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Establecimiento de organogénesis directa a partir de hojas y peciolo de violeta (Saintpaulia ionantha)
SALAZAR Andrea1, SUÁREZ Salomé 2
Escuela Politécnica del Ejército, Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Laboratorio de Cultivo de Tejidos. E-mail: [email protected] 1,
RESUMEN:
El presente trabajo tiene como objetivo el cultivar dentro de un medio estéril un explante de violeta para inducir organogénesis directa. Para lo cual se realizó un medio MS enriquecido con: 0.8mg/L de tiamina, 0.2mg/L de KIN, 2mg/L de AIA, 20g/L de azúcar y 7.5g/L de agar y pH ajustado a 5.7-5.8, ya que este proporcionará las condiciones adecuadas para el crecimiento de órganos, además previo a la siembra se realizó el proceso de desinfección el cual consistió en someter a los explantes de violeta en detergente y cloro tomando en cuenta las concentraciones y el tiempo que debe permanecer los explantes dentro de estos. Finalmente dentro de una cámara de flujo laminar se procedió al corte y siembra del explante en cada uno de los medios. Días después de la siembra se observaron los medios para ver características, los medios se encontraban contaminados.
Palabras clave: organogénesis, Saintpaulia ionantha, desinfección, explante
INTRODUCCIÓN:
El cultivo de tejidos vegetales se ha convertido en una estrategia importante en la propagación de especies, permitiendo obtener altas tasas de multiplicación a partir de un explante inicial. Debido a esto en los últimos años han ocurrido avances en el desarrollo de tecnologías para obtener órganos vegetales de un número cada vez mayor de especies. Esta técnica biotecnológica
permite la micropropagación, lo cual a partir de diferentes explantes y en condiciones de cultivo adecuadas se puede inducir a la formación de nuevos órganos de manera directa e indirecta. Esta es directa cuando el explante no pasa por la etapa de callo e indirecta cuando existe la formación del callo (Levitus et al, 2006).
La importancia de esta técnica radica en que la micropropagación y la organogénesis pueden ser utilizadas para la obtención de clones somáticos y regeneración de plantas completas con características uniformes, para lograr obtener plantas libres de microorganismos y difíciles de obtener por métodos de cultivo tradicionales (Calva y Vargas, 2005)
Por otro lado los sistemas de regeneración in vitro como la organogénesis directa realizada a partir de segmentos de hoja han permitido la obtención de gran número de plantas bien desarrolladas bajo condiciones establecidas y en un corto lapso de tiempo (Salazar, 2005).
El objetivo de este trabajo fue aislar mediante la técnica de cultivo in vitro explantes a partir de violeta (Saintpaulia ionantha) y cultivarlos en un medio estéril para promover la organogénesis directa observando las características que se presentan en el proceso.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Previamente al cultivo del explante se realiza los medios de cultivo medio MS enriquecido con: 0.8mg/L de tiamina, 0.2mg/L de KIN, 2mg/L de AIA, 20g/L de azúcar y 7.5g/L de agar y pH ajustado a 5.7-5.8, los cuales fueron debidamente autoclavados para evitar cualquier tipo de contaminación, además realizar un
proceso de desinfección en donde se toma en cuenta el tiempo y las proporciones de los componentes (tabla 1). Una vez desinfectado el material vegetal (hojas de violeta) se prosigue a la cámara de flujo laminar donde se realizaron 3 lavados para retirar los restos de hipoclorito de sodio y se mantienen los explantes en agua autoclavada.
Tabla 1: Concentraciones y tiempos del protocolo de desinfección
Concentración TiempoDetergente 1% 10 min
Cloro 1% 15 minAñadir 2 gotas de Tween20 por cada 100
ml de cada solución
Posteriormente tomar la pinza y bisturí, y flamear en el mechero. Sacar cuidadosamente las servilletas estériles y trabajar en los cortes, retirar el borde, la nervadura de la hoja y el peciolo, posteriormente dividir a la hoja en 5 o 6 pedazos, mientras que el peciolo fue cortado en la mitad, uno mitad se corta en forma transversal. Para el primer medio de cultivo se coloca 4 explantes de hoja y en el segundo medio se coloca los explantes del peciolo. Después de este proceso se coloca 3 capas de plástico y una liga para que el cultivo esté libre de contaminación. Finalmente se rotula y se los coloca en una repisa.
RESULTADOS:
Se realizó el 16-05-2012 la excisión, inoculación y transferencia de los explantes de violeta.
En la tabla 2 se indica las fechas en las cuales se realizaron las observaciones y si los medios se encontraban contaminados:
FECHA FRASCO 1(Hoja)
FRASCO 2(Hoja)
FRASCO 3(Peciolo)
FRASCO 4(Peciolo)
23 – 05 – 2012 Contaminado Contaminado Contaminado Contaminado30 – 05 – 2012 Contaminado Contaminado Contaminado Contaminado
Todos los explantes tanto de hoja como de peciolo se encuentran cubiertos por un moho blanco.
En las siguientes fotos se puede observar los frascos de la primera siembra:
Fig 1. Frasco 1, explantes del hoja (30-05-2012)
Fig 2. Frasco 2, explantes del hoja (30-05-2012)
Fig 3. Frasco 3, explantes del peciolo (30-05-2012)
Fig 4. Frasco 4, explantes del peciolo (30-05-2012)
Como todos los medios se encontraban contaminados se realizó una nueva siembra el 01-06-2012.
