INTRODUKSI GEN Osdep1 KE DALAM TANAMAN PADI

VARIETAS CIHERANG, NIPPONBARE, DAN KASALATH

MELALUI PERANTARA Agrobacterium tumefaciens

RUTH MADUMA DEWININGSIH SIANTURI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Introduksi Gen Osdep1 ke dalam

Tanaman Padi Varietas Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath melalui Perantara

Agrobacterium tumefaciens adalah karya saya dengan komisi pembimbing dan

belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber

informasi yang berasal atau kutipan dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan tercantum dalam

Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2012

Ruth Maduma Dewiningsih Sianturi

P051090071

ABSTRACT

RUTH MADUMA DEWININGSIH SIANTURI. Introduction of Osdep1 Gene

through Agrobacterium tumefaciens into Rice cv. Ciherang, Nipponbare, and

Kasalath. Under direction of SUHARSONO and TRI JOKO SANTOSO.

Development of high yielding rice varieties can be performed through

Agrobacterium-mediated transformation techniques by inserting a gene that

regulates the characters related to high yield. DEP1 gene (dense and erect

panicle1) is a gene with single locus responsible for pleiotropy manner of three

important traits i.e. dense panicle, grain number per panicle and erect panicle. The

objective of this research was to introduce an Osdep1 gene into genome rice cv.

Nipponbare, Ciherang, and Kasalath by using Agrobacterium-mediated

transformation to obtain transgenic rice carrying the transgene. The vector used in

this research was Agrobacterium tumefaciens strain LBA-4404. Concentration of

higromycin antibiotic used for selecting agent was 50 mg/L, and acetosyringone

compound was added to the media that is equal to 100 M. In vitro

Agrobacterium tumefaciens (OD600 = 0.3)-mediated transformation through

dropping the bacteria to rice immature embryo explants have been successfully

performed and produced three transgenic plants of Nipponbare. Meanwhile, in

planta transformation have produced two transgenic plants cv. Ciherang and three

transgenic plants cv. Kasalath. Inheritance analysis of T1 generation Kasalath-

Osdep1-4 dan Kasalath-Osdep1-8 lines showed that the transgenic lines were not

chimeras. Molecular analysis should be performed to make sure that the T1

transgenic rice lines also carry the transgene.

Keywords: Agrobacterium tumefaciens, genetic transformation, Osdep1 gene,

rice (Oryza sativa).

RINGKASAN

RUTH MADUMA DEWININGSIH SIANTURI. Introduksi Gen Osdep1 ke

dalam Tanaman Padi Varietas Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath Melalui

Perantara Agrobacterium tumefaciens. Dibimbing oleh SUHARSONO dan TRI

JOKO SANTOSO.

Upaya peningkatan produksi padi harus tetap dilakukan untuk

meningkatkan ketahanan pangan nasional sehingga tercipta swasembada pangan

yang berkelanjutan. Usaha pengembangan varietas dengan produktifitas tinggi

dapat dilakukan dengan teknik rekayasa genetika yaitu melalui transformasi

dengan vektor Agrobacterium tumefaciens yang dilakukan dengan cara

menyisipkan vektor plasmid yang mengandung gen yang meregulasi karakter

produktifitas tinggi. Gen dense erect panicle 1 (dep1) bertanggung jawab secara

pleiotropi terhadap tiga sifat penting yaitu malai rapat (dense panicle), jumlah biji

per malai (grain number per panicle) dan malai tegak (erect panicle). Ekspresi

berlebih atau over-ekspresi gen Osdep1 diharapkan dapat meningkatkan densitas

panikula, jumlah bulir per panikula dan panikula yang tegak sehingga

produktivitas tanaman padi meningkat.

Penelitian ini bertujuan untuk mengintroduksikan gen Osdep1 ke dalam

tanaman padi varietas Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath. Introduksi gen

Osdep1 dilakukan dengan 2 metode yaitu transformasi secara in planta

menggunakan eksplan skutelum (Supartana et al. 2005) dan transformasi secara in

vitro menggunakan eksplan embrio muda (Hiei & Komari 2006). Analisis PCR

dilakukan dengan menggunakan primer gen spesifik hpt (hygromycin phospho-

transferase) yaitu primer forward (F): 5-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3 dan primer reverse (R): 5-GCATCTGCCGTGCACATG-3. Elektroforesis hasil PCR dilakukan pada 1% gel agarose dan dijalankan pada 80 volt selama 35 menit.

Pita-pita DNA hasil PCR di dalam gel agarosa divisualisasi dengan perangkat

Chemidoc gel system.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada transformasi secara in vitro

padi japonica (Nipponbare) mempunyai efisiensi transformasi lebih tinggi

daripada indica (Ciherang atau Kasalath). Eksplan yang berupa embrio muda dari

varietas Nipponbare dapat membentuk kalus dan beregenerasi di media seleksi.

Walaupun eksplan dapat membentuk kalus, tetapi kalus Ciherang dan Kasalath

tidak mampu beregenerasi untuk membentuk tunas. Hal ini menunjukkan bahwa

transformasi genetika pada padi indica masih mengalami kesulitan terutama dalam

kemampuan regenerasinya dan ini juga memperkuat dugaan selama ini bahwa

padi indica bersifat rekalsitran untuk ditransformasi. Transformasi dengan eksplan

embrio muda ini telah berhasil mendapatkan 9 tanaman putatif transgenik

Nipponbare, namun hanya 7 yang bertahan hidup dan 3 tanaman diantaranya

adalah positif PCR untuk gen hpt dengan efisiensi transformasi sebesar 1.56%.

Hasil transformasi secara in planta menunjukkan bahwa konsentrasi

higromisin 40 mg/L yang ditambahkan pada media MS (Murashige-Skoog) sudah

dapat membedakan tanaman transforman dan non-transforman pada varietas

Ciherang. Efisiensi transformasi menggunakan metode in planta dalam media

seleksi higromisin 40 mg/L adalah 2%, 0%, dan 3% masing-masing untuk varietas

Ciherang, Nipponbare dan Kasalath. Analisis pewarisan transgen dilakukan pada

galur padi transgenik generasi T1 Kasalath-Osdep1-4 dan Kasalath-Osdep1-8

yang ditanam pada media MS yang mengandung higromisin 40 mg/L dan 50

mg/L. Hasil uji pewarisan gen hpt melalui penanaman biji di media seleksi

menunjukkan bahwa gen tersebut diwariskan kepada generasi T1. Hal ini menjadi

bukti bahwa transgen hpt telah terintegrasi pada genom sel-sel meristem apikal

(biasanya belum terdiferensiasi) yang berkembang menjadi sel-sel reproduksi

yang selanjutnya diwariskan pada generasi berikutnya.

Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, gen Osdep1, padi (Oryza sativa),

transformasi genetik

Hak cipta milik IPB, tahun 2012

Hak cipta dilindungi Undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau

tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar dari IPB dan Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi

dan Sumber Daya Genetika Pertanian (BB-Biogen)

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB dan Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetika Pertanian (BB-

Biogen)

INTRODUKSI GEN Osdep1 KE DALAM TANAMAN PADI

VARIETAS CIHERANG, NIPPONBARE, DAN KASALATH

MELALUI PERANTARA Agrobacterium tumefaciens

RUTH MADUMA DEWININGSIH SIANTURI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA

Judul Tesis : Introduksi Gen Osdep1 ke dalam Tanaman Padi Varietas Ciherang,

Nipponbare, dan Kasalath melalui Perantara Agrobacterium

tumefaciens

Nama : Ruth Maduma Dewiningsih Sianturi

NIM : P051090071

Disetujui

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA. Dr. Tri Joko Santoso, SP. MSi.

Ketua Anggota

Diketahui,

Ketua Program Studi/Mayor Dekan Sekolah Pasca Sarjana

Bioteknologi

Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc Agr.

Tanggal Ujian: 24 Juli 2012

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah atas segala karunia-Nya

sehingga penulis dapat menyusun tesis dengan judul Introduksi Gen Osdep1 ke

dalam Tanaman Padi Varietas Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath melalui Perantara

Agrobacterium tumefaciens.

Terimakasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA, dan

Dr. Tri Joko Santoso, SP. M.Si, selaku komisi pembimbing yang telah

mengarahkan dan membimbing penulis baik dalam proses penelitian maupun

penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga penulis ucapkan kepada

seluruh peneliti dan staf Laboratorium Biologi Molekular BB-Biogen Cimanggu

Bogor yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk melaksanakan

penelitian ini. Terimakasih kepada Ibu Atmitri, Ibu Aniversari, Ibu Nur, Pak Heri,

Pak Umar, Pak Asep, dan seluruh BB-Biogen Family: Dewi Praptiwi, Falin

Fakhrina, Ibu Sesanti, Happy, Fina, Taufan, Obosh, Reza, mba Ida, Anggun, Ade,

Gitaw, Sekar, Rizki, Dina, Retno, Safia, Alifah yang telah memberikan semangat

dan keceriaan pada penulis.

Penulis juga mengucapkan terimakasih untuk keluarga tercinta, Mama dan

Papa atas kasih sayang, cinta, dukungan, nasihat, dan doa yang tak hentinya

dicurahkan kepada penulis. Terimakasih disampaikan untuk ibu Ridho Kurniaty,

Kak Ellya, teman-teman BTK 2009 dan 2010, teman-teman PBT 2008 dan 2009,

teman-teman Fitopatologi 2009, serta teman-teman guru sekolah minggu dan cool

DM GBI Gd. Lautan, teman-teman Wisma Flora, teman-teman GSP (Gita Swara

Pascasarjana) atas segala dukungan, ide, nasihat dan doanya. Semoga karya ilmiah

ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2012

Ruth Maduma Dewiningsih Sianturi

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Cirebon tanggal 2 November 1986 dari orang tua

terkasih pasangan bapak J. Sianturi S.AP dan ibu Linceria Sihombing S.Pd.

Penulis menyelesaikan jenjang pendidikan menengah umum tahun 2004 di SMA

Negeri 2 Cirebon dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan jenjang

pendidikan strata satu (S1) di program studi Pemuliaan Tanaman Fakultas

Pertanian Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto melalui PMDK. Selama

menempuh studi penulis pernah menjadi asisten praktikum Pemuliaan Tanaman

Terapan I, dan Rekayasa Genetika, dan pengurus HIMALITAN (Himpunan

Mahasiswa Pemuliaan Tanaman). Pada tahun 2009 penulis mengikuti seleksi

penerimaan mahasiswa Pascasarjana Institut Pertanian Bogor dan diterima sebagai

mahasiswa pada Program Studi Bioteknologi. Selama mengikuti program S2

penulis bergabung dalam GSP (Gita Swara Pascasarjana).

