Inmunoglobulina ADN clase recombinación de cambio: la inducción, la orientación y más allá

Resumen | ADN recombinación de cambio de clase (CSR) de la cadena pesada de inmunoglobulina (IGH) locus es fundamental para la maduración de la respuesta de anticuerpos y de manera crucial requiere la AID citidina deaminasa. RSE implica cambios en el estado de la cromatina y la activación transcripcional del locus de IGH en el interruptor de aguas arriba y aguas abajo (S) regiones que se van a someterse a S S-ADN de recombinación. Además, la RSE implica la inducción de la expresión de AID y la focalización de los factores de RSE a las regiones S por 14-3-3 adaptadores, y se ve facilitada por la maquinaria de transcripción y por modificaciones de las histonas.

En esta revisión, nos centramos en los últimos avances en cuanto a la inducción y orientación de RSE y delinear un modelo integrado del conjunto de complejos macromoleculares que transduce información epigenética crucial para efectores enzimáticos de la maquinaria de la RSE.

Los anticuerpos (inmunoglobulinas) son mediadores centrales de la inmunidad. Neutralizan directamente patógenos y productos derivados de patógenos, así como reclutan molecular y efectores inmunes celulares para erradicar las infecciones y las células tumorales. Las clases de anticuerpos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE se identifican por las diferentes regiones constantes en sus cadenas pesadas y tienen distinta distribución tisular y la eficacia contra diferentes tipos de agentes patógenos. Moléculas de IgM son secretadas como pentámeros o hexámeros, tiene una alta avidez para los antígenos con motivos repetitivos (tales como los que se producen en la mayoría de los patógenos microbianos) y mediar la activación del complemento. Sin embargo, no pueden pasar al espacio extravascular, debido a su gran tamaño. Por el contrario, la IgG monomérica, IgE monomérica y dimérica IgA monomérica o pueden distribuirse sistémicamente a los tejidos, en los que median una variedad de funciones efectoras biológicas. Aunque las células B vírgenes expresan solamente IgM e IgD, seleccionado clases de inmunoglobulinas y / o subclases (isotipos) son provocados durante el curso de una respuesta inmune, dependiendo de la naturaleza del antígeno provocar y su modo de ingreso. En los seres humanos, IgG1 e IgG3 son eficaces contra los virus, IgG2 contra bacterias encapsuladas, IgG4 e IgE contra parásitos extracelulares grandes, y IgA1 y IgA2 contra bacterias patógenas en las mucosas

Las regiones constantes de diferentes isotipos de inmunoglobulinas son codificadas por distintos grupos CH exón, que se organizan en el orden Cμ, Cδ, Cγ, Cε y Cα de la cadena pesada de inmunoglobulina (CIB) locus (Fig. 1). Clase-switch recombinación de ADN (RSE) da como resultado la sustitución de la agrupación CH exón expresado - por ejemplo, Cμ para IgM - con Cγ, Cα o Cε, dando lugar, respectivamente, a IgG, IgA o IgE en la que el antígeno región de unión variable es inalterada. De la nota, IgD se genera no a través de la RSE, sino a través de splicing alternativo de las (la línea germinal) transcritos primarios que codifican IgM. CSR da lugar a células B de clase conmutados, tales como células de IgG + B, que pueden responder a los antígenos más rápido que las células ingenuas Igμ + o Igδ + B, probablemente porque la cola más larga citoplásmico del receptor de células IgG B (BCR) induce BCR fuerte de señalización.

Junto con la hipermutación somática (SHM), que inserta principalmente mutaciones puntuales en el anticuerpo región variable de loci a una alta tasa para proporcionar un sustrato estructural para la selección positiva de los mayores mutantes de afinidad por el antígeno, la RSE es fundamental para la maduración de la respuesta de anticuerpos provocada por infecciones naturales y vacunas. Resultados de RSE defectuosos o aberrantes en una serie de enfermedades, incluyendo el síndrome de hiper-IgM (síndrome HIGM),

autoinmunidad sistémica o de órganos específicos, alergia y asma asociado con atópicas respuestas de IgE y la transformación neoplásica.

En esta revisión, nos centramos en los mecanismos moleculares que subyacen a la inducción de la RSE y considerar las formas en que el interruptor aguas arriba y aguas abajo (S) regiones que han de someterse a S-S ADN recombinación están dirigidos por la maquinaria de la RSE a través de la ARN polimerasa II maquinaria transcripcional y por medio de adaptador de proteínas que se unen específicamente a repeticiones en tándem que son característicos de ADN de la región S. También se discuten las funciones de andamios emergentes tanto enzimática y los elementos no enzimáticos en la estabilización de los factores de la RSE en las regiones S y consideran datos recientes sobre el papel de la inducción y regulación epigenética en especificando las regiones S que son el objetivo de la RSE. S generación y resolución región OSD RSE requiere la transcripción que inicia en una IGH intervenir región (IH) promotor y continúa a través del exón IH, la región S y luego el grupo CH exón; esto se conoce como la línea germinal IH-S-CH transcripción. RSE

también requiere deaminasa inducida por activación citidina (AID), que desamina deoxycytosines en región de ADN S, produciendo deoxyuracils (Recuadro 1; Fig. 2). Los tratamiento de dichos deoxyuracils resultados en la inserción de roturas en el ADN de doble cadena (DSBs) en el sentido ascendente (donante) y aguas abajo (aceptor) S regiones. RSE luego procede a través de la resolución del OSD; esto conduce a la supresión de la ADN intermedio (que da lugar a un ADN extracromosómico interruptor de círculo) y a la formación de una unión S-S que trae el CH región de ADN aguas abajo más cerca de la región de ADN VHDJH.

Para iniciar la RSE, la expresión de la AID y otros factores se deben en gran medida upregulated, y estos factores deben entonces ser dirigidos a las regiones S que serán sometidos a la recombinación, donde generan DSB y, finalmente, promover S S-ADN recombinación.

