Insegnamento

CHIMICA ANALITICA STRUMENTALE

TeCoRe

Docente

Prof. Daniele Fabbri

Laboratori di Scienze Ambientali via S.Alberto, 163

dani.fabbri@unibo.it Tel. 0544 - 937344

Materiale didatticoRubinson and Rubinson, Chimica Analitica Strumentale, 2002.Fifield and Kealey, Chimica Analitica, teoria e pratica, 1999. Lucidi: disponibili on-line o presso portineria sede.

PROGRAMMA

PARTE PRIMA.

Fasi di un procedimento analitico Valutazione del metodo analitico.

Campionamento e preparazione del campione

Analisi quantitativa

PARTE SECONDA Spettrometria atomica: FAAS GFAAS, HGAAS,ICP-AES, ICP-MS.

LABORATORI strumenti di indagine bibliografica - uso banche dati

Analisi metalli assorbimento atomico. Calibrazione esterna.Analisi acidi grassi gas cromatografia. Calibrazione interna.

Elaborazione dati (EXCELL)

ESAME

Orale.

Discussione esercitazione in biblioteca (articolo scientifico ottenuto da una ricerca bibliografica).

Discussione esercitazioni di laboratorio (relazioni).

Domande sul programma.

lot

campione: porzione di materiale selezionato per rappresentare un corpo più esteso di materiale.

sub-sample: porzione del campione ottenuto per suddivisione o selezione.

campione del laboratorio: materiale inviato al laboratorio per le analisi

campione test: campione preparato partendo dal campione di laboratorio

test portion: il materiale pesato e sottoposto all’analisi.

soluzione di misura

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

TRATTAMENTODEL CAMPIONE

CAMPIONEmateriale per il quale è richiesta un’informazione analitica

RAPPRESENTATIVO: la composizione è, nella sua globalità, identica a quella del materiale di partenza.

OMOGENEO: la composizione è la medesima in tutte le sue parti.

INTEGRO: non ci devono essere alterazioni durante il trasporto, la conservazione ….(adsorbimento, volatilizzazione, …)

altrimenti non si può mettere in relazione il risultato finale con il materiale originale, non importa quanto accurata sia l’analisi

Il campione deve essere:

Specificare l’identità dell’analita.nome comunenome commercialenome IUPACChemical Abstract Registry Number (CA RN)formula di strutturanome della miscela, presenza di isomeri, sottoprodotti…?

Cl

ClCl

Cl

ClDDTp,p’-DDTdiclorodifeniltricloroetano1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)etano (IUPAC)1,1’-(2,2,2-tricloroetilidene)bis[4-clorobenzene] (CA)CA RN 50-29-3Trade Names: Agritan, Anofex, Arkotine, ….,Santobane, Zeidane, Zerdane…

esempio :

struttura molecolare

Vedi :esercitazione in biblioteca

ANALITA il componente da misurare attraverso l’analisi del campione

ANALITA MATRICE TRATTAMENTO

inorganico inorganica dissoluzione-digestione

inorganico organica distruzione sostanza organica

organico inorganica estrazione

organico organica estrazione selettiva

Analysts are seldom lucky enough to be able to inject samples with no pretreatment RE Majors, LC-GC 2003

MATRICE i componenti del campione chimicamente diversi dall’analita.

Il termine MATRICE è usato anche per Indicare le caratteristiche fisiche del campione (solido, liquido, gassoso, organico, inorganico, ecc). La natura della matrice e dell’analita definiscono la procedura di preparazione e trattamento del campione. Esempio:

Esempi:Interferenza da PAN nella determinazione NOx nell’atmosfera.[NOx] = [NO] + [NO2] ; PAN = perossiacetilnitrato Si effettua misura NO per chemiluminescenza, dopo che un convertitore ha trasformato NO2 in NO. Il convertitore trasforma anche il PAN in NO. Interferenza trascurabile nelle zone urbane ([NOx] >> [PAN]), significativa nelle zone rurali ([NOx]max).