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ........................................................................................ xii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xiv

PENDAHULUAN

Latar Belakang ................................................................................... 1

Tujuan Penelitian ............................................................................... 3

Manfaat Penelitian ............................................................................. 3

TINJAUAN PUSTAKA

Padi .................................................................................................... 5

Perkembangan Transformasi Genetik pada Padi ............................... 6

Gen DEP1 .......................................................................................... 8

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu .............................................................................. 11

Bahan ................................................................................................. 11

Metode ............................................................................................... 11

Transformasi Genetik Secara In-vitro .................................... 11

Transformasi Genetik Secara In-planta .................................. 14

Analisis Amplifikasi Transgen pada Transforman ................ 15

Isolasi DNA Genom Tanaman .................................. 15

Analisis PCR .............................................................. 16

Elektroforesis ............................................................. 16

Analisis Pewarisan Gen hpt pada Tanaman Transgenik ......... 17

HASIL DAN PEMBAHASAN

Transformasi Genetik secara In vitro ................................................ 19

Transformasi Genetik secara In planta .............................................. 24

SIMPULAN ................................................................................................. 29

SARAN ........................................................................................................ 29

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 31

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Data luas lahan, produksi dan produktivitas padi nasional (2006-2011) ......................................................................................................... 1

2. Perbedaan morfologi padi indica, japonica, javanica ................................ 5

3. Jumlah eksplan yang membentuk kalus beregenerasi dari embrio muda dari varietas padi Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath

yang diinfeksi oleh A. tumefaciens ............................................................ 19

4. Hasil transformasi secara in planta pada varietas Ciherang (C), Nipponbare (N), dan Kasalath (K) ............................................................ 25

5. Jumlah tanaman positif PCR dan efisiensi transformasi secara in planta padi Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath ..................................... 25

6. Uji toleransi kecambah padi varietas Kasalath nontransgenik dan Kasalath-Osdep1 generasi T1 di media seleksi yang

mengandung higromisin 40 mg/L ............................................................. 26

7. Uji resistensi varietas Kasalath nontransgenik terhadap antibiotik higromisin pada media yang mengandung 50 mg/L higromisin ............... 27

8. Hasil skrining galur-galur tanaman transgenik Kasalath-Osdep1 pada media mengandung 50 mg/L higromisin ........................................... 27

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Peta genetik DEP1 pada kromosom padi nomor 9 .................................. 2

2. Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid pC1301-OsDep1 yang membawa gen Osdep1 dan gen ketahanan terhadap antibiotik

Higromisin (HPT II) .................................................................................. 11

3. Embrio muda setelah diinfeksi Agrobacterium tumefaciens dalam media ko-kultivasi .......................................................................... 19

4. Kalus yang ditumbuhkan di media yang mengandung 50 mg/L higromisin ................................................................................................. 20

5. Regenerasi tunas dari kalus ....................................................................... 20

6. Tunas padi berakar .................................................................................... 21

7. Analisis integrasi gen hpt di dalam tanaman transgenik putatif dengan PCR .............................................................................................. 22

8. Analisis PCR menggunakan primer spesifik gen hpt terhadap tanaman padi varietas Ciherang hasil transformasi in planta ................... 24

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Stok dan komposisi media transformasi padi ............................................ 37

2. Komposisi media A200 untuk 1L ............................................................. 39

3. Komposisi media A201, A202, A203 ....................................................... 40

4. Komposisi media A204, A205 .................................................................. 41

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Beras merupakan bahan makanan pokok sebagian besar penduduk

Indonesia. Peningkatan jumlah penduduk tiap tahunnya menuntut peningkatan

ketersediaan beras. Produksi padi sawah Indonesia pada tahun 2009 meningkat

mencapai 6.32% dari tahun sebelumnya, namun produksi pada tahun 2011

menurun mencapai 1.08% dari tahun 2010 (Tabel 1). Untuk itu, peningkatan

produksi padi harus tetap dilakukan untuk meningkatkan ketahanan pangan

nasional dan mencapai swasembada pangan. Upaya yang perlu dilakukan untuk

meningkatkan produksi padi nasional antara lain dengan melakukan

pengembangan varietas tanaman padi yang memiliki produktifitas tinggi dengan

ketahanan terhadap cekaman biotik dan abiotik. Peningkatan hasil produktifitas

dapat dilakukan melalui peningkatan produksi bulir padi per malai.

Tabel 1 Data luas lahan, produksi, dan produktivitas padi nasional (20062011)

Tahun Luas Panen

(ha)

Produksi Padi

Sawah Nasional (ton)

Produktifitas Padi Sawah

Nasional (Ku/ha)

Laju Produksi

(%)

2006 11 786 430 54 454 937 46.20 0.55

2007 12 147 637 57 157 435 47.05 4.72

2008 12 327 425 60 325 925 48.94 5.25

2009 12 883 576 64 398 890 49.99 6.32

2010 13 253 450 66 469 394 50.51

3.11

2011 13 203 643

65 756 904

49.80

1.08

Sumber: Badan Pusat Statistik 2012

Pengembangan varietas dengan hasil produksi yang tinggi dapat dilakukan

dengan teknik pemuliaan tanaman konvensional dan teknik rekayasa genetika.

Teknik pemuliaan konvensional dilakukan dengan persilangan antara tetua jantan

dan betina yang memiliki sifat yang diinginkan, yang disebut dengan hibridisasi

(Nasir 2001), yang diikuti dengan seleksi terhadap karakter tanaman yang

diinginkan. Namun teknik persilangan ini masih memiliki kelemahan diantaranya

membutuhkan waktu yang lama dalam perakitan varietas baru, sehingga untuk

perbaikan genetik dibutuhkan rekayasa genetika. Rekayasa genetik dilakukan

dengan mengintroduksikan gen asing (transgen) yang diinginkan ke dalam genom

2

tanaman sehingga tanaman tersebut mengalami transformasi secara genetik, tanpa

mengubah sifat-sifat unggul yang sudah ada.

Gen yang memiliki fungsi dalam meningkatkan produksi padi telah

teridentifikasi diantaranya ialah gen Gn1a, EP2, dan DEP1 (Ashikari et al. 2005;

Zhu et al. 2009; Huang et al. 2009). Huang et al. (2009) berhasil mengisolasi gen

DEP1 yang terdapat pada kromosom 9 padi (Gambar 1). Gen DEP1 berperan

dalam menentukan kepadatan malai, jumlah bulir per panikula, dan ketegakan

panikula. Jumlah bulir pada tanaman padi transgenik DEP1 mencapai 40.9% lebih

banyak daripada tanaman padi kontrol (non-transgenik) (Huang et al. 2009).

Gambar 1 Peta genetik DEP1 pada kromosom padi nomor 9 (Huang et al. 2009).

Agrobacterium tumefaciens banyak digunakan untuk melakukan

transformasi genetik pada berbagai tanaman, baik tanaman dikotil maupun

monokotil. Kelebihan dari teknik A. tumefaciens dibandingkan dengan metode

penembakan partikel adalah mampu memindahkan fragmen DNA berukuran

besar, memerlukan biaya relatif murah, relatif mudah dalam pengerjaannya, dan

ekspresi transgen di dalam tanaman transgenik lebih tinggi (Lee et al. 2010).

Proses introduksi gen dengan penembakan partikel seringkali menyebabkan

terjadinya kerusakan sel/jaringan yang ditembak sehingga terjadi peningkatan

kematian eksplan dan menurunkan daya regenerasi sel/jaringannya (Santoso et al.

2005).

Transformasi genetik pada tanaman padi melalui perantara A. tumefaciens

sudah banyak dilakukan, namun efisiensi transformasi pada tanaman padi

subspesies indica masih rendah. Keberhasilan transformasi genetik pada padi

dipengaruhi oleh kesesuaian antara strain A. tumefaciens dengan jenis maupun

varietas tanaman (Hiei et al. 1994; Smith & Hood 1995; Rahmawati 2006).

Supartana et al. (2005) mengembangkan metode transformasi genetik padi

melalui perantara A. tumefaciens secara in planta menggunakan eksplan skutelum,

serta Hiei dan Komari (2006) mengembangkan metode transformasi genetik padi

3

melalui perantara Agrobacterium tumefaciens menggunakan ekplan embrio muda.

Kedua metode tersebut telah diketahui menunjukkan efisiensi transformasi yang

cukup tinggi pada tanaman padi.

Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah mengintroduksi gen Osdep1 ke dalam genom

tanaman padi varietas Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath dengan bantuan A.

tumefaciens strain LBA-4404 sehingga memperoleh tanaman padi transgenik

yang membawa gen Osdep1.

Manfaat Penelitian

Tanaman padi transgenik yang mengandung gen Osdep1 diharapkan

mempunyai produktifitas yang tinggi sehingga dapat meningkatkan produksi padi

secara nasional.

4

5

TINJAUAN PUSTAKA

Padi

Padi merupakan makanan pokok sebagian besar penduduk Indonesia.

Tanaman padi berakar serabut, daun berbentuk lanset (sempit memanjang), urat

daun sejajar, memiliki pelepah daun, bunga tersusun sebagai bunga majemuk,

buah dan biji sulit dibedakan karena merupakan bulir (grain) (Hattori & Siwi

1986). Smith & Dilday (2002) menyatakan bahwa Oryza sativa terbagi menjadi

tiga subspesies yaitu japonica, indica, dan javanica. Padi indica ditanam dan

dikonsumsi secara luas di Indonesia. Padi subspesies indica umumnya memiliki

masa dormansi beberapa minggu. Sifat ini cocok untuk daerah basah tropik karena

suhu dan kelembaban sangat sesuai untuk perkecambahan (Yoshida 1981).

Perbedaan morfologi antara padi subspesies indica, japonica, dan javanica dapat

dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2 Perbedaan morfologi padi indica, japonica, dan javanica

Karakteristik Indica Japonica Javanica

Daun Lebar hingga

sempit

Sempit Lebar dan kaku

Warna daun Hijau muda Hijau tua Hijau muda

Butir padi Panjang hingga

pendek, ramping

dan sedikit rata

Pendek dan

membulat

Panjang, lebar dan

tebal

Bentuk lemma dan

palea

Tipis dan rambut

pendek

Tebal dan rambut

panjang

Rambut yang

panjang

Jaringan Lunak Keras Keras

Kadar amilum 2331% 1020% 2025%

Sumber: Smith & Dilday (2002)

Morfologi suatu tanaman sangat berpengaruh terhadap produktivitasnya.

