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Informe Darlym, Hans, Humberto
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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
ESCUELA DE POSGRADO
CURSO
QUÌMICA Y BIOQUÍMICA AGROINDUSTRIAL
TEMA
CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES, PROTEÍNA POR
ESPECTROFOTOMETRIA Y TEOBROMINA POR RF-HPLC
ALUMNO:
REATEGUI DIAZ DARLYM
TAFUR PEREDA HANS JOAN
RIVERA ROJAS HUMBERTO HUGO
DOCENTE:
Dr. MANUEL RICARDO GUERRERO OCHOA
TINGO MARIA
2015
I. INTRODUCCION
La determinación de azúcares reductores, la obtención de aislados proteicos y el
análisis de teobromina mediante la técnica de HPLC se abordan en este trabajo. Con la
finalidad de afianzar nuestro aprendizaje y consolidar nuestros conocimientos teóricos,
siendo de suma importancia y trascendencia comprender los fundamentos para la
determinación de los temas antes mencionados.
El trabajo es de naturaleza experimental demostrativo y se desarrolló de la siguiente
manera: los azúcares reductores fue determinado por el método del 3,5-Dinitrisalicilico
(DNS) propuesto por Miller (1955), la cuantificación de proteínas se desarrolló por el
protocolos descrito por Lowry et al. (1951), ligeramente modificado usando una alta
concentración de la solución salina de cobre (Hartree, 1972). Y protocolo descrito por
Bradford (1976). Finalmente la teobromina Se determinó por cromatografía líquida de fase
reversa (FR-HPLC) propuesto por Carrillo (2013).
La práctica se desarrolló planteándose los siguientes objetivos:
Cuantificar azúcares reductores en muestra de plátano y hojas de zarzamora por el método
DNS.
Obtención de aislados proteicos a partir de torta de sachainchi (plukenetia volubilis) y
harina de semilla de huingo (crescentia cujete) y su cuantificación por los métodos de
Lowry y Bradford
Cuantificación de teobromina por FR-HPLC
II. MARCO TEORICO
2.1. Azúcares reductores
Definición: Los azúcares que contienen un grupo carbonilo libre se conocen como
azucares reductores. Todos los monosacáridos son azucares reductores. Los disacáridos son
azúcares reductores solo si contienen un grupo carbonilo libre. Los grupos carbonilo de la
glucosa y la fructosa intervienen ambos en el enlace glicosídico y, por tanto no están libres
para participar en otras reacciones. La maltosa, por otra parte, tiene un grupo carbonilo que
interviene en el enlace glicosídico, y el otro grupo carbonilo esta libre, por tanto la maltosa
es un azúcar reductor.
Importancia de los azúcares reductores en los alimentos. La reacción de Maillard
(técnicamente: glucosilación no enzimática de proteínas) se trata de un conjunto complejo
de reacciones químicas que se producen entre las proteínas y los azúcares reductores que se
dan al calentar (no es necesario que sea a temperaturas muy altas) los alimentos o mezclas
similares, como por ejemplo una pasta. Se trata básicamente de una especie de
caramelización de los alimentos, es la misma reacción la que colorea de marrón la costra de
la carne mientras se cocina al horno.
En 1916 Maillard (1878-1936) demostró que los pigmentos marrones y los
polímeros que ocurren durante la pirólisis (degradación química producida únicamente por
calor) se liberan después de la reacción previa de un grupo de aminoácidos con un grupo
carbonilo de azúcares. No fue sino hasta 1953 cuando se descubrió el mecanismo de las
complejas interacciones que se producen. La reacción de Maillard, también conocida como
'Pardeamiento no enzimático', es la responsable de muchos de los colores y sabores
existentes en todos los alimentos.
Factores que influyen en la Reacción de Maillard 1) Tipo de hidrato de carbono
2) Tipo de aminoácidos o proteína 3) Concentración de sustratos 4) Tiempo y temperatura de cocción
5) pH 6) Presencia de inhibidores 7) Actividad de agua Tipo de hidrato de carbono Los hidratos de
carbono se pueden clasificar según su estructura química en Monosacáridos, Disacáridos,
Polisacáridos
Inhibidores de la reacción de Maillard: Los inhibidores más comunes son los
sulfitos, metabisulfitos, bisulfitos y anhídrido sulfuroso. Actúan en la etapa de inducción retardando
la aparición de productos coloreados, pero no evitan la pérdida del valor biológico de los
aminoácidos. Su uso está limitado ya que produce efectos adversos a la salud.
