IS DE DOCTORAD Vitis vinifera L.) Val do Salnés

“TESIS DE DOCTORADO”

Biodiversidad de bacterias ácido lácticas asociada a la variedad Albariño (Vitis vinifera L.)

cultivada en Val do Salnés. Estudio de sus aplicaciones.

Jacobo López Seijas

2017

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17

Escola Internacional de Doutoramento


TESIS DE DOCTORADO

Biodiversidad de bacterias ácido lácticas asociada a la variedad Albariño (Vitis

vinifera L.) cultivada en Val do Salnés. Estudio de sus aplicaciones.

Dirigida por la doctora: Carmen Sieiro Vázquez

Año: 2017

Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el proyecto PGIDIT06RAG018E “Estudio

de la microbiota maloláctica del Val del Salnés” concedido por la Xunta de Galicia y

desarrollado en colaboración con la bodega Condes de Albarei, así como con la Universidad

de Vigo

Jacobo López Seijas ha disfrutado de una Beca Predoctoral concedida por la Universidad de

Vigo, así como de una beca Leonardo concedida por la Excma. Diputación Provincial de

Lugo para la realización de una estancia en la Universidad de Viena, Austria.

A MI FAMILIA

i

AGRADECIMIENTOS

Me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que me han

acompañado a lo largo de estos años, y especialmente:

A la Dra. Carmen Sieiro Vázquez, por darme la oportunidad de realizar el doctorado

bajo su supervisión sin tan siquiera conocerme, por compartir sus amplios conocimientos

conmigo haciendo el trabajo mucho más fácil, y por la gran paciencia y comprensión mostrada

cuando las cosas no han salido como se esperaba.

A mis compañeras Belén, Abi y Andrea, siempre dispuestas a echar una mano, a dar

un consejo, ya sea personal o profesional, a compartir horas y horas haciendo esta aventura

más agradable y amena. Habéis sido un gran apoyo y tenéis gran parte de culpa de que esto

haya llegado a buen término. A Ana Belén, que a pesar de compartir poco tiempo contigo, me

ayudaste a integrarme en el laboratorio.

A todas las personas que han pasado por el laboratorio de Microbiología Industrial y

Biotecnología Microbiana: Guille, Iria, Fernando, Daniel, Ángeles,… así como a las/los demás

miembros del área de Microbiología, en especial a Rosa Farto y Leticia Rivera, ya que todos

habéis aportado vuestro granito de arena, aunque en muchos casos ni os hayáis dado cuenta.

A las Dras. Pilar Combarro, Elisa Longo y Teresa Pérez, por vuestras palabras

amables, vuestros consejos y, en muchos caso, por vuestro ejemplo.

A Sandra Álvarez, técnico del departamento de Biología Funcional y Ciencias de la

Salud, por compartir tu tiempo, por tus consejos y por tu inestimable ayuda.

Al área de Parasitología y, de manera especial, a los Dres. Jose M. García y Raúl

Iglesias.

A la Dra. Ana Gago y al Dr. J. Manuel Leão, por permitirme llevar a cabo una parte

importante de esta tesis en vuestro laboratorio. Gracias por vuestra amabilidad y paciencia, y

por adentrarme en el interesante mundo de la Química Analítica.

ii

A mis padres y hermano, porque seguramente estaréis orgullosos de mí al tener este

“libro” en vuestras manos, sin saber que soy yo el que está orgulloso de vosotros. Os estaré

eternamente agradecido porque sólo gracias a vosotros esto se ha hecho realidad.

A mi familia, por vuestras incansables palabras de ánimo, vuestro cariño y vuestro

apoyo infinito.

A mis amigos, porque no todo va a ser trabajar. Habéis conseguido que no me vuelva

loco……creo.

A ti, Vanesa, por animarme cada día, por escucharme, por entenderme…, en

definitiva, por quererme. Sin ti mi vida ya no tendría sentido.

