metaboloma, uma grande quantidade de dados é
gerada para detectar metabólitos conhecidos, bem como identificar possíveis análogos
relacionados. Diversas ferramentas de bioinformática que utilizam dados de EM/EM
foram desenvolvidas com o intuito de promover uma rápida caracterização química, bem
como a anotação de metabólitos em misturas complexas. Nesse contexto, a ferramenta de
molecular networking pode fornecer um método rápido e sensível para visualizar
simultaneamente a composição química dos extratos de plantas, minimizando o trabalho
árduo de dados analisados manualmente (YANG et al., 2013; WANG et al., 2016). Essa
ferramenta encontra-se disponível na plataforma GNPS, a qual possui uma grande
biblioteca espectral englobando banco de dados como MassBank, ReSpect e NIST,
contando com mais de 70.000 metabólitos e ainda permite que os usuários inseriram seus
dados espectrais, os quais são disponibilizados para toda comunidade científica (WANG
et al., 2016).
Molecular networking organiza grandes conjuntos de dados de espectros de massa
sequencial (EM/EM) com base na similaridade entre padrões de fragmentação de íons
precursores relacionados e compara os espectros de EM/EM com bancos de dados
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 39
robustos (YANG et al., 2013; ALLARD et al., 2016; WANG et al., 2016). No contexto
de produtos naturais, os metabólitos relacionados compartilham padrões de fragmentação
semelhantes e agrupam-se de acordo com a origem biossintética. As famílias moleculares
resultantes permitem a exploração visual de moléculas idênticas e análogas, acelerando a
detecção de metabólitos conhecidos por comparação com banco de dados de produtos
naturais e a identificação de análogos com base em estudos de fragmentação (YANG et
al., 2013; ALLARD et al., 2016).
Desde sua criação, a plataforma GNPS tem sido utilizada em diversos estudos
com as mais diversas aplicações. Em nosso grupo, diversos trabalhos tem utilizado essa
estratégia no contexto da química de produtos naturais. Dentre os trabalhos podemos
destacar o estudo realizado com Erytrhina velutina baseado nas abordagens de
transcriptoma e metaboloma, no qual essa ferramenta permitiu a anotação de 40 alcaloides
(CHACON et al., 2021). Além disso, estudando a espécie S. convoluta conseguimos
realizar a predição três novas selaginelinas, bem como a proposta do perfil de
fragmentação de todas as selaginelinas anotadas (REGINALDO et al., 2020).
Diante disso, a abordagem de análise de dados baseada em molecular networking
constitui uma interessante ferramenta para análises de metaboloma, visto que permite
uma rápida visualização do perfil metabólito, bem como a anotação de metabólitos
conhecidos de modo rápido e sensível, proporcionado ainda a possibilidade de anotação
de metabólitos não conhecidos baseado no perfil de fragmentação de análogos.
I.5.3 Comparação das técnicas de RMN e EM sob o prisma das análises de metaboloma
A sensibilidade é talvez o requisito mais importante para as análises de
metaboloma, uma vez que a alta sensibilidade favorece a análise de uma fração maior do
metaboloma. 1H RMN, possui um limite de detecção muito menos sensível que EM
(SUMNER et al., 2003). Esta diferença de sensibilidade é conferida por uma cobertura
mais completa do metaboloma com a técnica de EM – 326 metabólitos polares e
lipofílicos foram detectados, e 164 identificados nas folhas de Arabidopsis thaliana
(FIEHN et al., 2000); enquanto mais de 150 metabólitos polares foram detectados, e 77
identificados, em um extrato de tecido de tubérculo de batata (ROESSNER et al., 2000).
Esses números excedem significativamente os 20 – 40 metabólitos normalmente
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 40
identificados em estudos de perfil de metabólitos de amostras de plantas por 1H RMN
(SOBOLEV et al., 2003; GALL, LE et al., 2004; KRISHNAN, 2004).
Além disso, a técnica de MS requer uma quantidade de amostra menor para uma
boa detecção quando comparado ao RMN. Considerando um metabólito especifico que
possui uma concentração restrita de 0.1 nmol g -1 em tecido fresco – a extração de 50 g
de tecido pode permitir a detecção de “todo metaboloma” por 1H RMN; enquanto, apenas
10 mg de tecido seriam suficientes para MS (KRISHNAN, 2004).
A sobreposição de sinais num espectro de 1H RMN é um grande obstáculo para a
identificação de metabólitos; no entanto, esse problema pode ser amenizado usando
técnicas de RMN bidimensionais (SCHRIPSEMA, 2010). As análises de metaboloma
usando a técnica de MS, em geral são realizadas de modo integrado com a cromatografia
líquida, conferindo de modo geral, uma boa separação de metabólitos. Os problemas de
co-eluição de metabólitos, comumente encontrados quando se utiliza CL-EM, podem ser
facilmente solucionados usando a deconvolução das bandas através de software de pré-
processamento de dados (XIAO et al., 2012; VINAIXA et al., 2016).
O quadro 1 sumariza as vantagens e limitações mais importantes entre as técnicas
de RMN e EM relacionadas as aplicações de análises de metaboloma. De modo geral, a
comparação entre EM e RMN mostra claramente que a EM tem uma vantagem em termos
de sensibilidade, bem como confere um melhor processo de separação em misturas
complexas devido a integração com a técnica de CL. No entanto, a facilidade com que os
espectros de RMN podem ser registrados, além do fato de que mesmo EM parece ser
capaz de identificar apenas uma pequena fração do metaboloma, indica que a análise do
metabólito por RMN agrega valor à análise de metaboloma por meio da
complementaridade. Atualmente, EM está mais perto do ideal no que se refere a análises
de metaboloma do que RMN, entretanto, essas técnicas se complementam.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 41
Quadro 1 Comparação entre as técnicas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) e a
espectrometria de massa (EM) no contexto das análises de metaboloma.
RMN EM
Reprodutibilidade A alta reprodutibilidade é uma de
suas vantagens fundamentais.
Em comparação com a RMN, os dados
EM são menos reproduzíveis.
Sensibilidade
Intrinsecamente baixo. Um maior
tempo e número de varreduras,
maior força de campo magnético,
criossonda e microssondas podem
melhorar a sensibilidade.