Pemahaman mengenai bentuk dan fungsi dari organ-organ tanaman padi

diperlukan untuk merancang tipe tanaman padi ideal. Organ-organ tanaman padi

terdiri atas: a) gabah terdiri atas biji yang terbungkus oleh sekam, b) akar yang

berfungsi sebagai penguat/penunjang tanaman untuk dapat tumbuh tegak,

menyerap hara dan air dari dalam tanah, c) daun dan tajuk, d) batang yang

6

berfungsi sebagai penopang tanaman, penyalur senyawa-senyawa kimia dan air

dalam tanaman, serta e) bunga padi (malai).

Padi dapat tumbuh pada berbagai tipe tanah, dalam keadaan tergenang atau

di lahan kering yang kelembabannya sesuai dengan kapasitas lapang. Suhu

optimum untuk pertumbuhan padi ialah sekitar 27 oC. Padi adalah tanaman hari

pendek (short day plant) dengan periodisitas cahaya optimal untuk pembungaan

10 jam. Penyinaran yang lama dapat memperlambat atau menghambat

pembungaan. Periodisitas kritis berkisar antara 12-24 jam tergantung pada

kultivar (Setiamihardja & Herawati 2000).

Tanaman padi subspesies japonica varietas Nipponbare sering digunakan

sebagai model penelitian bagi tanaman monokotil. Beberapa alasan yang

mendukung penggunaan tanaman tersebut antara lain ukuran genomnya relatif

kecil (430 Mbp), mudah ditransformasi dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi

(Kolesnik et al. 2004). Genom padi diperkirakan mengandung 32 000 55 000

gen baik pada padi japonica (Nipponbare) maupun indica (Remelia 2008).

Informasi tersebut dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya yaitu identifikasi

fungsi gen-gen padi (Greco et al. 2003).

Perkembangan Transformasi Genetik pada Padi

Padi merupakan makanan pokok bagi hampir setengah dari penduduk

dunia dan telah banyak digunakan sebagai sistem model tanaman untuk tanaman

monokotil. Secara garis besar terdapat dua teknik transfer gen yang telah berhasil

diterapkan, yaitu transfer gen secara langsung dan tidak langsung. Transfer gen

secara langsung misalnya dengan senyawa kimia polyethylene glycol (PEG), atau

penembakan DNA. Transfer gen secara tidak langsung menggunakan bantuan

bakteri tanah A. tumefaciens (Slamet-Loedin 1994). Secara alami A. tumefaciens

hanya menginfeksi tanaman dikotil sehingga keberhasilan transformasi dengan A.

tumefaciens pada awalnya hanya terbatas pada tanaman dikotil.

Keberhasilan transformasi genetik pada tanaman padi (monokotil)

menggunakan Agrobacterium pertama kali dilaporkan oleh Hiei et al. (1994).

Keberhasilan transformasi yang dilakukan oleh Hiei et al. (1994) menggunakan

vektor super biner pTOK233 yang disisipkan ke dalam A. tumefaciens virulen

7

biasa LBA 4404, dan vektor biner p1G121Hm yang disisipkan ke dalam A.

tumefaciens super virulen EHA101. Keberhasilan tersebut didukung dengan

penggunaan kalus embriogenik, penambahan senyawa asetosiringon dan kondisi

pH yang rendah untuk mengaktifkan gen-gen vir dari A. tumefaciens.

Penambahan asetosiringon dapat membantu keberhasilan transformasi

menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens pada tanaman monokotil seperti

tanaman padi. Senyawa ini diketahui berhasil menginduksi terekspresinya gen-gen

vir pada plasmid Ti (Hiei et al. 1994; Saharan et al. 2004; Rahmawati 2006).

Penambahan asetosiringon dapat meningkatkan keberhasilan efisiensi

transformasi tanaman monokotil seperti pada tanaman tebu (Fitranty et al. 2003;

Wulandari 2005), tanaman jagung (Utomo 2005), dan tanaman Anggrek (Pambudi

2009). Penambahan asetosiringon sangat penting untuk transformasi tanaman padi

karena tanaman padi yang termasuk monokotil yang tidak menghasilkan senyawa

asetosiringon. Konsentrasi senyawa asetosiringon yang optimum dan umum

digunakan untuk transformasi genetik pada tanaman monokotil menggunakan

Agrobacterium adalah 100 M (Fitranty et al. 2003).

Terdapat dua kelompok besar tanaman padi budidaya yaitu subspesies

indica dan japonica. Padi indica ditanam dan dikonsumsi secara luas di dunia

termasuk di Indonesia. Oleh karena itu transfer gen pada tanaman padi tidak

hanya terbatas pada kelompok japonica tetapi juga untuk padi varietas elit

kelompok indica. Informasi keberhasilan transformasi genetik pada padi indica

masih terbatas. Padi indica sulit ditransformasi karena umumnya sensitif terhadap

kultur jaringan dan kurang responsif jika ditransformasi (Maftuchah 2003; Lin &

Zhang 2005; Purnamaningsih 2006; Mulyaningsih et al. 2010).

Berbagai upaya dilakukan untuk meningkatkan efisiensi transformasi padi

indica antara lain dengan pemilihan jaringan sebagai material awal yang

digunakan. Ketepatan pemilihan jaringan/eksplan dan waktu transformasi dapat

mempengaruhi waktu yang diperlukan untuk mendapatkan tanaman transgenik

(Hiei & Komari 2006; Toki et al. 2006). Eksplan tersebut dapat berupa skutelum

benih yang membentuk kalus embriogenik (Rames et al. 2009), skutelum benih

secara in planta (Supartana et al. 2005), benih (Toki et al. 2006) dan embrio

zigotik muda (Hiei & Komari 2006). Eskplan berupa embrio zigotik muda

8

merupakan kumpulan sel meristem yang aktif membelah. Oleh karena itu, metode

transformasi menggunakan eksplan embrio zigotik muda merupakan teknik

transformasi yang baik untuk padi c(Mulyaningsih 2011). Transformasi secara in

planta menggunakan eksplan berupa skutelum benih yang dilakukan oleh

Supartana et al. (2005) dapat menghasilkan tanaman transgenik dalam waktu yang

singkat.

Saat ini berbagai kultivar tanaman padi telah berhasil ditransformasi

menggunakan Agrobacterium. Ashikari et al. (2005) mengintroduksikan gen yang

meregulasi sitokinin oksidase ke dalam padi indica varietas Habataki dan ke

dalam padi japonica varietas Koshihikari. Supartana et al. (2005) melakukan

transformasi secara in planta menggunakan Agrobacterium tumefaciens strain

LBA-4404 pada padi Koshihikari. Mulyaningsih et al. (2010) berhasil

mengintroduksikan gen regulator HD-Zip pada padi indica kultivar Batutegi dan

Kasalath. Gen HD-Zip merupakan salah satu faktor transkripsi yang terkait

dengan adaptasi perkembangan tanaman terhadap cekaman kekeringan. Gen

isopentenyltransferase (ipt) berhasil diintroduksikan ke dalam genom padi kultivar

Nipponbare (Wagiran et al. 2010). Isopentenyltransferase berperan sebagai

katalisator dalam jalur biosintesis sitokinin tanaman padi, sehingga memberikan

pengaruh terhadap tinggi tanaman, panjang malai, jumlah biji per malai pada

tanaman padi (Wagiran et al. 2010).

Gen DEP1

Peningkatan produksi tidak hanya dipengaruhi oleh tinggi tanaman dan

waktu pembungaan. Arsitektur malai padi juga memegang peranan penting dalam

peningkatan produksi, yaitu berpengaruh terhadap fotosintesis. Padi dengan malai

tegak memberikan aerasi CO2 yang baik dan meningkatkan penerimaan cahaya

yang menyebabkan fotosintesis dapat berjalan lebih efektif sehingga pengisian

bulir maksimal (Guo & Hong 2010; Piao et al. 2009).

Penelitian mengenai gen-gen yang berpengaruh terhadap peningkatan

produksi padi melalui perbaikan arsitektur malai sudah banyak dilakukan.

9

Perbaikan arsitektur malai tersebut meliputi panjang malai, jumlah cabang primer

per malai, ukuran bulir, rasio set biji, kepadatan malai, dan ketegakan malai.

Huang et al. (2009) berhasil mengklon gen DEP1 yang terdapat dalam

lokus DEP1. Lokus DEP1 merupakan lokus yang bertanggungjawab terhadap tiga

karakter tanaman padi, yaitu kepadatan malai, jumlah bulir per panikula, dan

ketegakan panikula.

Penelitian terkait karakter malai yang tegak pada tanaman padi telah

dilakukan, namun hasil yang diperoleh masih terbatas. Gen dominan dan resesif

diketahui berpengaruh terhadap karakter malai padi yang tegak. Alel dominan

yang terdapat pada lokus DEP1 merupakan mutasi gain-of-function yang

menyebabkan pemotongan phosphatidylethanolamine-binding protein-like

domain protein, suatu protein pengontrol pergantian morfologis antara

pertumbuhan tunas dan struktur bunga pada tanaman. Efek alel tersebut

menyebabkan reduksi panjang internodus inflorensia, dan peningkatan jumlah

bulir per malai sehingga terjadi peningkatan hasil bulir padi. Dengan demikian

DEP1 (Dense and Erect Panicle 1) bertanggung jawab terhadap tiga bentuk

ekspresi yaitu densitas panikula, jumlah bulir per panikula yang tinggi dan

panikula yang tegak (Huang et al. 2009).

Selain gen DEP1, gen yang diidentifikasi terkait dengan peningkatan

jumlah bulir per malai dan sifat panikula yang tegak pada tanaman padi adalah

gen Gn1a dan EP2. Ashikari et al. (2005) melaporkan bahwa gen Gn1a

merupakan gen yang mengaktifkan enzim cytokine oxidase yang berperan dalam

mendegradasi fitohormon sitokinin sehingga merangsang pembentukan organ

reproduksi (malai). Jumlah bulir pada tanaman padi transforman Gn1a mencapai

21% lebih banyak daripada jumlah bulir pada tanaman padi kontrol

(nontransgenik).

Gen EP2 terletak pada kromosom padi nomor 7 dan diekspresikan pada

berkas pembuluh. Mutasi loss-of-function gen tersebut menyebabkan fenotip

malai tegak pada tanaman padi. Lokus EP2 merupakan lokus yang berperan

dalam mengkode protein EP2 yang terletak di retikulum endoplasma, namun

fungsi biokimiawinya belum diketahui (Zhu et al. 2009).

