INMUNOLOGIA GENERAL E INMUNOQUIMICA

Trabajo Práctico Nº2: Inmunodifusión

Eva Acosta Rodriguezeacosta@mail.fcq.unc.edu.ar

Objetivo general:- Adquirir herramientas para evaluar, identificar y cuantificar Ags o Acs mediante técnicas de inmunoprecipitación

Objetivos específicos:- Determinar cuantitativamente la IgG purificada en el TP Nº 1 mediante IDRS (Mancini)- Determinar mediante electroinmunodifusión la posible presencia de proteínas séricas contaminantes en la IgG purificada

Interacciones Ag-Ac

Interacción bimolecular reversible

Determinanteantigénico(epitope)

Dominiovariabledel Ac

Puente H

Enlace iónico

I. hidrofóbicas

I. van der Waals

interacciones débiles

interacción Ag-Ag fuerte requiere gran número de estas interacciones

alta complementariedad

ESPECIFICIDAD

Gran especifidad de la interacción

Ag-Ac

Desarrollo de ensayos inmunológicos para detectar o cuantificar Ags o Acs

UTILIDADES DE LOS INMUNOENSAYOS

• Diagnóstico de enfermedades• Monitoreo de la respuesta inmune humoral• Identificación de moléculas biológicas o de interés médico

Tipos de interacciones Ag-Ac

ENZIMOINMUNOENSAYOINMUNOFLUORESCENCIARADIOINMUNOANALISIS

Primaria:

- primera etapa- unión directa del Ac al Ag- no visualizable, sin fenómenos asociados- relativamente independiente de Tº y fuerza iónica

AGLUTINACIONINMUNODIFUSION

ELECTROINMUNODIFUSION

Secundaria:

- segunda etapa: agregación de los complejos formados en la interacción 1ria- fenómenos visibles a simple vista: precipitación o aglutinación- dependientes de Tº, pH, fuerza iónica, etc

Terciaria:- solo en interacciones “in vivo”

- efectos biológicos colaterales a la interacción (necrosis en la reacción de Arthus, efectos vasógenos y de miocontrac-ción en anafilaxia)

Reacciones de inmunoprecipitación

Interacción entre un Ac y un Ag soluble en solución acuosa

Formación de complejos multimoleculares

Desarrollo de precipitados visibles

Factores físico-químicos Características

inmunoreactantes

Proporción relativa de Ag y Ac

• Factores físico-químicos

• temperatura• fuerza iónica• pH• viscosidad

afectan la difusión de los inmunoreactantes

Difusión: movimiento de una sustancia disuelta desde el lugar de mayor concentración al de menor concentración tendiente a

igualar las concentraciones en el seno del líquido

Ley de Fick

(difusión libreunidimensional

en medio fluido)

dxdCD.A.dt

dQ −=

VTcte.D º=

Q: cantidad de sustancia que difundet: tiempoD: coeficiente de difusiónA: área de difusiónC: concentración inicialx: distancia recorridaTº: temperaturaV: volumen de la sustancia que difunde

• Características de los inmunoreactantes

• bivalente• no fragmentos F(ab)

Ac

• bivalente (al menos dos copias del mismo epitope)•distintos epitopes (reaccionan con distintos Acs del As)Ag

complejos pequeñossolubles

complejos grandesinsolubles

complejos pequeñossolubles

complejos grandesinsolubles

• Proporción relativa de Ag y Ac

La composición del enrejado (y su solubilidad) varían de acuerdo a la concentración relativa de los inmunoreactantes

+3 +9+1 +5 +7

sin precipitadoprecipitadoprecipitado ppdo máximosin precipitado

Prozona

Zona de exceso de Ac

Zona de exceso de Ag

Zona de equivalencia

Precipitado

Ag agregado

Sobrenadante exceso Acexceso Ag

+-

+ + + ++ + + +- - - -- - -

- - - - - -

Composición de los

complejos

Métodos de inmunodifusión

Utilizan medios gelificados (agar o gelatina) para evitar disturbios ocasionados por las corrientes en el fluido

•Tamaño de poros que permiten la libre difusión de inmunoreactantes•Ausencia de reacción física ó química entre los inmunoreactantes y el gel

Ley de Fick

El tamaño de los poros debe retener los inmunocomplejos facilitando la precipitación

Agar 0.3-1.5%

Sirven para determinar la concentración de Ags o Acs (cuantitativos), o para comparar Ags y evaluar su pureza (cualitativos)

Principales sistemas de inmunodifusión

Difusión Simple Difusión Doble

Unadimensión

Dosdimensiones

(radial)

Ag

Ag Ac

Ac

Ag Ac

Ag Ac

Gel neutro

Gel neutro

AgAc

Inmunodifusión radial simple (IDRS, o técnica de Mancini)

• técnica de ID bidimensional simple: difunde sólo uno de los inmunoreactantes (Ag) mientras que el otro (Ac) está disuelto en el gel a concentración constante.

