Institut de Génomique Fonctionnelle, France · La cellule saine ... - Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures (cellules ES et iPS) - Régénération des

Institut de Génomique Fonctionnelle, France INSERM U1191, CNRS 5203, Université de Montpellier

Dalle Stéphane, Directeur de Recherche, INSERM

DIPLOME d’UNIVERSITE MEDECINE REGENERATRICE

Ilots de Langerhans, cellules et cellules souches pancréatiques

Comment élaborer/remplacer les cellules pancréatiques ? Enjeux et problématiques ?

Introduction

How to make -cells ?

« Significant challenges remain for each strategies: First, it is important to set the bar high

with respect to requirement for newly generated cells:

properly regulated insulin secretion and the capacity of cell renewal (replication)

are at the top of the list…»

D’après Borowiak, M., Melton DA, Curr Opinion Cell Biology, 2009, 21, 727-732

Plan

La cellule saine

« Comprendre pour mieux appréhender les problématiques »

- Son environnement

- Comment définir une cellule saine

- Origine et cycle de vie

La cellule malade: Diabètes

« Comprendre pour mieux appréhender les enjeux »

- Problématique pour le diabète de type 1


La cellule réparée:

« Cellules souches et stratégies »

- Stratégies actuelles et perspectives

- Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures (cellules ES et iPS)

- Régénération des cellules au sein du pancréas

Rappels anatomiques: Le pancréas et l’architecture de l’îlot

Corps

du pancréas

Queue

du pancréas

Canaux

interlobulaires

Canal pancréatique

de Wirsung

Canal biliaire

Bile

Duodénum

Plis

circulaires

Abouchement

ampoule de Vater

Ampoule de Vater

Canaux

interlobulaires Flux enzymes digestives

vers le duodenum

Cellules acineuses

Réseaux capillaires

Cellules

Cellules

Cellules

Îlot de Langerhans

(1%)

Canal

lobulaire

Adapté d’après © Encyclopædia Britannica, Inc.

Pancréas in situ

Pancréas

Cellules canalaires

Rappels anatomiques/histologiques: Architecture de l’îlot de Langerhans

Foie Estomac

Pancréas

Intestin

Pancréas

Duodénum

Îlot de

Langerhans

Cellule(s) exocrine(s)

Zymogène

Capsule

Capillaires

Cellule Cellule Cellule

Proinsuline

Insuline Peptide-c Glucagon Somatostatine

Localisation des cellules pancréatiques dans les îlots de Langerhans Adapté d’après Expert Reviews in Molecular Medicine © Cambridge University Press

Interactions endocrine-exocrine

Interactions intercellulaires

Rôle de la cellule pancréatique: Sécrétion d’insuline et homéostasie glucidique

Pancréas Îlot

de Langerhans

Cellule

Insuline

Vx

sanguins

Glucose

Fibres musculaires

Plateforme histologie (IGF, Montpellier)

Microscopie électronique (CRIC, Montpellier)

Dr S. Costes, Dr C. Broca

La cellule saine


- Son environnement


- Son cycle de vie










Phase 1:

- rapide et activée par

[Ca2+] locale

- mobilisation du pool

de granules conditionnés

(pool RRP)(n < 100/cellule)

L’exocytose est biphasique

Mécanismes d’activation par le glucose: Initiateur/déclencheur

Cellule pancréatique Dalle S et al. J Biol Chem (1999) 274:10869

K+

MITOCHONDRIE

RE

Membrane plasmique

G6P

Pyr

Glucose

Ca2+

1

Ca2+

2 3

Ca2+

ext

int

Insuline (+ C-peptide)

