Tema: glucogenolisis

Laboratorio: 06

I Introducción

Nuestro organismo obtiene energía a partir de la glucosa, que puede ser almacenada en el hígado y en los músculos, en forma de glucógeno. Por lo tanto el glucógeno, constituye la principal fuente de energía para los músculos.

El glucógeno es un polisacárido de reserva energética de los animales, formado por cadenas ramificadas de glucosa. Está formado por varias cadenas cortas (12 a 18 unidades) de glucosa. Los enlaces presentes en el glucógeno son del tipo glucosidico cada intervalo de entre 8 y 10 residuos enlazados de esta forma.

El hígado, capta y almacena glucosa transformándola en glucógeno, proceso conocido como glucogénesis. En esta práctica determinaremos cuantitativamente el glucógeno en un corte de hígado y la glucosa en el filtrado obtenido de este mismo, luego de incubarlo. De esta manera cuando se coloca un trozo de hígado en un medio salino, sin sustratos, va a predominar la glucogenolisis, es decir, la despolimerización del glucógeno.

II Objetivos

estudiar el proceso metabólico de la glucogenolisis en el hígado y la cuantificación del glucógeno y la glucosa liberada, para determinar su relación con la temperatura y con el tiempo.

III marco teórico

Glucogenolisis

La glucogenólisis es un proceso catabólico llevado a cabo en el citosol que consiste en la remoción de un monómero de glucosa de un glucógeno mediante fosforólisis para producir glucosa 1 fosfato, que después se convertirá en glucosa 6 fosfato, el segundo paso de la glucólisis. Es antagónica de la glucogénesis. Estimulada por el glucagón en el hígado, epinefrina (adrenalina) en el músculo e inhibida por la insulina.

Es un proceso que requiere un grupo específico de enzimas citosolíticas: la glucógeno fosforilasa que segmenta secuencialmente los enlaces glucosídicos, la fosfoglucomutasa que convierte la G1P en G6P la cual puede hidrolizarse a glucosa (en hígado) o seguir la vía glucolítica (hígado y músculo) y por último la Glucosil Transferasa α(1→4) y la amilo-1,6-glucosidasa, que se encarga de hidrolizar las ramificaciones. Su deficiencia produce la Enfermedad de Cori y la Enfermedad de Pompe

La regulación de la glucogenólisis La glucógeno fosforilasa es, de entre los varios enzimas que participan en el

Catabolismo del glucógeno, el enzima que más eficazmente regula la Glucogenolisis.

La regulación de la glucógeno fosforilasa hepática y la muscular es diferente La regulación de la glucogenolisis puede tener lugar por tres vías diferentes: Interconversión enzimática de la glucógeno fosforilasa (mecanismo dependiente

de CAMP; hígado) Activación del enzima por mecanismos dependiente de Ca2+ (músculo e hígado) Activación alostérica (AMP) Dado que el destino metabólico del glucógeno es diferente, la glucogenolisis está

regulada por señales hormonales diferentes en cada tejido (glucagón en el hígado y β-adrenérgicos en el músculo). El glucagón se produce en respuesta a niveles bajos de glucosa. La epinefrina es parte de la respuesta, de “alerta” del individuo ante el peligro.

Regulación de la glucogenolisis (I) La glucógeno fosforilasa (hígado y músculo) existe bajo dos formas: "a" es una forma activa del enzima, fosforilada, cuya actividad es poco sensible a

reguladores alostéricos. La de músculo es sensible a glucosa "b" es una forma defosforilada del enzima que es mucho menos activa, pero que

puede ser activada por efectores alostéricos (más en músculo que en hígado).

Regulación de la glucogenolisis (II) En el hígado y músculo, la glucógeno fosforilasa es fosforilizada, y activada, por la

fosforilasa quinasa Este enzima existe también bajo dos formas, una fosforilizada que es activa y otra

no fosforilizada que es mucho menos activa En hígado, la fosforilización y activación del enzima escatalizada por la proteína

quinasa A, dependiente de CAMP

GLUCOGENOLISIS

El cAMP es un mensajero intracelular que es sintetizado por la adenilato ciclasa, a partir de ATP, y rápidamente degradado por la 3’-5’ fosfodiesterasa

Regulación de la glucogenolisis en el músculo tiene ciertas singularidades:

La glucógeno fosforilasa de músculo, además de su interconversión y activación por fosforilización, es también regulable alostéricamente por glucosa, AMP, ATP, y G6P.