La generación de DSBs (que son compuestos intermedios de RSE obligatoria) implica processive desaminación AID-mediada de deoxycytosines, particularmente aquellos dentro de 5'-AGCT-3 'y 3'-TCGA-5' repeticiones en tándem en el "núcleo 'de la región S, produciendo altas densidades de deoxyuracils en ambas hebras de ADN (Fig. 2). Deoxyuracils se eliminan por DNA glycosylase uracilo (UNG) - un elemento crucial de la reparación por escisión de base (BER) vía - para producir sitios abásicos. Escisión de estos sitios abásicos por endonucleasas apurínicos / apyrimidinic (APE) conduce a un solo capítulo rompe ADN (SSB). SSBs proximales en cadenas opuestas fácilmente pueden formar escalonados DSBs6.

Además, escalonados DSB pueden surgir de AID y procesamiento UNG dependiente de DSBs región S contundentes generados por endonucleasa G, que escinde de uno y ADN doble varados principalmente a desoxiguanina y desoxicitosina. Por último, la topoisomerasa 1 puede introducir mellas en S núcleos región, probablemente mediante la escisión no B-forma de ADN. AID también puede ADN deaminate flanquean la región central S, pero menos eficiente debido a la escasez de repeticiones 5'-3'-AGCT. La desaminación en estas regiones conduce a la generación de SSBs principalmente. Tales SSBs pueden ser convertidos a DSB en una forma dependiente de proteínas clave desajuste de reparación (MMR), como MSH2 y MSH6. Estas proteínas pueden ser dirigidos a desoxiuracilo: desoxiguanina desajustes adyacentes a la SSB, donde reclutan a los 5'→ 3'EXO1 exonucleasa para producir DSBs19 (Fig. 2). Por lo tanto, MSH2 complementa la principal vía BER (que depende de la región S de núcleo y UNG) en la generación de DSBs, como se destaca por la ablación de la RSE en las células B que carecen tanto de UNG y MSH2 (Ref. 20) y en células B que carece tanto el núcleo Sμ y MSH2 (REF. 21).

DSB en las regiones S se generan en condiciones fisiológicas, pero son propensos a desencadenar el mismo conjunto de respuesta al daño del ADN (DDR) factores que reparan DSB generados por agentes que dañan el ADN extrínsecos, como la radiación ionizante. Los DSBs son finalmente resueltos por el extremo no homóloga clásica de unión (C-NHEJ) vía o el final alternativo de unión (A-EJ) vía (recuadro 2). Un papel para C-NHEJ (que se produce en la fase G1 del ciclo celular) en la RSE es apoyada por la presencia predominante de DSB región S dependientes de la ayuda y IGH focos que contienen el factor de la reparación de DSB NBS1 (REFS 6,22). De la nota, la recombinación homóloga se produce en la G2 y M fases, pero no está claro cuando se produce A-EJ. A-EJ - que está mediada por CTIP (también conocido como rbbp8) 23 y poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) (Tabla 1) - funciona como una vía de copia de seguridad cuando un factor básico de C-NHEJ está ausente y también se produce cuando DSBs se generan a través de la MSH2- y la vía EXO1-dependiente. En general, la resolución de S región DSBs en la RSE es un proceso altamente coordinado que utiliza la maquinaria de reparación del ADN y mantiene la integridad genómica.

La inducción y regulación de la RSE

La inducción de la RSE requiere que ambos estímulos primarios y secundarios. RSE estímulos inductores primarios, ya sea de células T dependiente o independiente de células T, inducen la expresión de AID y otras proteínas que son importantes en la RSE a través de factores de transcripción como el factor nuclear-kB (NF-kB) (Fig. 3). Secundaria estímulos inductores de RSE no puede inducir la expresión de AID, pero son necesarios para dirigir el cambio de clase a IgG, IgA o IgE mediante la selección de la región S aceptor través de la inducción de la línea germinal IH-S-CH transcripción. Estos estímulos secundarias incluyen la interleucina-4 (IL-4), factor de crecimiento transformante-β (TGF) y el interferón-γ (IFN; en ratones, pero no los seres humanos). Durante T respuestas de anticuerpos dependientes de células, la RSE se presenta principalmente en los centros germinales y se induce a raíz de la participación de CD40 en las células B por trimérica CD154 expresado por helper folicular células T CD4 + (TFH). CD40 induce altos niveles de cambio de clase a IgG1 e IgE en presencia de IL-4 y niveles moderados de cambio de clase a IgG2a e IgA en presencia de IFN y TGF, respectivamente.

Deficiencia en CD40 o sus resultados CD154 ligando en el síndrome de HIGM en los seres humanos y muy reducidos IgG, IgA e IgE niveles en mice6, lo que indica que CD40 tiene una papel crucial en T respuestas de anticuerpos de clase con conmutación dependientes de células. Sin embargo, los anticuerpos específicos IgG e IgA pueden surgir en las primeras etapas de una infección antes células T auxiliares específicas son activadas, lo que sugiere que la RSC de células T-independiente y-CD40 independiente tiene un papel en la generación de estos anticuerpos. En adición, CSR de células T-independiente media la generación de anticuerpos IgG específicos para muchos antígenos microbianos, tales como polisacáridos bacterianos. De hecho, T célula o CD40 ratones deficientes tienen niveles normales de IgG3 de suero y pueden generar anticuerpos IgG que son protectores contra una variedad de agentes infecciosos, aunque no tan eficientemente como de tipo salvaje ratones mutaciones deletéreas en los genes que codifican los receptores Tolllike (TLRs), TACI (también conocido como TNFRSF13B) o las moléculas de señalización corriente abajo de estas receptores resultan en niveles reducidos de anticuerpos IgG polysaccharidespecific y respuestas inmunes defectuosas a bacterias encapsuladas. Estos datos sugieren que CSR de células T-independiente es inducida por TLRs y / o TACI. A pesar de ello, la participación de los TLR o TACI - con o sin co-estimulación por IL-4, TGFß o IFN - conduce a sólo niveles marginales de la RSE. Sin embargo, la señal de BCR, que por sí solo no induce la RSE, sinergia con señales de TLR1-TLR2, TLR4, TLR7 y TLR9 para inducir de manera eficiente el cambio de clase de IgG3 o, en presencia de IL-4, TGFß o IFN, a otros isotipos de

