INMUNOLOGIA

Inmunología III

Inmunoensayos.Clasificación

Definición

»Método analítico basado en la reacción antígeno- anticuerpo

»Hay muchos formatos , buscando diferentes características de funcionamiento.

¿Qué es un inmunoensayo?

• Puede ser cualitativo (identificación), semicuantitativo o cuantitativo.

• Encuentran aplicación en muchos campos, no sólo en el área clínica: ambiental, alimentaria, agronómica, etc.

Antígenos

• Sustancias que pueden ser reconocida por reacción con ella de anticuerpos.

• Estructuras químicas muy diferentes: proteínas, lípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, etc.

• Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopos.

Antígenos

• Nativos. • Se obtienen directamente a partir del patógeno. Ej. una

proteína purificada

• Recombinantes

• Péptidos sintéticos

Anticuerpos policlonales

• La inmunización de animales inyectando antígeno

• por la vía adecuada, • en dosis adecuadas y • en el adyuvante adecuado, (inmunógeno)

• producción de anticuerpos con diferentes afinidades y con especificidad por diferentes determinantes antigénicos (anticuerpos policlonales).

Anticuerpos policlonales

Separar el suero

Purificación de

anticuerpos

Conejo, cabra, oveja, etc.

Anticuerpos monoclonales

• Se obtienen inmortalizando plasmocitos por fusión con células de mieloma de ratón.

• Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el plasmocito.

• Por dilución límite se puede aislar(clonar) cada hibridoma, mantenerlo y expandirlo en cultivo.


Plasmocitos murinos

Células de mieloma Fusión

hibridomas


Cultivo de células individuales en pequeño volumen

Producción de Ac - +

Crecimiento continuo - +

- +

+ -


Cultivo en grandes volúmenes

Recuperar y purificar el AcMo secretado


• Ventajas con respecto a los policlonales:

• Alta especificidad, reconocen un único epitopo

• Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características.

• Desventajas:• Mayor costo

Ejemplos

• Cualitativo o de identificación: inmunoblot• Cuantitativo: ELISA• Inmunoblot• Ejemplo: Supongamos que queremos saber si están

presentes en un suero los anticuerpos que reconocen la banda de PM = 30 kDal del antígeno de Toxoplasma gondii.

kDa

94

43

30

14.4

SDS-PAGE

Dirección de la electroforesis

Rf

log PM

nitrocelulosa

Transferencia

Incubación con el suero problema

Conjugado enzimático

Sustrato

Producto insoluble

Ejemplos:

• Etapas principales:

• separación por electroforesis según pesos moleculares (SDS-PAGE),

• transferencia a membrana de nitrocelulosa , incubación con suero problema,

• incubación del conjugado (por ejemplo enzimático),

• revelado y

• examen contra patrón de pesos moleculares.

Clasificación de inmunoensayos

• Caótica en general, variados criterios de clasificación

• a) diseño competitivo o no competitivo • b) homogéneos y heterogéneos• c) por el método de detección • d) con o sin marcado• e) por el tipo de marca

Según el diseño del ensayo

De reactivo limitado o competitivos (inmunoensayos propiamente dichos)

De reactivo en exceso o no competitivos (ensayos

inmunométricos)

• Competitivos: • Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antígeno

o anticuerpo. • Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente

para unir todo el antígeno. • El antígeno marcado compite con el antígeno sin marcar

por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina a partir de la regresión correspondiente.

Competitivo- Captura de anticuerpos

E

Ag muestra +Ac marcado

E

+

Ag muestra

Ac marcado

E

Sustrato

[Ag]

Señal

Señal

Competitivo- Captura de antígeno

Antígeno marcado

Muestra

Lavado

Señal

[Ag]

Señal

Métodos no competitivos o inmunométricos

• El antígeno a cuantificar se une a un exceso de anticuerpos.

• Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase sólida, revelando con anticuerpo marcado.

• La concentración de antígeno se determina a partir de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.

Ag

+

Exceso de antígeno eliminado por lavado

E

E

Sustra-to

Señal

Señal

[Ag]

Curva standard

bloqueante

No competitivo- “sandwich” de anticuerpos

Ensayos con marca enzimática

• Las más utilizadas son:• peroxidasa (horseradish peroxidase, HRP), PM 44 kdal• fosfatasa alcalina(AP), PM 80-84,5 kDal• Ventajas• disponibles comercialmente• se pueden conjugar por técnicas simples • tienen varios sustratos.

Ensayos con marca enzimática

• Generación de la señal• La última parte de un inmunoensayo en que la marca es

enzimática es la cuantificación de la enzima.• Métodos de detección:• a) Espectrofotométrico o colorimétrico. Se mide la

aparición de un cromóforo.• b)Fluorométrico- Se mide la aparición de un producto

fluorescente• c)Quimioluminiscente- Se mide la aparición de un

producto luminiscente.

Ensayos con marca enzimática:límites de detección

(zeptomoles, 10-21 moles)

200000050000color

--100fluorescencia

250001quimioluminiscencia

HRP:AP:

Según el diseño del ensayo

homogéneos

heterogéneos

• heterogéneos:

• Los más utilizados.