10

11

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Januari 2011 sampai dengan Maret

2012 di Laboratorium Biologi Molekular, Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB BIOGEN).

Bahan

Biji padi varietas Nipponbare, Kasalath, dan Ciherang digunakan sebagai

tanaman sasaran untuk transformasi genetik. Agrobacterium tumefaciens LBA-

4404 yang mengandung pC1301-Osdep1 (Santoso et al. 2010) digunakan untuk

melakukan transformasi materi genetik padi. pC1301-Osdep1 mengandung gen

Osdep1 (Huang et al. 2009) dibawah kendali p35SCaMV (Gambar 2). Primer

forward (F): 5-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3 dan primer reverse (R):

5-GCATCTGCCGTGCACATG-3 digunakan untuk mendeteksi gen hpt dengan

PCR. Media kultur untuk proses transformasi padi disajikan pada lampiran 1, 2, 3,

dan 4.

Gambar 2 Peta fisik daerah T-DNA dari plasmid pC1301-Osdep1 yang membawa

gen Osdep1 dan gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin (HPTII)

(Santoso et al. 2010).

Metode

Penelitian ini menggunakan dua metode, yaitu (1) transformasi genetik

secara in vitro, dan (2) transformasi genetik secara in planta.

1. Transformasi genetik secara in vitro

Transformasi genetik secara in vitro menggunakan bahan tanaman berupa

NOS-pro HPTII (KanR) NOS-ter CaMV35s pro OsDep1 NOS-ter

HindIII Sal1 BamH1 EcoR1

RB LB

NOS-pro HPTII (KanR) NOS-ter CaMV35s pro OsDep1 NOS-ter

12

embrio muda dengan mengikuti prosedur Hiei dan Komari (2008). Transformasi

genetik secara in vitro dilakukan secara bertahap melalui: a) penanaman padi

sebagai sumber eksplan, b) Persiapan bakteri A. tumefaciens dan eksplan, c)

induksi kalus embriogenik, d) regenerasi kalus dan induksi perakaran, e)

aklimatisasi.

a. Penanaman padi sebagai sumber eksplan

Benih-benih padi dari tiga varietas Nipponbare, Kasalath, dan Ciherang

dikecambahkan pada cawan petri yang dilapisi dengan kertas saring [Advantec

Toyo] basah selama 2 minggu. Kecambah-kecambah padi kemudian dipindahkan

ke bak berisi tanah selama 2 minggu dan selanjutnya dipindah ke ember berisi

tanah dan dipelihara sampai menghasilkan biji belum masak yang akan digunakan

sebagai eksplan untuk transformasi. Eksplan yang digunakan adalah embrio muda

berumur 8-12 hari setelah penyerbukan (antesis).

b. Persiapan bakteri Agrobacterium tumefaciens dan eksplan

Satu koloni A. tumefaciens yang mengandung vektor pCambia1301-

Osdep1 [CambiaLabs] ditumbuhkan pada media YEP cair terdiri dari 10 g

BactoTM

pepton [Difco], 5 g NaCl [Merck], 10 g bacto yeast extract [Difco] yang

mengandung antibiotik 75 mg/L karbenisilin [Sigma] dan 100 mg/L kanamisin

[Sigma] selama semalam pada inkubator bergoyang pada kecepatan 200 rpm

[Labline Shaker Orbit] dengan suhu 28 oC. Selanjutnya 500 L dari kultur

tersebut ditumbuhkan pada media AB padat (0.5 g glukosa, 1.5 g BactoTM

Agar

[Difco], 5 mL AB buffer, 5 mL AB salt) yang mengandung antibiotik karbenisilin

[Sigma] 75 mg/L dan kanamisin [Sigma] 100 mg/L, selama 3 hari pada suhu 28

oC. Kultur Agrobacterium kemudian dilarutkan pada media ko-kultivasi cair, yaitu

media dasar R2 (100 mL R2 makro 1, 100 mL R2 makro 2, 10 mL FeNaEDTA, 1

mL R2 mikro, 25 mL vitamin R2) dengan penambahan 2.5 mg/L 2.4-D [Merck],

10 g/L glukosa, dan 100 M asetosiringon [Sigma], dengan pH 5.2. Kerapatan

bakteri yang digunakan adalah 0.3 pada panjang gelombang 600 nm.

Persiapan eksplan embrio muda dimulai dari pemanenan biji padi yang

belum masak. Kulit biji dikuliti dan disterilisasi dengan 100 mL ethanol [Merck]

70% selama 10 detik, kemudian dipindahkan ke larutan sodium hipoklorit

[Bayclin] 0.78% yang telah ditetesi tween 20 (1 tetes per 50 mL). Selanjutnya

13

dikocok selama 5 menit dan larutannya dibuang. Biji dibilas dengan aquades steril

sebanyak 5 kali, dan dikeringkan menggunakan kertas saring pada cawan petri.

Padi steril dipencet menggunakan pinset untuk mengeluarkan embrionya, dan

ditanam di media kokultivasi (media A201, yaitu media dasar NB dengan

penambahan 2 mg/L 2.4D [Merck], 2 mg/L NAA [Sigma], 1 mg/L BAP [Sigma],

dan 19.62 mg/1 asetosiringon [Sigma] dalam 1 mL DMSO [Sigma], pH 5.2)

dengan skutela menghadap ke atas. Suspensi A. tumefaciens diteteskan pada

masing-masing embrio yang belum masak. Embrio yang diinfeksi A. tumefaciens

diinkubasi selama 7 hari pada suhu 25 oC dalam kondisi gelap.

c. Induksi kalus embriogenik

Setelah ko-kultivasi, tunas yang memanjang dibuang dari embrio dengan

menggunakan skalpel. Embrio dibersihkan dari media ko-kultivasi menggunakan

kertas saring steril yang ditempelkan pada Embrio. Embrio dipindahkan ke

medium induksi kalus dan diinkubasi selama 5 hari. Media induksi kalus (A202)

yang digunakan adalah media dasar NB dengan penambahan 1 mg/L 2.4D

[Merck], 1 mg/L NAA [Sigma], 0.2 mg/L BAP [Sigma], 250 mg/L cefotaxim

[Duchefa], dan 100 mg/L vankomisin [Calbiochem] dengan pH 5.8. Kalus

dipindahkan ke medium induksi kalus yang mengandung 50 mg/L higromisin

[Higromisin B, Roche] dengan pH 5.8 (A203) dan diinkubasi selama 3 minggu.

Kalus-kalus tahan dipindahkan ke medium yang sama dan diinkubasi selama 10

hari. Kalus-kalus yang tahan dan menunjukkan tanda-tanda embriogenik

dipindahkan ke media regenerasi dan dinkubasi selama 10 hari.

d. Regenerasi kalus dan induksi perakaran

Kalus yang embriogenik dipindahkan ke media regenerasi (A204) yaitu

media dasar MS dengan penambahan 2 mg/L kinetin [Sigma], 5 mg/L NAA

[Sigma], 250 mg/L cefotaksim [Duchefa], 100 mg/L vankomisin [Calbiochem],

dan 50 mg/L higromisin [Higromisin B, Sigma], dan ditempatkan di dalam ruang

kultur pada suhu 28 oC dengan penyinaran 1000 lux selama 16 jam tiap hari.

Kalus dipindahkan ke media regenerasi setiap 2 minggu hingga terbentuk tunas.

Tunas diakarkan dalam media perakaran (A205) yaitu media dasar MS dengan

penambahan 2 mg/L kinetin [Sigma], 1 mg/L NAA [Sigma], 250 mg/L

cefotaksim [Duchefa], 100 mg/L vankomisin [Calbiochem], dan 50 mg/L

14

higromisin [Higromisin B, Roche]. Inkubasi dalam media pengakaran dilakukan

selama dua minggu atau sampai dengan terbentuk akar. Planlet yang bertahan

hidup kemudian diaklimatisasi.

Efisiensi transformasi ditentukan berdasarkan perbandingan jumlah

tanaman transgenik yang dihasilkan terhadap jumlah eksplan awal.

e. Aklimatisasi

Planlet-planlet dibersihkan dari agar dengan air mengalir sebelum

diaklimatisasi. Aklimatisasi dilakukan secara bertahap dengan menanam planlet

selama satu minggu dalam tabung reaksi berdiameter 1.5 cm dan tinggi 15 cm

yang berisi 5 mL air dan selama dua minggu dalam bak plastik ukuran 44 cm x 34

cm x 15 cm yang berisi tanah sawah. Planlet yang berhasil bertahan hidup dalam

periode aklimatisasi selanjutnya dipindahkan ke dalam pot plastik dengan volume

10 L yang berisi tanah sawah.

2. Transformasi genetik secara in planta

Transformasi genetik secara in planta menggunakan bahan tanam berupa

skutelum dengan mengikuti prosedur Supartana et al. (2005). Transformasi

genetik secara in planta dilakukan secara bertahap melalui: a) kultur bakteri

Agrobcaterium tumefaciens, b) perkecambahan benih padi untuk transformasi, c)

inokulasi bakteri pada meristem apikal embrionik, d) pemeliharaan benih

berkecambah setelah inokulasi.

a. Kultur bakteri Agrobacterium tumefaciens

Bakteri A. tumefaciens dikulturkan pada media LB cair yang mengandung

antibiotik 100 mg/L kanamisin [Sigma] dan 75 mg/L karbenisilin [Sigma] dengan

digoyang pada kecepatan 200 rpm [Labline Shaker Orbit] pada suhu 28 oC selama

48 jam. Kultur bakteri kemudian dipanen dengan cara mengambil 1 mL suspensi

bakteri dan dimasukkan ke dalam tabung mikro [Axygen] 1.5 mL kemudian

disentrifus pada 5000 rpm [Himac CF 15R, suhu 4 oC] selama 1 menit. Endapan

bakteri kemudian diresuspensi dengan 1 mL air steril dan ditambahkan 100 M

asetosiringon [Sigma]. Kerapatan suspensi bakteri yang digunakan adalah 0.3

pada panjang gelombang 600 nm. Kultur bakteri siap diinokulasikan ke benih

padi.