Cuantificación de azúcares reductores por el método de DNS. Este
procedimiento se fundamenta en la reacción de los grupos reductores de los azúcares con el reactivo
oxidante ácido dinitrosalicílico (DNS). El reactivo consiste en una disolución formada por los
siguientes compuestos: ácido dinitrosalicílico (ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico), que actúa como
oxidante; Sal de Rochelle (tartrato sódico-potásico), que impide la disolución de oxígeno en el
reactivo y hidróxido sódico, que aporta el medio requerido para que se produzca la reacción redox.
De esta forma, el ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico se reduce, en presencia del grupo reductor de
la glucosa, formando el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, mientras que el grupo aldehído reductor se
oxida, para formar un grupo carboxílico. En este método analítico el DNS está en exceso frente a los
grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que mayores
concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. Estas
diferencias de coloración pueden determinarse por espectrofotometría visible, a la longitud de onda
de máxima absorbancia de 540 nm.
2.2. Metilxantinas
La teofilina, la cafeína y la teobromina son tres alcaloides estrechamente
relacionados que se producen en plantas de amplia distribución geográfica. No menos de la
mitad de la población mundial consume té (que contiene cafeína y pequeñas cantidades de
teofilina y teobromina).
La cocoa y el chocolate, de las semillas de Theobroma cacao, contienen
teobromina y algo de cafeína. La Teobromina puede producir un síndrome de dependencia
el cual no está muy bien caracterizado. (Dependencia al Chocolate).
Teobromina: (C7H8N4O2, de nombre químico 3,7-dimetilxantina o 3,7-dihidro-
3,7-dimetil-1Hpurina-2,6-diona) es un alcaloide de la familia de las metilxantinas, familia que
incluye también a la teofilina y la cafeína. Es una sustancia incolora e inolora con un sabor
ligeramente amargo. Se encuentra presente en el árbol del cacao, y sus semillas, y por consiguiente
en los productos del cacao y sus derivados.
Toxicidad: La teobromina se encuentra en concentraciones altas en el
chocolate. En ensayos clínicos se han usado dosis de más de 1000 mg sin efectos dañinos,
aunque con pueden provocar molestias estomacales leves. Para tener efectos nocivos sobre
los humanos debe de ingerirse una gran cantidad de cacao.
Sin embargo, la teobromina es altamente tóxica para ciertos animales
domésticos, como perros y gatos. Una dosis pequeña de teobromina puede causarles
arritmias cardíacas y convulsiones, e incluso la muerte.
Fuente: La fuente principal de teobromina es el cacao, Theobroma cacao que
puede llegar a contener hasta 3% de teobromina
2.3. Proteínas
Las proteínas son sustancias complejas, formadas por la unión de ciertas
sustancias más simples llamadas aminoácidos, que los vegetales sintetizan a partir de los
nitratos y las sales amoniacales del suelo. Los animales herbívoros reciben sus proteínas de
las plantas; el hombre puede obtenerlas de las plantas o de los animales, pero las proteínas
de origen animal son de mayor valor nutritivo que las vegetales. Esto se debe a que, de los
aminoácidos que se conocen, que son veinticuatro, hay nueve que son imprescindibles para
la vida, y es en las proteínas animales donde éstas se encuentran en mayor cantidad.
Funciones: Las proteínas determinan la forma y la estructura de las células y
dirigen casi todos los procesos vitales. Las funciones de las proteínas son específicas de cada
una de ellas y permiten a las células mantener su integridad, defenderse de agentes externos,
reparar daños, controlar y regular funciones, etc. Todas las proteínas realizan su función de
la misma manera: por unión selectiva a moléculas. Las proteínas estructurales se agregan a
otras moléculas de la misma proteína para originar una estructura mayor. Sin embargo, otras
proteínas se unen a moléculas distintas: los anticuerpos a los antígenos específicos, la
hemoglobina al oxígeno, las enzimas a sus sustratos, los reguladores de la expresión génica
al ADN, las hormonas a sus receptores específicos, etc.