Interferenza dei cloruri nella determinazione ICP-MS dell’arsenico. Il cloruro produce nel plasma lo ione 40Ar35Cl+ isobaro con 75As+ .

INTERFERENZA effetto indesiderato di un componente sulla accuratezza della misura di un altro componente.

CONTAMINAZIONEintroduzione non intenzionale dell’analita o di altre specie nel campione possibile causa di errore nella determinazione.Spesso è irriproducibile ed erratica.Esempio: lavaggio della vetreria inadeguato per l’analisi di metalli in tracce.

GLI ERRORI

La storia contaminata.Concentrazioni di piombo nell’acqua di mare pubblicate dal 1938 al 1980.tratta da M.Stoeppler Ed. Sampling and Sample Prep., Springer 1997

1930 1950 1970

10000

1000

100

10

1

198019601940

ng / l

anno

Errori casuali :

originati da processi incontrollabili e indeterminati, riducibili (ma non eliminabili) con un lavoro attento, presentano variazioni positive e negative, misurati dalla deviazione standard s.

Minore il contributo degli errori casuali, più precisa la procedura.

Errori sistematici (determinati): originati da cause determinate con lo stesso andamento (positivo o negativo), in principio eliminabili. Misurati dal bias.

Errori grossolani.Errori di calcolo, lettura, ….

RISULTATO il valore finale riportato per una quantità misurata o calcolata dopo avere effettuato la procedura di misurazione comprese le opportune valutazioni.

numero + unità di misura + incertezza

ESEMPIO:

valore medio Xm ± deviazione standard s , n (numero di misure)

stima del valore ± stima della “precisione”, n

Cifre significative:

Le cifre note con certezza più la prima cifra incerta (qualunque sia la posizione della virgola).lL’errore di una misura è rappresentato dall’errore sull’ultima cifra.Gli zeri a destra delle cifre significative sono significativi (se dopo la virgola), a sinistra no (indicano l’ordine di grandezza).

0.0410 tre cifre significative650 tre o due cifre significative, meglio usare la notazione scientifica: 6.50·102 oppure 6.5·102

definizione dell’informazione

desiderata

scelta del metodo

strategia di campionamento campionamento

omogeneizzazioneconservazione …

pretrattamento:eliminazione interferentiforma idonea per l’analisi

determinazione-bianco- calibrazione- campione- RM, CRM

convertire i dati in risultati numerici

interpretazione dei risultati

subsamplingcampione per il laboratorioaliquote per le analisi

ricerca bibliografica

LA PROCEDURA ANALITICA

fotodegradazione

ossidazione

rilascio di contaminanti

volatilizzazione

attività microbica

adsorbimento

reazioni chimiche

CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE

Trasformare analita/matrice nella forma più adatta alla tecnica d’analisi

Rimuovere interferenti

Ottenere concentrazione ottimale

Evitare contaminazione.Minimizzare perdite

Durante il trattamento del campione si possono avere perdite di analita. La capacità della procedura analitica di misurare la quantità reale di analita presente inizialmente nel campione è espressa dal recupero (recovery):

R, recupero % = Cmisurata/Cattesa·100 = Qmisurata/Qattesa·100

La concentrazione C (o quantità Q) di analita attesa può essere ottenuta dal valore certificato di un CRM, oppure stabilita preparando un campione fortificato.Il valore ideale è R = 100%Se R < 100% possibili cause: perdite durante le fasi di trattamento (filtrazione, ecc.)Se R > 100% possibili cause: contaminazione.

TRATTAMENTO DEL CAMPIONE

METALLIMatrice : acqua Filtrazione.preconcentrazione: complessare il metallo con un legante organico per estrarlo in un solvente organico.Matrice: solida digestione: trattamento con acidi forti concentrati a caldo; bomba per digestione se si formano prodotti volatili; digestione assistita da microonde (T< 200°C)Acidi utilizzati:HNO3, H2SO4, HClO4: ossidanti, precauzioni se organici elevato.HCl: complessante, in miscela con altri acidi.HF: disgregazione totale silicati; per analisi concentrazione totale.