15

b. Perkecambahan benih padi untuk transformasi

Benih-benih padi dikuliti dan disterilisasi dengan 100 mL ethanol [Merck]

70% selama 1 menit dan 0.78% sodium hipoklorit [Bayclin] yang telah ditetesi

tween 20 (1 tetes per 50 mL) selama 15 menit kemudian dibilas dengan air steril 2

kali. Setelah steril, benih-benih padi kemudian direndam dalam air steril selama 2

hari pada suhu 20 oC. Selama perendaman, air diganti satu kali. Setelah 2 hari

perendaman, daerah sekitar embrio akan berwarna putih. Pada tahap ini, baik

bakal tunas atau akar tidak terlihat.

c. Inokulasi bakteri pada meristem apikal embrionik

Untuk menginokulasi bakteri pada meristem apikal embrionik dari benih-

benih yang telah direndam maka bagian embrio yang nanti akan muncul sebagai

tunas ditusuk-tusuk dengan ujung jarum steril [General Care] yang sebelumnya

telah dicelupkan pada suspensi bakteri. Benih-benih yang telah diinokulasi

kemudian ditempatkan pada petridis [Pyrex] yang telah diberi kertas saring

[Advantec Tayo] basah dan diinkubasi pada ruang gelap selama 2-3 hari.

d. Pemeliharaan benih berkecambah setelah inokulasi

Benih yang telah berkecambah dipindahkan ke botol kultur yang

mengandung media MS + 300 mg/L cefotaksim [Duchefa] ditambah agen

seleksi higromisin [Higromisin B, Roche] dengan konsentrasi 0 mg/L, 10 mg/L,

20 mg/L, 30 mg/L, dan 40 mg/L. Setelah berumur 7-9 hari, kecambah

diaklimatisasi ke media air selama 2 hari dan selanjutnya dipindah ke pot yang

mengandung media campuran tanah dan pupuk kandang. Tanaman T0 dipelihara

sampai dewasa dan menghasilkan benih. Selama pemeliharaan, tanaman

transforman secara in planta dianalisis PCR untuk mendeteksi integrasi dari gen.

Efisiensi transformasi dihitung berdasarkan perbandingan jumlah tanaman

transgenik terhadap jumlah eksplan.

Analisis Amplifikasi Transgen pada Transforman

Isolasi DNA Genom Tanaman. Isolasi DNA genom tanaman dilakukan

mengikuti metode Doyle dan Doyle (1991) yang dimodifikasi. Daun padi

sebanyak lebih kurang 0.5 gram digerus dengan bantuan nitrogen cair. Setelah itu

serbuk dimasukkan ke dalam tabung mikro [Axygen] 2 mL kemudian ditambahi

16

1000 l bufer ekstraksi CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide). Campuran

diinkubasi di dalam penangas air [Stuart Scientific] pada suhu 65 o

C selama 15

menit. Selama inkubasi campuran dibolak-balik setiap 5 menit sekali agar

homogen. Campuran ditambah dengan 100 L Na-asetat dan 900 L kloroform

isoamilalkohol (24:1) [Merck] ke dalam tabung mikro [Axygen], kemudian

dikocok hingga merata. Suspensi selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12

000 rpm (Himac CF 15R, suhu 4 oC) selama 5 menit. Lapisan paling atas

dipindah ke tabung mikro [Axygen] baru sebanyak 350 L kemudian

ditambahkan 35 L Na-Asetat dan 256.6 L isopropanol [Merck] (2/3 volume

supertanatan) dicampur perlahan. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12 000

rpm [Himac CF 15R, suhu 4 oC] selama 5 menit. Supernatan dibuang. Endapan

yang diperoleh ditambah dengan 200 L etanol [Merck] 70%. Campuran

disentrifugasi kembali selama 5 menit pada kecepatan 12 000 rpm [Himac CF

15R, suhu 4 oC]. Endapan selanjutnya dikeringkan di dalam oven [Heraeus]

selama 10 menit. Endapan yang telah kering dilarutkan dalam larutan TE (Tris

base-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) yang mengandung RNase [Invitrogen]

sebanyak 50 L dan diinkubasi [VWR Scientific] pada suhu 37 C selama 30

menit.

Analisis PCR. Reaksi PCR [DNA Engine Tetrad 2] mempunyai total

volume 20 L menggunakan PCR kit FastStart [Roche Diagnostics GmBh]

dengan konsentrasi akhir dari masing-masing komponen adalah sebagai berikut:

1x buffer PCR (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8.3), 1.5 mM MgCl2 , 0.2

mM dNTP mix, 1 unit Taq DNA polymerase, 0.5 M masing-masing primer hpt-F

dan hpt-R [FirstBase] dan 50 ng DNA cetakan.

Program amplifikasi PCR [DNA Engine Tetrad 2] adalah: denaturasi awal

pada suhu 94 C selama 5 menit sebanyak 1 siklus, dilanjutkan dengan 30 siklus

yang terdiri atas: denaturasi pada suhu 94 C selama 30 detik, penempelan primer

pada suhu 60 C selama 30 detik, pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 1

menit. Pemanjangan primer terakhir selama 5 menit pada suhu 72 oC.

Elektroforesis. Elektroforesis hasil PCR dilakukan pada 1% gel agarose

[Sigma]. Volume DNA hasil PCR yang dimasukkan ke dalam sumur gel agarose

sebanyak 10 L ditambah dengan 2 L loading dye. Gel elektroforesis dijalankan

17

pada 80 volt selama 35 menit [Biorad]. Gel direndam dengan Ethidium Bromida

[Merck] (0.5 mg/L) selama 5 menit kemudian direndam di air selama 5 menit.

Pita-pita DNA hasil elektroforesis divisualisasi dengan perangkat Chemidoc gel

system [Biorad].

Analisis Pewarisan Gen hpt pada Tanaman Transgenik

Tanaman T0 ditumbuhkan di rumah kaca dan dibiarkan melakukan

penyerbukan sendiri dengan menutup seluruh bunganya untuk menghindari

penyerbukan silang. Biji dari tanaman T0 disterilisasi dengan perendaman 1 menit

di dalam ethanol [Merck] 70% dan 15 menit di dalam 0.78% sodium hipoklorit

[Bayclin] yang mengandung 1 tetes tween 20 untuk setiap 50 mL, kemudian

dibilas 5 kali dengan air steril. Setelah dikeringkan di atas kertas saring [Advantec

Toyo], biji ditanam di media MS0 padat yang mengandung 40 mg/L dan 50 mg/L

higromisin [Higromisin B, Roche]. Tanaman atau kecambah yang tumbuh diamati

pada 14 hari setelah tanam. Kecambah dikelompokkan menjadi dua yaitu

kecambah yang resisten terhadap higromisin dapat hidup di media seleksi dan

kecambah yang sensitif terhadap higromisin tidak dapat hidup.

18

19

HASIL DAN PEMBAHASAN

Transformasi Genetik secara In vitro

Transformasi genetik padi dengan vektor Agrobacterium tumefaciens

secara in vitro telah dilakukan pada tanaman padi varietas Ciherang, Nipponbare,

Kasalath. Embrio muda yang diinfeksi dengan A. tumefaciens membentuk kalus

dan tunas (berkecambah) dalam waktu 7 hari setelah ditanam pada media ko-

kultivasi (Gambar 3). Untuk menginduksi terbentuknya kalus, dilakukan

pemotongan tunas dari embrio yang berkecambah. Di dalam media induksi kalus,

embrio muda dari semua varietas padi dapat menghasilkan kalus. Namun tidak

semua kalus yang terbentuk ini dapat tumbuh pada media perbanyakan kalus yang

mengandung 50 mg/L higromisin.

Gambar 3 Embrio muda setelah diinfeksi Agrobacterium tumefaciens dalam

media ko-kultivasi.

Sebagian kalus dari varietas Ciherang dan Nipponbare dapat tumbuh di

media perbanyakan kalus yang mengandung agen seleksi antibiotik higromisin.

Namun, kalus yang lain khususnya dari varietas Kasalath mengalami kematian

(Tabel 3).

Tabel 3 Jumlah eksplan yang membentuk kalus dan beregenerasi dari embrio

muda dari varietas padi Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath yang

diinfeksi oleh A. tumefaciens

Varietas

Jumlah

embrio

muda

Kalus

yang

terbentuk

Kalus tahan

higromisin

Kalus

beregenerasi

Jumlah

planlet

Jumlah

tanaman

transgenik

Efisiensi

transformasi

Ciherang 180 70 20 (11.11) 0 0 0 0

Nipponbare 192 110 33 (17.18) 11 7 3 (1.56)

Kasalath 159 68 0 0 0 0 0

Keterangan: angka dalam kurung menunjukkan persentase

20

Agen seleksi higromisin dalam konsentrasi tertentu mampu menekan

pertumbuhan kalus padi nontransgenik. Antibiotik higromisin bekerja dengan cara

menghambat sintesis protein melalui gangguan translokasi yang menyebabkan

kesalahan translokasi pada ribosom 80s (Bashir et al. 2004). Kalus yang tahan

akan tumbuh normal dan mampu berproliferasi pada media yang mengandung

agen seleksi. Kalus yang dapat berproliferasi berwarna putih kekuningan,

sedangkan kalus yang tidak tahan pada media seleksi berwarna cokelat kehitaman

yang akhirnya mengalami kematian (Gambar 4).

Gambar 4 Kalus yang ditumbuhkan pada media yang mengandung 50 mg/L

higromisin. (a) kalus yang tahan, (b) kalus yang tidak tahan.

Padi Nipponbare menghasilkan persentase kalus yang tahan higromisin

paling tinggi (17.18%) dibandingkan dengan Ciherang (11.11%) dan Kasalath

(0%) (Tabel 3). Kalus-kalus yang tahan tersebut kemudian dipindahkan ke dalam

media regenerasi. Pada media regenerasi, kalus membentuk embrio somatik yang

berbentuk struktur globular. Regenerasi dimulai dengan terbentuknya bintik-bintik

hijau pada kalus (Gambar 5). Tidak semua kalus mampu membentuk bintik hijau.

Bintik hijau tersebut kemudian tumbuh menjadi tunas walaupun tidak semua

bintik hijau tumbuh menjadi tunas.

Gambar 5 Regenerasi tunas dari kalus. (a) embrio somatik, (b) tunas hasil

regenerasi dari embrio somatik.

(a) (b)

(a) (b)

21

Tunas yang tumbuh dan berkembang dengan baik mampu membentuk

akar pada media perakaran (Gambar 6). Tunas yang berakar telah berhasil

diaklimatisasi. Aklimatisasi dilakukan secara bertahap yaitu dengan menanam

tunas berakar pada media air selama 7 hari, kemudian dipindahkan ke media tanah

di tempat teduh selama 2 minggu dan kemudian dipindahkan ke rumah kaca.