inmunoglobulina; sino que también mejora el cambio de clase TACI-dependiente IgA33. El componente microbiana sólo se conoce que pueden inducir directamente eficiente RSE es lipopolisacárido bacteriano (LPS). LPS no sólo pueden participar TLR4 en las células B de ratón a través de su fracción de lípido A, pero también pueden reticular las BCRs de una gran proporción de células B a través de su resto polisacárido repetitivo (antígeno O). La necesidad de doble compromiso TLR y BCR para la RSE inducción destaca el papel de forma natural vinculados patrones moleculares microorganismassociated y microbiana repetitivo antígenos en la conformación del response34 células B adaptativa. Al igual que la señal de BCR, la señal de TACI sinergia con la señal del TLR7 y TLR9 para inducir la RSE.

En general, la participación de CD40 inicia células T dependiente de la RSE, mientras que la doble TLR-BCR, TACI-BCR o compromiso TLR-TACI induce RSE células T-independiente, que tiene un papel importante en T respuestas de anticuerpos de células independiente y también en las primeras etapas de T respuestas de anticuerpos dependientes de células.

La inducción de la AID.

Ya sea inducida en una celda de manera independiente de las células T dependiente o T, la RSE requiere AID, que se expresa de una manera células B linaje específico y la diferenciación etapa específica. AID es virtualmente indetectable en células B en reposo maduro, pero se expresa en altos niveles en las células B se someten a la RSC. Sin embargo, la AID puede mediar el cambio de clase a la IgE en las células B inmaduras, a pesar de que se expresa en un nivel bajo en estas cells. También podría mediar en la programación epigenética en células germinales primordiales y reprogramación de células somáticas. Esta idea es apoyada por la evidencia reciente de que la AID (y miembros de la familia APOBEC) pueden promover la desmetilación de 5-hydroxymethylcytosines (que se producen a partir de 5-metilcitosinas por la familia TET hidroxilasas) cuando se combina con la vía BER, que elimina 5-hydroxymethyluracils (que probablemente se generan por desaminación AID mediada de 5-hydroxymethylcytosines) 38. Sin embargo, la regulación estricta de la expresión de AID es necesario evitar translocaciones cromosómicas y para mantener la integridad genómica tanto en las células B y las células no-B. Esto se logra a través de un control fino del gen AID (AICDA en seres humanos y en ratones AICDA) y la proteína, en el nivel de la transcripción, la regulación post-transcripcional, la regulación después de la traducción (incluyendo la distribución nuclear y citoplasmática y estabilidad) y la función enzimática.

La transcripción del gen AID depende de NF-kB, que se activa en las células B principalmente por stimuli CSRinducing primario (Fig. 3). De la nota, CD40, TLR y TACI, pero no la BCR, solo pueden inducir la expresión de AID.

CD40 o compromiso dual TLR-BCR pueden activar las vías de NF-kB tanto canónicos y no canónicos. Debido a su capacidad de participar TLR4 y para reticular BCR, LPS también activa las dos vías para inducir la AID; induce el reclutamiento de la (no canónica) NF-KB p52 subunidad a la promoter28 gen AID y del (canónica) p65 subunidad a un elemento potenciador de aguas arriba. Además, la cinética de inducción AID (alcanzando un máximo de 48-60 horas después de la estimulación) reflejan la cinética de activación de la no canónica ruta de NF-kB, que media la expresión génica sostenida para apoyar la proliferación celular (que se requiere para RSC) y la diferenciación.

Por el contrario, la vía canónica NF-kB se activa rápidamente para inducir inmediata, pero normalmente transitoria, la expresión génica. Por lo tanto, la activación de la canónica y no canónica NF-kB vías iniciados y sostiene la transcripción de genes AID.

Además de NF-kB, que se expresa de forma ubicua y regula ampliamente muchos genes, factores de transcripción que se expresan en un lineage- células B y / o la diferenciación de manera etapa específica regula la inducción de la AID. Entre ellos se destaca hoxc4, un factor de transcripción homeodominio que está altamente expresado por las células B y es inducida por los mismos estímulos que inducen la AID y la RSE. Hoxc4 se une directamente al promotor del gen de la AID, que se conserva evolutivamente, en un sitio 5 'ATTT-3'incrustado dentro de un sitio de unión para la transcripción de dominio que contienen POU factores OCT1 y / o OCT2 (5'-3'-ATTTGAAT). NF-kappa B y SP1 también se unen a el mismo promotor (Fig. 3). Hoxc4 está regulada positivamente por estrógenos, potenciando con ello la expresión de AID y RSE, lo que sugiere que el estrógeno puede ser responsable de la desregulación de la AID en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), así como en ratones propensos al lupus. Estos ratones han aumentado los niveles de autoanticuerpos translocaciones clase conmutados (y hypermutated) y cromosómicas, que son inducidos de manera HOXC4- y dependientes de la ayuda.

La inducción de la expresión AID está influenciada por cuatro grandes regiones evolutivamente conservados en el locus del gen AID través de elementos cis-reguladores seleccionados, muchos de los cuales son sitios para factores de transcripción que se activan por la IL-4 y TGF (Fig. 3) vinculantes. Por ejemplo, transductor de señal y activador de la transcripción 6 (STAT6) es activada por IL-4 y probablemente se une a la región I, que se encuentra aguas arriba del promotor. Por otra parte, STAT6 IL-4-activa y activa-TGF SMAD3 y SMAD4 se unen a la región IV, que se encuentra a 9 kb aguas arriba del promoter49. Proteína proteínas emparejado cuadro 5 (PAX5) y E2A se unen a la región II, que es en el primer intrón, y el factor de transcripción AP1 BATF familia se une a la región III, que se encuentra a 17 kb aguas abajo del promotor. Estos factores de transcripción probablemente cooperan con NF-kB y hoxc4 sobre los elementos promotores y potenciadores, probablemente a través de interacciones de ADN de largo alcance, para mediar la inducción de la transcripción del gen AID en respuesta a estímulos y citocinas que inducen RSE primarios.