Propiedades:
Especificidad: Las propiedades de las proteínas dependen de la estructura
tridimensional en el medio acuoso, es decir, de los aminoácidos que se disponen en su
superficie, que son los que constituyen el centro activo; también de los aminoácidos que se
disponen hacia el interior, ya que son los que dan rigidez y forma a la proteína.
Cada proteína tiene una conformación según su estructura primaria. Así, un pequeño cambio
en la secuencia de aminoácidos provoca cambios en la estructura primaria, secundaria,
terciaria, y por tanto pérdida de la actividad biológica.
Solubilidad: Las proteínas globulares son solubles en agua, debido a que sus
radicales polares o hidrófilos se sitúan hacia el exterior, formando puentes de hidrógeno con
el agua, constituyendo una capa de solvatación. Esta solubilidad varía dependiendo del
tamaño, de la forma, de la disposición de los radicales y del pH.
Desnaturalización: Pérdida de la estructura tridimensional o conformación,
y por tanto también de la actividad biológica. Se produce al variar la temperatura, presión,
pH, electronegatividad, etc. Esto provoca la rotura de los puentes de hidrógeno que
mantienen las estructuras secundaria y terciaria, y las proteínas se convierten en fibras
insolubles en agua. Si las condiciones son suaves, el proceso es reversible, y si el cambio es
más drástico, es irreversible.
III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Lugar de la práctica:
La práctica se desarrolló en el Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM), de la Universidad Nacional Agraria de la Selva
(UNAS); ubicada en el distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio Prado, departamento de
Huánuco; a una altitud de 660 m.s.n.m. a 09°17’08” de Latitud Sur, a 75° 59’52” de Latitud
Oeste, con clima tropical húmedo y con una humedad relativa media de 84% y temperatura
media anual de 24ºC.
3.2. Materiales, equipos y reactivos:
Materiales:
Fiola de 100 mL
Tubos de ensayo de 10 mL
Tubos ependoff 2mL
Micropipetas de 100, 1000 y 5000 uL, marca Lasany.
Gradilla
Equipos:
Espectrofotometro uv-vis. Modelo Espectronic 20. Marca Thermo Scientific
HPLC Desgasificador. Modelo DGU-14A. Marca Shimatzu.
HPLC Bomba. Modelo LC-10AT. Marca Shimatzu.
HPLC Horno Columna. Modelo CTO-10AS. Marca Shimatzu.
HPLC Detector uv-vis. Modelo SPD-10AU. Marca Shimatzu.
HPLC Controlador de Sistema. Modelo SCL-10A. Marca Shimatzu.
Software HPLC Class-VP versión 6.3.
Homogenizador
Centrifuga modelo MIKRO 22R
Balanza analítica modelo ESJ-210-4, Marca Presición
Estufa modelo ODH6-9240A. Marca Tomos
Reactivos:
Glucosa anhidra, Scharlau
3,5-Dinitrosalicilico acid, Sigma Aldrich.
Phenol P.A. Merck
Bisulfito de sodio. Merck
Tartrato de sodio y potasio. Sigma Aldrich
Estándar de teobromina 99%, Sigma Aldrich
Agua destilada desionizada.
Metanol grado HPLC, Merck.
Ácido acético glacial, Merck.
Cloruro de sodio, Merck
Hidroxido de sodio, Merck
Etanol absoluto, Induquimica
Muestra biológica:
Pulpa de plátano manzano (Musa balbisiana)
Polvo de cacao (Theobroma cacao)
Torta de sachainchi (Plukenetia volubilis)
Harina de semilla de huito (Genipa americana)
3.3. Métodos
Cuantificación de azucares reductores: Se determinó por
espectrofotometría por el método del 3,5-Dinitrisalicilico (DNS) propuesto por Miller
(1955)
Cuantificación de teobromina: Se determinó por cromatografía líquida de
fase reversa (FR-HPLC) propuesto por Carrillo (2013), se utilizó como fase móvil agua,
metanol y ácido acético (80:24,9:0,1), la fase estacionaria fue una columna C18 de 5 um. El
análisis se realizó con una elución isocrática a un flujo de 1mL/min en un tiempo de 10 min.