SERCA 3

Mitochondrial

transport

VDCC

CC / IP3R

KIR 6.2

Glut 2

Cycle de Krebs

Equivalents réduits

Chaine respiratoire

ATP

Ashcroft FM, Rorsman P. Cell (2012) 148, 1160

Henquin JC. Diabetologia (2009) 52, 739

La cellule saine


- Son environnement


- Son cycle de vie










Masse des cellules pancréatiques adultes et renouvellement

Croissance/Néogenèse Mort

CELLULES SOUCHES

PROGENITEURS

PROGENITEURS

Canaux pancréatiques

Equilibre dynamique

Masse fonctionnelle de cellules

Néogenèse

- Progéniteurs canaux pancréatiques

- Transdifferenciation

- Progéniteurs intra-îlots

Plasticité de l’îlot de Langerhans

Senescence/Vieillissement

- Facteurs génétiques

- Stress oxydant

- Détérioration de l’ADN

Replication

A partir de cellules préexistantes - Importante chez le fœtus

- Réduite chez l’adulte

Apoptose

Vie et mort des cellules pancréatiques

Développement postnatal

Gestation

Obésité

Régimes Hypergluc/Hyperlip

Insulinorésistance

Régénération

Fonction

Masse

Fonction

Masse

Autoimmunité inflammation

Vieillissement

Glucotoxicité/lipotoxicité

Programmation in utéro (malnutrition)

Facteurs cytotoxiques

La plasticité de la masse permet d’adapter au long cours la fourniture en insuline

aux besoins métaboliques de l’organisme

Quand la robustesse de ces adaptations est dépassée…

l’hyperglycémie s’installe: DT1, DT2

Phénomène de compensation par les cellules pancréatiques

Prentki, M. et al. J. Clin. Invest, 2006, 116, 1802-1812

Phénomène de compensation par les cellules pancréatiques

TGF-, Activine A

EGF (NGF, VEGF, FGF), IGF-1

Hormones/incretines

GH, GLP-1

REPLICATION et

DIFFERENCIATION

+ -

Pancreatic cells

APOPTOSE

NEOGENESIS

DIFFERENCIATION

Cellules precurseurs +

SENESCENCE

-

INGAP (Ilotropin)

Nutriments

Glucose, FFA

Nutriments

Haut Glucose, FFA

Cytokine

Facteurs Inflammation

IL-1, TNF-, IL-6,

Interféron

Facteurs stress oxydant

Altération ADN

+ + + + + +

EGF, IGF-1 GLP-1

Facteurs controlant la différenciation et la masse des cellules pancréatiques

PROLIFERATION

Cellules pancréatiques

APOPTOSE

DIFFERENCIATION +

+ -

CRIC-Montpellier

Haut glucose (hyperglycémie)

Diabète de type 2

Glucose

(concentrations physiologiques)

Régulation de la masse des cellules pancréatiques (plasticité) :

Dualité des effets du glucose

La cellule saine


- Son environnement


- Son cycle de vie










Role central des cellules pancréatiques dans le DIABETE

Diabète de type 1 (10% des sujets diabétiques)

Destruction des cellules par un processus autoimmun

Carence totale en insuline : Injections

Insuline = seule hormone hypoglycémiante de l’organisme

Diabète de type 1 et type 2 : Déficit de l’insulino-sécrétion

Diabète de type 2 (90% des sujets diabétiques)

Déficit sécrétoire et mort par apoptose des cellules ,

associés à une résistance à l’action de l’insuline

Carence partielle puis totale en insuline: Arsenal thérapeutique

Hyperglycémie chronique

Complications dégénératives du diabète

Proposed model for the different pathways contributing to the execution of cytokine-induced ß-cell apoptosis. Arrows indicate genes for which expression was modified by cytokines in a time course microarray analysis. ß-Cell apoptosis is probably mediated by

three main pathways—namely JNK, ER stress, and liberation of pro-apoptotic proteins from the mitochondria.