La transcripción de genes AID se somete a regulación negativa a través de cuatro elementos cis-represivas en la región II: dos sitios de unión putativos para MYB, que se conoce para activar o reprimir la transcripción en función del gen diana; un sitio de unión putativo para la familia factor de transcripción E2F, el cual contiene ambos activadores y represores; y una secuencia de CT-rica 350 pares de bases. Tanto MYB y factores inhibidores de la E2F familia se expresa en las células B vírgenes y células no-B y, por lo tanto, tiene un papel importante en el silenciamiento de la expresión de la AID en esas células. En las células B que están experimentando el cambio de clase, este efecto silenciador o bien se elimina o superado por factores de transcripción activados por estímulos y citocinas que inducen RSE primarios. Por último, la expresión de AID es suprimida por la proteína E-box inhibitoria ID2, que antagoniza PAX5 y E2A42. Por lo tanto, los factores de transcripción positivos y negativos restringir la ayuda de inducción a las células B se someten a la RSE y / o SHM.

Germinal IH-S-CH transcripción especifica RSE. Estímulos primarios permiten RSE, sino que requieren la cooperación de los estímulos secundarios a la conmutación directa al predeterminado isotipos de inmunoglobulina. Por lo tanto, los estímulos secundarios (es decir, IL-4, TGF o IFN) adaptar las funciones efectoras de anticuerpos a diferentes ámbitos del medio ambiente; por ejemplo, IgA es inducida en las mucosas, donde TGF se produce a altos niveles. La especificación de cambio de clase a un isotipo de inmunoglobulina dado depende de la inducción de de la línea germinal IH-S-CH transcripción que progresa a través de la región aceptor S; la región donante S se transcribe constitutivamente. Durante elongación de la transcripción, la la accesibilidad de la cromatina de las regiones S intrónicos se increased60

considerablemente, facilitando así su objetivo por la maquinaria de la RSE. Esto refleja el principio general que se requiere un estado de la cromatina abierta para la recombinación de ADN, la reparación y la replicación. Germinal IH-S-CH transcripción generaría ADN de cadena sencilla en la cadena no transcrita en las regiones S para permitir AIDmediated desaminación de deoxycytosines. Durante la transcripción, el exosome ARN ha demostrado recientemente para permitir AID también deaminate deoxycytosines en la cadena de ADN transcrita, posiblemente mediante la degradación de las moléculas de ARN en híbridos ARN: ADN. De la línea germinal IH-S-CH transcripción se inicia por promotores IH específicas de una manera dependiente en general factores de transcripción activados por citoquinas. IL-4 activa STAT6, que se une a los promotores Iγ1 y varepsilon para iniciar la transcripción de la línea germinal que procede a través

Sγ1 y Sε, permitiendo de este modo el cambio de clase a IgG1 e IgE, respectivamente. TGF activa SMAD3, SMAD4 y / o proteínas RUNX para promover la transcripción procediendo a través Sγ2b y Sα para el cambio de clase de IgG2b e IgA, respectivamente. Finalmente, IFN activa T-bet, STAT1 y / o STAT2 para la iniciación de la transcripción de la línea germinal que procede a través de Sγ2a para el cambio de clase a IgG2a6,62. La competencia entre los diferentes promotores IH para la maquinaria de transcripción

mejora la selección de isotipo. Por ejemplo, Ikaros media la supresión de la línea germinal Iγ2a-Sγ2a-Cγ2a y Iγ2b-Sγ2b-Cγ2b transcripción, downregulating con ello el cambio de clase de IgG2a e IgG2b, y promueve el cambio de clase de IgG3 e IgG1 (REF. 64).

Como se mencionó anteriormente, los estímulos primarios y secundarios activan distintos conjuntos de factores de transcripción. La división de las funciones específicas de estos factores, sin embargo, es borrosa debido a su interacción combinatoria de promotores y potenciadores en el locus IGH. IL-4, TGF y IFN sólo puede inducir niveles significativos de línea germinal IH-S-CH transcripción cuando CD40 o TLRs y BCR, también participan. Suchtranscription se induce a niveles suficientes para la RSE sólo en la presencia tanto de un promotor de intrónica IGH completamente funcional (iEμ) 65 y la región de control del locus situada aguas abajo de Cα (3'-LCR). El 3'-LCR contiene varios DNasa I-hipersensible elementos potenciadores que pueden ser activados por NF-kB, hoxc4, OCT1 y / o OCT2 (REF. 67), lo que sugiere que estos factores de transcripción probablemente interactúan con las activadas por IL-4, TGF o IFN para mediar en la inducción completa de transcription68. Estas interacciones pueden producirse a través de largo alcance ADN "sinapsis"

la participación de la 3'-LCR y promotores IH seleccionados. La interacción combinatoria de los factores de transcripción inducidos por estímulos primarios y secundarios también es importante en la inducción de la expresión AID. IL-4 STAT6 activado y proteínas Smad activadas por TGF mejoran notablemente la inducción AID por NF-kB, hoxc4, OCT1 y / o OCT2, que se activan por estímulos de RSE que inducen primarios. Así, mientras que los estímulos que inducen RSE primarios activan factores de transcripción que regulan la transcripción del gen AID y varios otros genes, los estímulos secundarios activan factores de transcripción que se unen a diferentes promotores IH para iniciar la línea germinal IH-S-CH transcripción, especificando así las regiones aceptor S que han de someterse a la RSE. La inducción completa de la línea germinal IH-S-CH transcripción requiere la interacción de los dos conjuntos de factores de transcripción.