Glucosa es un efector alostérico negativo de la forma “a” (fosforilizada, activa) hepática.

AMP, que aumenta cuando los niveles de ATP son bajos, activa la forma “b” (no fosforilizada) del enzima.

ATP y glucosa-6-fosfato, poseen sitios de unión que se solapan con los de AMP, e inhiben la forma “b” de la fosforilasa activada por AMP

La degradación del glucógeno se inhibe cuando existe suficiente ATP y glucosa-6-fosfato.

Los mecanismos de desactivación de la glucogenolisis:

Los mecanismos descritos explican cómo tras una señal apropiada, se pone en marcha la glucogenolisis pudiendo dar la impresión de que una vez activada no cesaría hasta haber degradado totalmente el glucógeno.

Sin embargo existen en la célula toda una serie de mecanismos de desactivación que garantizan que la glucogenolisis solo estará activa si existe un estímulo continuado para que así sea.

En cuanto cesa ese estímulo, cesa poco después la degradación del glucógeno.

Los mecanismos de inactivación actúan a varios niveles:

1. Disminución de los niveles de cAMP Inactivación de la adenilato ciclasa por separación de G-GTP a G-GDP y su

separación del enzima Hidrólisis del cAMP por la fosfodiesterasa Inactivación de la Proteína quinasa A

2. Disminución del Ca2+ intracelular por bombeo a los correspondientes reservorios

3. Defosforilización de la glucógeno fosforilasa y la fosforilasa quinasa por una fosfoproteín-fosfatasa que se inactiva por efecto del glucagón y proteína quinasas

Glucogenolisis en la amilasa

La glucogenólisis aumenta en el músculo varios cientos de veces inmediatamente después del comienzo de la contracción. Esto comprende la activación rápida de la fosforilasa causada por la activación rápida de la fosforilasa cinasa por el calcio, la misma señal que inicia la contracción. La fosforilasa cinasa muscular tiene cuatro tipos de subunidades: alfa, beta gamma y delta, en una estructura representada como (alfa-beta gamma-delta).

Las subunidades alfa y beta contienen residuos de serina que son fosforilados por la proteincinasa dependiente de AMPc. La subunidad beta fija 4 iones calcio y es idéntica a la proteína fijadora de calcio, calmodulina. La fijación del calcio activa el sitio catalítico de la subunidad gamma en tanto que la molécula permanece en la configuración b desfosforilada. Sin embargo, la forma a fosforilada sólo es activada en forma total en presencia de calcio. En un hecho significativo que la calmodulina sea análoga en estructura a la TpC, la proteína fijadora de calcio en el músculo. Una segunda molécula de calmodulina o de TpC puede interactuar con la fosforilasa cinasa, aumentando la activación. Por lo tanto la activación de la contracción muscular y de la glucogenólisis son realizadas por la misma proteína fijadora de calcio, que asegura su sincronización (9).

Las enzimas que participan en la glucogenólisis son:

a) Fosforilasa: Es la enzima más importante para el desdoblamiento del glucógeno. Rompe el enlace 1,4 de la unidad de glucosilo del extremo de una rama o cadena de glucógeno, y cataliza simultáneamente la transferencia del glucosilo liberado a un fosfato inorgánico. De esta manera, la fosforilasa puede desdoblar casi la tercera parte de la molécula de glucógeno en glucosa 1-fosfato. Lo que queda de la molécula de glucógeno después de que la fosforilasa ha ejercido su efecto máximo se llama "dextrina límite".