Extracción y cuantificación de proteína: El método utilizado para la
obtención de aislados proteicos es el siguiente:
Preparación de la muestra
1. Deshidratar la muestra hasta una humedad final aproximada del 10%.
2. Moler hasta alcanzar un tamaño de partícula menor a 500 um.
3. Para 100 g de muestra seca, diluir en 1000 mL de éter de petróleo anhidro y dejar agitar
por al menos 16 h a temperatura ambiente, también puede utilizar hexano en una
relación 1:4 (p/v) y dejar agitando por el mismo tiempo a 4°C, con el objetivo de
desgrasar la muestra.
4. Filtrar la muestra para separar el solvente que arrastrará la fracción lipídica.
5. Secar la torta residual a 40°C por al menos 60 minutos o hasta evaporar el solvente
residual.
6. Almacenar en refrigeración (4°C) la harina desgrasada (HD), obtenida en bolsas de
polietileno de alta densidad selladas herméticamente, hasta su uso posterior.
Extracción de la proteína.
1. En un matraz de 1L pesar 50 g de Harina Desgrasada (HD).
2. Si para la extracción se considera necesaria la incorporación de NaCl, pesar la cantidad
adecuada para la muestra y añadir al matraz.
3. Añadir buffer o agua destilada en una relación solvente: harina adecuada para la materia
prima (mL/g).
4. Regular el pH de la solución utilizando NaOH o HCl, si fuera necesario en función de
la materia prima a utilizar.
5. Agitar utilizando un agitador magnético a una temperatura y tiempo adecuado para la
materia prima a ser utilizada.
6. Centrifugar a 6000 rpm por al menos 20 min a 4°C.
7. Guardar el sobrenadante (S1).
8. Repetir con el precipitado el proceso de extracción (Pasos 3 al 6).
9. Guardar el sobrenadante (S2).
10. Juntar ambos sobrenadantes (S1 y S2).
11. Filtrar utilizando papel Whatman de paso rápido y medir el volumen total.
*Tomar una alícuota de 100 uL y cuantificar la proteína soluble por el método de Lowry
et al. (1951) o Bradford (1976).
12. Regular el pH hasta alcanzar el punto isoeléctrico (pI) de la proteína utilizando NaOH
2M y HCl 2M.
13. Centrifugar a 6000 rpm por al menos 20 min a 4°C, para lograr la precipitación de la
proteína.
14. Adicionar agua destilada en una proporción 4 a 1 (v/v) con los precipitados.
15. Repetir los pasos 12 y 13.
16. Repetir los pasos 14 y 15, por al menos dos veces más con la finalidad de lavar la
proteína.
17. Eliminar el sobrenadante y juntar los precipitados.
18. Neutralizar la proteína obtenida utilizando NaOH 2M y HCl 2M.
19. Liofilizar.
20. El aislado proteico así obtenido almacenarlo a 4°C en bolsas de polietileno de alta
densidad herméticamente selladas.
Cuantificación de proteína por el método de Lowry.
Se utilizará el protocolo descrito por Lowry et al. (1951), ligeramente
modificado usando una alta concentración de la solución salina de cobre (Hartree, 1972).
1. Preparar los siguientes reactivos stock:
a. Solución A, 2% p/v de CuSO4.5H2O;
b. Solución B, 4% p/v de tartrato de sodio potasio; y la
c. Solución C, 3% p/v de Na2CO3 en una solución de NaOH 0.1 M.
2. Al momento del análisis preparar el reactivo D adicionando a 50 mL de reactivo C, 0.5
mL de reactivo B y 0.5 mL de reactivo A.
3. Preparar el reactivo E diluyendo reactivo de Folín-Ciocalteu (2N) con agua en una
proporción 1:2.
4. En un tubo de ensayo adicionar 0.5 mL de muestra convenientemente diluida con suero
fisiológico (0.9% NaCl).
5. Adicionar al tubo con muestra 2.5 mL de reactivo D.
6. Mezclar utilizando un vórtex y dejar reposar un tiempo de 20 min a temperatura
ambiente.
7. Adicionar 0.5 ml de reactivo E.
8. Mezclar utilizando un vórtex y dejar reposar un tiempo de 40 min a temperatura
ambiente.
9. Con un espectrofotómetro medir la absorbancia a 750 nm contra un blanco preparado
con suero fisiológico (0.9%).