Apoptose des cellules pancréatiques et diabète de type 1

Cnop, M. et al. Diabetes, 2006, 54S2, 97-107

Les enjeux pour le diabète de type 1, et de type 2

Préserver Restaurer

Diabète de type 2

(Dysfonction cellule )

Agents pharmacologiques

Diabète de type 1

(Perte cellule )

Transplantation Pancréas entier/ Ilots de Langerhans

Thérapie cellulaire (?)

une masse fonctionnelle

de cellules

Recherches fondamentale et clinique

ND

DT2

Butler, A.E. et al. Diabetes, 2003, 52, 102-110 Del Guerra, S. et al. Diabetes, 2005, 54, 727-735

« cell deficit and increased cell apoptosis in humans with type 2 diabetes »

« Therapeutic approaches designed to arrest cell apoptosis could be a significant new development

in the management of type 2 diabetes »

Cellules pancréatiques et diabète de type 2

Adapté de Primary Care, 26, Ramlo-Halsted BA, Edelman SV, The natural history of type 2 diabetes. Implications for clinical practice, 771–

789, © 1999, with permission from Elsevier.

Développement et progression du diabète de type 2 et de ses complicationsa

(représentation conceptuelle)

Progression du diabète de type 2

Insulino résistance

Fonction cellulaire

Insulinémie

Glucose post-prandial

Glycémie à jeun

complications macrovasculaires

complications microvasculaires

Intolérance au glucose Diagnostic du diabète

4-7 années

Préserver la fonction et la survie des cellules est essentiel

Importance des études sur le maintien et/ou la restauration de la masse

des cellules fonctionnelles chez les diabétiques de type 2

Déclin de la sécrétion d’insuline et de la masse de cellules

Hyperglycémie chronique

Intérêt de prendre en charge tôt le pancréas

- Cibler les fonctions physiologiques du pancréas

- Agir sur l’insuline (et le glucagon)

- Maintenir la structure de l’îlot: Masse fonctionnelle de cellules pancréatiques

Les enjeux pour le diabète de type 2

La cellule saine


- Son environnement


- Son cycle de vie










Stratégies actuelles

D’après Borowiak, M., Melton DA, Curr Opinion Cell Biology, 2009, 21, 727-732

Stratégies actuelles: Quelles sources de cellules (à partir de 2011) ?

Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures

Rappels d’embryogénèse: Origine et développement des cellules pancréatiques

Facteurs de transcription impliqués dans la différenciation pancréatique

Cellules ES: Différenciation en cellules produisant de l’insuline Cellules$ES:$Différencia4on$en$cellules$

produisant$de$l insuline$

Cellule%ES%Précurseur%endodermal%

Cellule%insuline%+%

D amour,(Nature(biotech,(2005,(2006(

Cellules ES Précurseur endodermal Cellule Insuline +

D’amour, Nature Biotech, 2005, 2006

could also be seen from another angle. Indeed, retinoidsignalingwasshowntoactivateBMPexpression inseveralin vivo and in vitro systems including embryonal carci-noma cells and differentiating mouse embryoid bodies(34–36). It isnot yet clear whether this inductiveeffect onBMPalso occursduringhEScell differentiation. Neverthe-less, considering the in vivo function of BMPsignaling inthe midgut endoderm, it appears reasonable that bothretinoid signaling and BMP antagonism were required inthesestudiesfor stronginductionof apancreatic fatefromtheDEcellswhilepreventinghepatic differentiation. How-ever, it is likely that theeffect of RA iscontext-dependentbecausewhenapplied onhES-derived DEcellscultured atlow density, it resulted in the inhibition of Smad 1/5/8phosphorylation (23). It remains to beelucidated whetherthis later effect representsan artifact of in vitro cultureoraspecific retinoid effect at the single cell level.