Alta sensibilidade é uma importante
vantagem do EM; metabólitos em
baixas concentrações (nanomolares)
são possíveis de ser detectados.
Seletividade
Geralmente usada para análises não
seletivas. As sobreposições de sinais
de vários metabólitos detectados
representam uma limitação.
Seletivo. Em combinação com a
cromatografia, é uma ferramenta
superior para análise direcionada.
Medição de amostra
Permite medição relativamente
rápida usando 1H-RMN ‒ todos os
metabólitos são detectáveis a nível
de concentração ‒ em uma medição.
Diferentes métodos de ionização são
requeridos para maximizar o número de
metabólitos detectados.
Recuperação da amostra Não destrutiva e, portanto, várias
análises podem ser realizadas com a
mesma amostra.
É uma técnica destrutiva, a amostra não
pode ser recuperada. Entretanto, uma
pequena quantidade de amostra é
requerida nas análises.
Análise quantitativa
Inerentemente quantitativo; a
intensidade do sinal é diretamente
proporcional às concentrações dos
metabólitos.
A intensidade da linha RMS
frequentemente não está correlacionada
com as concentrações de metabólitos,
pois a eficiência da ionização também é
um fator determinante.
Número de metabólitos
detectáveis
Dependendo da resolução espectral,
geralmente menos de 200
metabólitos podem ser detectados
e identificados de forma inequívoca
em uma medição.
Usando diferentes técnicas de EM,
é possível detectar milhares de
diferentes metabólitos; identificam
várias centenas.
Adaptado: EMWAS et al., 2019 NMR Spectroscopy for Metabolomics Research. Metabolites; 9, 123.
II.OBJETIVOS
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo
44
Considerando a diversidade de potencial fitoquímico e bioativo da família
Selaginellaceae, o fato de Selaginella convoluta ser endêmica na Caatinga, bioma que
possui condições edafoclimáticas peculiares, bem como a capacidade de tolerância a
dessecação dessa espécie, assim como seu potencial bioativo, os objetivos gerais dessa
tese foram: (i) realizar uma revisão bibliográfica da família Selaginellaceae; (ii) investigar
os metabólitos e proteínas envolvidos na tolerância a dessecação de S. convoluta; e por
fim (iii) avaliar a influência do metil jasmonato nos metabólitos especializados dessa
espécie.
Dessa maneira, os objetivos específicos propostos foram:
1. Realizar uma revisão do uso popular, potencial fitoquímico e bioativo da família
Selaginellaceae;
2. Investigar as proteínas possivelmente relacionadas à tolerância a dessecação (TD);
3. Realizar uma análise de metaboloma não direcionada através da técnica de RMN a fim
de anotar metabólitos primários e especializados relacionado à TD;
4. Realizar uma análise de metaboloma não direcionada através da técnica de CL-EM/EM
combinada com abordagem de molecular networking avaliando os metabólitos
especializados relacionados a TD, bem como a influência do metil jasmonato sobre estes.
III.ARTIGOS CIENTÍFICOS
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 48
III.I CAPÍTULO 1: Fernanda P. Santos Reginaldo; Isabelly C. Matos Costa; Raquel
B. Giordani. Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and
pharmacology. Boletín Latinoamericano y del Caribe de
Plantas Medicinales y Aromáticas 19:3 (2020).
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 49
Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and pharmacology
Fernanda P. Santos Reginaldo, Isabelly C. Matos Costa, Raquel B. Giordani
College of Pharmacy, Pharmacy Department. University of Rio Grande do Norte, Natal,
RN, Brazil.
Contacts: Raquel Brandt Giordani - E-mail address: [email protected]
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 50
Abstract
Selaginella is the only genus from Selaginellaceae, and it is considered a key factor in
studying evolution. The family managed to survive the many biotic and abiotic pressures
during the last 400 million years. The purpose of this review is to provide an up-to-date
overview of Selaginella in order to recognize their potential and evaluate future research
opportunities. Carbohydrates, pigments, steroids, phenolic derivatives, mainly
flavonoids, and alkaloids are the main natural products in Selaginella. A wide spectrum
of in vitro and in vivo pharmacological activities, some of them pointed out by folk
medicine, has been reported. Future studies should afford valuable new data on better
explore the biological potential of the flavonoid amentoflavone and their derivatives as
chemical bioactive entities; develop studies about toxicity and, finally, concentrate efforts
on elucidate mechanisms of action for biological properties already reported.
Keywords
Selaginella; Natural Products; Overview.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 51
III.II CAPÍTULO 2: Fernanda P. Santos Reginaldo, Luiz F. Rodrigues de Souza,
Marlon D. Mariano dos Santos, Daisy S. Chacon, Taffarel M.
Torres, Ivanice B. Silva, Alan A. Roque, José Angelo S.
Zuanazzi, Carlos André O. Ricart, Mariana S. Castro, Paulo C.
Carvalho, Wagner Fontes, Marcelo V. Sousa, Arthur G. Fett-
Neto, Raquel B. Giordani. Proteomic analysis of Selaginella
convoluta: can the organ-specific approach provide insights into
the orchestrated events in the desiccation tolerance?
MANUSCRITO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO Proteomics.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 52
Proteomic analysis of Selaginella convoluta: can the organ-specific approach
provide insights into the orchestrated events in the desiccation tolerance?
“Dataset brief”
Fernanda Priscila Santos Reginaldo1#, Luiz Fernando Rodrigues de Souza1#, Marlon
Dias Mariano Santos7, Daisy Sotero Chacon1, Taffarel Melo Torres2, Ivanice Bezerra da
Silva1, Alan de Araújo Roque3, José Angelo S. Zuanazzi4, Carlos André O. Ricart5,
Mariana S. Castro5, Wagner Fontes5, Paulo Costa Carvalho7, Marcelo Valle de Sousa5,
Arthur Germano Fett-Neto6, Raquel Brandt Giordani1*
1 Laboratory of Pharmacognosy, Department of Pharmacy, Federal University of Rio
Grande do Norte, Natal, RN, Brazil.
2 Bioinformatic, Biostatistics and Computer Biology Nucleus, Rural Federal University
of Semiarid, Mossoró, RN, Brazil.
3 Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbario, Natal,
RN, Brazil.
4 Laboratory of Pharmacognosy, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
RS, Brazil.