Diversos formatos :

• microplacas,

• partículas magnéticas,

• membranas de nitrocelulosa,

• cortes de tejidos, o en

• ensayos homogéneos, sin pasos de separación

Métodos homogéneos y heterogéneos

• Heterogéneos:• implican un paso de

separación del antígeno unido del no unido. Por ejemplo ELISA, los pasos de lavado son etapas de separación.

• Homogéneos: • no se requiere la

separación del antígeno unido del no unido.

Heterogéneos• Ventajas y desventajas:• Más difíciles de automatizar• Mayor tiempo de análisis• Menos interferencias, más específicos y sensibles• Instrumentación menos costosa• Admiten mayor tamaño de muestra, así disminuye el

límite de detección.• Más versátiles en cuanto a tipo de analito

Heterogéneos

Heterogéneos

• Algunos métodos de separación:

• Precipitación fraccionada con sulfato de amonio, etanol en frío o PEG.

• Unión de la forma unida a una fase sólida (EIA, partículas magnéticas)

• Centrifugación

Homogéneos:

• Ventajas y desventajas:• Más precisos• Al ser en general automatizados se llevan a cabo sin

entrenamiento especial• Son más costosos en reactivos • En general sólo sirven para fármacos

Homogéneos

• La cuantificación de la reacción Ag-Ac en los EIA homogéneos se realiza por cambios(modulación) en la señal proveniente de la marca sin hacer separación física de las formas libre y unida.

• El cambio de señal depende de la inhibición , activación o cambios conformacionales en la enzima.

• monitoreo terapéutico de fármacos(digoxina) detección de drogas de abuso.

Homogéneos:

• Podríamos distinguir entre otros :• a) de modulación directa . Las señales de la marca unida

al Ag se ve modificada cuando se produce la unión del Ac.

• Por ejemplo, un cambio conformacional de la enzima o impedimento estérico.

• b) de modulación indirecta. Un antígeno es acoplado a un modulador o grupo prostético cuya actividad es modificada por la unión del antígeno al anticuerpo.

Homogéneos

Ag

Sustrato

Ag

EnzimaAg

Homogéneos:

E Ag

Enzima activa Enzima inactiva

S

Homogéneos:

• Detección y cuantificación:

• Las medidas se pueden hacer con un simple espectrofotómetro o con un analizador automático de química clínica.

• Introducción a los inmunoensayos de fluorescencia:

Fluorescencia:

• 3 etapas( excitación, decaimiento, emisión) • ocurre en ciertas moléculas (hidrocarburos

poliaromáticos o heterociclos), llamados fluoróforos o colorantes fluorescentes.

• Si el fluoróforo es modificado para localizar una región o un componente específico de una muestra:

Sonda o conjugado fluorescente

Fluoresceína.

• Diagrama de Jablonski

Fluorescencia

S0

S1

S1’

hexc..

S0

hem.

1

2

3

Fluoróforos

O O

C

OH

O

R1

R2

HO

Fluoresceína

• Las sondas fluorescentes permiten detectar componentes particulares de ensamblados complejos, incluyendo células vivas, con mucha sensibilidad y especificidad.

• Poderosas técnica para identificación de componentes

Fluorescencia

• Fuente de energía: lámpara incandescente (Hg) o un láser.

Fluorescencia

• No todas las moléculas que han sido excitadas vuelven al nivel de base por emisión de fluorescencia. Hay otros procesos que compiten

• Rendimiento cuántico: Relación entre el número de fotones fluorescentes emitidos y el número de fotones absorbidos por el fluoróforo.

• (etapa 3/etapa 1)• Desplazamiento de Stokes

Instrumentación

• 2 tipos de instrumentos son los más utilizados en el laboratorio de inmunología clínica:

• a.microscopio de fluorescencia - Muestra la fluorescencia sobre estructuras que son reconocidas por sondas (sobre corte de tejidos, cultivo de microorganismos). Identificación

• b. citómetro de flujo - Mide la fluorescencia de células individualizadas en una corriente que fluye. Identificación y cuantificación

Inmunofluorescencia indirecta

Antígeno tisular


suero de paciente(IgG)


+ anti-IgG humana (de conejo por ejemplo) con

marca fluorescente


Microscopio de luz UV

Inmunoensayos de fluorescencia resuelta en el tiempo

• El desplazamiento de Stokes en la fluorescencia es normalmente de 30- 50 nm. Sin embargo, para ciertos compuestos, quelatos de dicetonas con Eu por ejemplo, ese desplazamiento puede ser de 250- 300 nm.

• El tiempo de decaimiento para la mayoría de los compuestos fluorescentes es de nanosegundos.

• Sin embargo, para estos compuestos de Eu, es mucho mayor, de micro a milisegundos.

• Ambas características permiten discriminar la fluorescencia del“ruido”utilizando equipamiento adecuado.