Other studies made use of RA combined with FGFligands(FGF4, FGF7, FGF10) or of Noggin combined withFGF2and EGFto inducepancreatic cellsalbeit at alowerefficiency than for combined Noggin and RA (Table 3)(13,14,16,17,19,23). Our unpublished observations suggestthat FGF signals favor hepatic gene expression in theabsence of BMP antagonism, but the addition of FGFligands together with BMP antagonism (Noggin) and RAenhances pancreatic gene expression. Furthermore, theinduction of PDX1 cells by combined Noggin and RArequires at least a basal level of FGF activity (via theextracellular signal–regulated kinase/mitogen-activatedprotein kinase [ERK/MAPK] pathway [Fig. 3]) given thatthe addition of the MAPK-inhibitor U1026 prevented pan-creatic cell differentiation (20). Because RA is known to

act synergistically with FGF signaling during endodermpatterning, supplemented FGF can be seen as an enhanc-ing factor in protocols that already integrate Noggin andRA (13,14,19). This view might resolve the nature offactors X suggested as involved in the indirect effects ofRA in Xenopus dorsal endoderm (37). It was recentlysuggested that in thepresenceof FGF7, RAcan efficientlyinduce PDX1 progenitors from hES-derived DE cellsseeded at low density (5–50,000 cells/cm2) and that thiseffect is paralleled by inhibition of Smad1/5/8 phosphory-lation, thereforerecapitulatingBMPantagonismdescribedabove (23).

Recent analysis of the signaling network during earlyliver and pancreas development in 3–6 somites-stagemouse embryos further indicated that inhibition of theactivin signaling significantly increases the proportion ofcells fated toward PDX1expression. Thesefindings there-fore suggest that the addition of activin inhibitors to theabove-mentioned cocktails might still boost the occur-rence of PDX1 cells in hEScell cultures (13,24).

Despite the fact that combining BMP antagonism withretinoid signaling efficiently generates PDX1 pancreaticprogenitors from hES-derived definitive endoderm, therequirement for hedgehog antagonism with cyclopamineduring pancreas induction from these cells has not beenclarified by thesestudies. Theinitial report byD’Amour etal. (18) indicated the necessity to antagonize hedgehogsignaling that is indeed activated during EScell differen-tiation, and it was shown to also play a negative role exvivo by limiting endocrine and exocrine genes expressionin embryonic (E12.5) mouse pancreatic explants (38,39).However, additional studies using Noggin, FGF ligands,

TABLE 3Derivation of PDX1 progenitors from hEScells

References DE induction Pancreas induction Differentiation Key features

D’Amour (2006) ActA Wnt3a; ActAFBS

FGF10 Cyclo (4d);FGF10 Cyclo RA(4d)

DAPT Ex4; IGF1HGF Ex4

7%INS cells, doubleendocrine cells; no glucoseresponse

Johannesson(2009)

ActA Wnt3a; ActAFBS

FGF4 RA ( / Cyclo) — 32%PDX1 cells, very low INSexpression

Cai (2009) ActA; ActA ITS (DE replating on 3T3)FGF7 RA (6d)

HGF Ex4 NA(6d)

90%PDX1 ; co-expressionFOXA2, HNF1b, HNF4a,HNF6, NKX6.1; some INScells

Jiang (2007) ActA NaBut (7d) EGF bFGF NG(14d);EGF NG(7d)

NA IGF2 (5d); NA(2d)

EBs after DE induction; buddingPDX1 INS clusters; 3D isbetter

Kroon (2008) ActA Wnt3a; ActAFBS

FGF7 (4d); NG RAFGF7 (4d)

Transplantation inimmunodeficientmice

Endocrine cells in grafts,glucose response in vivo at 3months, protection from STZeffect

Vallier (2009) ActA BMP4 bFGF(3d)

NG RA FGF10SB431542 (6d)

— PDX1 clusters, culture infeeder-free settings

Zhang (2009) ActA Wortmanin(4d)

NG RA FGF7 (4d);EGF (5d)

bFGF Ex4 BMP4NA ITS(7d)

20%PDX1 , 25%INS , lowglucose response, ITSissuenot addressed

Mfopou (2010) ActA Wnt3a; ActAFBS

NG RA Cyclo (8d);FGF10 Ex4Compound E (4d)