TABLA DE CONTENIDOS

TABLA DE CONTENIDOS

Abreviaturas .................................................................................................................................... i

Introducción

1. Las bacterias malolácticas: consideraciones generales .................................................................... 3

2. Taxonomía, filogenia y hábitat de las bacterias lácticas .................................................................. 3

3. Fisiología de las bacterias lácticas ................................................................................................... 8

3.1. Metabolismo de azúcares ....................................................................................................... 9

3.2. Metabolismo de ácidos orgánicos ......................................................................................... 11

3.2.1. Metabolismo del ácido málico ...................................................................................... 11

3.2.2. Metabolismo del ácido cítrico ...................................................................................... 12

3.2.3. Metabolismo del ácido tartárico ................................................................................... 12

3.3. Metabolismo de proteínas y compuestos nitrogenados ......................................................... 12

3.4. Metabolismo de lípidos ......................................................................................................... 13

4. Las bacterias lácticas y el ser humano .......................................................................................... 14

5. Las bacterias lácticas en la industria alimentaria ........................................................................... 16

6. Identificación de bacterias ácido lácticas ...................................................................................... 22

6.1. Identificación fenotípica clásica ............................................................................................ 22

6.2. Identificación genotípica ...................................................................................................... 23

6.2.1. Identificación basada en la hibridación ........................................................................ 23

6.2.2. Identificación basada en PCR ....................................................................................... 24

6.2.2.1. Análisis del ADN ribosómico ............................................................................. 24

6.2.2.1.1. Secuenciación ........................................................................................... 26

6.2.2.1.2. ARDRA .................................................................................................... 27

6.2.2.1.3. Análisis de regiones hipervariables .......................................................... 27

6.2.2.1.4. Análisis de regiones espaciadoras intergénicas ........................................ 28

6.2.2.2. Análisis del gen recA .......................................................................................... 28

6.2.2.3. Otras secuencias de interés ................................................................................. 29

6.2.2.4. PCR múltiple ...................................................................................................... 30

6.2.3. PCR/DGG ..................................................................................................................... 31

7. Aplicaciones de las bacterias lácticas ............................................................................................ 32

7.1. Producción de enzimas de interés industrial y enológico ...................................................... 33

7.2. Biocontrol ............................................................................................................................. 34

7.3. Síntesis de nanopartículas ..................................................................................................... 35

Justificación y Objetivos .............................................................................................................. 39

Capítulo I: Aislamiento, identificación y caracterización de bacterias malolácticas en vino

albariño

1. Introducción ................................................................................................................................... 43

1.1. Industria vitivinícola en España: geografía y producción ..................................................... 43

1.2. Origen del exceso de acidez .................................................................................................. 45

1.3. Control de la acidez en los vinos ........................................................................................... 45

1.3.1. Control químico ............................................................................................................ 46

1.3.2. Control biológico: fermentación maloláctica ............................................................... 46

1.3.2.1. Concepto y factores físico-químicos que afectan al desarrollo ........................ 46

1.3.2.2. Impacto en vinos .............................................................................................. 48

1.3.2.2.1. Reducción de la acidez .......................................................................... 48

1.3.2.2.2. Modificación del perfil aromático, color y textura................................ 48

1.3.2.2.3. Estabilidad microbiológica ................................................................... 49

1.3.2.2.4. Seguridad del producto ......................................................................... 50

1.3.2.3. Biodiversidad de BAL ...................................................................................... 51

1.3.2.4. Dinámica poblacional ....................................................................................... 51

1.3.3. Fermentación malo-alcohólica con Schizosaccharomyces ........................................... 53

1.3.4. Enzima maloláctico ...................................................................................................... 54

1.3.5. Mejora genética de cepas vínicas ................................................................................. 54

1.4. Tecnología de la fermentación maloláctica ........................................................................... 55

1.4.1. Fermentación espontánea ............................................................................................. 55

1.4.2. Fermentación dirigida con cultivos iniciadores ............................................................ 56

1.4.2.1. Momento de la inoculación ................................................................................ 56

1.5. Problemática en la consecución de la FML ........................................................................... 57

1.6. Obtención de cultivos iniciadores ......................................................................................... 58