Focalización de la maquinaria de la RSE

La orientación específica de la maquinaria de la RSE a las regiones S que serán sometidos a la recombinación se basa en varios factores. La primera es la recurrencia en un alto frecuencia de repeticiones 5'-3'-AGCT en las regiones S, que no están presentes en el genoma en su conjunto, ya que estas repeticiones están ligados específicamente por 14-3-3 adaptadores y otros Elementos de RSE. En segundo lugar, se

necesita el estado de la cromatina abierta inducida de las regiones de destino S (según lo especificado por los estímulos de RSE que inducen secundarias), y este estado permite para el acceso de la maquinaria de la RSE. Por último, la orientación requiere el estancamiento de la ARN polimerasa II durante la línea germinal IH-S-CH transcripción, lo que permite una alta tasa de de depósito sobre los S regiones de las moléculas AUXILIOS que están enganchados a la polimerasa. Regiones S y repeticiones 5'-3'-AGCT. Regiones S son los objetivos específicos de la maquinaria de la RSE, y la supresión de Sμ o regiones S aguas abajo ablaciona CSR69. La maquinaria de la RSE no inserta DSBs en sitios predeterminados dentro de las regiones S. Más bien, se puede introducir DSBs en prácticamente cualquier parte de una región S (que va desde 3 kb a 10 kb de longitud), pero con una fuerte preferencia por su núcleo. El núcleo de todas las regiones S es altamente enriquecidas en repeticiones 5'-3'-AGCT. Estos representan más del 45% de ADN Sμ núcleo pero menos de 1,4% del ADN en el genoma, incluyendo CH regions70. La frecuencia de las repeticiones de 5'-3'-AGCT en regiones S se conserva a través especies que utilizan la RSE para diversificar sus anticuerpos, desde ranas para humans70 (ver información complementaria S1 (figura)). Los altos niveles de suero de inmunoglobulina específica isotipos en ciertas especies (por ejemplo, IgE en los caballos y IgG2a en ratas) probablemente reflejan la adaptación de las especies a las presiones selectivas inducida por patógenos como resultado de condiciones de vida de acogida o dietas. Los altos 5'-3'-AGCT frecuencias en las regiones S de los loci que codifican estos isotipos son, por lo tanto, sugerente de un beneficio evolutivo de tándem 5'-3'-AGCT repite con la RSE. RSC está alterada en las células B en el que el núcleo Sμ ha sido borrada y está casi abolido en las células B cuando la eliminación del núcleo Sμ se ve agravado por la abrogación de MSH2 expression21. Además, la sustitución de la región de ratón Sγ1 con el extremo 5 'AGCT-3'-rica región Sμ de Xenopus laevis promueve el cambio de clase a IgG1 (REF. 71), y la sustitución de la región Sγ1 ratón de longitud completa con Sγ1 y Sγ3 núcleos, los cuales son ricas en repeticiones 5'-3'-AGCT, era suficiente para inducir la RSE en este sitio. Estas observaciones apoyan aún más la importancia crucial de repeticiones 5'-3'-AGCT en la RSE. Además, 5'-3'-AGCT es una versión de un punto de acceso 5'-3'-RGYW de SHM, y esta secuencia hotspot contiene el motivo desaminación AID 5'-3'-WRC en ambas hebras de ADN. Por lo tanto, se repite 5'-3'-AGCT proporcionan el sustrato para la AID para generar deoxyuracils a altas densidades en ambas hebras de ADN, dando lugar a la formación de DSB en la región del núcleo S. Dada la escasez de repeticiones 5'-3'-AGCT en las zonas que flanquean la región central S, desaminación AID mediada en esas zonas - que depende probablemente en el R-loop formación-daría lugar a la generación de SSBs principalmente, que se puede convertir a DSB de manera MSH2-dependiente.

Por lo tanto, los 5'-3'-AGCT repeticiones centrales proporcionan los sustratos estructurales que median la afinidad intrínseca de la maquinaria de RSC para las regiones S pero no para otro ADN secuencias en el locus IGH o en los genes no inmunoglobulinas en el genoma en general.

14-3-3 proteínas como objetivo adaptadores.

Repeticiones 5'-3'-AGCT no son sólo los sustratos preferidos de la ayuda, sino también la objetivos específicos de las proteínas 14-3-3 adaptador, que no se unen a otras iteraciones 5'-3'-RGYW o motivos ricos en G.

14-3-3 adaptadores son reclutados para S regiones (Fig. 2), y la inhibición de su unión a las regiones S usando difopein resultados en RSE disminuida. Además, las células B que son deficientes en 14-3-3γ o que expresan un dominante negativo

Mutante 14-3-3σ es defectuoso en CSR70.

14-3-3 proteínas tienen un papel importante en la orientación de la maquinaria de RSC a las regiones S, en virtud de su capacidad para tender un puente sobre las proteínas con ADN u otras proteínas. Ellos interactúan directamente con la AID y la proteína quinasa A subunidad-α catalítica (PKA-Cα) y median la unión de la AID y PKA-Cα a las regiones S, donde fosforila PKA

AID75 (Fig. 2). La unión de las proteínas 14-3-3 a la AID depende de la región carboxi-terminal de AID70, que contiene la secuencia de exportación nuclear (NES). Esta región es prescindible para la actividad desaminación de la AID, pero es crucial para la RSE y se ha planteado la hipótesis de que el sitio de unión de cofactores RSE específicos de la AID.

El fracaso de una ayuda C-terminal truncado mutante (AID1-190) - que se encuentra en algunos pacientes con síndrome HIGM - para unirse a 14-3-3 adaptadores explica por qué este mutante AID no se puede concentrar en las regiones S.