ORGANICI

estrazione. (biota dopo saponificazione; sedimenti); a riflusso; soxhlet; estrazione accelerata con solvente (ASE T>, P>, t<, V<); con fluidi supercritici (SFE; es.CO2).

cromatografia su colonna; per eliminare interferenti.

Esempi di trattamento del campione

criteri per la scelta del metodo analitico FIGURE DI MERITO

precisione

accuratezza (bias)

sensibilità

limite di rivelabilità

selettività

intervallo dinamico

costi/investimenti

durata dell’analisithroughput

sicurezza, tossicità reagentigreenness

abilità richiesta all’operatore

portability

ruggdness

dimensione del campione

VALIDAZIONE è il processo che permette di dimostrare se i risultati ottenuti con il metodo sono affidabili, riproducibili e se il metodo è adatto per l’applicazione richiesta.

Può essere effettuata tramite:

Confronto con un metodo differente sullo stesso campione (le fonti di errori dovrebbero essere differenti).

Confronto con altri laboratori (partecipazione a studi inter-laboratorio).

Uso di materiali di riferimento (certificati).

Quando validare un metodo Viene sviluppato un nuovo metodo per risolvere un particolare problema.

Si intende migliorare un metodo esistente per estenderlo ad un nuovo problema.

Il controllo di qualita’ mostra che le prestazioni del metodo stanno cambiando.

Si intende valutare la prestazione del laboratorio anche per un metodo esistente, utilizzato da un altro laboratorio, analista, …

Reference material (RM): a material or substance, one or more of whose property values are sufficiently homogeneous and well-established to be used for the calibration of an apparatus, for the assessment of a measurement method or for assessing values to materials.

Certified reference material (CRM): a reference material, accompained by a certificate, one or more of whose property values are certified by a procedure. This procedure enables the material’s traceability to be established in terms of the SI unit (to be understood as: a mole of a substance…). Each certified value is accompanied by an uncertainty at a stated level of confidence. ISO guide 1991

materiali di riferimento - materiali di riferimento certificati (CRM)

Alcuni enti che producono (C)RMASTM American Society for Testing and MaterialsBCR Bureau Communitaire de ReferenceIAEA International Atomic Energy AgencyNIST National Institute of Standard and TechnologyNRC National Research Council of Canada

Come scegliere i crmIl materiale di riferimento dovrebbe avere una composizione simile a quella del campione (matrix matching)Contenere l’analita ad una concentrazione simile a quella del campione.

Serie: i risultati …Xi… di analisi ripetute usando un solo metodo analitico su un materiale omogeneo n : il numero totale dei valori misurati della serie. Il numero di repliche n va sempre riportato.

PRECISIONEconcordanza fra misure ripetute

Media (aritmetica) : Xm = Xi / n = (X1 + X2 + X3 + X4) / n

indici della precisione (imprecisione) della misura Stima della deviazione standard: s = [(Xi - Xm)2/ (n -1)]1/2

Deviazione standard relativa: sr = s / Xmerrore standard della media: s/n1/2

numero minimo consigliato per una stima utile: n = 6

X1

X2

X3

X4

analisi strumentale

valori misurati

soluzione di misura

campione test

prelievoporzioni test trattamento

soluzione di misura misura calcoli

valore misurato

X1

X2

X3

X4

campione test

prelievoporzione test trattamento

soluzione di misura

misura calcolivalore misurato

X1

X2

X3

X4

Esempi di analisi replicate

Precisione del metodo

Y1 = 10.09

Y2 = 10.11

Y3 = 10.09

Y4 = 10.10

Y5 = 10.12

Risultato:Ym = 10.10 ± 0.013 n = 5

Calcoli:Ym = 10.102s = 0.0130rsd% = 0.13 %

0.5344 g

0.4984 g

0.5003 g

0.5034 g

20 mL

20 mL

20 mL

20 mL

digestionediluizione2 mL a 10 mL misura

conc. rame nella soluzione

0.383 mg/L

0.377 mg/L

0.394 mg/L

0.380 mg/L

Risultato:75.4 ug /g ± 2.9 ug/g (RSD = 3.8 %) n = 4oppure 75 ug /g ± 3 ug/g n = 4

Ripetibilità : s è riferito allo stesso metodo sullo stesso materiale nelle stesse condizioni (operatore, apparato, laboratorio) dopo brevi intervalli di tempo.