2. Materiales y Métodos .................................................................................................................... 60

2.1. Medios de cultivo .................................................................................................................. 60

2.2. Aislamiento de bacterias ácido lácticas ................................................................................. 61

2.3. Otras cepas bacterianas utilizadas en este estudio ................................................................. 61

2.4. Conservación de los aislados bacterianos ............................................................................. 62

2.5. Elaboración del perfil bioquímicos de asimilación de azúcares ............................................ 62

2.6. Manipulación de ácidos nucleicos......................................................................................... 63

2.6.1. Extracción de ADN ...................................................................................................... 63

2.6.2. Amplificación del ADNr 16S ....................................................................................... 63

2.6.3. Amplificación de la región espaciadora intergénica (ISR) 16S/23S ............................. 64

2.6.4. Amplificación del gen recA .......................................................................................... 64

2.6.5. Purificación de fragmentos de ADN a partir de gel de agarosa .................................... 65

2.6.6. Secuenciación ............................................................................................................... 65

2.6.7. Digestión de ácidos nucleicos con enzimas de restricción .......................................... 66

2.7. Análisis bioinformático ......................................................................................................... 67

2.7.1. Bases de datos y herramientas bioinformáticas empleadas .......................................... 67

2.7.2. Elaboración de los árboles filogenéticos 16S y recA.................................................... 67

2.8. Microfermentaciones ............................................................................................................ 68

2.9. Determinación molecular de la presencia de genes codificantes de enzimas carboxilasas de

ácidos fenólicos ..................................................................................................................... 68

2.10. Determinación de la actividad β-glucosidasa ....................................................................... 69

2.10.1. Actividad β-glucosidasa en células vivas ................................................................. 69

2.11. Determinación de la capacidad de producción de aminas biógenas..................................... 70

2.11.1. Determinación molecular de la capacidad de producción de ABs ............................ 70

2.11.2. Cuantificación de la producción de ABs .................................................................. 71

2.11.2.1. Reactivos y patrones ................................................................................... 72

2.11.2.2. Preparación de soluciones estándar y muestras de vino ............................. 72

2.11.2.3. Análisis UHPLC-MS/MS ........................................................................... 72

2.11.2.4. Parámetros de cuantificación ...................................................................... 73

2.12. Análisis de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa ........................... 74

2.13. Determinación de la capacidad de degradación de ABs ...................................................... 75

3. Resultados y Discusión .................................................................................................................. 76

3.1. Aislamiento de bacterias lácticas .......................................................................................... 76

3.2. Identificación de los aislados mediante perfil de asimilación de azúcares ............................ 77

3.3. Identificación de los aislados mediante pruebas moleculares ............................................... 80

3.4. Esquema general del proceso de identificación .................................................................... 89

3.5. Ecología de las bacterias lácticas aisladas ............................................................................. 92

3.6. Caracterización enológica de las cepas de bacterias lácticas ................................................ 96

3.6.1. Actividad maloláctica .................................................................................................. 96

3.6.2. Formación de ABs ........................................................................................................ 99

3.6.3. Determinación de la capacidad de degradación de ABs ............................................. 101

3.6.4. Actividades β-glucosidasa y descarboxilasa de ácidos fenólicos ............................... 102

Capítulo II: Biocontrol de microorganismos patógenos mediante el empleo de LAB. Estudio

de aplicación en plantas de Solanum lycopersicum

1. Introducción ................................................................................................................................. 109

1.1. Microorganismos fitopatógenos y alterantes de los alimentos ............................................ 109

1.2. Impacto económicos ........................................................................................................... 110

1.3. Implicaciones sobre la salud ............................................................................................... 110

1.4. Deterioro causado por hongos ............................................................................................. 111

1.5. Deterioro causado por bacterias .......................................................................................... 112

1.6. Control de los microorganismos indeseados ....................................................................... 113

1.6.1. Control químico y su problemática............................................................................. 113

1.6.2. Control biológico ........................................................................................................ 114