De hecho, hace cumplir 'unión' de AID1-190 a 14-3-3γ través de la vinculación física de los dos péptidos podrían rescatar plenamente la RSE en las células AUXILIOS deficientes B (TM, EJP, G. Li, J. Moehlman, Z.X. y P.C., observaciones no publicadas). Por el contrario, la RSE no podía ser rescatado mediante la vinculación de AID1-190 a un NES de otra proteína, tal como proteína quinasa inhibidor-α, el VIH-1 Rev, humano linfotrópico-T virus 1 (HTLV-1) Rex, un mitógeno proteína quinasa activada o vinculante RAN-proteína 1 (REF. 79). Esto sugiere que 14-3-3 adaptadores son cofactores que se unen a la C-terminal de la AID y son necesarias para la RSE. Por lo tanto, la orientación inherente de las regiones S por la maquinaria de RSC depende de 14-3-3 adaptadores, ya que estas proteínas son altamente específicos para las repeticiones 5'-3'-AGCT. 14-3-3 adaptadores tienen un papel importante en la región de ADN S en el reclutamiento y la estabilización de la AID y la PKA.

Transcripción y RSE focalización.

La alta densidad de repeticiones 5'-3'-AGCT en todos los S regiones y el alta avidez inherente de 14-3-3 adaptadores para esas repeticiones asegurar que 14-3-3 adaptadores se pueden unir a cualquier región S. Sin embargo, estos adaptadores (así como otros factores RSE) se dirigen solamente las regiones donantes y aceptor S que serán sometidos a recombination70. Esto es probablemente debido a la presencia de un estado de la cromatina abierta en estas regiones S que proporciona el acceso de los factores de RSE, como se refleja por el (constitutiva o inducida) de línea germinal IH-S-CH transcripción en las regiones donantes y aceptor S.

Un papel directo de la línea germinal IH-S-CH transcripción en AID focalización fue sugerida por la asociación selectiva de AID con la RNA polimerasa II y el transcrito S región DNA80,81. En consecuencia, la RSE se altera en las células B con deficiencia de proteínas de unión a AID que también funcionan en el metabolismo del RNA. Tales proteínas incluyen la elongación factores de transcripción SPT5 y SPT6, polypyrimidine proteína de unión al tracto-2 (PTBP2), que regula el empalme de ARN y el exosoma ARN, que funciones en el procesamiento del ARN (Fig. 4). ARN polimerasa II se estancó o se detuvo en S regions, tal vez debido a las conformaciones de ADN secundarias complejas (como estructuras cruciforme similares) ha sido posible gracias palindromic repite 5'-3'-AGCT. La interacción de AID con ARN polimerasa II es mediada por SPT5, que, al igual ARN polimerasa II, se enriquece en S regions83. SPT5, sin embargo, también se enriquece en los promotores de una proporción sustancial de transcrito activamente no inmunoglobulina genes83, coherente con los resultados que muestran el genoma unión de AID para genes88 transcrito. La sugerencia de que la contratación AID está mediada por SPT5 y ARN polimerasa II estancamiento presta apoyo a la

modelo propuesto que la maquinaria SHM AID-centrado está vinculada a la machinery transcripcional y explica reciente datos que indican que la ayuda puede generar mutaciones en muchos genes transcritas. El loci no inmunoglobulina unión de ayuda a las regiones S y seleccionado - junto con el capacidad de la exosome ARN para permitir AID a deaminate deoxycytosines en ambas hebras de ADN transcritas no transcritas y - que también proporciona una explicación para la generación AIDmediated de DSBs en las regiones S y, por lo tanto las frecuencias más bajas, todo el genoma. DSBs que no se resuelven a través de intra-S o inter-S región recombinaciones proporcionan el sustrato para translocaciones interchromosomal. Tales translocaciones pueden ser perjudiciales, particularmente cuando la translocación implica oncogenes (tales como MYC), como ocurre a altas frecuencias en el linfoma de células B. Esto pone de relieve, además, que la expresión de la AID, la actividad y la focalización necesidad de ser estrechamente controlados. Por lo tanto, los mecanismos altamente regulados deben estar en su lugar para dirigir la ayuda a las regiones S intrónicos, que tienen la mayor densidad en el genoma de las moléculas de ayuda que se dirigía. AID puede asociar con la RNA polimerasa II a través SPT5 y mayo luego 'paseo' en la maquinaria de transcripción de 'barrido' el transcriptoma hasta que la polimerasa se estancó en región de ADN S. Allí, la AID se estabiliza mediante la unión a 14-3-3 adaptadores (Fig. 4). Esto es una reminiscencia de la focalización de p53, que utiliza un dominio no esencial de obligar 'no específicamente "para y rápidamente deslizarse a lo largo de ADN hasta que haga' éxitos 'un objetivo secuencia que luego es obligado por el dominio del núcleo p53 con alta affinity95. 14-3-3 mediada por la estabilización de la AID en regiones S puede, a su vez, contribuir a un mayor estancamiento o la pausa de la maquinaria de transcripción y, por lo tanto, el enriquecimiento de la ARN polimerasa II en las regiones S. Por lo tanto, la orientación de la maquinaria de la RSE a las regiones S que han de someterse a la recombinación se hace posible por el estado de la cromatina abierta de esas S regiones. Este estado está habilitada de línea germinal IH-S-CH transcripción, y se asegura que 14-3-3 adaptadores tienen acceso a los 5'-3'-AGCT repite sólo en las regiones S que han de someterse a la recombinación, con todas las demás regiones S restante inaccesibles. Estancamiento de la ARN polimerasa II en las regiones S durante la transcripción permite la deposición de la AID, que se concentra aún más por 14-3-3 adaptadores.

Epigenética y andamios proteínas

En las regiones S, el reclutamiento, la estabilización y la función enzimática de la AID, la glicosilasa UNG y otras enzimas RSE requieren interacciones adicionales, que implican los dominios no catalíticos de estas enzimas, adaptadores no enzimáticos (como las proteínas 14-3-3) y específica modificaciones de las histonas que son inducidos en la región S objetivos de la RSE.