Riproducibilità : s è riferito allo stesso metodo sullo stesso materiale in condizioni diverse (operatore, apparato, laboratorio) e/o dopo lunghi intervalli di tempo.

tempo

Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595.

Valore vero : valore ideale che si potrebbe ottenere se tutte le cause di errore fossero eliminate e l’intera popolazione fosse campionata.

Valore ‘ritenuto vero’ T (accepted reference value; conventional true value) valore attribuito ad una quantità e accettato con un incertezza appropriata per un determinato scopo.).

CRMT è il valore certificato

materiale FORTIFICATO (spiked)T è il valore stabilito dall’aggiunta

dell’analita

ACCURATEZZA (accuracy):

concordanza tra il risultato ed il valore ‘vero’ T

L’accuratezza è un concetto qualitativo. Una misura è accurata quando è precisa e libera da bias.

ESATTEZZA (trueness): vicinanza di accordo tra il valore medio Xm ottenuto da una serie grande di misure e .

ACCURATEZZA

ESATTEZZA

diminuita daerrori sistematici

PRECISIONE

diminuita daerrori casuali

Currie and Svehla, Pure and Appl.Chem. 66(1994)595.

Errore del risultato : Ei = Xi - TErrore relativo: Er = E / TErrore relativo percentuale Er(%) = E/T•100

BIAS E = Xm - T

Ei = (Xi - Xm) + (Xm -T) = Ecasuale + Esistematico(bias)

In questo caso l’accuratezza indica una combinazione di errori casuali e sistematici.

valore misuratomedia laboratorio

valore vero

bias totale

mediainter-laboratorio

bias del lab

bias del metodo

Bias del metodo: tipico del metodo, l’errore si presenta in qualsiasi laboratorio; corrisponde al bias di un test inter-laboratorio.

Bias del laboratorio: comprende il bias del metodo e il bias inerente al dato laboratorio.

CALIBRAZIONE insieme di operazioni che stabiliscono, sotto condizioni specificate, le relazioni tra i valori delle quantità indicate da un sistema di misura e i valori corrispondenti realizzati da uno standard.

STANDARD di CALIBRAZIONEmateriale con valori noti della quantità Qst da misurare.Esempio: composto puro in un solvente.

STRUMENTO DI MISURA

segnale Yst

Qst

CAMPIONE STRUMENTO DI MISURA

segnale Yc

Qc

RELAZIONE Q - Y

CONFRONTO. Calibration is comparison

Nota bene:

non confondere CALIBRAZIONE (= relazione tra segnale e misurando) e TARATURA (= accertamento funzionalità di uno strumento).

preparazione (ottenimento) degli

standard

analisi degli standard

produrre il modello di calibrazione

analisi dei campioni

applicare il modello di calibrazione ai dati dei

campioni

ricalibrare regolarmente

PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE

Il modello di calibrazione viene utilizzato per ricavare il valore di C del campione utilizzando la funzione inversa: MODELLO ANALITICO.