5 Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology,
University of Brasilia, Brasilia, DF, Brazil.
6 Plant Physiology Laboratory, Center for Biotechnology and Department of Botany,
Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil.
7 Laboratory for Structural and Computational Proteomics, Carlos Chagas Institute,
Fiocruz, Curitiba, PR, Brazil.
Corresponding author: *[email protected] / Phone: +55(84)3342-9818 / Fax:
+55(84)3342-9834.
#Fernanda Priscila Santos Reginaldo and Luiz Fernando Rodrigues de Souza should be
considered joint first authors’.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 53
Abstract
Selaginella convoluta is a desiccation tolerant (DT) plant native from Brazilian semiarid.
DT plants have highly effective drought-resistance mechanisms that allow their survival
under extreme conditions. This study aimed to perform a proteomics dataset brief of
shoots and roots of Selaginella convoluta in two hydration conditions: dehydrated –
harvested in the natural semiarid environment; and hydrated – after acclimatization in lab.
The proteome analysis was performed by gel-free liquid chromatography coupled to mass
spectrometry and data analysis using PatternLab for proteomics; this approach allowed
the annotation of 1176 proteins. The differentially abundant proteins were related to
signaling and regulation, stress and defense, carbohydrates and energy metabolism,
protein destination and storage, and protein synthesis. Interestingly, the major responses
showed by shoots were photosynthesis and proteins involved in stress and defense;
otherwise, roots showed as major response signaling and protein regulation. Overall, roots
and shoots appear to have the capacity to establish an antioxidant protective system both
in the dehydration and in the hydration by a well-orchestrated response for regulating
desiccation tolerance.
Keywords
Desiccation tolerant; LC-MS/MS; organ-specific; proteome; Selaginella convoluta.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 54
III.III CAPÍTULO 3: Fernanda P. Santos Reginaldo, Rafael Freire, Isabelly C. M.
Costa, Ivanice Bezerra da Silva, Alan de Araújo Roque,
Fernando Hallwass, Ian Castro-Gamboa, Arthur Germano Fett-
Neto, Alberto J. Cavalheiro, Raquel B. Giordani. NMR-based
metabolite profiling of Selaginella convoluta in different
hydration states and the unprecedented occurrence of anabasine
in lycophytes. Phytochemistry Letters. 43: 75-79. 2021.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 55
NMR-based metabolite profiling of Selaginella convoluta in different hydration
states and the unprecedented occurrence of anabasine in lycophytes
Fernanda P. Santos Reginaldo,a Rafael Freire,b Isabelly C. M. Costa,a Ivanice Bezerra
da Silva,a Alan de Araújo Roque,c Fernando Hallwass,d Ian Castro-Gamboa,e Arthur
Germano Fett-Neto,f Alberto J. Cavalheiro,e Raquel B. Giordani a,*
a Pharmacognosy Laboratory, Department of Pharmacy; Federal University of Rio
Grande do Norte (UFRN); Natal, RN, 59012-570; Brazil
b Medway Metabonomics Research Group; University of Greenwich (UoG); Chatham
Maritime, Kent, ME4 4TB; United Kingdom
c Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbarium;
Natal, RN, 59015-350; Brazil
d Department of Fundamental Chemistry; Federal University of Pernambuco (UFPE);
Recife, 50670-901; Brazil
e Chemistry Institute; São Paulo State University (UNESP); Araraquara, São Paulo,
14800-060; Brazil
f Plant Physiology Laboratory, Center for Biotechnology and Dept. of Botany, Federal
University of Rio Grande do Sul (UFRGS); Porto Alegre, RS, 91501970; Brazil
*[email protected] / Phone: +55(84)3342-9818 / Fax: +55(84)3342-9834.
Address: Gal. Gustavo Cordeiro de Farias Street, s/n, 59012-570, Natal, RN, Brazil.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 56
ABSTRACT
Selaginella convoluta is a Brazilian endemic, desiccation tolerant plant with an effective
drought-resistance mechanism. Herein, nuclear magnetic resonance (NMR-based
metabolite profiling was used to investigate this species in different hydration states: dried
(harvested in the natural semiarid environment) and after rehydration. NMR is a suitable
tool for this analysis because it allows the simultaneous detection of secondary and
primary metabolites. To support NMR-based metabolite annotation, an in-house database
was built by including all the experimental 1H NMR spectral data reported for the natural
products previously identified in Selaginella spp. The analysis criteria were related to
spectral similarity values based on the algorithm of pattern recognition between the in-
house database and the 2D 1H-TOCSY-NMR experimental data. The in silico strategy
with a similarity threshold of 50%−100% between the experimental and virtual spectra
enabled the annotation of 86 metabolites. Among these, 49 metabolites showed a spectral
similarity of 100%. Notably, the isolation of the pyridine alkaloid anabasine from S.
convoluta shoots and its structural assignment provided new chemical information for
lycophytes. The multi-edaphoclimatic features of the Caatinga, an exclusively Brazilian
semiarid biome, may contribute to an altered metabolite profile associated with
desiccation.
Keywords:
NMR, nuclear magnetic resonance; SPE, solid-phase extraction
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 57
III.IV CAPÍTULO 4: Fernanda P. Santos Reginaldo, Paula C. Pires Bueno, Isabelly C.
Matos Costa, Alan A. Roque, Arthur G. Fett-Neto5, Alberto J.
Cavalheiro, Raquel B. Giordani. Molecular networking discloses
the chemical diversity of flavonoids and selaginellins in
Selaginella convoluta. Planta Medica 87:113–123. 2020
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 58
Molecular networking discloses the chemical diversity of flavonoids and
selaginellins in Selaginella convoluta
Fernanda Priscila Santos Reginaldo1, Paula Carolina Pires Bueno2,3, Isabelly Cristina
de Matos Costa1, Alan de Araújo Roque4, Arthur Germano Fett-Neto5, Alberto José
Cavalheiro6, Raquel Brandt Giordani1*
Affiliations
1 Department of Pharmacy; Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN),
Natal/RN, Brazil.
2 Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FCFRP-
USP), Ribeirão Preto/SP, Brazil.
3 Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam-Golm, Germany.
4 Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbarium,
Natal/RN, Brazil.
5 Laboratory of Plant Physiology, Center for Biotechnology and Department of Botany,
Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre/RS, Brazil.