NA Ex4 IGF1BMP4

50–80%PDX1 in 4 hESlines,co-expression FOXA2, SOX9,HNF1b, HNF6, NKX6.1, lowPTF1a. Some INS cells

Recent models of pancreas differentiation from hEScells integrate BMP antagonism and retinoid signaling early after definitive endoderminduction. This allows for concomitant hepatic blockade and pancreas induction from definitive endoderm cells. Cyclo, cyclopamine;DAPT, N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester (gamma secretase inhibitor); EBs, embryoid bodies; Ex4,exendin-4; FBS, fetal bovine serum; ITS, insulin selenium transferring supplement; NA, nicotinamide; NaBut, sodium butyrate; NG, Noggin;STZ, streptozotocin; 3D, three dimensional. The text in bold marks protocol with combination of NGand RA.

J.K. MFOPOU AND ASSOCIATES

diabetes.diabetesjournals.org DIABETES, VOL. 59, SEPTEMBER 2010 2097

Cellules$ES:$Différencia4on$en$cellules$produisant$de$l insuline$

Mfopou,(diabetes(2010(

Cellules ES: Différenciation en cellules produisant de l’insuline

Mfopou, Diabetes, 2010

Cellules iPS: Différenciation en cellules produisant de l’insuline iPS$cells:$Différencia4on$en$cellules$produisant$du$CRpep4de$et$de$l’insuline$

www.cell-research.com | Cell Research

Donghui Zhang et al.

431

npg

Day 0

HumanES cells

Endoderminduction

Pancreaticspecialization

Progenitorexpansion Maturation

Act A+Wort

DF12 DF12F12/IMDM

EGF

DMEM

Nico+bFGF+Ex-4+BMP4Insulin-

producing cells

4 8 13 20

0 4 8 12 16 20

0 4 8 12 16 20

0 4 8 12 16 20

0 4 8 12 16 20

1.0

0.4

1.0

0.4

1.0

0.4

1.0

0.4

Re

lative

ge

ne

expre

ssio

nR

ela

tive

gen

e e

xp

ressio

n

Rela

tive g

ene e

xp

ressio

nR

ela

tive g

ene e

xpre

ssio

n

Sox17 T Foxa2 Oct4

Pdx1 Hnf6

Pax4 Pax6

MafA Glut2

Nkx6-1 Tcf1

Insulin Glucokinase

0.0%

0.3%

96.4%

25.3%

Forward scatter

Sox17

CX

CR

4In

su

lin

100 10

1 10

2 10

3 10

4

10

0

1

01

1

02

1

03

10

4

10

0

10

1

1

02

10

3

10

4

10

0

10

1

10

2

1

03

10

41

00

10

1

1

02

10

3

1

04

100 10

1 10

2 10

3 10

4

100 10

1 10

2 10

3 10

4

100 10

1 10

2 10

3 10

4

SOX17 DAPI

Insulin DAPI

A

B

D

F

G

C

E

RA+NOGGIN+FGF7

Time (day) Time (day)

Time (day) Time (day)

iPS$cells$

Fibroblaste$humain$

Cell Research | Vol 19 No 4 | April 2009

H ighly effic

i

en t gen erat ion of ins ul in-producing cel ls

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Pdx1 Insulin

C1 C2 C5 H9

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2

1

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C5

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D4 SOX17 D8 PDX1 D13 SOX9

D20 Amylase

C-peptidePDX1

D20 PDX1 D20 Insulin

A

C

D

B

PDX1 C-peptide PDX1 C-peptide DAPI

Cell Research | Vol 19 No 4 | April 2009

H ighly effic

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en t gen erat ion of ins ul in-produci ng cel ls

436

npg

MafA Glut2

Pdx1 Insulin

C1 C2 C5 H9

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D4 SOX17 D8 PDX1 D13 SOX9

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C-peptidePDX1

D20 PDX1 D20 Insulin

A

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PDX1 C-peptide PDX1 C-peptide DAPI

!$25%$de$cellules$produisant$de$l’insuline$à$par4r$de$cellules$ES$et$iPS$

Zhang(Cell(research(2009(

Zhang, Cell Research, 2009

25% de cellules produisant de l’insuline à partir de cellules ES et iPS

Fibroblaste humain

iPS cells

Limites à l’utilisation de cellules pluripotentes

Ethique ?