Funciones de andamios de 14-3-3 y el EPR. En la RSE, la focalización de la AID, la inserción de las DSB y la resolución de DSBs dependen de la formación de macromoléculas complejos que contienen ADN de la región S. Proponemos que estos son nucleados por la unión de homodímeros, heterodímeros 14-3-3 o tetrámeros de alta avidez a 5'-3'-AGCT repeticiones en tándem en la región del núcleo S. Además, como proteins96 andamio, las proteínas 14-3-3 estabilizar la unión de la AID y la PKA de ADN de la región S y potenciar la actividad de desaminación AID70. Dentro del mismo complejo macromolecular, la fosforilación de la AID PKA mediada en la serina replicación 38 reclutas proteína A (RPA), que mejora la desaminación AYUDA mediada deoxycytosines. RPA, probablemente, también funciona como un andamio de proteínas para estabilizar los factores de RSE durante la etapa posterior a la desaminación. Tales factores incluyen UNG98, proteins99 MMR y la complex100 MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) durante la generación de DSBs, así como fosforilados histona H2AX (γH2AX) 101, la proteína de unión p53-1 (53BP1) 102 y la proteína dependiente de ADN subunit103 catalítico quinasa durante la resolución de DSB. El hallazgo de que RPA interactúa con la región amino-terminal de UNG, que es crucial para CSR104, apoya la idea de que la función de andamio RPA tiene

un papel importante en la RSE. Funciones de andamios de la AID y REV1. Además de posee actividad desaminación, moléculas AUXILIOS funcionan como elementos de andamio para reclutar a otros factores de RSE (como UNG, MSH2 y MSH6) a las regiones S y / o para estabilizar los there.AID moléculas son, a su vez, se estabilizaron por estos factores. La estabilización de reciprocidad y de cooperación de la AID con UNG, MSH2 y MSH6 no implica la interacción directa de la AID con estos factores y depende de la región C-terminal de AID78. Esta región también media la unión a 14-3-3 AID, lo que sugiere que las proteínas 14-3-3 -que pueden interactuar directamente con UNG (T. Lam y PC, observaciones no publicadas) - AYUDA puente y UNG para formar un AID-14- compleja 3-3-UNG. Esto podría mejorar el tratamiento de los deoxyuracils AUXILIOS generados por UNG promover la eventual formación de DSB. Por otra parte, la AID y UNG pueden tener un papel durante la etapa de resolución del OSD en factores que intervienen en C-NHEJ más de los que participan en A-EJ, como lo sugiere el aumento microhomology (una característica de la A-EJ) en las uniones Sμ-Sα en pacientes estabilización que expresan el mutante de truncamiento C-terminal AID1 -190 o que son deficientes en UNG105. Así, media la región la ayuda C-terminales RSE tanto por la orientación ayuda a las regiones a través de S 14-3-3 proteínas adaptadoras, que conduce a la inserción de DSBs, y mediando funciones de andamio que permiten la estabilización de factores de reparación de ADN, que median OSD resolution78,105,106. Estas actividades contrastantes de la región AID C-terminal proporcionan una explicación para el descubrimiento de que los niveles detectables de S región DSBs en las células B que expresan AID1-190 son comparables a los de las células B que expresan de tipo salvaje AID106.

De manera similar a AID, UNG media la CSR de una manera dependiente tanto en residues104 aminoácido catalítica y no catalítica. Además de 14-3-3 y el EPR, el translesion

ADN polimerasa REV1 interactúa directamente con UNG a través de la no catalítica 231WXXF234 motivo de UNG y recluta UNG a las regiones S para mediar RSE (HZ, C. A. White, L. Thomas, J. Zhang, G. Li, E. S. Yu, ZX, TM y P.C., observaciones no publicadas). Por lo tanto, UNG se cree que está estabilizado en regiones S por tres factores: por RPA a través del dominio N-terminal de UNG98; por 14-3-3 través de su dominio C-terminal (de una manera independiente de la 231WXXF234 motivo); y por REV1 a través 231WXXF234 (HZ, C. A. White, L. Thomas, J. Zhang, G. Li, E. S. Yu, ZX, TM y PC, observaciones no publicadas). Curiosamente, la actividad catalítica de REV1 (es decir, la incorporación de deoxycytosines opuestos deoxyuracils y sitios abásicos) es importante en SHM107 pero prescindible en CSR108, lo que sugiere que las funciones de REV1 sólo como un andamio de proteínas en este proceso. En general, ambos elementos enzimáticos y adaptador de proteínas no enzimáticas ejercen funciones de andamios en la RSE a través del ADN-proteína y proteína-proteína interacciones multivalentes, con lo que la estabilización de cada cooperativa otros, así como otros factores, de ADN de la región S (Fig. 4).

Modificaciones de las histonas en las regiones S. Las enzimas y moléculas adaptadoras son reclutados selectivamente a y se estabilizaron en las regiones S que han de someterse a la recombinación porque sólo estas regiones S están en un estado de la cromatina abierta. Esto es un reflejo no sólo de la línea germinal IH-S-CH transcripción, sino también de los cambios en modificaciones de las histonas, en las regiones S aceptor. De hecho, estas regiones pierden modificaciones de las histonas represivas, como trimethylation de la histona H3 lisina 27 (H3K27me3), y adquieren modificaciones de las histonas permisivas, como H3K4me3 (de la nota, Sμ es 'constitutiva' marcada por las modificaciones que activan en IgM-que expresan las células B). Estas modificaciones de las histonas tienen un papel importante en la RSE de forma independiente de la línea germinal IH-S-CH transcripción, como lo sugiere el cambio de clase defectuoso a IgA que se observó en una línea de células B de ratón - a pesar de la línea germinal normales Iα-S-Cα transcripción - siguiendo pequeña interferir regulación a la baja de ARN mediada histona metiltransferasa expresión y el deterioro posterior en la generación de H3K4me3 (REF. 112). Modificaciones de las histonas permisivos son inducidas

por estímulos de RSE que inducen primarias en regiones aceptor S que se especifican por estímulos secundarios (como la IL-4 o TGF), que por sí sola no puede inducir a tales modificaciones.