6 Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), Araraquara/SP, Brazil.
Correspondence
*Professor Raquel Brandt Giordani - [email protected] / Phone: +55(84)3342-9818
/ Fax: +55(84)3342-9834. Address: Gal. Gustavo Cordeiro de Farias Street, s/n, 59012-
570, Natal/RN, Brazil.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 59
ABSTRACT
Selaginella convoluta is a desiccation tolerant plant native from the Brazilian semiarid
(Caatinga), endowed with an effective drought-resistance mechanism. As part of our
research efforts to understand the chemical diversity of Selaginella convoluta, dehydrated
(harvested in natural habitat under dry season) and hydrated (plant acclimated in
laboratory after rehydration) specimens were analyzed by HR-LC-ESI-MS/MS followed
by a structural annotation on the Global Natural Products Social Molecular Networking
(GNPS) Web platform. Molecular networking approach allowed the putative annotation
of 39 metabolites, mainly selaginellins and flavonoids. Based on MS/MS data, three
unprecedented selaginellin were annotated: 29-hydroxy selaginellin O, 29-hydroxy
selaginellin A, and 4-{[2-(4-hydrophenyl)-6-[2-(4-hydroxyphenyl)ethynyl]phenyl](4-
oxocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl}cbenzaldehyde, Results pointed out that
valuable scientific knowledge can be obtained from studies conducted with plants in their
natural habitat by allowing a more realistic profile of chemical diversity. The present
study adds new information on specialized metabolites of S. convoluta, mainly flavonoids
and selaginellins, and highlights the species as an untapped source of chemobiodiversity
from Caatinga.
Keywords
Selaginella convoluta, Selaginellaceae, selaginellins, flavonoids, Caatinga.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 60
III.V CAPÍTULO 5: Fernanda Priscila Santos Reginaldo, Paula Carolina Pires Bueno,
Estela Mariana Guimarães Lourenço, Isabelly Cristina de Matos
Costa, Letícia Gondim Lambert Moreira, Alan de Araújo Roque4,
Euzébio Guimarães Barbosa, Arthur Germano Fett-Neto, Alberto
José Cavalheiro, Raquel Brandt Giordani. Methyl jasmonate-
induced potentially bioactive selaginellins accumulation in
Selaginella convoluta.
MANUSCRITO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO Journal of Natural Products
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 61
Methyl jasmonate-induced potentially bioactive selaginellins accumulation in
Selaginella convoluta
Fernanda Priscila Santos Reginaldo1, Paula Carolina Pires Bueno2,3, Estela Mariana
Guimarães Lourenço1,7, Isabelly Cristina de Matos Costa1, Letícia Gondim Lambert
Moreira1, Alan de Araújo Roque4, Euzébio Guimarães Barbosa1, Arthur Germano Fett-
Neto5, Alberto José Cavalheiro6, Raquel Brandt Giordani1*
Affiliations
1 Department of Pharmacy; Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN),
Natal/RN, Brazil.
2 Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FCFRP-
USP), Ribeirão Preto/SP, Brazil.
3 Max-Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam-Golm, Germany.
4 Institute for Sustainable Development and Environment, Dunas Park Herbarium,
Natal/RN, Brazil.
5 Laboratory of Plant Physiology, Center for Biotechnology and Department of Botany,
Federal University of Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre/RS, Brazil.
6 Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), Araraquara/SP, Brazil.
7 Faculty of Pharmaceutical Sciences, Food and Nutrition, Federal University of Mato
Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brazil.
Correspondence
*Professor Raquel Brandt Giordani - [email protected] / Phone: +55(84)3342-9818
/ Fax: +55(84)3342-9834. Address: Gal. Gustavo Cordeiro de Farias Street, s/n, 59012-
570, Natal/RN, Brazil.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 62
Abstract
The chemotaxonomy of Selaginella spp. is interesting mainly regarding selaginellins an
unusual pigment class potentially bioactive. Although being important chemical markers
for the genus, selaginellins are naturally produced at low levels in the plant, which makes
their isolation and chemical characterization difficult, time consuming and impair
biological tests. However, the induction of the corresponded biosynthetic pathways with
methyl jasmonate (MeJA) could be an alternative to increase the content of specialized
metabolites, especially those with pharmaceutical interest. As part of our efforts in
investigate the desiccation tolerant Selaginella convoluta, a medicinal plant found in
northeastern Brazil, herein, specimens MeJa-treated (50, 100 M; 12, 24 and 48h) were
analyzed by liquid chromatography coupled to mass spectrometry. The results pointed
out that the exogenous MeJA significantly increased the phenolic derivatives content, and
selaginellins was the main metabolite class affected by the MeJA treatment. The amount
of Selaginellin G increased in 5.63-fold relative to control. Seven unprecedented
selaginellins were annotated herein by molecular networking approach, besides other
ones previously reported. Additionally, the in silico bioactive potential of the annotated
selaginellins was evaluated. The results pointed out significant antineurodegenerative,
antiproliferative, and antiparasitic potential activities. Taken together, our results pointed
out that the phytohormone MeJA could be an interesting alternative to induce potentially
bioactive selaginellins accumulation in S. convoluta.
Keywords
Selaginellaceae. MeJA. Selaginellins. Phenolic derivatives. Lycophytes
IV.DISCUSSÃO GERAL
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 66
A família Selaginellaceae possui diversas espécies que são reconhecidas por suas
atividades farmacológicas, as quais tem sido evidenciada por sua ampla utilização pelas
culturas indígenas (WENG; NOEL, 2013) e na medicina tradicional indiana (Sistema
Ayurverda) (SAH et al., 2005). Em Shen Nong Ben Cao Jing (The Divine Farmer’s
Materia Medica) 2737 a.C. está relatada a mais antiga documentação de tratamentos
baseados no uso da Selaginella, na qual espécies deste gênero foram usadas para tratar
inflamação, amenorreia e protuberâncias abdominais em mulheres (YANG, 1998).
Selaginella tem sido utilizada, em vários países para tratamento de uma diversidade de
doenças como câncer, problemas cardiovasculares diabetes, gastrite, hepatite, doenças de
pele e infecções do trato urinário (REGINALDO, F.P.S. et al., 2020). Estudos evidenciam
que extratos de algumas espécies de Selaginella demonstraram ter atividade
antinociceptiva (SÁ et al., 2012), anti-inflamatória, atividade antimutagênica,
antiespasmódica, imunoestimulante e como agente inibidor de transcriptase reversa
(REGINALDO, F.P.S. et al., 2020).
