INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA · INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA APLICAÇÃO NO CONTROLE DE QUALIDADE DE FÁRMACOS Prof. Dr. Marcelo Martins de Sena MÓDULO

INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADAMULTIVARIADA

APLICAÇÃO NO CONTROLE DE QUALIDADE APLICAÇÃO NO CONTROLE DE QUALIDADE DE FÁRMACOSDE FÁRMACOS

Prof. Dr. Marcelo Martins de Sena

MÓDULO 04

1Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas

UnUCET – Anápolis

Prof. Dr. Marcelo Martins de SenaProf. Dr. Marcelo Martins de Sena

2 MÓDULO 04

CALIBRAÇÃO:CALIBRAÇÃO:

Revisão deRevisão deCalibração Calibração UnivariadaUnivariada


3 CALIBRACALIBRAÇÇÃOÃOUm mundo sob observação indireta requer calibração⇒ Estabelece um modelo para descrever a relação entre variável independente (x) e uma variável dependente (y)

⇒Transforma medidas instrumentais em resultados que possam ser compreendidos

⇒ Previsão de informação quantitativa (concentração ou outra propriedade) a partir de medidas químicas (frequentemente instrumentais), via alguma função de transferência

⇒ Desenvolvimento de funções empíricas (MODELOS): y = f(x)


4 CALIBRACALIBRAÇÇÃOÃOTIPOS:

1) LINEAR X NÃO LINEAR

2) UNIVARIADA X MULTIVARIADA

3) CLÁSSICA (DIRETA) X INVERSA


5 UnivariadaUnivariada xx MultivariadaMultivariada

⇒ O modelo é baseado somente em uma variável medida (x)⇒ É usada quando existe uma variável seletiva, que torna possível a previsão (ex: absorbância em um comprimento de onda onde não existe sobreposição espectral de interferentes)

1) Univariada

2) Multivariada⇒ O modelo é baseado em muitas variáveis (x é um vetor para cada amostra)⇒ É usada quando não existe uma única variável seletiva, tornando possível previsões na presença de sinais analíticos sobrepostos e de interferentes


6 ClCláássica x Inversassica x Inversa

⇒ A concentração (C) como função da resposta instrumental (S)⇒ Mais usada em calibração univariada⇒ Ex: Lei de Beer → S = f(C) + E

1) Clássica

2) Inversa⇒ A resposta instrumental como função da concentração⇒ Mais usada em calibração multivariada⇒ C = f(S) + F


7 CalibraCalibraçção ão UnivariadaUnivariada ClCláássicassicaExemplo de Curva de Calibração Clássica


8 CALIBRAÇÃO UNIVARIADACALIBRAÇÃO UNIVARIADADuas Etapas:1) Construção do Modelo: Medidas feitas em uma série de padrões analíticos de concentrações conhecidas são usadas para estimar um modelo que relacione as medidas (espectrais, cromatográficas, potenciométricas, etc.) com a concentração (ou outra propriedade) da espécie de interesse.

2) Previsão: Usa-se esse modelo para prever concentrações de novas amostras, a partir dos sinais analíticos medidos para elas.


9 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAO modelo mais simples consiste em estimar os parâmetros b0 e b1 que satisfaçam à equação:

y = b0 + b1x

onde “x” pode representar a concentração de uma espécie química, e “y” a medida analítica (Calibração Clássica).

Como encontrar a estimativa de b0 e b1 a partir dos pares de valores xi,yi para cada amostra medida i ?


10 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAAtravés do Método dos Mínimos Quadrados⇒ Não é possível ajustar uma reta passando por todos os pontos ao mesmo tempo.⇒ Então, ajusta-se uma reta que passe o mais perto possível dos pontos.⇒ Isto é feito pela minimização da soma dos quadrados dos resíduos (ou erros).⇒ Também conhecida como Análise de Regressão (Sir Francis Galton, 1885).

iii yye −= ˆResíduo de uma medida

( )2

1

ˆ∑=

−n

iii yy

Soma quadrática dos resíduos


11 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADA

xi xPor que minimizar os quadrados dos resíduos?

Porque a soma dos resíduos é zero


12 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAEstimando os parâmetros b0 e b1:

→ Somatória dos resíduos: ( ) ( )210

22 ˆ ∑∑∑ −−=−= iiiii xbbyyye

→ Derivando em relação a b0 e b1:

( ) 02 210

0

2

=−−−=∂

∂∑∑

iii xbby

be

( ) 02 210

1

2

=−−−=∂

∂∑∑

iiii xbbyX

be

→ Resolvendo o sistema de 2 equações acima:

( )( )( )∑

∑−

−−= 21 xx

yyxxb

i

ii xbyb 10 −=


13 CALIBRACALIBRAÇÇÃO UNIVARIADAÃO UNIVARIADAGeneralizando o modelo: y = b01 + b1x

→ Forma matricial:

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

=

⎥⎥⎥⎥

⎦

⎤

⎢⎢⎢⎢

⎣

⎡

1

02

1

2

1

.