La fosforilasa hepática se activa por transfosforilación (del ATP), debida a la enzima cinasa de desfosfofosforilasa, en presencia de magnesio. Esta activación es acelerada varias veces por el monofosfato cíclico de adenosina (AMP, o fosfato de 3,5-ribosa-adenina cíclica). El AMP se forma a partir del ATP por efecto de la enzima ciclasa de adenilo, que se encuentra en las membranas celulares. El glucágon y la adrenalina triplican la formación de AMP, por lo tanto, activan así la fosforilasa hepática, lo que explica su potente efecto glucogenolítico.

b) Fosforilasa del Músculo: Esta enzima difiere de la fosforilasa hepática por varias razones, principalmente porque existe en dos formas, las variedades a y b. La fosforilasa a del músculo (P.M. 495 000) es un dímero de b, y contiene cuatro unidades de fosfato de piridoxal por molécula, en tanto que la variedad b sólo contiene dos.

Las dos variedades presentan transformaciones mutuas. En el músculo en reposo predomina ampliamente la fosforilasa b; se activa y convierte en fosforilasa a por efecto de la cinasa de fosforilasa b, activada a su vez por el AMP cíclico. Puesto que la adrenalina (pero no el glucágon) aumenta considerablemente la formación de la AMP cíclico en el músculo, esta hormona aumenta la actividad de las fosforilasas del músculo e hígado, mientras que la acción del glucágon sólo se ejerce sobre el hígado.

En reposo, el AMP cíclico del músculo no basta para activar la fosforilasa, pero el ejercicio muscular y la anaerobiosis probablemente aumentan localmente la concentración del adenilato cíclico.

c) Enzima de desramificación (glucosidasa de 1,6 –amilo):

Puesto que la fosforilasa sólo ataca los enlaces 1,4 glucosídicos, deja de actuar cuando llega a un punto de ramificación. Cori y Larner (1951) dedujeron que la fosforólisis de las principales cadenas externas se detiene a varias unidades glucosílicas de distancia de un punto de ramificación; pero en el caso de las ramas laterales, prosigue hasta que sólo queda la unidad de glucosilo fijada por el enlace 1,6. La molécula de glucógeno "deshojada" o podada por la fosforilasa se llama "dextrina límite".

En este punto, la enzima de desramificación ataca el enlace 1,6 en cuestión, liberando unas moléculas de glucosa por cada punto de ramificación, lo que permite que vuelva a actuar la fosforilasa. En teoría cuando menos, estas intervenciones sucesivas de fosforilasa y enzima de desramificación pueden llevar el glucógeno al estado de cadena basal solamente, lo que se podría llamar el tronco; se puede producir así de 92 a 93% de glucosa 1-.fosfato y de 7 a 8% de glucosa libre.

d) Glucotranferasa de oligo 1,4 --------1,4:

Walker y Whelan ya sospechaban la presencia de esta enzima como contaminante en los preparados de glucosidasa de 1-6 amilo. En diversos análisis efectuados se obtuvieron resultados que hasta la fecha sugieren que la acción de la fosforilasa sobre las cadenas terminales se detiene a cuatro unidades de glucosilo de distancia de un punto de ramificación. En esta etapa (dextrina límite), la mayor parte de las cadenas externas "desprendidas" de la molécula parecen formadas por cuatro unidades alfa- 1,4-glucosilo, a partir de un punto de ramificación. Se cree que la glucotransferasa de oligo- 1,4 ---------1,4, pasa tres de estas unidades al extremo de otra cadena; por consiguiente, la fosforilasa puede volver a actuar sobre la cadena, ya más larga, y la enzima de desramificación puede atacar el enlace 1,6 en el punto de ramificación.

e) Alfa amilasas:

Olivarría y Torres (1962) demostraron que el alfa-amilasa del hígado podía atacar el glucógeno mediante: 1) Producción de oligosacáridos de cadena recta, como maltotriosa y maltotetrosa, a partir de las ramas externas del glucógeno, y 2) Liberación de sacáridos ramificados y de maltosa, desde el interior de la molécula. Existen varias maltasas (glucosidasas alfa 1,4) para transformar estos productos en glucosa. Sin embargo, todavía se ignora la importancia de la vía alfa-amilasa-oligosacárido maltasa en el catabolismo del glucógeno.

f) Glucógeno de lisosomas:

Los lisosomas poseen un conjunto de enzimas capaces de hidrolizar prácticamente cualquier componente del citoplasma que contienen entre otras, fosfatasa ácida, RNA asa, DNA asa, catepsina, beta-glucoronidasa, sulfatasa de arilo, beta-N-acetilglucosaminidasa, beta-galactosidasa y alfa-1,4(glucosidasa).