1.6.2.1. Biocontrol mediante bacterias del ácido láctico ............................................... 116

1.7. Microorganismos como promotores del crecimiento vegetal.............................................. 118

2. Materiales y Métodos .................................................................................................................. 119

2.1. Cepas de bacterias, hongos filamentosos y levaduras utilizadas en este estudio ................ 119

2.2. Medios de cultivos .............................................................................................................. 119

2.3. Determinación in vitro del antagonismo de las BAL frente a bacterias y levaduras ........... 120

2.4. Determinación in vitro del antagonismo de las BAL frente a hongos filamentosos ........... 121

2.5. Determinación in vivo del antagonismo BAL-F. oxysporum .............................................. 122

2.6. Determinación del efecto fitoestimulador de las BAL ........................................................ 123

2.7. Metodología de análisis realizados y tratamiento estadístico .............................................. 124

3. Resultados y Discusión ................................................................................................................ 125

3.1. Antagonismo BAL-Bacteria y BAL-levadura ..................................................................... 126

3.2. Antagonismo BAL-hongo filamentoso ............................................................................... 130

3.3. Capacidad de biocontrol de las BAL ................................................................................... 136

3.4. Capacidad fitoestimulante de las BAL ................................................................................ 140

Capítulo III: Biosíntesis de nanopartículas de plata, optimización y efecto microbicida

1. Introducción ................................................................................................................................. 145

1.1. Definición ........................................................................................................................... 145

1.2. Mecanismo de síntesis de NPs ............................................................................................ 146

1.2.1. Métodos químicos ..................................................................................................... 146

1.2.2. Métodos biológicos .................................................................................................... 147

1.3. Actividad antimicrobiana de las AgNPs ............................................................................. 149

2. Materiales y Métodos .................................................................................................................. 152

2.1. Cepas de bacterias y levaduras utilizadas en este estudio ................................................... 152

2.2. Medios y condiciones de cultivo ......................................................................................... 152

2.3. Reactivos ............................................................................................................................. 153

2.4. Obtención del extracto reductor .......................................................................................... 153

2.5. Síntesis de nanopartículas de plata ...................................................................................... 153

2.6. Determinación de la producción de nanopartículas............................................................. 155

2.7. Caracterización de las nanopartículas de plata .................................................................... 155

2.8. Determinación de la actividad antimicrobiana de las AgNPs ............................................. 156

2.8.1. Ensayo cualitativo ...................................................................................................... 156

2.8.2. Ensayo cuantitativo .................................................................................................... 156

3. Resultados y Discusión ................................................................................................................ 158

3.1. Obtención de extractos acuosos reductores ......................................................................... 158

3.2. Evaluación de la capacidad de los extractos acuosos para producir AgNPs ....................... 159

3.3. Efecto de la luz, agitación, temperatura y NaOH sobre la síntesis de AgNPs..................... 160

3.4. Determinación de los valores máximos de producción. Estabilidad de AgNPs .................. 165

3.5. Caracterización de AgNPs mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) .... 167

3.6. Capacidad de las AgNPs sintetizadas para penetrar en las células y efecto microbicida .... 170

Conclusiones ................................................................................................................................ 179

Referencias ................................................................................................................................... 183

ABREVIATURAS

i

Abreviaturas

AB Amina biógena

Abs. Absorbancia

ADN Ácido desoxirribonucleico

ARDRA Análisis de restricción del ADN ribosómico

ARN Ácido ribonucleico

ATP Adenosín trifosfato

BAL Bacteria ácido láctica

CECT Colección Española de Cultivos Tipo

CMI Concentración mínima inhibitoria

CMM Concentración mínima microbicida

D.O. Denominación de Origen

DGG Gel con gradiente de desnaturalización

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

FA Fermentación alcohólica

FML Fermentación maloláctica

GRAS Generalmente reconocidos como seguros

hdc Histidina descarboxilasa

HILIC Cromatografía de interacción hidrofílica

HIS Histamina

ISR Región espaciadora intergénica

MS Espectrometría de masas

NCBI “National Center for Biotechnology Information”