X = Y - b / a

Y = aX + b

diluizioni seriali

misura

stocksolution

1000 mg Cu / L 1 mL qb a 100 mL 1 mL qb a 200 mL

50.0 ugCu / L solvente

0 uL + 1000 uL

100 uL + 900 uL

250 uL + 750 uL

500 uL + 500 uL

750 uL + 250 uL

1000 uL + 0 uL

soluzioni di calibrazione

bianco

5.00 ug/L

12.5 ug/L

25.0 ug/L

37.5 ug/L

50.0 ug/L

segnaleY

0.002

0.092

0.202

0.378

0.615

0.788

0

0.25

0.5

0.75

1

0 10 20 30 40 50

ug / L

Y

Y = 0.0158*C + 0.0045R2 = 0.9981

modello di calibrazione

PROTOCOLLO DI CALIBRAZIONE

campione test

prelievoporzione test trattamento

soluzione di misura

misura

segnale

0.513

Y = 0.0158*C + 0.0045

0

0.25

0.5

0.75

1

0 10 20 30 40 50

ug / L

Y

0.513

32.2 ug/L

C = (Y - 0.0045) / 0.0158

modello di calibrazione modello analitico

ANALISI CAMPIONE

la curva di calibrazione

INTERVALLO DINAMICO (dynamic range) del metodo: valori estremi di concentrazione C fra cui si registra una variazione netta del segnale Y al variare di C.

INTERVALLO DINAMICO LINEARE: valori di estremi di concentrazione (LOQ-LOL) in cui il segnale Y varia linearmente con la C.

Y

LOD concentrazione C

Yb

LOQ LOL

intervallo dinamico lineare

A valori bassi di concentrazione il segnale è troppo debole;

A valori alti di concentrazione si hanno deviazioni dalla proporzionalità (a in genere diminuisce all’aumentare di C).

REGRESSIONE LINEARE : l’operazione per ottenere la relazione lineare Yr = b + a•Cr che meglio interpola i dati sperimentali

La retta ottimale è quella che minimiza la somma dei quadrati dei residui :

(Yst - Yr)2 valore minimo

Ym = Yst / NCm = Cst / NXm, Ym centroide

Yst, XstX

YYr = a•Xr + b

PENDENZA (sensibilità)a = (Xst - Xm)•(Yst - Ym)/(Xst-Xm)2

INTERCETTAb = Xm - a•Xm

Yst, Xst ottenuti dall’analisi di N soluzioni di calibrazione.

Con lo sviluppo dei computer l’interpolazione dei punti diventa più semplice.

Difficile trovare equazioni su basi teoriche teoriche, perché la non-linearità è dovuta a molteplici cause. Relazioni empiriche:

Modello di calibrazione polinomiale :

Y = b + a•C + a’•C2 + a’’•C3 + …

problemi: necessita più standard, maggiori difficoltà nella valutazione dell’incertezza,

single-point calibration :

La calibrazione più semplice è quella in cui si usa un solo standard): Yst, Xst.

Si assume Y = 0 per X = 0; risposta lineare da X = 0 a X = Xst (estrapolazione oltre i valori Yst, Xst sconsigliata).

il modello di calibrazione

Modello di calibrazione lineare :

Y = a•C + b = S•C + Yb

I chimici hanno favorito metodi con relazioni lineari, causa difficoltà ad interpolare curve. Ci sono metodi analitici non-lineari (saggi immunologici).

.S = dY / dXpendenza della retta di calibrazione Y = a C + b

SENSIBILITÀ costante di propozionalità tra il segnale ed il misurando

è una misura dell’abilità di un metodo di distiguere piccole differenze di concentrazioni dell’analita.

Y metodo più sensibile

C

metodo meno sensibile

linee analitiche del Si nell’intervallo 250-253 nm

curve di calibrazione lineari per ogni linea analitica.

Analisi del Si tramite AAS

La sensibilità dipende dalla scelta della di misura

25

0.6

9

25

1.4

32

51

.61

25

1.9

2

25

2.4

1 25

2.8

5

lunghezza d’onda, nm

inte

nsi

tà r

ela

tiva

concentrazione Si, mg/Lass

orb

an

za

esempio

251.61

251.92

standard esterno analita nella soluzione di calbrazione misurato separatamente dal campione. Il campione contenente quantità ignote di analita e le soluzioni di calibrazione contenenti quantità note di analita standard sono separate.Soluzioni di calibrazione preparate per diluizioni seriali da una soluzione madre concentrata.