Selaginellaceae demonstra ser um interessante objeto de estudo com uma enorme
gama de potenciais a serem explorados. Conforme descrito no capítulo I, um amplo
espectro de atividades farmacológicas de espécies dessa família foi relatado, nas quais
algumas delas foram apontadas pela medicina popular. De modo geral, os principais
potenciais bioativos investigados para as espécies de Selaginella foram antimicrobiano,
antiparasitário, antifúngico, citotóxico, antioxidante e anti-hiperglicemiante.
Carboidratos, pigmentos, esteroides, derivados fenólicos, principalmente flavonoides, e
alcaloides são os principais produtos naturais de Selaginella. Além disso, diversas
espécies de Selaginellaceae tem demonstrado também ser um interessante objeto de
estudo no tocante aos potenciais químico e bioativo, visto que ainda foram pouco
explorados. Os estudos futuros devem fornecer dados para melhor explorar o (i) potencial
biológico das moléculas bioativas dessa família; (ii) desenvolver estudos sobre a
toxicidade e, (iii) por último, concentrar esforços em elucidar mecanismos de ação para
propriedades biológicas já relatadas. (Dados compilados e publicados em: Reginaldo et
al. 2020. Selaginellaceae: traditional use, phytochemistry and pharmacology.
Blacpma 19:3). Os principais dados de uso popular, fitoquímica e farmacologia da família
Selaginellaceae estão sumarizados na figura 1.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 67
Além dos pontos acima elencados apontando a família Selaginellaceae como uma
interessante ferramenta de estudo, é importante destacar que essa é uma família possui
mais de 400 milhões de anos de evolução, resistindo a diversas pressões bióticas e
abióticas durante seu processo evolutivo, conferindo a algumas espécies o interessante
traço evolutivo de tolerância à dessecação (BANKS, 2009).
Figura 1 Resumo dos mais importantes aspectos descritos na literatura sobre uso
popular, fitoquímica e farmacologia de Selaginellaceae.
Fonte: elaborado pelo autor
Nesse contexto, a investigação de redes regulatórias e metabólicas que conferem
tolerância à dessecação demonstram ser um interessante objeto de estudo, visto que
possuem um enorme potencial para o melhoramento de plantas agrícolas, particularmente
à medida em que os padrões climáticos globais mudam e os períodos de seca e
precipitação inconsistente se tornam mais comuns (FERNÁNDEZ-MARÍN et al., 2016).
A tolerância à dessecação (TD) envolve mais do que simplesmente ser capaz de resistir
ao estado desidratado – plantas tolerantes à dessecação podem resistir a um conteúdo de
água < 10% nos seus tecidos vegetativos e se recuperar desse estado (CUSHMAN;
OLIVER, 2011). TD é um traço evolutivo muito raro e algumas espécies de
Selaginellaceae possuem essa habilidade adaptativa (BANKS, 2009). Selaginella
convoluta é uma espécie endêmica na Caatinga, dotada do interessante traço evolutivo de
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 68
tolerância a dessecação (GAFF, 1987). Estudos ômicos tem investigado os mecanismos
moleculares envolvidos na tolerância à dessecação das espécies S. tamariscina (WANG
et al., 2010), S. lepidophylla (YOBI et al., 2013) e S. bryopteris (DEEBA et al., 2016).
No entanto, no tocante a S. convoluta não havia dados reportados na literatura sobre os
eventos orquestrados na tolerância dessecação para essa espécie antes do presente
trabalho.
Os capítulos II, III e IV reportam a investigação de S. convoluta em dois estados
de hidratação: (i) planta no estado desidratado ‒ conforme encontrada em campo na
Caatinga; e (ii) planta no estado hidratado ‒ reidratação adquirida em laboratório.
Conforme descrito no capítulo II, partes aéreas e raízes parecem ter estratégias similares
em resposta aos diferentes estados de hidratação. Além disso, a estratégia de análise
proteômica órgão-específica mostrou um maior número de proteínas diferencialmente
abundantes no estado desidratado nas partes aéreas do que nas raízes.
A estratégia órgão-específico apontou que os eventos envolvidos na TD não
somente ocorrem de forma bem orquestrada entre partes aéreas e raízes, mas também são
complexos e integrados. A figura 2 mostra uma representação esquemática integrando as
respostas a TD baseado em estudos de proteoma de espécies de Selaginella tolerantes à
dessecação. Nessa representação esquemática das respostas envolvidas na TD,
observamos que S. convoluta parece compartilhar com outras espécies de Selaginella
processos relacionados à TD principalmente a fotossíntese, sistema antioxidante e
metabolismo de proteínas, bem como o mecanismo morfológico do enrolamento do caule.
Além disso, a homoioclorofila, é uma resposta fisiológica ao TD que S. convoluta
compartilha com S. bryopteris e S. lepidophylla. Por outro lado, não observamos nenhuma
resposta espécie-específica relacionada à TD em S. convoluta; entretanto, foi possível
observar que outras espécies de Selaginella parecem ter respostas espécie-específicas
relacionadas à TD (Figura 2).
De modo geral, partes aéreas e raízes parecem ter a capacidade de estabelecer um
sistema de proteção antioxidante tanto durante a desidratação quanto no processo de
reidratação. A análise de interações proteína-proteína sugeriu que partes aéreas e raízes
parecem ter uma resposta bem orquestrada para regular a tolerância à dessecação nesta
espécie. A análise por Blastkoala indicou a presença de enzimas envolvidas na
biossíntese de metabólitos especializados como fenólicos, terpenoides, bem como
metabólitos contendo nitrogênio/enxofre.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 69
Figura 2 Representação esquemática de respostas compartilhadas e específicas de
espécies de Selaginella estudadas pela abordagem de proteoma.