Despl. Stokes

Fluoróforos

Quelatos de Eu con dicetonas

30-50nm

250- 300 nm

ns

s-ms


400 800 1000

t(s)

deteccióndecaimiento

Fluorescencia

quelatos

componentes fluorescentes de la

muestra

Quimioluminiscencia

• Es el fenómeno que ocurre en las luciérnagas:• una reacción química con un muy alto rendimiento

energético produce una molécula potencialmente fluorescente.

• (No hay excitación luminosa como en la fluorescencia)• Usualmente son reacciones redox catalizadas por

enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgánico oxidable. La energía se libera como luz visible.

Quimioluminiscencia

Oxidante(H2O2,, perborato Na)

Luminol

PON2

Intermediarioelectrónicamente excitado

Luz, 425 nm

(3-aminoftalhidrazida)

aminoftalato

Quimioluminiscencia

• Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de moléculas, menor límite de detección que en los métodos isotópicos y en otros enzimáticos.

Técnica analítica quimioluminiscente

• Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reacción quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscencia es el paso final en la detección.

• Se hacen en fase sólida, o en técnicas homogéneas

Quimioluminiscencia

• La medida de la luz emitida por la reacción quimioluminiscente se realiza en un luminómetro. Componentes luminómetro:

• Compartimiento de muestra aislado de la luz• Fotomultiplicador de alta sensibilidad• También puede haber un sistema para hacer llegar la

muestra a la cámara. • La emisión de luz medida se relaciona con la

concentración de analito refiriéndola a soluciones con concentraciones conocidas.

Técnica analítica quimioluminiscente

• Las medidas deben hacerse en unos pocos segundos ya que la luz se emite a menudo como una ráfaga corta inmediatamente después de la mezcla de los reactivos.

Electroquimioluminiscencia


• Marca: Ru(bipy)2+3

• Ru 2+ Ru 3+

En presencia de N(Pr)3, en un ánodo, el pasaje de la forma +3 a +2 va acompañado de quimioluminiscencia.,

Con partículas magnéticas y un imán asociado al electrodo, se realiza la reacción allí.


• Ejemplo: TSH

• anti-TSH-biotina(1); anti-TSH-Ru(bipy)3,(2),

muestra con TSH(3) Incubación a 37º

1

23

Partícula magn

Streptavidina


• Ejemplo: TSH

• anti-TSH-biotina(1); anti-TSH-Ru(bipy)3,(2),

muestra con TSH(3) Incubación a 37º

IMÁN

ELECTRODO

.Anal Chim Acta, 378, 1(1999)

• Para poder utilizar la reacción Ag- Ac en un inmunoensayo, siempre debe buscarse una forma de hacer evidente esa reacción (revelado).

• Hay diferentes metodologías de detección.

Marcado Enzima

Radioisótopo

Coloides metálicos

Látex

Fluoróforo

Hematíes Partículas de colorante

Complejos de Ru

Aglutinación de partículas

Aglutinación de partículas

• Se enfrenta una cantidad fija del reactivo látex a diluciones en serie del analito. Se observa a simple vista hasta qué dilución hay aglutinación. Semicuantitativo

• El límite de detección del reactivo látex se ajusta previamente por titulación con standards.

• Puede haber diferencias entre diferentes operadores.

• Ventajas: • Bajo costo• Requiere escaso equipamiento• No requiere gran destreza del operador

• Desventajas:• Semicuantitativo a menos que se modfique cambiando el

sistema de reacción de portaobjetos a cubeta (turbidimetría, nefelometría).

Concentración de Ag (g)

Pp

do

(m

g

pro

t .)

Exceso de AgExceso Ac

Equivalencia

• Inmunoprecipitación cuantitativa

Muy laborioso el análisis químico de los precipitados

+Se sustituyó el análisis por la

determinación de la turbidez de mezclas de Ag y antisuero

Primer paso hacia nefelometría y turbidimetría automatizadas

Inmunoensayos de aglutinación. Detección por dispersión de luz

mUAbs

¨conc.

Marcado con partículas

Sin marcado

mUAbs

¨conc.

Inmunoensayos por dispersión de luz

Fuente luminosa

Muestra

Detector

Turbidímetro

Nefelómetro

r


• Seguimiento de la reacción:• Turbidimetría- Mide la luz dispersada mediante la

disminución en la intensidad del rayo incidente al pasar por la muestra.

• Se puede realizar en un espectrofotómetro.


• Nefelometría-Mide la dispersión de luz como un incremento promedio de la luz que es dispersada a un ángulo cuando el rayo incidente pasa a través de la muestra. La mejor sensibilidad se logra cuando la fuente de luz es láser.

Dispersión de luz según el tamaño de partícula

.

Rayleigh

Rayleigh-Debye

Mie


• Según la teoría de la dispersión de la luz (Rayleigh) , cuando una luz monocromática, de longitud de onda , intensidad I0 incide sobre una pequeña partícula(dimensiones 0.05 ), se establecen sobre ella dipolos oscilantes que sirven como fuentes secundarias de emisión.


• El patrón de dispersión se modifica con el tamaño de partícula, al pasar de monómeros a agregados.

Medida cinética vs. medida a punto final

t(s)

Abs

t

A

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