Aklimatisasi dilakukan secara bertahap agar tanaman beradaptasi dengan

lingkungannya.

Gambar 6 Tunas padi berakar.

Transformasi genetik dengan menggunakan vektor Agrobacterium pada

padi japonika seperti Nipponbare sudah banyak dilaporkan dan memiliki efisiensi

transformasi yang tinggi. Akan tetapi informasi keberhasilan transformasi pada

padi indica seperti Ciherang dan Kasalath masih sangat terbatas. Padi indica sulit

ditransformasi karena regenerasi dari sel atau jaringan sangat sulit (Maftuchah

2003; Saharan et al. 2004; Lin & Zhang 2005; Purnamaningsih 2006;

Mulyaningsih et al. 2010).

Ge et al. (2006) menyatakan bahwa pembentukan kalus dan regenerasi

jaringan padi sangat tergantung pada beberapa faktor seperti genotipe tanaman,

tipe dan status fisiologi eksplan, komposisi dan konsentrasi garam, komponen

organik dan hormon pertumbuhan dalam media. Hormon pertumbuhan memegang

peranan penting pada tanaman monokotil termasuk serealia dalam kultur in vitro.

Konsentrasi hormon pertumbuhan pada media regenerasi sangat mempengaruhi

perkembangan kalus berdeferensiasi lanjut menjadi tunas (Mok et al. 1987; Cate

et al. 1988; Bhaskaran & Smith 1990).

Hasil penelitian ini mendukung penelitian yang sudah ada, bahwa

transformasi genetik pada padi subspesies indica masih mengalami hambatan.

22

Dari tiga varietas yang diko-kultivasi dengan A. tumefaciens tidak satupun kalus

dari padi indica yang beregenerasi membentuk tunas, walaupun varietas Ciherang

menghasilkan jumlah kalus yang tahan higromisin sebesar 11.11% (Tabel 3).

Hanya kalus dari padi japonica (Nipponbare) yang menghasilkan tunas transgenik

putatif. Dari 11 tunas transgenik putatif yang berhasil diregenerasi, hanya 7 tunas

yang mampu membentuk tanaman transgenik putatif.

Analisis PCR terhadap 7 tanaman transgenik putatif menunjukkan bahwa

3 tanaman adalah transgenik yang mengandung gen hpt, sedangkan 4 tanaman

lainnya tidak mengandung transgen hpt (Gambar 7). Hasil PCR dengan primer

gen hpt diketahui adanya tanaman transgenik putatif yang tidak membawa gen

hpt. Hal ini kemungkinan terjadi kalus escape, dimana kalus lolos pada media

yang mengandung agen seleksi higromisin 50 mg/L tetapi tidak membawa gen

hpt. Lolosnya tanaman nontransgenik di media seleksi ini kemungkinan diduga

akibat terjadinya degradasi antibiotik higromisin dalam media seleksi yang

dipergunakan, dan tanaman terhindar dari agen seleksi karena tidak semua bagian

kalus terbenam di dalam media. Berdasarkan tanaman transgenik yang membawa

gen hpt, efisiensi transformasi genetik pada padi varietas Nipponbare adalah

1.56%.

Gambar 7 Analisis integrasi gen hpt di dalam tanaman transgenik putatif dengan

PCR. Lajur M = Penanda DNA Ladder 1 kb plus (Invitrogen), lajur 1-

7 = DNA tanaman putatif transgenik, lajur 8 = air, lajur 9: DNA

tanaman nontransgenik, dan lajur P = plasmid rekombinan pCAMBIA-

Osdep1.

Untuk mengidentifikasi tanaman transgenik pada tingkat awal, pada

penelitian ini digunakan primer dari gen hpt untuk analisis PCR-nya. Primer yang

digunakan untuk mengamplifikasi hpt bersifat spesifik karena primer tersebut

500 bp 650 bp

500 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 P

1000 bp

100 bp

23

tidak dapat mengamplifikasi DNA dari tanaman nontransgenik dan secara

indigenus tidak mempunyai homologi pada tanaman padi (Gambar 7). Primer

yang dapat mengamplifikasi gen hpt banyak digunakan untuk mengidentifikasi

tanaman transgenik (Zaidi et al. 2006; Rao & Rao 2007; Mulyaningsih et al.

2010; Aryani 2011).

Deteksi integrasi gen hpt di dalam genom adalah tahap awal dalam

menyeleksi tanaman transgenik. Gen hpt dan gen Osdep1 berada pada daerah T-

DNA dalam plasmid pCambia1301-Osdep1. Keberadaan gen hpt dapat

merupakan indikasi keberadaan gen lain dalam satu T-DNA yang sama. Dengan

demikian jika hasil PCR menunjukkan keberadaan gen hpt dalam genom maka

gen sasaran Osdep1 juga telah terintegrasi dalam genom.

Untuk mengetahui pengaruh gen Osdep1 terhadap produksi biji maka

tanaman transgenik harus mengandung transgen Osdep1. Untuk itu primer harus

didesain berdasarkan urutan DNA pada promoter sebagai forward primer dan

daerah penyandi Osdep1 sebagai reverse primer. Pasangan primer dengan

promoter dan daerah penyandi Osdep1 hanya mengamplifikasi DNA tanaman

transgenik tetapi tidak DNA tanaman nontransgenik. Karena transgen Osdep1

difusikan dengan gen hpt, maka tanaman transgenik yang mengandung gen hpt

diharapkan juga mengandung transgen Osdep1. Walaupun demikian, keberadaan

transgen Osdep1 harus dideteksi pada tanaman transgenik.

Transformasi secara in vitro menggunakan eksplan embrio muda memiliki

keunggulan. Keunggulan tersebut adalah transgen terintegrasi ke dalam genom

tanaman. Apabila transgen telah terintegrasi pada genom tanaman maka transgen

tersebut akan stabil diwariskan ke generasi berikutnya. Hiei dan Komari (1996)

melaporkan bahwa transgen stabil diwariskan sampai generasi ke-4. Bahkan Wu

et al. (2002) melaporkan bahwa transgen stabil diwariskan hingga generasi ke-6.

24

Transformasi Genetik secara In planta

Transformasi genetik secara in planta pada 100 eksplan yang berupa

embrio dari biji padi untuk setiap varietas menghasilkan 2 tanaman transgenik

pada varietas Ciherang dan 3 tanaman transgenik pada varietas Kasalath, dan

tidak satupun tanaman transgenik dihasilkan dari varietas Nipponbare. Analisis

tanaman transgenik ini didasarkan pada PCR menggunakan primer yang spesifik

untuk gen hpt. Amplifikasi DNA tanaman transgenik dengan primer tersebut

menghasilkan amplifikasi sebesar 500 pb, seperti tanaman transgenik varietas

Ciherang (Gambar 8).

Gambar 8 Analisis PCR menggunakan primer spesifik gen hpt terhadap tanaman

padi varietas Ciherang hasil transformasi in planta. Lajur 1-7 = DNA

tanaman Ciherang pada media MS, lajur 8 = DNA tanaman

Ciherang pada media MS+Higromisin 40 mg/L, lajur 9-10 = DNA

Ciherang pada media MS+Higromisin 30 mg/L, lajur 11 = air, lajur

12 = DNA tanaman Ciherang nontransgenik, lajur P = plasmid

rekombinan pCAMBIA-Osdep1, dan lajur M = penanda DNA Ladder

1 kb plus (Invitrogen).

Tanaman transgenik terbanyak dihasilkan dari eksplan yang ditanam di

media tanpa higromisin yaitu 1 tanaman transgenik varietas Ciherang dan 3

tanaman transgenik varietas Kasalath. Eksplan yang ditanam di media yang

mengandung 10 mg/L, 20 mg/L, 30 mg/L higromisin tidak menghasilkan tanaman

transgenik untuk ketiga varietas, sedangkan yang ditanam pada 40 mg/L

higromisin menghasilkan 1 tanaman transgenik varietas Ciherang (Tabel 4).

500 bp 650 bp 1000 bp

100 bp

3 4 2 5 7 8 6 9 10 11 P 1 12 M

25

Tabel 4 Hasil transformasi secara in planta pada varietas Ciherang (C),

Nipponbare (N), dan Kasalath (K)

Media

higromisin 50

mg/L

benih yang ditransformasi

benih yang tumbuh media

seleksi

tanaman yang diaklimatisasi

transgenik positif PCR

C N K C N K C N K

0 20 19 19 20 19 19 18 1 - 3

10 20 15 18 20 13 18 19 - - -

20 20 8 20 11 4 19 10 - - -

30 20 5 13 9 2 7 6 - - -

40 20 5 2 6 1 - 2 1 - -

Total 100 52 72 66 39 63 55 2 - 3

Gen hpt menyandikan enzim hygromicin phosphotranfserase yang

digunakan sebagai penanda untuk mengetahui terintegrasinya T-DNA

Agrobacterium ke dalam genom tanaman, sehingga hanya tanaman transgenik

saja yang dapat hidup di media tumbuh yang mengandung antibiotik higromisin

(Christou et al. 1991). Seleksi yang dilakukan terlalu dini terhadap kalus yang

terbentuk menyebabkan terhambatnya regenerasi. Hasil ini menunjukkan bahwa

higromisin menghambat regenerasi tanaman transgenik.

Efisiensi transformasi menggunakan metode in planta dalam media seleksi

higromisin 40 mg/L adalah 2%, 0% dan 3% masing-masing untuk varietas

Ciherang, Nipponbare dan Kasalath (Tabel 5). Transformasi secara in planta

memiliki kesamaan dengan infeksi oleh A. tumefaciens pada tanaman di alam

(Kojima et al. 2000; Supartana et al. 2005).

Tabel 5 Jumlah tanaman positif PCR dan efisiensi transformasi secara in planta

padi Ciherang, Nipponbare, dan Kasalath

Transformasi secara in planta telah menghasilkan sejumlah transforman

yang membawa gen penyeleksi hpt dan tanaman transgenik tersebut merupakan

tanaman generasi pertama (T0). Untuk varietas Kasalath, transformasi in planta

menghasilkan 3 galur tanaman yaitu galur no. 2 (Kasalath-Osdep1-2), galur no. 4

(Kasalath-Osdep1-4) dan galur no. 8 (Kasalath-Osdep1-8). Sementara, untuk

varietas Ciherang, dua galur transgenik telah diperoleh melalui transformasi in

Varietas benih awal

transformasi

transforman positif

PCR

Efisiensi transformasi

(%)

Ciherang 100 2 2

Nipponbare 100 - -

Kasalath 100 3 3

26

planta ini yaitu galur no. 1 (Ciherang-Osdep1-1) dan galur no. 2 (Ciherang-

Osdep1-2). Salah satu kelemahan teknik transformasi secara in planta adalah

terbentuknya tanaman khimera (Supartana et al. 2005). Oleh karena itu, untuk

membuktikan bahwa tanaman-tanaman transgenik yang diperoleh melalui

transformasi secara in planta adalah tanaman transgenik yang tidak khimera maka

dilakukan analisis pewarisan transgen.