La función de esta última enzima en el metabolismo celular normal no se conoce todavía, pero la falta de maltasa ácida de lisosomas en la enfermedad de Pompe tiene como consecuencia el almacenamiento de glucógeno en acúmulos limitados por membranas (lisosomas).

Cascada amplificadora de la degradación del glucógeno, estimulada por adrenalina:

Este proceso se inicia cuando la adrenalina estimula la degradación del glucógeno en el hígado para convertirse a glucosa, originando una serie de reacciones de amplificación (cascada amplificadora), con lo cual se eleva la concentración de glucosa sanguínea. El mecanismo se lleva a cabo como sigue:

EFECTO DE TEMPERATURA Y PH EN LA ACTIVIDAD CATALITICA DE LA AMILASA

La amilasa, denominada también ptialina o tialina, es un enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien la bautizó en un principio con el nombre de diastasa.

En pocas palabras, en biología es una enzima presente en la saliva, que hidroliza el almidón de todo alimento.

Clasificación

α-Amilasa

(Nombre alternativos: 1,4-α-D-glucano-glucanohidrolasa; glucogenasa)

Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponiéndolos en dextrina desde la amilopectina. Dado que puede actuar en cualquier punto de la cadena es más rápida que la β-amylasa. En los animales es una enzima digestiva mayor y su pH óptimo está entre 6.7 y 7.2

β-Amilasa

(Nombres alternativos: 1,4-α-D-glucano-maltohidrolasa; amilasa sacarogénica)

Otra forma de amilasa, la β-amilasa es también sintetizada por bacterias, hongos y plantas. Actúa desde el extremo no reductor de la cadena, catalizando la hidrólisis del segundo enlace α-1,4, rompiendo dos unidades de glucosa (maltosa) a la vez. Durante el proceso de maduración de la fruta la β-amilasa rompe el almidón en azúcar dando lugar al sabor dulce de la fruta. La amilasa presente en el grano de cereal es la responsable de la producción de malta. Muchos microorganismos también producen amilasa para degradar el almidón extracelular. Los tejidos animales no contienen β-amilasa, aunque puede estar presente en microorganismos saprófitos del tracto gastrointestinal. Tiene un pH óptimo de 12.

γ-Amilasa

(Nombres alternativos: Glucano 1,4-α-glucosidasa; aminoglucosidasa; Exo-1,4-α-glucosidasa; glucoamilasa; α-glucosidasa lisosómica; 1,4-α-D-glucano glucohidrolasa)

Además de romper el último enlace α(1-4)glucosídico en el extremo no reductor de la cadena de amilasa y amilopectina, liberando glucosa, la γ-amilasa puede romper los enlaces glucosídicos α(1-6). A diferencia de las otras amilasas esta forma es más eficaz en medios ácidos y su pH óptimo es de 3. También colabora en el momento de la excitación.

Usos

Sirve en el diagnóstico de enfermedades determinando sus niveles en plasma para saber si se puede producir una pancreatitis. Sus niveles pueden estar elevados por un daño a las células productoras de la enzima en el páncreas, o bien, por una deficiencia renal (excreción reducida) o también por paperas.

Las enzimas amilasas son empleadas en la fabricación de pan para romper azúcares complejos como el almidón (presente en la harina) en azúcares simples. La levadura puede entonces alimentarse de esos azúcares simples y convertirlos en productos de fermentación alcohólica. Este proceso da sabor al pan y hace elevar la masa. Las células de la levadura contienen amilasas pero necesitan tiempo para fabricar la suficiente cantidad para romper el almidón. Este es el motivo de la necesidad de largos tiempos de fermentación (especialmente para determinadas masas). Las técnicas modernas de elaboración de masas incluyen la presencia de amilasas para facilitar y acelerar estos procesos.