NP Nanopartícula

odc Ornitina descarboxilasa

p/v Peso por volumen

pb Pares de bases

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PUT Putrescina

PVDF Difluoruro de polivinilideno

SD Desviación estándar

ii

sp. Especie

subsp. Subespecie

tdc Tirosina descarboxilasa

TEM Microscopía electrónica de transmisión

TYR Tiramina

U Unidad enzimática

UFC Unidad formadora de colonia

UHPLC Cromatografía líquida de alto rendimiento

UV Ultravioleta

v/v Volumen por volumen

INTRODUCCIÓN GENERAL


3


1. Las bacterias lácticas: consideraciones generales

El término “bacteria acido láctica” (BAL, o LAB, del inglés “lactic acid bacteria”)

tiene origen a principios del siglo XIX para denominar a un grupo heterogéneo de bacterias

que en la actualidad incluye a más de 30 géneros. La gran disparidad de criterios para la

definición de dicho término, con la formación de ácido láctico como único punto en común,

originaba una importante confusión en torno a qué bacterias o especies bacterianas debían ser

consideradas “bacterias ácido lácticas”.

Entre 1857 y 1863, Louis Pasteur desarrolla sus investigaciones en torno a las

fermentaciones vínicas, sin embargo, no será hasta 1873 cuando se produzca el primer

aislamiento de una bacteria acido láctica. Joseph Lister aísla una cepa de Bacterium lactis (en

la actualidad Lactococcus lactis) al tratar de reproducir los experimentos de Pasteur, lo que

permitirá el establecimiento de nuevos criterios fenotípicos para la determinación de los por

entonces denominados “lacto-bacilos”.

Ya en 1901, con la determinación de los Lactobacillus (L.) como bacterias Gram-

positivas por parte de Martinus Willem Beijerinck, se concreta la separación entre coliformes

y bacterias acido lácticas, que hasta entonces eran consideradas dentro del mismo grupo (Stiles

y Holzapfel, 1997).

2. Taxonomía, filogenia y hábitat de las bacterias lácticas

En 1907 Felix Löhnis estableció 4 grupos diferenciados de bacterias ácido lácticas: el

grupo de los coli-aerógenos, el grupo estreptococus, el grupo estafilococus y el grupo

lactobacilos (Heineman, 1920).

Pocos años después, en 1919, el trabajo de Orla-Jensen: “The lactic acid bacteria”

sentaría las bases de la sistemática de bacterias acido lácticas, para lo cual recurre a

características fenotípicas todavía en uso actualmente como son la morfología celular (cocos


4

o bacilos), el modo de fermentación de la glucosa, el crecimiento a ciertas temperaturas y el

rango de utilización de carbohidratos, concluyendo en una nueva clasificación de los tres

últimos grupos descritos por Lönis, en 7 géneros: Streptococcus, Tetracoccus,

Thermobacterium, Estreptobacterium, Betabacterium, Microbacterium y Betacoccus

(Heineman, 1920; Stiles y Holzapfel, 1997). A partir de este momento se abre el camino al

estudio de las relaciones filogenéticas.

Las características fenotípicas empleadas por Orla-Jensen permanecen en vigor y son

empleadas para una primera aproximación en la identificación de estos microorganismos. Sin

embargo, la llegada de las nuevas técnicas de análisis molecular ha originados numerosos

cambios en la ordenación filogenética de las bacterias ácido lácticas desde la primera

clasificación realizada por Löhnis.

En este sentido, el manual Bergey’s estima, en su edición de 1986, 5 géneros de

bacterias como bacterias ácido lácticas “tipo”: Aerococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus y Streptococcus (S.). Este último género sería posteriormente dividido en tres:

Enterococcus, Lactococcus (L.) y Streptococcus senso stricto.

Bacterias por entonces pertenecientes al género Lactococcus serían posteriormente

identificadas como género Vagococcus, así como los géneros Carnobacterium, previamente

incluido en el género Lactobacillus, y Tetragenococcus, que había sido descrito dentro del

género Pediococcus, como Pediococcus halophilus (Khalid, 2011).