La inducción simultánea de modificaciones de las histonas (un proceso denominado "código de histonas escritura") y de la línea germinal que HS-CH transcripción sugiere una regulación coordinada de ambos procesos por factores de transcripción que se unen específicamente a los promotores IH (Fig. 4). Tales factores de transcripción pueden reclutar PAX-proteína de interacción 1 (PTIP), que tiene un papel crucial en la iniciación de la línea germinal IH-S-CH transcripción y en la generación de múltiples modificaciones de las histonas (H3K4me3, y H3K36me3

Acetilación H3K27, pero no monometilación H3K4) en S regions60. En contraste con la escasez de modificaciones de las histonas permisivas o activadores (particularmente H3K4me3) en los cuerpos de los genes transcritos (en comparación con los promotores de dichos genes) en el genoma en large113, tales modificaciones de las histonas se enriquecen en las regiones S en niveles más altos que los de los promotores IH, exones IH y CH exones. Esta diferencia podría deberse a la contratación y / o estabilización de enzimas modificadoras de histonas a través del estancamiento del complejo de ARN polimerasa II, y por lo tanto estas enzimas puede ser enriquecido en las regiones S en la línea germinal IH-S-CH transcripción.

De acuerdo con la hipótesis de código de histonas, patrones combinatorios de modificaciones de las histonas no sólo cifrar la información para especificar los estados de la cromatina distintos, pero también aumentan la complejidad de chromatininteracting effectors114, determinando así los resultados específicos de información biológica. Los altos niveles de modificaciones de las histonas específicas en las regiones S que serán sometidos a la recombinación sugiera que estas modificaciones tienen un papel en el reclutamiento y la estabilización de los elementos de RSE. Por ejemplo, H3K9me3 (una modificación de las histonas nominalmente represiva) en donantes regiones S está obligado por HP1 (proteína heterocromatina 1), que está complejado con KAP1 (proteína de dominio asociada KRAB 1) y la ayuda en Sμ pero no en cualquier región aceptor S, y las células B deficientes para la exhibición KAP1 redujo la unión de AID para Sμ y CSR115 defectuoso. Además, 14-3-3 proteínas se unen a la modificación de histonas H3 combinatoria K9 acetilación-S10 fosforilación (H3K9acS10ph), facilitar crosstalk116,117 de histonas y son probablemente los lectores de modificaciones específicas de las histonas en las regiones S (Fig. 4). La estabilización de las proteínas 14-3-3 en regiones S a través interacciones con repeticiones 5'-3'-AGCT y H3K9acS10ph serían paralelas al reclutamiento del complejo RAG1 RAG2 a V (D) J centros de recombinación a través interacciones con secuencias señal de recombinación y H3K4me3 (Ref. 118).

Por lo tanto, los códigos específicos de las histonas son 'escritos' en las regiones S que han de someterse a la recombinación. Las enzimas modificadoras de histonas que son responsables de estos cambios están enganchados a la ARN polimerasa II y por lo tanto se convierten enriquecido en las regiones S en la línea germinal IH-S-CH transcripción, que se inicia por la transcripción específica factores que son activados por la combinación de los estímulos inductores de RSE primarios y secundarios. Tales códigos histonas son leídos por factores de RSC, tales como adaptadores 14-3-3, con ello estabilizar aún más las proteínas 14-3-3 en estas regiones S. Finalmente, las proteínas 14-3-3, así como otras proteínas de andamiaje (tales como EPR y REV1), estabilizan AID y / o UNG en región de ADN S y mejorar su actividad enzimática, contribuyendo así a la transducción de la información epigenética a factores cruciales de RSE.

Conclusiones

Estímulos de RSE que inducen primarias proporcionan el principal impulso de la RSE mediante la inducción de la expresión de la AID y otros factores cruciales en materia de RSE, así como por la histona induciendo modificaciones. Estímulos secundarios especifican la región (s) aguas abajo (aceptor) S que se someterá a la línea germinal IH-S-CH transcripción, modificaciones de las histonas y, eventualmente, recombinación. Esta división de roles, sin embargo, es borrosa, como estímulos primarios y secundarios sinergia - a través de la interacción combinatoria de factores de transcripción - Para inducir la AID, transcripción y las histonas modificaciones IH-S-CH línea germinal. Una mejor caracterización de la contratación y la interacción de estos factores de transcripción daría lugar a una mejor comprensión de la dinámica de la apertura de la cromatina y la accesibilidad en el locus IGH. La inducción de un estado de la cromatina abierta y línea germinal

IH-S-CH transcripción en las regiones donantes y aceptor S permite la focalización de las proteínas 14-3-3 a estas regiones S. Esta orientación se basa en la alta avidez inherente de estas proteínas de 5'-3'-AGCT repeticiones, que son característicos de toda S regiones.

A través de la interacción directa con la AID y otros factores de RSE, las proteínas 14-3-3 en regiones S pueden nucleada el montaje de ADN macromolecular y proteínas complejos, en los que las proteínas de andamiaje (ambas enzimas y elementos no enzimáticos) estabilizan más factores de RSE en las regiones S. La composición dinámica de tales complejos macromoleculares y la naturaleza de los lectores de códigos de histona dentro de los complejos aún no se han esclarecido completamente.

La regulación de la RSE inducción por TLR y estímulos BCRdependent y por diferentes tipos de células hay que explorar, así como la contribución de la RSE a la modulación de la diferenciación de células B. Es probable que esto mejorar nuestra comprensión de la desregulación de la diferenciación de las células B y 'dirigido fuera de' de la ayuda, que puede conducir a translocaciones cromosómicas y la transformación neoplásica.