Analisis pewarisan transgen dilakukan pada galur padi transgenik generasi

T1 Kasalath-Osdep1-4 dan Kasalath-Osdep1-8. Alasan digunakan dua galur ini

adalah karena galur tersebut menghasilkan cukup banyak benih T1 sehingga

memudahkan di dalam melakukan analisis pewarisan. Benih-benih T1 dari kedua

galur tersebut ditumbuhkan pada media MS (Murashige-Skoog) yang

mengandung higromisin 40 mg/L. Konsentrasi ini merupakan konsentrasi yang

digunakan untuk penapisan awal pada transformasi secara in planta. Hasil uji

resistensi kecambah padi varietas Kasalath nontransgenik dan populasi turunan

dari Kasalath-Osdep1 terhadap higromisin disajikan pada tabel 6.

Tabel 6 Uji toleransi kecambah padi varietas Kasalath nontransgenik dan

Kasalath-Osdep1 generasi T1 di media seleksi yang mengandung

higromisin 40 mg/L

Benih benih

awal

tanaman tahan

(tumbuh normal)

tanaman sensitif

(bleaching, kerdil, mati)

benih tidak

tumbuh

Kasalath NT*) 20 - 20 (4 kerdil) -

Kasalath NT**) 20 20 - -

Kasalath-Osdep1-4 109 41 68 -

Kasalath-Osdep1-8 109 35 68 6

Keterangan: *) Tanaman padi Kasalath kontrol (non transgenik yang ditumbuhkan pada media MS

yang mengandung higromisin 40 mg/L)

**) Tanaman padi Kasalath kontrol (non transgenik yang ditumbuhkan pada media

MS yang tidak mengandung higromisin)

Uji resistensi terhadap higromisin tidak efektif karena 4 dari 20 tanaman

nontransgenik dapat tumbuh pada media yang mengandung 40 mg/L higromisin

meskipun tanamannya kerdil dan daunnya menjadi kuning. Kemungkinan hal ini

disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain adalah kurang lamanya waktu

pemaparan pada media seleksi higromisin 40 mg/L atau kurang tingginya

konsentrasi higromisin yang digunakan di dalam media. Untuk itu, tanaman padi

27

varietas Kasalath nontransgenik diuji di media yang mengandung higromisin 50

mg/L.

Semua tanaman Kasalath nontransgenik mati pada media seleksi

higromisin 50 mg/L (Tabel 7). Oleh karena itu, uji toleransi tanaman varietas

Kasalath keturunan dari tanaman Kasalath transgenik (generasi T1) dilakukan di

media yang mengandung 50 mg/L higromisin.

Tabel 7 Uji resistensi varietas Kasalath nontransgenik terhadap antibiotik

higromisin pada media yang mengandung 50 mg/L higromisin

Benih

awal benih

benih resisten

(tumbuh normal)

benih sensitif

(bleaching, kerdil,

mati)

benih tidak

tumbuh

MSH0 MSH50 MSH0 MSH50 MSH0 MSH50 MSH0 MSH50

Kasalath 13 20 13 - - 15 - 5

Hasil uji resistensi terhadap higromisin pada populasi terhadap T1 dari

Kasalath-Osdep1 pada media MS yang mengadung higromisin 50 mg/L

menunjukkan bahwa hanya 9 tanaman T1 dari Kasalath-Osdep1-4 dan 1 tanaman

T1 dari Kasalath-Osdep1-8 yang resisten terhadap higromisin (Tabel 8).

Berdasarkan perbandingan tanaman yang resisten dan sensitif terhadap

higromisin, pewarisan gen hpt pada tanaman T1 tidak mengikuti hukum Mendel.

Tabel 8 Hasil skrining galur-galur tanaman transgenik Kasalath-Osdep1 pada

media mengandung 50 mg/L higromisin

Benih benih

awal

benih resisten

(tumbuh normal)

benih sensitif

(bleaching, kerdil,

mati)

benih tidak

tumbuh

Kasalath-Osdep1-4 100 9 86 5

Kasalath-Osdep1-8 100 1 95 4

Diperolehnya tanaman-tanaman generasi T1 yang resisten terhadap

higromisin merupakan bukti bahwa transgen hpt telah terintegrasi pada genom

sel-sel meristem apikal (biasanya belum terdiferensiasi) yang berkembang

menjadi sel-sel reproduksi yang selanjutnya diwariskan pada generasi berikutnya.

Apabila transgen terintegrasi pada sel-sel yang telah terdiferensiasi maka hanya

bagian tunas atau akar saja yang tertransformasi sehingga hanya sebagian organ

saja yang transgenik (khimera) dan transgen tidak diwariskan kepada generasi

berikutnya. Seperti pada transformasi secara in vitro yang menggunakan eksplan

28

embrio muda, transformasi secara in planta menggunakan eksplan skutelum

dilakukan dengan vektor ekspresi yang sama sehingga tanaman transgenik yang

mengandung hpt diharapkan juga mengandung gen Odep1.

29

SIMPULAN

Gen hpt telah berhasil masuk ke dalam genom tanaman padi Nipponbare

dengan metode in vitro menggunakan eksplan embrio muda. Selain transformasi

secara in vitro, gen hpt telah berhasil masuk ke dalam genom padi varietas

Kasalath melalui metode in planta walaupun dengan efisiensi yang rendah.

Transgen hpt di dalam tanaman padi Kasalath transgenik telah diwariskan kepada

generasi berikutnya walaupun tidak mengikuti hukum mendel.

SARAN

Analisis integrasi Osdep1 baik pada tanaman T0 maupun T1 perlu

dilakukan untuk memastikan bahwa tanaman-tanaman tersebut telah membawa

transgen.

30

31

DAFTAR PUSTAKA

Aryani AT. 2011. Transformasi gen Osdep1-Tc (Oryza sativa dense and erect

panicle1-Truncated) ke kalus padi cv. Taipei 309 menggunakan

Agrobacterium tumefaciens [skripsi]. Depok: Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia.

Ashikari et al. 2005. Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science

309:741-745.

Bashir K, Rafiq M, Fatima T, Husnain T, Riazuddin S. 2004. Hygromicin based

selection of transformants in a local inbred line of Zea mays (L). Pakistan

J Biol Sci 7:318-323.

Bhaskaran S, Smith RH. 1990. Regeneration in cereal tissue culture a review.

Crop Sci 30:1328-1336.

[BPS] Badan Pusat Statistik. 2012. Luas Panen, Produktivitas, Produksi Tanaman

Padi Provinsi Indonesia. http://www.bps.go.id/tnmn_pgn.php?eng=0. [15

Maret 2012].

Cate HT, Ennik E, Roest S, Ramulu KS, Dijkhuis P. 1988. Effect of in vitro

differentiation of genetic stability in potato. Theor Appl Genet 75:452-459.

Christou P, Ford TL, Kofron M. 1991. Production of transgenic rice (Oryza sativa

L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via

electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature

zygotic embryos. Biotechnology 9:957-966.

Doyle JJ, Doyle JL. 1991. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13-

15.

Fitranty N, Nurilmala F, Santoso D, Minarsih H. 2003. Efektivitas Agrobacterium

mentransfer gen P5CS ke dalam kalus tebu klon PS 851. Menara

Perkebunan 71:16-27.

Ge X, Chu Z, Lin Y, Wang S. 2006. A tissue culture system for different

germplasms of indica rice. Plant cell Rep 25:392-402. Greco et al. 2003. Transpositional behavior of an Ac/Ds system for reverse

genetics in rice. Theoritical and Applied Genetics 108:10-24.

Guo Y, Hong D. 2010. Novel pleiotropic loci controlling panicle architecture

across environments in japonica rice (Oryza sativa L.). Science Direct

37:533-544.

Hattori I, Siwi SS. 1986. Rice stemboreres in Indonesia. JARQ 20:25-30.

32

Hiei Y, Komari T. 1996. Stable inheritance of transgenes in rice plants

transformed by Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the Third Rice

Genetic Symposium 16-20 October 1996. Manila Philippines. p. 131-142.

Hiei Y, Komari T. 2006. Improved protocols for transformation of indica rice

mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Tissue and Organ

Culture 85:271-283.

Hiei Y, Komari T. 2008. Agrobacterium-mediated transformation of rice using

immature embryos or calli induced from mature seed. Nature 3:824-834.

Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice

(Oryza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of

boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6:271-282.

Huang et al. 2009. Natural variation at the DEP1 locus enhances grain yield in

rice. Nature Genetic 41:494-497.

Kojima et al. 2000. Note development of a simple and efficient method for

transformation of Buckwheat plant (Fagopyrum esculentum) using

Agrobacterium tumefaciens. Agrosci Biotechnol Biochem 64:845-847.

Kolesnik et al. 2004. Establishing an efficient Ac/Ds tagging system in rice: large

scale analysis of Ds flanking sequences. The Plant Journal 37:301-314.

Lee et al. 2010. Genotypic variation of Agrobacterium-mediated transformation of

Italian ryegrass. Electronic Journal of Biotechnol 13:1-10.

Lin YJ, Zhang Q. 2005. Optimising the tissue culture conditions for high

efficiency transformation of indica rice. Plant Cell Rep 23:540-547.

Maftuchah. 2003. Transformasi genetik padi indika dengan gen cryIA(b) dan

cryIB menggunakan Agrobacterium tumefaciens untuk ketahanan terhadap

hama penggerek batang kuning (Scirpophaga incertulas walker.).

[disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Mok MC, Mok DWS, Tuner JE, Mujer CV. 1987. Biological and biochemical

effects of cytokinin-active phenylurea derivative in tissue culture systems.

HortScience 22:1194-1197.

Mulyaningsih ES, Aswidinnoor H, Sopandie D, Ouwerkerk PBF, Slamet Loedin

IH. 2010. Transformasi padi indika kultivar Batutegi dan Kasalath dengan

gen regulator HD-Zip untuk perakitan varietas toleran kekeringan. J Agron

Indonesia 38:1-7.