1

11

bb

x

xx

y

yy

nn

MMM

→ Forma matricial abreviada: y = Xb→ Estimando o vetor b: b = (XTX)-1XTy→ Condições p/ resolução desta equação:1) A matriz (XTX)-1 deve ser inversível, ou seja, não singular (det≠0);2) Os modelos devem ser lineares nos parâmetros, ou seja não

devem conter termos como b02 ou b0b1.


14 AnAnáálise de Variância (ANOVA)lise de Variância (ANOVA)⇒ Separa a variação sistemática da variação aleatória⇒ Se baseia na análise dos resíduos (variância aleatória)⇒ O desvio de uma resposta pode ser decomposto como:

( ) ( ) ( )yyyyyy iii ˆˆ −+−=−


15 Análise de Variância (ANOVA)Análise de Variância (ANOVA)⇒ Os desvios são expressos como somas de quadrados

( ) ( ) ( )∑∑∑ −+−=− 222 ˆˆ yyyyyy iii

SQT = SQR + SQr

variância total

variância aleatória

(resíduos)variância sistemática (Regressão)


16 Análise de Variância (ANOVA)Análise de Variância (ANOVA)Tabela de ANOVA

Significância estatística da Regressão:→ Avaliada através de um teste F

Se MQR/MQr > F1,n-2 ⇒ A regressão é significativaSe MQR/MQr < F1,n-2 ⇒ o valor de b1 não é significativo


17 Análise de Variância (ANOVA)Coeficiente de Determinação (R2)

( )( )2

2

2 ˆ

∑∑

−

−==

yy

yySQSQR

i

i

T

R

0 < R2 < 1R2 = 1 ⇒ Ajuste perfeito

O coeficiente de correlação r entre uma resposta observada e um valor previsto é igual a raiz quadrada do coeficiente de determinação


18 AnAnáálise dos Reslise dos Resííduosduos⇒ Suposições assumidas na Regressão Linear:1) O erro na variável independente (x) pode ser desprezado

(assume-se que não há erros no preparo dos padrões);

2) Os resíduos não são correlacionados (as medidas em y são independentes umas das outras); ⇒ Para isto, a amostragem deve ter sido feita em ordem aleatória (Aleatorização)

3) Os resíduos seguem uma distribuição normal (graças ao TLC e ao esforço dos pesquisadores p/ evitar erros sistemáticos);

4) Os dados são homoscedásticos: a variância dos erros éconstante ao longo de toda a faixa estudada.


19 AnAnáálise dos Reslise dos Resííduosduos⇒ É fundamental que os resíduos sejam plotados e se

garanta que eles possuam comportamento aleatório

Exemplos de Resíduos não aleatórios


20 Dados Dados HeteroscedHeteroscedáásticossticos

⇒ Deve-se aplicar alguma transformação linearizante (ex: log) ou usar uma regressão ponderada (weighted regression)


21 Análise de Variância (ANOVA)Análise de Variância (ANOVA)Falta de Ajuste e Erro Puro⇒ A soma quadrática dos resíduos (SQr) pode ainda ser

dividida em um fator devido à falta de ajuste (SQfaj) e outro fator devido ao erro experimetal (erro puro, SQep)

⇒ Só é possível estimar SQep se tiverem sido feitas replicatas de pelo menos um ponto da curva

⇒ Para que o modelo seja adequado, é preciso que a falta de ajuste não seja significativamente maior do que o erro experimental (Faz-se um teste F)

SQr = SQfaj + SQep


22 CALIBRAÇÃO UNIVARIADABIBLIOGRAFIA:1) B. Barros Neto, I. S. Scarminio e R. E. Bruns, “Como Fazer

Experimentos. Pesquisa e desenvolvimento na ciência e na indústria”, Cap. 5, 2a ed., Ed. da UNICAMP, Campinas, 2003.

2) D.C. Harris, “Análise Química Quantitativa”, Cap. 5, 6a ed., Rio de Janeiro: LTC, 2005.

3) M.F. Pimentel e B. Barros Neto, “Calibração: Uma Revisão para Químicos Analíticos”, Quím. Nova 19: 268-277 (1996).

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