Finesse des protocoles de différenciation à mettre en place:

Utilisation de molécules spécifiques, en associations complexes,

fenêtres d’action courtes, cultures 3D (Wandzioch, Science 2009)

Risque tératogène des cellules pluripotentes

Risque spécifique des iPS:

Mutations de séquences codant pour des protéines, anomalies épigénétiques…

Tumorigénèse possible (Gore, Nature 2001; Lister Nature 2001)

Régénération cellulaire au sein du pancréas

Physiologique chez le sujet obèse ou la femme enceinte

Quelles sont les cellules à l’origine de cette régénération ?

Régénération des cellules au sein du pancréas ?

Preuve de concept

Preuve de concept

Régénération des cellules pancréatiques (1)

Régénération des cellules pancréatiques (2)

Bibliographie sélectionnée Dor, Nature 2004 Xu, Cell 2008 Nir, J Clin Invest 2007 Collombat, Cell 2009 Thorel, Nature 2010 Herrera, Nature 2010

Régénération cellulaire au sein du pancréas: Limites

Origines du renouvellement β-cellulaire débattues

Etudes in vivo chez le rongeur uniquement

Quelles molécules pharmacologiques pour promouvoir cette régénération ?

- A partir de canaux: Tumorigénèse ?

- A partir de cellules α ou β: dysfonction endocrine / dosage/rapport cellulaire ?

Conclusion

How to make -cells ?

« We believe that the potential of cellular therapies for diabetics is ever closer

and is an achievable goal…»

D’après Borowiak, M., Melton DA, Curr Opinion Cell Biology, 2009

Les progrès effectués ces 10 dernières années

permettent d’envisager de nouvelles sources pour traiter le patient diabétique

- Cellules pluripotentes

- Cellules reprogrammées

- Cellules régénérées in situ

Avantages sur transplantation îlots ou pancréas

- Contrôle qualité

- Masse infusée contrôlée et adaptée

- Greffe autologue

Autres voies de recherche parallèles

- Lutte contre l’auto-immunité

- Site alternatif de transplantation (Ilots), tolérance…

- Autres encore non explorées ?

Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, France INSERM U1191, CNRS 5203, Université de Montpellier

Merci pour votre attention

INSTITUT de GENOMIQUE FONCTIONNELLE

Physiopathologie de la Cellule Pancréatique

INSERM U661 – UMR CNRS 5203 – Universités Montpellier 1 et 2

INSTITUT de RECHERCHE en BIOTHERAPIE

Laboratoire de thérapie cellulaire du Diabète

CHU Montpellier

DIPLOME UNIVERSITAIRE MEDECINE REGENERATRICE

Ilots de Langerhans,

cellules et cellules souches pancréatiques

Merci pour votre attention

îlots de Langerhans

Pancréas

Anatomie du pancréas

Bloc duodéno-hépato-pancréatique Adapté d’après © sanofi-aventis France

Foie Veine Porte Vésicule Biliaire Canal Cystique Canal Hépatique Canal Cholédoque Artère Hépatique Rein droit Ampoule de Vater Tête du pancréas Canal de Wirsung

Veine cave inférieure

Aorte

Diaphragme Artère gastrique Tronc coeliaque Glande surrénale Artère et veine spléniques Rate Queue du pancréas Corps du pancréas Rein gauche Jéjunum Artère et veine mésentériques sup Duodénum Veine mésentérique

Documents

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