Mulyaningsih ES. 2011. Pengembangan padi gogo indica toleran kekeringan

melalui transformasi genetik gen regulator HD-ZIP OSHOX6 dan seleksi

33

populasi padi mengandung marka genetik QTL12.1. [disertasi]. Bogor:

Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Nasir M. 2001. Pengantar Pemuliaan Tanaman. Departemen Pendidikan

Nasional. Jakarta. hal:283-287.

Pambudi A. 2009. Teknik Transformasi genetik beberapa tanaman menggunakan

Agrobacterium tumefaciens. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Piao et al. 2009. Map-based cloning of the ERECT PANICLE3 gene in rice.

Theory Application Genetic 119:1497-1506.

Purnamaningsih R. 2006. Induksi kalus dan optimasi regenerasi empat varietas

padi melalui kultur in vitro. AgroBiogen 2:74-80.

Rahmawati S. 2006. Status perkembangan perbaikan sifat genetik padi

menggunakan transformasi Agrobacterium. J AgroBiogen 2:36-44.

Ramesh M, Gupta AK, Murugiah V. 2009. Efficient in vitro plant regeneration

via leaf base segment of indica rice (Oryza sativa L.). Indian J Exp Bio

47:68-74.

Rao MVR, Rao GJN. 2007. Agrobacterium-mediated transformation of indica

rice under acetosyringone-free conditions. Plant Biotechnology 24:507-

511.

Remelia M. 2008. Analisis insersi T-DNA pembawa transposon Ac/Ds pada T0

dan aktivitas Ds pada T1 tanaman padi (Oryza sativa L.) kultivar

Nipponbare [skripsi]. Depok: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Indonesia.

Saharan V, Yadav RC, Yadav NR, Ram K. 2004. Studies on improved

Agrobacterium-mediated transformation in two indica rice (Oryza sativa

L.). African J Biotechnol 3:572-575.

Santoso TJ, Sudarsono, Aswidinnoor H, Somantri IH. 2005. Catatan penelitian

daya regenerasi padi indika cv. Bengawan Solo dalam dua tipe media

regenerasi dengan penembakan mikroproyektil. Hayati 12:157-161.

Santoso TJ, Sustiprijatno, Setiawan D, Apriana A, Sisharmini A. 2010. Kloning

gen depI untuk produktivitas dengan kontribusi >15% peningkatan hasil

melalui teknik over-ekspresi dan informasi sekuen genom pada Padi.

Laporan Akhir Program Riset Insentif Peningkatan Kapasitas Penelitian

dan Perekayasa Tahun 2010. Bogor.

34

Setiamihardja R, Herawati T. 2000. Pemuliaan Tanaman Lanjutan. Program

Pengembangan Kemampuan Peneliti Tingkat S1 Non Pemuliaan Dalam

Ilmu Dan Teknologi Pemuliaan. Universitas Padjadjaran. Bandung.

Slamet Loedin IHS. 1994. Transformasi genetik pada tanaman: beberapa teknik

dan aspek penting. Hayati 1:66-67.

Smith CW, Dilday RH. 2002. Rice: origin, history, technology and production.

Willey & Sons Inc. New Jersey. 627 hlm.

Smith RH, Hood EE. 1995. Review and interpretation, Agrobacterium

tumefaciens transformation of monocotyledons. Crop Sci 35:301-309.

Supartana et al. 2005. Development of simple and efficient in planta

transformation method for rice (Oryza sativa L.) using Agrobacterium

tumefaciens. J Biosci Bioeng 100:391-397.

Toki et al. 2006. Early infection of scutellum tissue with agrobacterium allows

high-speed transformation of rice. Plant J 47:969-976.

Utomo SD. 2005. Pengaruh L-Sistein terhadap Efisiensi Transformasi Genetik

jagung (Zea mays) menggunakan Agrobacterium. Bul Agron 33:7-16.

Wagiran A, Ismanizan I, Che Radziah CMZ, Ruslan A. 2010. Agrobacterium

tumefaciens-mediated transformation of the isopentenyltransferase gene in

japonica rice suspension cell culture. Australian J of Crop Scie 4:421-429.

Wu et al. 2002. Inheritanced and expression of the cryIAb gene in Bt (Bacillus

thuringiensis) transgenic rice. Theor Appl Genet 104:727-734.

Wulandari I. 2005. Studi beberapa metode transformasi genetik tanaman tebu

(Saccharum officinarum L.) dengan gen fitase melalui perantara

Agrobacterium tumefaciens GV 2260. [tesis]. Bogor. Sekolah

Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Yoshida S. 1981. Foundamentals of Rice Crop Science. The International Rice

Research Institute. Los Banos Philippines. 277 hlm.

Zaidi MA et al. 2006. Optimizing tissue culture media for efcient transformation of different indica rice genotypes. Agronomy Res 4:563-

575.

Zhu et al. 2009. Erect Panicle2 encodes a novel protein that regulates panicle

erectness in indica rice. Genetics Scociety of America 184:343-350.

35

LAMPIRAN

36

37

Lampiran 1 Stok dan komposisi media transformasi padi

Stok Komposisi Jumlah

N6 Makro 1 KNO3 141.5 g/l

N6 Makro 2 MgSO4.7H2O

(NH4)2SO4

18.5 g/l

46.3 g/l

N6 Makro 3 KH2PO4 40 g/l

N6 Makro 4 CaCl2.2H2O 16.6 g/l

B5 Mikro 1 FeSO4.7H2O

Na2EDTA.2H2O

2.78 g/l

3.73 g/l

B5 Mikro 2 MnSO4.4H2O

ZnSO4.7H2O

H3BO3

10 g/l

0.2 g/l

0.3 g/l

B5 Mikro 3 KI 0.075 g/l

B5 Mikro 4 CuSO4.5H2O

Na2MoO4.2H2O

CoCL2.6H2O

0.0025 g/l

0.025 mg/l

0.0025 mg/l

Vitamin B5 Thiamin HCl

Pyridoxine HCl

Nicotinic acid

Myo Inositol

200 mg/100 ml

20 mg/100 ml

20 mg/100 ml

2 g/100 ml

AA Macro salt CaCl2.2H2O

MgSO4.7H2O

NaH2PO4.2H2O

KCl

1.5 g/l

2.49 g/l

1,7g/l

29.5 g/l

AA Micro salt CoCl2.6H2O

CuSO4.5H2O

H3BO3

KI

MnSO4

Na2MoO4.2H2O

KCl

25 mg/l

25 mg/l

3 g/l

750 mg/l

8.9 g/l

250 mg/l

2 g/l

AA Iron FeSO4.7H2O 2.78 g/l

38

Na2EDTA.2H2O 3.73 g/l

Glisin 7.5 g/l (filter sterilized and

store at -20 oC)

MS1 KNO3

(NH4)2SO4

95 g/l

82.5 g/l

MS2 MgSO4.H2O

MnSO4.4H2O

ZnSO4.7H2O

CuSO4.5H2O

37 g/l

2.34 g/l

0.86 g/l

0.0025 g/l

MS3 CaCl2.2H2O

KI

CoCl2.6H2O

44 g/l

0.083 g/l

0.0025 g/l

MS4 KH2PO4

H3BO3

Na2MoO4.2H2O

17 g/l

0.62 g/l

0.025 g/l

Vitamin MS Nicotinic acid

Pyridoxine HCl

Thiamine HCl

Glycine

Myo-Inositol

10 mg/100 ml

10 mg/100 ml

2 mg/100 ml

40 mg/100 ml

20 000 mg/100 ml

39

Lampiran 2 Komposisi media A200 (1L)

Komposisi Jumlah

AA salt macro

AA salt micro

AA iron

L-glutamin

Asam aspartat

Arginin

Larutan Glisin

Vitamin B5

Casamino

Sukrosa

D-glucose monohydrate

Ukur pH 5,2

Asetosiringon

100 ml

1 ml

10 ml

876 mg

260 mg

174 mg

1 ml

1 ml

500 mg

20 g

10 g

100 M

(penambahan

sebelum dipakai)

40

Lampiran 3 Komposisi media A201, A202. A203

Komposisi A201 A202 A203

N6 makro 1 20 ml 20 ml 20 ml

N6 makro 2 10 ml 10 ml 10 ml

N6 makro 3 10 ml 10 ml 10 ml

N6 makro 4 10 ml 10 ml 10 ml

B5 minor 1 10 ml 10 ml 10 ml

B5 minor 2 10 ml 10 ml 10 ml

B5 minor 3 10 ml 10 ml 10 ml

B5 minor 4 10 ml 10 ml -

Vitamin B5 5 ml 5 ml 5 ml

Cassamino acid 500 mg 500 mg 500 mg

L-Proline 500 mg 500 mg 500 mg

Glutamine - 300 mg 300 mg

Manitol - 36 g 36 g

Maltosa - 20 g 20 g

Sukrosa 20 g - -

Glukosa 10 g - -

pH 5.2 5.8 5.8

Agarose type 1 5.5 g 5 g 5 g

Autoklaf

15, 121 oC.

dinginkan sampai 50 oC

15, 121 oC.

dinginkan sampai 50 oC

15, 121 oC.

dinginkan

sampai 50 oC

2,4D 2 mg/L 1 mg/L 1 mg/L

NAA 2 mg/L 1 mg/L 1 mg/L

BAP 1 mg/L 0.2 mg/L 0.2 mg/L

Asetosiringon 19.62 mg/1 mL

DMSO - -

Cefotaxim - 250 mg/L 250 mg/L

Vancomycin - 100 mg/L 100 mg/L

Higromisin - - 50 mg/L

41

Lampiran 4 Komposisi media A204, A205

Komposisi A204 A205

MS1 20 ml 20 ml

MS2 10 ml 10 ml

MS3 10 ml 10 ml

MS4 10 ml 10 ml

Vitamin MS 5 ml 5 ml

B5 minor 1 10 ml 10 ml

Maltosa 30 g -

Sorbitol 20 g -

Sukrosa - 30 g

pH 5.8 5.8

Agarose type 1 10 g 3 g

Autoklaf 15, 121 oC. dinginkan sampai

50 oC

15, 121 oC. dinginkan sampai

50 oC

Kinetin 2 mg/L 2 mg/L

NAA 5 mg/L 1 mg/L

Cefotaxim 250 mg/L 250 mg/L

Vancomisin 100 mg/L 100 mg/L

Higromisin 50 mg/L 50 mg/L

rev 3. cover - daftar lampiranrevisi 3Blank PageBlank PageBlank PageBlank PageBlank PageBlank PageBlank PageBlank PageBlank PageBlank PageBlank Page