Figura 1: A: Bifidobacterium adolescentes con forma de Y. B: L. casei (http://microbewiki.

kenyon.edu) C: Oenococcus oeni (http://www.rubliweb.ch/ ).

El género Bifidobacterium (Fig. 1) fue originalmente identificado como una especie

de Lactobacillus por lo que ha sido históricamente considerado dentro de las bacterias ácido

A B C

http://www.rubliweb.ch/


5

lácticas. Sin embargo, la presencia de la enzima fructosa 6-fosfato fosfoquetolasa, y la

ausencia de aldolasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, dos enzimas presentes en el género

Lactobacillus, dieron lugar a la separación de ambos géneros en 1967. Además, presenta

características particulares ya que a menudo desarrolla forma de V o de Y, con ramificaciones

en la que se acumula la cromatina (Ballongue, 2004). Este género adquiere importancia debido

a las implicaciones sobre la salud humana al ser un componente principal de la microbiota

intestinal humana, llegando a suponer el 99% de los microorganismos intestinales en recién

nacidos (Ballongue, 2004). Sin embargo, al no estar filogenéticamente relacionado con las

bacterias ácido lácticas propiamente dichas (Fig. 2) no será tratado extensamente en este

trabajo (Giraffa, 2014).

Figura 2: Árbol filogenético desenraizado de los géneros de bacterias lácticas más representativos

(Axelson, 2004).

Actualmente se consideran bacterias ácido lácticas aquellos cocos o bacilos Gram-

positivos, catalasa-negativos, no móviles, no formadores de esporas, anaerobios aunque

aerotolerantes y productores de ácido láctico (Axelson, 2004). Estas características, a

excepción de la no-formación de esporas y el carácter Gram-positivo, pueden sufrir

variaciones en función de la cepa, especie o condiciones de cultivo, lo que complica aún más

su identificación (Köning y Fröhlich, 2009; Axelsson, 2004; Khalid, 2011). Este grupo cuenta

con alrededor de 30 géneros, incluidos en el filo Firmicutes (a excepción del género


6

Bifidobacterium, que pertenece al filo Actinobacteria), alguno de los cuales (Lactobacillus)

incluye más de 150 especies conocidas.

Dentro del filo Firmicutes, las bacterias acido lácticas se engloban en el orden

Lactobacillales que incluye 13 géneros: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,

Vagococcus, Aerococcus, Alloiococcus y Weissella siendo los géneros: Leuconostoc,

Oenococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus y Pediococcus los que tienen una

mayor presencia en procesos industriales de ámbito alimentario (Giraffa, 2014).

Su capacidad de adaptación a una amplia variedad de condiciones ambientales ha

permitido a las bacterias acido lácticas colonizar diversos nichos ecológicos. En la actualidad

se considera que estos microorganismo se encuentran distribuidos de forma ubicua en la

corteza terrestre, desde el tracto gastrointestinal de peces marinos, crustáceos (Merrifield et

al., 2014) y humanos, a vegetales y productos alimenticios como derivados lácteos o carnes

fermentadas (Vandamme et al. 2014).

El género Leuconostoc está formado por 12 especies bacterianas, de las cuales

Leuconostoc mesenteroides es la especie de este género que aparece con mayor frecuencia en

vino. Se trata de bacterias heterofermentativas obligadas, de forma esférica, y que

comúnmente aparecen en pares o de forma aislada (Dicks y Endo, 2009; Björkroth et al.,

2014). Son por lo general sensibles a bajos valores de pH, prefiriendo valores entre 6 y 7. Su

capacidad para desarrollarse en ambientes fríos, incluso por debajo de los 4 ºC, ha hecho que

su presencia sea a menudo considerada perjudicial, al aparecer en numerosos alimentos crio-

conservados de origen tanto animal como vegetal, como leche y productos lácteos, carnes,

pescados, aceitunas, pepinos, etc. (Björkroth et al., 2014).