Nota: La curva estándar se construirá ploteando la absorbancia medida a 750
nm de albumina de suero bovino (BSA) a diferentes concentraciones (0-0.5 mg/mL) tratadas
con el mismo procedimiento de la muestra.
Cuantificación de proteína por el método de Bradford. Se utilizará el
protocolo descrito por Bradford (1976):
1. Preparar el reactivo de bradford:
a. Disolver 100 mg de Azul Brillante de Comassie G-250 em 50 mL de etanol (95%).
b. Agregar 100 mL de ácido fosfórico (85%).
c. Enrasar la solución a 1 L.
d. Mezclar bien y filtrar con una bomba de vació utilizando papel Whatman de paso
lento por lo menos tres veces, para evitar la presencia de reactivo no disuelto en forma
de puntos.
e. Almacenar a 4°C hasta su uso.
2. En un tubo de ensayo adicionar 0.4 mL de muestra convenientemente diluida con suero
fisiológico (0.9% NaCl).
3. Adicionar al tubo con muestra 1.6 mL de reactivo de Bradford.
4. Mezclar utilizando un vórtex y dejar reposar un tiempo de al menos 5 min y menos de
1 h a temperatura ambiente.
Con un espectrofotómetro medir la absorbancia a 595 nm contra un
blanco preparado con suero fisiológico (0.9%).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1. Cuantificación de azúcares reductores:
Determinación de la curva patrón
La curva patrón de glucosa, obtenida por regresión lineal entre los valores de
concentración de glucosa (g/L) versus la absorbancia, se muestra en la figura 1.
Skoog (1995) menciona que la ley de Beer es válida para una sustancia cuando la relación
concentración versus absorbancia es una línea recta, que pasa por el origen de los ejes
cartesianos, sin embargo a menudo en la práctica se observan desviaciones debidas a
diversos factores. Por lo tanto en base a esto podemos afirmar que para el caso de la glucosa
se cumple la ley de Beer por lo que obtuvimos un R2 = 0,9926 lo que indica que hay
linealidad entre concentración de glucosa y absorbancia. Si bien la recta no pasa por el origen
de los ejes cartesianos existe una desviación muy pequeña del orden de -0,088 lo cual
cumple con lo indicado por el mismo autor.
Figura 1. Curva patrón de glucosa
En el cuadro 1 se presenta los resultados de la evaluación de azúcares
reductores en pulpa de plátano manzano y hojas de zarzamora. Los resultados muestran
y = 0.4355x + 0.0888R² = 0.9926
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40
Ab
sorb
anci
a
Concentracion glucosa (g/L)
valores de azúcares reductores para la pulpa de plátano de 11,6% el cual difiere del reportado
por ITAL, (1985), quien encontró valores de azucares en plátano de 16,2% así mismo Davila,
(1992) reporta 14% de azúcares reductores al igual, Inga (2003) reporta 10,36%; estas
diferencias es posible se deban a los estados de madurez de la muestra evaluada tal como lo
menciona ITAL (1985). El contenido de almidón es mayor en los plátanos verdes los cuales
durante el proceso de maduración por efecto de las enzimas van transformándose en azucares
reductores por lo que el contenido de azucares reductores es mayor cuando mayor sea su
estado de madurez. El contenido de azucares reductores para el caso de la hoja de zarzamora
no fue detectado esto puede deberse que los valores de azucares presentes son muy bajos,
sin embargo esto se podría determinar por agregación de estándar como menciona (Soto,
2006)
Cuadro 01. Resultados de la cuantificación de azucares reductores en el plátano guayabo
Muestra Azucares reductores
(%)
Plátano manzano
Hoja de zarzamora
11,6
N.D.
4.2. Cuantificación de teobromina por RF-HPLC
Encendido y acondicionamiento de parámetros del RF-HPLC:
El acondicionamiento de los parámetros internos del RF-HPLC se realizó
utilizando el software Class-VP 6.3. Los cuales se muestran en el cuadro 2.
Cuadro 2. Parámetros del RF-HPLC para cuantificación de teobromina
Parámetro Medida
Temperatura horno 35 ºC
Flujo fase móvil 1 mL/min
Longitud de onda 270 nm
Sistema de elución Isocrático
Con los parámetros establecidos y luego de una limpieza de la columna con
metanol grado HPLC se creó la línea base eluyendo la fase móvil (Metanol 20% : agua 80%).