Fonte: elaborado pelo autor
No capítulo III, o perfil metabólico baseado em RMN apontou a presença de
metabólitos como carboidratos e fenólicos numa resposta bem coordenada para regular
os eventos relacionados a TD, corroborando com os dados de proteoma ‒ capítulo II. As
análises de dados tiveram como critérios os valores de similaridade espectral baseados no
algoritmo de reconhecimento de padrões entre o banco de dados interno e os dados
experimentais 2D 1H-TOCSY-RMN. Essa estratégia in silico permitiu a anotação de 86
metabólitos com uma faixa de similaridade de 50% − 100% frente a dados espectrais de
metabólitos (primários e secundários) previamente relatados na literatura para o gênero.
Dentre eles, 49 metabólitos apresentaram similaridade espectral de 100%. O diagrama de
venn mostrou a distribuição dos metabólitos anotados entre os órgãos e estados de
hidratação (Figura 3). Diversos metabólitos primários foram anotados (carboidratos,
aminoácidos, poliaminas e nucleotídeos), os quais possuem uma relação bem estabelecida
com estresse abiótico em vários estudos disponíveis na literatura. Os metabólitos
especializados, flavonoides, biflavonoides e selaginelinas foram os principais derivados
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 70
fenólicos anotados. Essa quimiodiversidade de derivados fenólicos é intrinsecamente
relacionada com as características de TD, visto que as características mais típicas não são
apenas um alto acúmulo de carboidratos e aminoácidos, mas também alterações nos
fenilpropanoides, levando a perfis diferenciais de flavonoides (RASMUSSEN et al.,
2012; ARBONA et al., 2013). O gênero Selaginella é caracterizado pela presença de
amentoflavona como o principal biflavonoide (metabólito majoritário) (GEIGER, H.,
QUINN, 1988), que também foi caracterizado em S. convoluta.
Além disso, treze alcaloides foram anotados em S. convoluta. Embora dados
reportados na literatura apontem que os alcaloides possam ter um interessante potencial
antioxidante (MATSUURA et al., 2014), o papel específico desses metabólitos nos
processos de hidratação/desidratação ainda precisa ser estabelecido. Como um achado
inédito, o alcaloide anotado mais importante foi a anabasina. A anabasina foi isolada a
partir das PA, sendo caracterizada e elucidada através das técnicas de RMN e EM (Figura
3). Os sinais propostos para anabasina no espectro de 1H-TOCSY-RMN do extrato
metanólico de partes aéreas (antes dos procedimentos de isolamento) reforçam a
descoberta de que é um produto natural, descartando a possibilidade de um artefato
(Dados compilados e publicados em: Reginaldo et al. 2021. NMR-based metabolite
profiling of Selaginella convoluta in different hydration states and the unprecedented
occurrence of anabasine in lycophytes. Phytochemistry Letters. 43: 75-79).
A anabasina é um alcaloide encontrado em espécies de Nicotiana, que também
ocorre junto com a nicotina em algumas angiospermas. Até o momento, não existem
relatos da presença deste alcaloide em Selaginellaceae. Alcaloides foram relatados em S.
doederleinii (CHAO et al., 1987, 1990), S. moellendorfii (WANG et al., 2009) e S.
tamariscina (ZHENG et al., 2004); entretanto, nenhum deles está biossinteticamente
relacionado à anabasina. A relevância da anabasina contra o estresse biótico está bem
estabelecida (SINCLAIR et al., 2004), particularmente em Nicotiana glauca (DEBOER
et al., 2013). No entanto, não há dados reportados na literatura apontando a função da
anabasina no estresse abiótico. S. convoluta é uma das linhagens mais antigas de plantas
vasculares, e a ocorrência de anabasina em licófitas é inesperada. Não está claro se esta
ocorrência está relacionada às condições ambientais peculiares da Caatinga onde S.
convoluta ocorre e se uma função desse alcaloide poderia estar relacionada à mitigação
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 71
de espécies reativas de oxigênio e/ou proteção UV (LARSON; MARLEY, 1984;
NASCIMENTO et al., 2013).
Figura 3 (A): Diagrama de venn mostrando a distribuição dos metabólitos anotados
por RMN de Selaginella convoluta; (B): anabasina – alcaloide isolado.
Fonte: elaborado pelo autor
Conforme descrito no capítulo III, a quimiodiversidade nas amostras estudo
quando analisadas pela ferramenta de RMN permite apenas verificar se em S. convoluta
ocorre ou não metabólitos previamente descritos no gênero. Embora essa estratégia
apresente a vantagem de analisar em uma mesma amostra simultaneamente metabólitos
de diferentes polaridades e características estruturais, percebe-se a desvantagem de
identificar estruturas inéditas na literatura. Considerando que flavonoides e selaginelinas
foram os principais metabólitos especializados anotados na análise por RMN, abriu-se a
perspectiva de investigar de forma mais detalhada a ocorrência de novas entidades
químicas por outras ferramentas analíticas.
Desse modo, o capítulo IV tem como enfoque reportar a quimiodiversidade de
flavonoides e selaginelinas utilizando a técnica de LC-MS/MS combinada com a
abordagem de molecular networking (MN). A abordagem de MN permitiu a anotação de
39 metabólitos especializados, principalmente selaginelinas e flavonoides. Na figura 4 as
principais famílias moleculares associadas ao estresse hídrico foram destacadas, bem
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 72
como um diagrama de venn gerado usando o plugin Venn and Euler Diagrams do
software cytoscape para comparação quantitativa de íons registrados no Molecular
Networking entre os órgãos e os diferentes estados de hidratação. Baseado nos dados de
MS/MS, três selaginelinas não descritas na literatura até o momento foram anotadas: 29-
hidroxi-selaginelina O, 29-hidroxi-selaginelina A e 4 - {[2- (4-hidrofenil) -6- [2- (4-
hidroxifenil) etinil] fenil] (4-oxociclohexa-2,5-dien-1-ilideno) metil} benzaldeído. Até o
momento, este foi o primeiro estudo sobre Selaginella spp. usando a abordagem de MN
que mostrou não somente uma proposta do padrão de fragmentação para todas as
selaginelinas anotadas, mas também a predição de novas selaginelinas com base nos
dados espectrais MS/MS (Dados compilados e publicados em: Reginaldo et al. 2020.
Molecular networking discloses the chemical diversity of flavonoids and selaginellins in
Selaginella convoluta. Planta Medica. 87:113–123).