AgAcAgAc

Exceso Ag

Exceso Ac

Zona de equivalencia

(anillo de precipitación)

precipitado

• técnica cuantitativa: el diámetro del anillo de precipitación es proporcional a la concentración inicial del Ag

Diámetro del anillo

AgAc

Ag

Ac

AgAc

AgAc

Ecuación derivada de La Ley de Fick

D: diámetro del anilloDo: diámetro del orificiok: constante

22 DoAgkD += ][

[ ]kDoDAg

22 −=

4. Visualizar los anillos de precipitación. Medir diámetro

[Ag]

D2

5. Realizar curva de trabajo con el diámetro de los estándares. Calcular concentración muestras problemas

PROCEDIMIENTO:

Muestra B

x

Muestra A

x

22 DoAgkD += ][

1. Preparar agar impregnado con Ac

200 mg/ml 800 mg/ml

400 mg/ml 1600 mg/ml

Muestra A

Muestra B2. Agregar estándares y muestras

3. Colocar en cámara húmeda y permitir la difusión

Do

k

CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES

• los estándares y las muestras problemas se deben procesar simultáneamente en la misma placa de agar para igualar las condiciones de reacción (temperatura, fuerza iónica).

• la pendiente de la curva de trabajo (k) depende de la concentración del Ac en el agar

más económico

diámetros más grande

mayor pendiente = sensibilidad

bordes más difusos = mayor error

bordes nítidos = menor error

menor pendiente = sensibilidad

Ac diluido

Ac concentrado

Aplicación en Práctico

Determinación cuantitativa de la IgG humana purificada en el TP 1

PROCEDIMIENTO

Inmunodifusión radial doble (IDRD, o técnica de Ouchterlony)

• técnica de ID bidimensional doble: ambos inmunoreactantes (Agy Ac) difunden radialmente uno hacia el otro. Cuando se forma alcanza la zona de equivalencia se observa una banda de precipitación.

AcAg

Zona de exceso de Ag Zona de exceso de AcZona de equivalencia

AcAg

Zona de exceso de Ag Zona de exceso de AcZona de equivalencia

La distancia a la que una sustancia difunde está :

• en relación DIRECTA con su CONCENTRACION.

• en relación INVERSA a su PM.

Ag Ac Ag Ac

[ ] de equivalencia Exceso de Ac

Ag Ac Ag Ac

PM Ag = PM Ac PM Ac

• técnica cualitativa: permite analizar sistemas de Ag-Ac sin poder determinar la concentración de los inmunoreactantes

• Usos principales: verificar la pureza de una muestra (Ag o Ac)

detectar Ags o Acs en una muestra

CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES

• se debe cumplir la LEY DE FICK

• se forman tantas bandas de precipitación como sistemas Ag-Actengamos en la muestra

• los Ag o Ac no atraviesan la banda en la que ellos mismos precipitan

• los Ag o Ac pueden atravesar una banda en la que ellos no precipitan

Sistemas con tres reservorios pueden generar bandas de precipitación que han recibido nombres específicos.

PATRONES DE PRECIPITACION POR IDRD

IDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son iguales, por lo lo tanto se funden en una banda de precipitación.

Y

NO IDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son distintos, cada uno origina bandas de precipitación independientes que se cruzan.

YY

IDENTIDAD PARCIAL: los dos sistemas antigénicos comparten algún componente (banda que se funde), pero no son iguales(espolón o prolongación).

YY

Inmunoelectroforesis(IEF)

• técnica semicuantitativa que combina dos metodologías:

1°) separación de proteínas por electroforesis

2°) inmunodifusión radial doble

Paso 1: Electroforesis

Las proteínas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son sometidas a un campo eléctrico se separan en un gel de agar de acuerdo a su carga eléctrica.

- +- +

Consideraciones:

Fenómeno de ELECTROENDÓSMOSIS: las proteínas poco cargadas son desplazadas en sentido contrario a su migración electroforéticareal.

Paso 2: InmunodifusiónLas proteínas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son sometidas a un campo eléctrico se separan en un gel de agar de acuerdo a su carga eléctrica.

AntisueroAntisuero

AplicacionesEn laboratorios clínicos se utiliza para detectar presencia o ausencia de proteínas séricas, en el diagnóstico de Gammapatías.Investigar e identificar los componentes de una muestra antigénica.

-- ++

Anti proteínas séricas totales

Anti proteínas séricas totales

Anti proteínas séricas totales

Anti IgM

Anti IgG

Anti IgA

Anti proteínas séricas totales

Anti proteínas séricas totales

Anti proteínas séricas totales

Anti IgM

Anti IgG

Anti IgA