Los parámetros establecidos pueden variar dependiendo la fase móvil a utilizar como
menciona Alves, 2002.
Curva estándar de Teobromina:
En el cuadro 3 se muestra los resultados de los cálculos de volúmenes de agua
y stock (teobromina 100 uM), necesarios para preparar los estándares de teobromina a cinco
concentraciones diferentes.
Los valores de concentración de las soluciones pueden variar teniendo
siempre en cuenta no exceder los límites superior e inferior ya que ello puede conllevar a
pérdida de la linealidad de la curva patrón como menciona Skoog, 2005.
Cuadro 3. Preparación de estándares para curva patrón de teobromina
Estándar Stock 50 uM
Tb (uL) Agua (uL)
Volumen
Final (uL)
Concentració
n Tb (uM)
1 900 100 1000 5
2 800 200 1000 10
3 700 300 1000 15
4 600 400 1000 20
5 400 600 1000 30
En el cuadro 4 y figura 2 se muestran los resultados de las áreas encontradas
por cada solución estándar así como la curva patrón obtenida por regresión lineal entre los
valores de concentración de teobromina versus área de los picos cromatográficos de cada
solución estándar de teobromina.
En la figura 2 se puede observar dos curvas patrón esto se debe a que se tuvo
que corregir el mostrado en la figura 2 (a) ya que la ecuación no mostro linealidad al obtener
un R2 de 0,696 por lo que se descartó dos puntos hasta obtener el R2 de la figura 2 (b) esto
es posible que suceda por error de medición de volúmenes al preparar las disoluciones de
estándares.
Cuadro 4. Resultados de integración de áreas de las soluciones estándar de teobromina
Estándar Concentració
n (uM) TR (min) Área
1 5 4,02 78479
2 10 4,02 116407
3 15 4,017 93524
4 20 4,012 105531
5 30 4,013 150054
Figura 2. Curva patrón de teobromina
y = 2345x + 71279R² = 0.696
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0 10 20 30 40
Are
a
Concentracón Tb (uM)(a)
y = 1760.8x + 69035R² = 0.9844
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 5 10 15 20 25
Are
a
Concentracón Tb (uM)(b)
En la figura 3 se muestra el cromatograma obtenido de la corrida
cromatografica por RF-HPLC de extracto de polvo de cacao. Aquí se puede observar
diferentes picos cromatográficos que corresponden a cada componente de la muestra en la
cual se puede identificar teobromina por comparación del tiempo de retención al del estándar
corrido en la curva patrón (Ramírez, 2014)
Podemos además notar que el pico de teobromina esta sobre montado con
otro componente esto se debe a que los solventes de fase móvil no son los adecuados como
lo menciona (Cruz, 2015) quien indica que el agua debe ser acidificada con ácido acético al
0,1%
Figura 3. Cromatograma de extracto de polvo de cacao para cuantificación de teobromina
En el cuadro 5 se presenta el resultado de cuantificación de teobromina en
polvo de cacao. El valor encontrado (0,539 g/100g) es menor a los obtenidos por Carrillo,
2013 (0,77%) y Cruz, 2015 (0,61%) esto puede deberse al proceso de extracción de la
muestra que en nuestro caso solo se utilizó agua a diferencia de los autores mencionados que
utilizaron fase móvil como solvente de extracción.
El valor encontrado pueden ser discutidos en dos puntos de vista: en primer
lugar en el aspecto tecnológico, ya que éste compuesto junto con los polifenoles son
responsables de la amargura y la astringencia del chocolate producido (Efraim et al., 2011).
Teobromina
El otro aspecto es el efecto de la teobromina en el cuerpo humano, éste no
tiene el efecto estimulante, sobre el sistema nerviosos central como la cafeína, debido a que
su acción sobre este sistema es muy débil o casi inexistente, pero puede actuar como un
vasodilatador, relajante muscular, diurético y reductor de la presión arterial (.Van den
Bogaard y otros, 2010; Mitchell et al., 2011).
Cuadro 5. Concentración de teobromina en polvo de cacao
Muestra Área Teobromina (g/100 g)
Polvo de Cacao 91056 0,539
4.3. Cuantificación de proteína por los métodos de Lowry y Bradford
Curva patrón: En la figura 4 se presenta el grafico de dispersión y la
ecuación de regresión lineal de la concentración de albumina de suero bovino (0,1-0,6
mg/mL).