Figure 4 (A): Molecular networking dos dados de EM/EM obtidos no modo positivo
de ionização para Selaginella convoluta mostrando as principais famílias moleculares
associadas ao estresse hídrico; (B): Diagrama de venn com o total de íons observados
entre as amostras. Self-loops foram excluídos.
Fonte: elaborado pelo autor
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 73
Diversos potenciais biológicos de biflavonoides e selaginelinas de Selaginella
spp. foram relatados, dentre eles citotóxico, antiviral, antiprotozoário, antioxidante e anti-
hiperglicemiante. Ainda, esses metabólitos demonstraram ter um potencial protetor em
doenças cardiovasculares e neurodegenerativas (REGINALDO, F.P.S. et al., 2020). As
selaginelinas são produzidas naturalmente em níveis baixos na planta, o que torna a
extração química desses metabólitos difícil e demorada. Nesse contexto, o metil
jasmonato (MeJA) tem sido utilizado para induzir metabólitos especializados de interesse
farmacêutico. MeJA é um fitohormônio que desempenha papeis importantes na regulação
do crescimento vegetal e na sinalização de estresse endógeno e/ou exógeno (BLECHERT
et al., 1995; MEMELINK et al., 2001). Estudos relataram o uso de MeJA exógeno como
indutor de estresse para aumentar metabólitos especializados com importante potencial
bioativo em várias espécies de angiospermas (ZHANG et al., 2018; FRASER et al., 2020;
CHEN et al., 2020). No entanto, até o momento, não há relatos de tratamento com MeJA
para plantas da divisão Lycopodiophyta. Diante disso, conforme descrito no capítulo V,
realizamos um ensaio para examinar os efeitos do fitohormônio MeJA na indução de
metabólitos especializados, principalmente selaginelinas em S. convoluta. Os resultados
apontaram que o MeJA exógeno aumentou significativamente o conteúdo de derivados
fenólicos, sugerindo que as rotas biossintéticas associadas a esses metabólitos poderiam
ser reguladas positivamente pelo MeJA. A principal classe de metabólitos anotada e
afetada pelo tratamento com MeJA foram as selaginelinas. A selaginelina G foi a
selaginelina mais afetada pelo tratamento com MeJA, aumentando 5,63 vezes em relação
ao controle. De acordo com a rota de biossíntese das selaginelinas, a selaginelina G é
produzida sequencialmente por meio de desidroxilação, hidrogenação, desidroxilação e
redução a partir do intermediário β-hidroxicetona. As demais selaginelinas são
produzidas a partir da selaginelina G (SHI et al., 2012). Portanto, um maior acúmulo de
Selaginelina G pode resultar em um acúmulo de outras selaginelinas. Este padrão foi
observado para selaginelina, selaginelina A e selaginelina B nas partes aéreas na
concentração de 50 µM e 100 µM de MeJA em 24h, bem como em 100 µM de MeJA em
48h. No entanto, na concentração de 50 µM MeJA em 48h este padrão não foi observado
para selaginelina e selaginelina B. Adicionalmente, neste estudo, foi realizado o potencial
bioativo das selaginelinas por atividade in silico. Os resultados apontaram um interessante
potencial antineurodegenerativo, antiproliferativo e antiparasitário. Ainda, a abordagem
de molecular networking permitiu a predição de sete selaginelinas até então não descritas
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 74
na literatura. Essas selaginelinas preditas contribuem como uma nova informação química
para esta espécie. De modo geral, os nossos resultados apontaram que o MeJA pode ser
uma alternativa interessante para induzir o acúmulo de selaginelinas.
Finalmente, os dados aqui obtidos demonstram que a família Selaginellaceae é um
interessante objeto de estudo, visto que possui potencial bioativo e muitas espécies com
a quimiodiversidade até então pouco explorada. A aplicação de diferentes abordagens
ômicas num cenário complementar entre proteoma e metaboloma (RMN e LC-MS/MS-
MN) mostra ser uma estratégia correta capaz de fornecer dados robustos e mais próximos
do que ocorre naturalmente na planta. A expressiva quimiodiversidade observada em S.
convoluta, principalmente representada pela ocorrência de anabasina com grande
relevância quimiotaxonômica e pela anotação de dez moléculas inéditas de selaginelinas.
Finalmente, os resultados apontam para novas perspectivas de aprofundamento de
estudos de viés biotecnológico com a espécie, uma vez que indicamos a eficiência do
MeJA na elicitação de selaginelinas e exploramos dados de proteoma em diferentes
aspectos de hidratação. Os desdobramentos científicos desta tese são imensuráveis neste
momento, e os resultados aqui apresentados apontam para a necessidade de pesquisas na
área de produtos naturais utilizando ferramentas na fronteira do conhecimento para que
os resultados sejam efetivamente robustos.
V.CONCLUSÕES GERAIS
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 78
Os resultados apresentados nesta tese demonstraram que a família Selaginellaceae
tem diversos potenciais de estudo a serem explorados englobando da fitoquímica a
atividade biológica. Ainda, S. convoluta é uma interessante ferramenta de estudo tanto no
que se refere a investigação dos eventos envolvidos na tolerância a dessecação como em
relação a sua interessante diversidade química e potenciais bioativos pouco explorados.
Os dados aqui obtidos permitem as seguintes conclusões:
1. A família Selaginellaceae demonstra ser uma interessante ferramenta de estudos no que
se refere ao potencial fitoquímico e bioativo. Estudos de toxicidade e mecanismo de ação
até então ainda não foram explorados para os metabólitos de diversas espécies desta
família com potencial bioativo reportado.
2. Os dados de proteoma indicaram que partes aéreas e raízes parecem utilizar estratégias
similares para lidar com os eventos relacionados a tolerância à dessecação, possuindo um
robusto sistema antioxidante. Ainda, os dados de interação proteína-proteína apontam
que raízes e partes aéreas respondem a esses eventos de modo bem orquestrado.
3. Carboidratos, aminoácidos, poliaminas, e nucleotídeos foram os principais metabólitos
primários anotados por RMN. Ao passo que, flavonoides, biflavonoides e selaginelinas
foram os principais metabólitos secundários anotados. Ainda, um alcaloide inédito para
licófitas foi isolado, caracterizado e elucidado: anabasina. Este achado contribuiu como
uma importante informação referente à quimiotaxonomia das licófitas.
