INGENIERÍA GENÉTICA

Clonación de DNA

• Introducir el DNA recombinante a una célula hospedera ( la maquinaria enzimática para la replicación del DNA)

• Seleccionar e identificar a las células hospederas que contienen el DNA • Seleccionar e identificar a las células hospederas que contienen el DNA recombinante

Sistemas de restricción-modificación( M-R)

• análogo a un “sistema inmune”

• usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exógenos

• Cómo defenderse del DNA exógeno ??

• Cómo proteger el DNA propio??

• Restricción reconocimiento de DNA exógeno “extraño” y destrucción del mismo

• Modificación El DNA propio es “marcado” químicamente (adición de grupos metilo)

Par Par endonucleasaendonucleasa + + metilasametilasa

de la misma de la misma especificidadespecificidad

(reconocen la misma (reconocen la misma secuencia)secuencia)

Sistemas de restricción

Tipo I Tipo II Tipo III

Complejos multisubunidadActividad de endonucleasa y metilasa en el mismo complejo

Enzimas endonucleasa y metilasa independientes

Complejos multisubunidadActividad de endonucleasa y metilasa en el mismo complejo

Cortan al DNA aleatoriamente en sitios lejanos (1,000 pb) del sitio de reconocimiento

Cortan en la secuencia de reconocimiento

Cortan cerca (25pb) del sitio de reconocimiento

Requieren ATP Requieren ATP

Sistema de modificaciónSistema de modificación--restricción restricción EcoEcoRI (en RI (en E. E.

colicoli))

Secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción TipoII

Secuencias palindromicas de 4 a 8 pb

Tipos de corte

VECTORES DE CLONACIÓN

Vectores de clonación y/o expresión

• En procariontes:– Plásmidos bacterianos– Bacteriófagos– Cósmidos– BACs

• En eucariontes– levaduras

• derivados del plasmido 2µµµµ, • YACs

Approximate Maximum Length of DNA That Can Be

Cloned in Vectors

•Vector Type Cloned DNA (kb)

Plasmid 20

λ phage 25

Cosmid 45

BAC (bacterial artificial chromosome)

300chromosome)

YAC (yeast artificial chromosome)

1000

VECTORES DE CLONACIÓN

• Vector de clonación- molécula de DNA transportadora

1. Replicación independiente (ori*)

2. Sitios de corte únicos

3. Marcador de selección3. Marcador de selección

4. Recuperación sencilla

Plásmidos

pBR322

Bacteriófagos

Bacteriófagos

Cósmidos

BAC (cromosoma bacteriano artificial)

YAC (cromosoma artificial de levadura)

SecuenciaciónMétodo Sanger

SecuenciaciónMétodo de Sanger

1 2 3 4

SecuenciaciónMétodo de

Sanger

MUESTRAS SECUENCIAS DE DNA NUCLEOTIDO

ATCCACGTGACCGTATATGCCTGAGATCCCTTCGT 35*TAG

TAGG* 1 5 ---------TGCAC* 2 10-------------------TGGCA* 3 15-----------------------------TA* 4 17---------------------------------TACGGAC* 5 24-----------------------------------------------TC* 6 26-------------------------------------------------TAGGGAAGCA 7 35TAGGTG* 8 7------------CA* 9 9----------------CTGG* 10 13------------------------CATATA* 11 19------------------------------------CGGA* 12 23--------------------------------------------CT* 13 25------------------------------------------------CTAGGGAAG* 14 34-------------------------------------------------------------------CA 15 35

Con ddT

Con ddC

-------------------------------------------------------------------CA 15 35TAG* 16 4------GT* 17 6----------GCACT* 18 11--------------------G* 19 12----------------------GCATATAC* 20 20--------------------------------------G* 21 21----------------------------------------GACTCTA* 22 28------------------------------------------------------G* 23 29--------------------------------------------------------G* 24 30----------------------------------------------------------GAA* 25 33-----------------------------------------------------------------GCA 26 35TAGGTGC* 27 8--------------ACTGGC* 28 14--------------------------AT* 29 16------------------------------AT* 30 18----------------------------------ACGG* 31 22------------------------------------------ACTCT* 32 27----------------------------------------------------AGGG* 33 31-------------------------------------------------------------A* 34 32-------------------------------------------------------------- AGC* 35 35

Con ddG

Con ddA

Reacción en cadena de la polimerasaPCR

Reacción en cadena de la polimerasaPCR

Aislamiento mRNA

Construcción y escrutinio de bibliotecas

Bibliotecas de DNA

Bibliotecas de cDNA

Escrutinio

NORTHERN O SOUTHERNBLOT

Microarreglos

Aplicaciones

También se puede introducir un nucleo a un ovulo anucleado, fecundar mediante tratamiento hormonal y reintroducir el ovulo a una oveja (o cualquier animal).

Terapia génica