Skoog (1995) menciona que la ley de Beer es válida para una sustancia
cuando la relación concentración versus absorbancia es una línea recta, que pasa por el
origen de los ejes cartesianos, sin embargo a menudo en la práctica se observan desviaciones
debidas a diversos factores. Por lo tanto en base a esto podemos notar que para el caso de la
albumina de suero bovino no cumple la segunda condición por lo que a pesar que obtuvimos
obtuvimos un R2 = 0,9626 la recta está lejos de cruzar por el origen de coordenadas lo que
nos revelaría que no cumple con la ley de Beer.
Para comprobar ajustamos la curva patrón a pasar por el origen de
coordenadas en la cual podemos notar que la ecuación posee correlación negativa
(R2=-0,312) como se muestra en la figura 5. Estos resultados puede deberse a un error en la
preparación del blanco ya que el objetivo de éste es calibrar el equipo que a concentración
cero la absorbancia también sea cero.
Figura 4. Curva patrón de albumina de suero bovino
Figura 5. Curva patrón de albumina de suero bovino ajustada al origen de coordenadas
En el cuadro 6 se muestras los valores de absorbancia obtenidas por
extracción en diferentes medios (con y sin NaCl) de proteínas de harina de huingo a
diluciones de 50 y 100 .
El cuadro nos revela errores de lectura debido a la ineficiente preparación de
las disoluciones o puede también ser una deficiente rotulación de las mismas ya que para
cumplir la ley de Beer (mayores concentraciones deberá existir mayor absorbancia), sin
y = 1.0009x + 0.4485
R² = 0.9626
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Ab
sorb
anci
a
Concentración albumina de suero bovino (mg/mL)
y = 2.0359x
R² = -0.312
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Ab
sorb
anci
a
Concentración de Albumina de suero bovino (mg/mL)
embargo el cuadro indica a una menor dilución (mayor concentración) existe menor
absorbancia.
El contenido de proteína obtenido resulta ser negativo estos se debe a la
ineficiente preparación de las soluciones para preparar la curva patrón como se indicó
anteriormente.
Cuadro 6. Resultados de absorbancia de proteínas de Huingo obtenidas en medios con y sin
NaCl y a diferentes diluciones
Muestra Repetición Dilución Abs Proteína (mg/mL)
Huingo (con NaCl)
r1 50
0,061 -0,3872
r2 0,065 -0,3832
r1 100
0,116 -0,3322
r2 0,123 -0,3253
Huingo (sin NaCl)
r1 50
0,11 -0,3382
r2 0,111 -0,3372
r1 100
0,198 -0,2503
r2 0,184 -0,2643
En el cuadro 7 se muestras los valores de absorbancia obtenidas por
extracción en diferentes medios (con y sin NaCl) de proteínas de torta de sachainchi a
diluciones de 50 y 100 .
Al igual que en el caso anterior el cuadro nos revela errores de lectura debido
a la ineficiente preparación de las disoluciones o puede también ser una deficiente rotulación
de las mismas ya que para cumplir la ley de Beer (mayores concentraciones deberá existir
mayor absorbancia), sin embargo el cuadro indica a una menor dilución (mayor
concentración) existe menor absorbancia.
El contenido de proteína obtenido resulta ser negativo por los motivos indicados en
el caso anterior.
Cuadro 7. Resultados de absorbancia de proteínas de torta de sachainchi obtenidas en medios
con y sin NaCl y a diferentes diluciones
Muestra Repetición Dilución Abs Proteína (mg/mL).
Torta de sachainchi (con NaCl)
r1 100
0,024 -0,424
r2 0,028 -0,420
r1 200
0,039 -0,409
r2 0,043 -0,405
Torta de sachainchi (sin NaCl)
r1 100
0,011 -0,437
r2 0,014 -0,434
r1 200
0,024 -0,424
r2 0,02 -0,428
V. CONCLUSIONES
El contenido de azucares reductores en pulpa de plátano manzano fue de 11,6 %
No se logró determinar los contenidos de proteína por ninguno de los métodos (lowry y
Bradford) en torta de sachainchi y harina de semilla de huingo.
El contenido de teobromina en polvo de cacao fue de 0,539%
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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