Algunas amilasas bacterianas se emplean como detergentes para disolver almidones en determinados procesos industriales.

En la maduración de frutas la amilasa es sintetizada en la maduración, degradando el almidón de las frutas en azúcar, y volviéndolas más dulce

IV Materiales

Materiales y reactivos:

3.1Muestra

Hígado de res licuado.

Almidón

agua

3.2 Materiales:

Vasos de precipitado

pH metro

olla

matraz

lugol

3.3 Equipos:

balanza analítica

V Parte experimental:

1.- se midió el pH a la muestra (hígado licuado) obteniendo como resultado un pH igual a 5.

2.- Se adiciono 5 ml de extracto de hígado a un tubo de ensayo y luego se le adiciona 3 gotas de lugol y se comprobó que la reacción fue negativa ya que no hubo cambio de color.

3.- Se pesa 10 gr de almidón y 1 gr de cloruro de sodio.

4.- Se llena 10 ml de agua en un vaso precipitado.

5.- La muestra de almidón cloruro de sodio se adiciono en los 10 ml de agua.

6.- Se adiciona la solución de almidón y cloruro de sodio a los 125ml de hígado licuado y luego se mide el pH cuyo valor fue 6.

8.- La nueva solución (almidón + NaCl+ hígado licuado) se le adiciona en 4 tubos de ensayo utilizando un tubo de control que contiene 5 ml de agua.

9.- Los tubos de ensayos fueron puestos a baño María a 37° para luego hacer la prueba de lugol y observar.

10.- Cada 2s se iba retirando un tubo de ensayo para luego adicionarle 3 gotas de lugol, en nuestra experiencia el segundo tubo fue donde se pudo observa el cambio de color mostrándose de color blanco evidenciando presencia de glucosa.

VI Discusión

El resultado para la obtención de glucógeno a partir de hígado de res fue positiva, así como la prueba testigo, ya que ambas mostraron el color que el lugol debe marcar cuando es negativa en polisacáridos: un color blanco. Los resultados arrojados por los demás tubos de prueba muestran que obtuvieron pequeñas cantidades de glucógeno, y en ocasiones hasta la muestra testigo daba negativa siendo que esta era glucógeno al 1%; las respuestas de esta problemática creo que se deben al control que se tuvo ese día en el laboratorio por situaciones externas ya que, el manejo del recipiente que contenía al glucógeno pudo ser contaminado, ya que este era pipeteado con la boca; entre otros factores externos del medio ambiente que pudieron haber influido. Con respecto a la muestra, por lo cual no se obtuvieron los resultados deseados, esto se debe a que el animal pudo a ver sido sacrificado con muchos días de anticipación, lo que llevo a la pérdida del glucógeno, ya que para que la prueba de positiva debe ser sacrificado el animal al momento de la práctica.

VII Conclusiones

Se determino la presencia de glucosa, derivado de la reacción del glucógeno hepático y la enzima glucógeno fosforilaza en una muestra de hígado licuado.

Se conoció el proceso de glucogenolisis mediante el cual el glucógeno es catalizado por la enzima glucógeno fosforilaza hasta la obtención de glucosa.

Se llego a determinar la presencia de glucosa derivado de la glucogenolisis, en los tubos de ensayo mediante la prueba de lugol dando positivo solo para un tubo de cuatro, el color blanco que apareció en el tubo, efectivamente nos demuestra la presencia de glucosa en la muestra de hígado licuado.

VIII Recomendaciones

No excederse en el tiempo ni en el aumento de la temperatura de incubado de la muestra que fue de 37◦C, ya que esto podría provocar una desnaturalización de la enzima glucógeno fosforilaza.

Lo ideal para este tipo de análisis cualitativo es medir el pH del extracto enzimático con un potenciómetro (pH-metro) y no con una cinta de pH.

IX Bibliografía

Alemany M, Font S (1983): “Prácticas de Bioquímica”, 1ª ed. Editorial Alhambra

(Madrid, España), pp 99-107.

Clark JM (1966): “Bioquímica Experimental”, 1ª ed. Editorial Acribia (Zaragoza,España), pp 40-42.