International Journal of Experimental Pathology, 91, 144–154

A próstata é o órgão mais afetado por lesões malignas nos homens, e o câncer de próstata é a segunda causa mais comum de morte diagnosticada em homens de vários países.

No caso do epitélio acinar secretor da próstata pelo menos seis tipos celulares com características fenotípicas e biológicas distintas são encontrados:

células-tronco

células basais

células de amplificação transitória ou “transit-amplifying cells” (TAC)

células intermediárias

células luminais secretoras

células neuroendócrinas

O andrógeno é provavelmente o principal fator trófico para o epitélio acinar prostático, sendo indispensável para a proliferação e diferenciação celular. Portanto, sua ação é decisiva tanto para a indução da diferenciação epitelial durante o desenvolvimento embrionário como para a maturação pós-natal e manutenção da atividade secretora e do padrão normal de diferenciação

Remodelação estromal

Diminuição do perfil acinar

Alterações significativas no epitélio acinar

Atrofia

Diabetes tipo 1 prejudica a biosíntese de androgenos pelas células de Leydig e reduz a captação e retenção de andrógenos na próstata, promovendo regressão da glândula.

Grupos de Animais e tratamento

ratos machos Wistar adultos, com 3 meses de idade (400-500g)

A indução do diabetes foi realizada após 24 horas de jejum alimentar pela administração endovenosa (veia peniana) de 0,1ml de solução fisiológica contendo 40 mg/kg de peso corporal de aloxana

os animais foram alimentados normalmente e a glicemia foi testada diariamente

Foram utilizados apenas os ratos que apresentaram diabetes grave, com glicemia de jejum acima de 250mg/dl em todas as medições, perda de peso corporal e aumento do débito urinário

ratos diabéticos foram sacrificados uma semana (D1, n= 6) ou três meses (D2, n=6)

Análise dos hormônios séricos

Amostras de sangue foram coletadas imediatamente após a decaptação

Soro foi separado por centrifugação e armazenados para testes subsequentes

Foram usados 5 ratos por grupo e as análises foram realizadas em triplicata

Testosterona e estradiol

Preparação do tecido

fixação por imersão em formaldeído 4% recém preparado em tampão fosfato 0,1M pH 7,2 e inclusão em parafina (imuno)

fixação por imersão em solução de Karnovsky (formaldeído 2,5% recém preparado, glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato Sörensen 0,2M pH 7,2), por 12-24h (rotina histológica em parafina ou em historesina)

Detecção das células apoptóticas

foram detectadas in situ utilizando-se o ensaio da fragmentação de DNA associada à morte celular, baseado na reação do TUNEL

Reações imunocitoquímicas

recuperação antigênica em tampão citrato pH 6,0 (20 min)

bloqueio de peroxidases endógenas (30 min em 3% de H2O2 em metanol )

bloqueador de ligações inespecíficas (15 min)

Incubar no anticorpo primário em BSA 1% (1:100) – overnight AR e 1h para PCNA e p63 – 37ºC

Detecção do anticorpo primário – AR: anticorpo secundário; PCNA e p63: polímero – 45 min em TA

revelação com diaminobenzidina (0,03% em TBS)

contra-coloração com hematoxilina

Análise quantitativa e estatística

A imunocitoquímica usa o princípio da ligação específica do anticorpo detectável ao antígeno. A apresentação do antígeno se encontra no tecido fixado. Este método tem como principal vantagem mostrar a localização cito e histológica do antígeno.

Os sistemas de detecção nesta técnica geralmente são DAB (diaminobenzidina) + H2O2 ou então os fluoróforos. Usando diversos fluoróforos ligados a diferentes anticorpos é possível determinar em um mesmo tecido a colocalização de dois ou mais antígenos, fato muito importante para a pesquisa em biologia celular.

A diaminobanzidina (DAB), na presença de H2O2 e peroxidase, forma um polímero de cor marrom, precipitando no local no qual se encontra a peroxidase, sendo principalmente utilizada em estudos de imunocitoquímica.

Parâmetros Biométricos e Hormonais

Peso corpóreo

Peso relativo da próstata

Glicemia

Testosterona

Estradiol

Morfologia da próstata ventral

Análise imunocitoquímica e de morte celular no epitélio acinar

Figure 2 PCNA Immunocytochemistry (a–e) and TUNEL method (f–j) in the ventral prostate of 1 week control (a and f), 1 week diabetic (b and g), 1 week diabetic insulin-treated (c and h), 3 months control (d and i) and 3 months diabetic rats (e and j). Note that proliferation in prostate epithelium decreases significantly in older group (d) and also in diabetic groups, especially in short-term (b). The levels of apoptosis increased in prostate after diabetes (g and j), mainly in long-term rats (j). Insulin treatment completely reverses apoptotic levels but not cell proliferation in prostatic epithelium. Scale bar: 20 μm.

Figure 3 Immunocytochemistry for androgen receptor AR (a–e) and p63 (f–j) in the ventral prostate of 1 week control (a and f), 1 week diabetic (b and g), 1 week diabetic insulin-treated (c and h), 3 months control (d and i) and 3 months diabetic rats (e and j). The frequency of AR significantly decreased because of ageing (d), but not because of diabetes (b and e), although a lower intensity of immunoreaction could be observed in short-term diabetic group (b). The number of p63-positive cells is significantly greater in diabetic rats (g and j) and insulin treatment reduced its expression levels close to those observed in control group (h). Scale Bar: 20 μm.

Diferença na cinética epitelial nas diferentes idades utilizadas

Comparando-se os grupos controle as freqüências de células apoptóticas e p63 positivas não variaram mas a de células AR- e PCNA- positivas diminuiram nos animais mais velhos. Esses dados indicam que o envelhecimento influencia os mecanismos de proliferação do epitélio da próstata

O diabetes reduz os níveis séricos de testosterona, a expressão de AR, prejudica a proliferação celular e aumenta o nível de apoptose das células epiteliais com concomitante aumento de células p63-positivas na próstata de ratos

Uma ativação ineficiente de ARs causada pelo diabetes pode comprometer a via de sinalização envolvida com o estímulo à proliferação

A apoptose, aliada a diminuição da proliferação celular, é um dos principais mecanismos que levam à involução prostática em situações de privação androgênica

p63 tem importante função na regulação do desenvolvimento e diferenciação das células epiteliais, além de controlar a proliferação celular, apoptose e senescência