Composizione soluzione di calibrazione simile alla soluzione del campione ? matrix matching Soluzioni del bianco. Es. solvente puro (es. H2O), azzeramento dello strumento.

Soluzione del bianco procedurale (dei reagenti): contiene tutte le sostanze usate nella preparazione del campione alla stessa concentrazione della soluzione di misura (il valore va sottratto da quello del campione). (es. soluzioni di HNO3/HCl)

Matrix blank solution: contiene anche i costituenti della matrice (es. sedimento).

CALIBRAZIONE ESTERNA

standard interno sostanza differente ma simile all’analita (surrogato: comportamento simile a quello dell’analita). può essere aggiunto al campione nella fase iniziale della procedura, in fasi successive o nella soluzione di misura.

Scopo: controllare un passaggio critico causa di elevata incertezza.Rapporto [analita]/[surrogato] meglio di [analita] solo

Fattore di risposta F = [analita]•Ys/[surrogato]•Ya

Esempi surrogato:Cd per Tl, Pd per Pt spettroscopia atomica 57Co (radioattivo) per 59Co analisi radiochimicacomposto organico marcato con 2H, 13C analisi MSappartenente alla stessa classe (CH3(CH2)17COOH per acidi grassi)

CALIBRAZIONE INTERNA

Preparazione delle soluzioni di calibrazione. Lo standard interno si trova alla stessa concentrazione in tutte le soluzioni (e lo sarà nella soluzione campione), mentre la concentrazione dell’analita varia.

soluzione di standard interno

soluzione di analitasolvente

area analita / area s.i.

concentrazione analita

standardizzazione interna

Qs.i. (area analita / area s.i.)

Quantità di analitaQ analita

RUMORE DI FONDO: variazione indesiderata del segnale, casuale e dipendente dal tempo (noise); segnale non dovuto all’analita, costante o lentamente variabile (deriva) (background).

BIANCO: campione che non contiene analita deliberatamente aggiunto, ma contiene tutti i (o alcuni dei) componenti della procedura analitica.

N noise misurato come differenza tra il valore più alto e quello più basso (da picco a picco) oppure come valore medio.

Y

tempoN

Rapporto segnale su rumore : S / Ntempo

S

analisi del bianco

analisi del campione S segnale (altezza del picco).Y

LOD - LIMITE DI RIVELAZIONE (limite di rivelabilità, limit of detection): la quantità di analita che produce il minimo segnale significativamente diverso da quello del bianco.

Ylod = Yb + 3sbYlod = Yb + 3sb

f

YlodYb

Sb

Y

Yb segnale del biancosb deviazione standard del bianco

Ylod segnale del campione al LOD

Ylod LOD

Y

tempoN

S

dal rapporto segnale/rumore S/N LOD quella concentrazione che produce un rapporto segnale su rumore S / N = 3

LOD = 3·sb / a

b + 3sb

b

Y

LOD

C

dalla retta di calibrazioneY = aC + b

dalla retta di calibrazione:Ylod = a LOD + bLOD = (Ylod - b) / aponendo b Yb

LOD = (Ylod - Yb ) / asostituendo Ylod con la definizione di LOD: Ylod = Yb + 3sb

LOD = 3sb) / a

determinare il LOD

Y

LOD LOD

C

metodo 1metodo 2

Yb

il LOD dipende dagli effetti del fondo e dalla sensibilità (a).LOD = 3s / a

LOQ = 10 s / a limite di quantificazione

Y = a C + b

Selettività :

indica quanto il metodo è libero da interferenze. Coefficiente di selettività dell’analita A rispetto l’interferente B : K = Sb / Sa.

Specificità:

capacità del metodo di distinguere tra l’analita e le altre sostanze.

Robustezza (robustness):

capacità del metodo di resistere alle variazioni delle condizioni sperimentali.