En la tabla 3 se indican las fechas de las observaciones de los nuevos medios con explantes de violeta:
FECHA FRASCO 1(Hoja)
FRASCO 2(Hoja)
FRASCO 3(Peciolo)
FRASCO 4(Peciolo)
06 – 06 – 2012 Contaminado Contaminado Contaminado Sin contaminación
13 – 06 – 2012 Contaminado Contaminado Contaminado Contaminado
En la tabla 3 se detalla la contaminación que se observó en cada frasco
FRASCOS 06 – 06 – 2012 13 – 06 – 20121
(Hoja)Se observa un moho blanco sobre
algunas partes los explantes.El moho blanco cubrió todos los
explantes.2
(Hoja)Se observa un moho blanco sobre
algunas partes los explantes.El moho blanco cubrió todos los
explantes.3
(Peciolo)Alrededor del explante la
superficie del medio de cultivo presenta un color blanco.
Se observa que toda la superficie se encuentra presenta color blanco.
4(Peciolo)
El medio no presenta ninguna contaminación y no cambio de
color. Los explantes no presentan ningún cambio.
Alrededor de dos explantes la superficie del medio presenta un color blanco y alrededor del otro explante se observa una cubierta
amarilla.
En las observaciones realizadas el volumen del medio no disminuyó.
En las siguientes fotos se observan los frascos de la segunda práctica:
Fig 4. Frasco 4, explantes del peciolo (06-06-2012)
Fig 4. Frasco 4, explantes del peciolo (06-06-2012)
Fig 4. Frasco 4, explantes del peciolo (06-06-2012)
Fig 4. Frasco 4, explantes del peciolo (06-06-2012)
Fig 4. Frasco 4, explantes del peciolo (13-06-2012)
DISCUSIÓN:
La organogénesis es un proceso en el cual se forma nuevos órganos estos pueden ser: vástagos, raíces, flores, hojas, etc. Esta técnica puede ser directa o indirecta, en la práctica se realizó la organogénesis directa, es decir, sin la formación de callo se obtienen órganos a partir de explantes (Alva, et al., 2010).
El proceso de desinfección permite la eliminación de los microorganismos mediante métodos químicos, en las técnicas de cultivo in vitro es indispensable que los explantes utilizados se encuentren en total asepsia, es por esto que se debe seguir protocolos de desinfección específicos para cada explante (Roca y Mroginski, 1993). Los explantes fueron desinfectados utilizando detergente al 1% y cloro 0,5% la primera práctica, se puede decir que con los resultados obtenidos el protocolo de desinfección fue incorrecto porque todos los medios realizados en la práctica se contaminaron.
Es por esto que se realizó una nueva práctica en la cual se aumentó la concentración del cloro al 1%. Los medios realizados se contaminaron otra vez, a excepción del medio que contenía los explantes del peciolo de la violeta. Se puede decir que en esta nueva práctica la contaminación probablemente se originó por un protocolo incorrecto al momento de la excisión, inoculación y transferencia de los explantes en el medio de cultivo, porque uno de los medios cultivados no se contaminó en la primera semana.
Las contaminantes más frecuentes en condiciones in vitro son los vitropátogenos estos son: hongos, bacterias y levaduras. Estos microorganismos influyen de forma negativa en la organogénesis directa porque compiten con el explante por los nutrientes que contiene el medio de cultivo y esto no permite que el explante pueda desarrollar órganos de forma directa (Alva, et al., 2010). Es por esto
que los medios fueron desechados y no se logró desarrollar el proceso de organogénesis directa con los explantes de violeta (Saintpaulia ionantha).
CONCLUSIONES:
• La técnica de organogénesis directa es un proceso en el cual a partir de un explante cultivado en un medio adecuado, se obtiene un órgano sin la formación de callo.
• Los protocolos de desinfección adecuados dependiendo del tipo de explante es fundamental en cualquier técnica de cultivo in vitro, porque el medio de cultivo en el cual se siembran los explantes tienen las condiciones adecuadas para el crecimiento de microorganismos si los explantes no se encuentran desinfectados correctamente.
• El proceso de excisión, inoculación y de transferencia de los explantes al medio de cultivo deben realizarse en total asepsia para que los medio no presenten ninguna contaminación.
BIBLIOGRAFÍA:
• Alva S, Menéndez A, Oropeza M y Vargas T (2010). Guía de Prácticas de Cultivo de Tejidos. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Ciencias. Escuela de Biología.
Departamento de Botánica. Venezuela.
• Calva, G., Vargas, J. (2005). Cultivo de células y tejidos vegetales: Fuente de alimentos para el futuro. Revista digital Universitaria de Mexico.
• Hernández Y y González M (2010). Efectos de la Contaminación Microbiana y Oxidación Fenólica en el Establecimiento In Vitro de Frutales Perennes. Departamento de Genética y Mejoramiento Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). La Habana- Cuba.
• Levitus, G., Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E. (2006) Biotecnología y mejoramiento vegetal II. Argenbio. Instituto Nacional de tecnología Agropecuaria. Argentina.
• Roca W y Mroginski (1993). Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y Aplicación. Centro Internacional de Agricultura. Cali- Colombia.
• Salazar, R. (2005) Micropropagación y organogénesis directa. Asociación de interciencia. Caracas. Venezuela.