4. Abordagem de Molecular Networking revelou a diversidade química de uma
interessante classe de metabólitos: selaginelinas. Esta abordagem permitiu ainda a
predição de 3 novas selaginelinas com base nos dados espectrais, bem a proposta do perfil
de fragmentação para todas as selaginelinas anotadas.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 79
5. O Metil jasmonato exógeno parece regular positivamente a biossíntese dos derivados
fenólicos. Selaginelina foi a principal classe de metabólitos anotada e verificou-se que
seu teor é influenciado pelo tratamento com MeJA. Os estudos in silico apontaram que
esta classe demonstrou ter um interessante potencial antineurodegenerativo,
antiproliferativo e antiparasitário. Os dados de molecular networking permitiram a
predição de sete novas selaginelinas.
VI. REFERÊNCIAS
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88
APÊNDICE
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 91
APÊNDICE – Artigos publicados durante o período de doutorado
PUBLICADOS:
➢ Reginaldo, F. P. S.; Costa, I. M.; Giordani, R. B. Selaginellaceae: traditional use,
phytochemistry and pharmacology. Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas
Medicinales y Aromaticas, v. 19, p. 247-288, 2020.
➢ Reginaldo, F.P.S.; Bueno, P.C.P.; Costa, I.C.M.; Roque, A.A; Fett-Neto, A.G.;
Cavalheiro, A.J.; Giordani., R.B. Molecular networking discloses the chemical diversity
of flavonoids and selaginellins in Selaginella convoluta. Planta Medica. 2020.
➢ Damasceno, G. A. B. ; Barreto, S.M.A.G. ; Reginaldo, F. P.S. ; Souto, A.L.; Negreiros,
M. M.F.; Viana, R.L.S.; Pinto, T.K.B. ; Daher, C. C.; Silva-Filho, J.A.A.; Moura, R.
A.O.; Silva, M.A.; Silveira, W.L.L.; Medeiros, A. A.; Ostrosky, E.A.; Veríssimo, L.M.;
Sassaki, G.L.; Lopes, P.S.; Sales, V.S.F.; Rocha, H.A.O.; Cavalheiro, A. J. ; Giordani,
R. B.; Ferrari, M. Prosopis juliflora as a new cosmetic ingredient: Development and
clinical evaluation of a bioactive moisturizing and anti-aging innovative solid core.
Carbohydrate Polymers, v. 233, p. 115854, 2020.
➢ Lambert Moreira, L.G.; Leite Ferreira, M. E.; Reginaldo, F.; Lourenço, E.; Zuanazzi,
J.A.; Barbosa, E.; Santis Ferreira, L.; Fett-Neto, A. G. Cavalheiro, A. J.; Luchiari, A.C.;
Giordani, R.B. Erythroxylum pungens tropane alkaloids: GC-MS analysis and bioactive
potential of 3-(2- methylbutyryloxy) tropan-6,7-diol. Planta Medica. 2020.
➢ Reginaldo, F.P.S.; Freire, F.; Costa, I.C.M; Silva, I.B.; Roque, A.A; Hallwass, F.; Fett-
Neto, A.G.; Cavalheiro, A.J.; Giordani, R.B. NMR-based metabolite profiling of
Selaginella convoluta in different hydration states and the unprecedented occurrence of
anabasine in lycophytes. Phytochemistry Letters. 2021.
➢ Chacon, D.S.; Torres, T.M.; Silva, I.B.; Araújo, T.S.; Roque, A. A.; Selegatto, D.;
Reginaldo, F.P.S.; Pilon, A.; Costa, C.T.; Vilasboa, J.; Freire, R.; Ferreira, L.S.; Voigt,
E.L.; Zuanazzi, J.A.S.; Libonati, R.; Rodrigues, J.A.; Santos, F. L.M.; Peporine Lopes,
N.; Santos, L.V.; Scortecci, K.C.; Cavalheiro, A.J.; Fett-Neto, A.G.; Giordani, R.B.
Erythrina velutina Willd. alkaloids: piecing biosynthesis together from transcriptome
analysis and metabolite profiling of seeds and leaves. Journal of Advanced Research.
2021.
➢ Chacon, D.S.; Torres, T.M.; Silva, I.B.; Torres, T.M; Pereira, G.M; Moreira, L.G.L.;
Souza, L.F.R.; Reginaldo, F.P.S.; Roque, A. A.; Zuanazzi, J.A.S Libonati, R; Rodrigues,
J.A.; Santos, F.L.M.; Ricart, C.A.O.; Castro, M.S.; Fontes, W.; Sousa, M.V.; Fett-Neto,
A.G.; Giordani; R.B. Proteome of Erythroxylum pungens O. E. Shulz (Erythroxylaceae):
an endemic species of the semiarid Caatinga. Plant Systems. 2021.
Selaginella convoluta (Arn.) Spring: uma abordagem fitoquímica aliada a estudos ômicos
Fernanda Priscila Santos Reginaldo 92
EM PREPARAÇÃO:
➢ Reginaldo, F.P.S.; Souza, L.F.R.; Santos, M.D.M.; Chacon, D.S.; Torres, T.M.; Silva,
I.B.; Roque, A. A.; Zuanazzi, J.A.S.; Libonati, R; Rodrigues, J.A.; Santos, F.L.M.; Ricart,
C.A.O.; Castro, M.S.; Carvalho, P.C.; Fontes, W.; Sousa, M.V.; Fett-Neto, A.G.;
Giordani; R.B. Proteomic analysis of Selaginella convoluta: can the organ-specific
approach provide insights into the orchestrated events in the desiccation tolerance?
Proteomics.
➢ Reginaldo, F.P.S.; Bueno, P.C.P.; Lourenço, E.M.G.; Costa, I.C.M.; Lambert Moreira,
L.G.; Roque, A.A; Barbosa, E.G.; Fett-Neto, A.G.; Cavalheiro, A.J.; Giordani., R.B.
Methyl jasmonate-induced potentially bioactive selaginellins accumulation in Selaginella
convoluta. Journal of Advanced Research.
PRÊMIOS
➢ POSTER SESSION – NATURAL PRODUCTS: QPN091 - Metabolomic fingerprint at
different hydration states and structural identification of anabasine in Selaginella
convoluta, 42 Reunião Anual da Sociedade Brasileira Química. 2019.