En 1995, Dicks et al. reclasificaron el género Oenococcus (Gr. n. oinos, vino; N.L.

masc. n. coccus) a partir de una especie incluida dentro del género Leuconostoc con especiales

características en cuanto a la asimilación de carbohidratos o su crecimiento en medio ácido.

Esta especie fue denominada Leuconostoc oenos por Garvie en 1967, en cuyo estudio ya se

mostraban algunas características claramente diferenciadoras dentro de dicho género.

Posteriormente, mediante el análisis genético-molecular llevado a cabo por Dicks y


7

colaboradores, se confirmó su separación filogenética del género Leuconostoc, y con ello su

autonomía como género independiente.

Su importancia deriva de su implicación en la industria vitivinícola, que

históricamente ha considerado a la especie Oenococcus oeni (Fig. 1) (antiguo L. oenos), una

de las dos únicas especies que incluye el género junto con Oenococcus hitaharae (Dicks y

Endo, 2009), como la principal conductora de la fermentación maloláctica. Posiblemente su

preferencia por medios ácidos, la estimulación de su crecimiento en presencia de un 10% de

CO2 y su resistencia a etanol haya contribuido a esta consideración de especie de interés

enológico. Todo esto ha hecho que numerosas empresas hayan puesto interés en su explotación

comercial como cultivos iniciadores, lo que ha derivado en un mayor conocimiento de este

género, y más concretamente, de la especie O. oeni.

Inicialmente considerado una sarcina al aislarlo en cerveza deteriorada, el género

Pediococcus, fue identificado como tal en 1884. Se trata de cocos que aparecen en forma de

tétradas, lo que los distingue de otros géneros de bacterias acido lácticas, y están presentes en

un gran número de procesos fermentativos. Se desarrollan a temperaturas de entre 25 y 35 ºC

y valores de pH ligeramente ácidos (≈5).

Del mismo modo que varias especies del genero Leuconostoc, son considerados en

muchos casos agentes perniciosos cuando aparecen de forma no controlada en productos

alimentarios, principalmente por su capacidad para producir diacetilo, sin embargo su

presencia puede resultar positiva e incluso en ocasiones son inoculados. Tienen una importante

presencia en vegetales frescos y fermentados, lo que se refleja en su empleo como estárteres

para la producción de chucrut (col blanca fermentada), alubias fermentadas, así como de otros

productos de estas características con un consumo y distribución más localizado. La

producción de carnes procesadas es también otra importante aplicación de algunas especies de

este género al haber sido empleadas recurrentemente en la elaboración de salchichas o jamón

curado (Franz et al., 2014).

El género Lactobacillus es quizás el más conocido debido a la adición de algunas de

sus especies en productos de consumo popular, principalmente lácteos. Se trata del género más

amplio de bacterias ácido lácticas al contar más de 150 especies (Mattarelli et al., 2014). En

la actualidad, este género no se puede considerar completamente definido debido a la gran


8

divergencia entre los caracteres de estas especies, así como a su importante diversidad

genética. Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en hábitats que van desde

el tracto gastrointestinal humano, a peces o plantas. Esta amplia variedad de hábitats abarca

un extenso rango de condiciones ambientales en las que estos microorganismos pueden

desarrollarse, lo que ha derivado en numerosas aplicaciones industriales, especialmente en la

industria alimenticia. Por ejemplo, estos microorganismos se encuentran entre las especies de

BAL más tolerantes a bajos valores de pH, con un rango entre 3 y 8, lo que les permite llevar

a cabo fermentaciones de productos alimentarios, principalmente vegetales (Axelson, 2004).

Del mismo modo, a pesar de que la temperatura óptima de crecimiento suele encontrarse entre

30 y 40 ºC, algunas especies pueden desarrollarse incluso a temperaturas cercanas al punto de

congelación o por encima de los 50 ºC (Pot et al., 2014).

Como el resto de las bacterias acido lácticas, el género Lactococcus incluye especies

de altos requerimientos nutricionales. Se trata de una especie homofermentativa que se

encuentra también ampliamente distribuida en la naturaleza, con forma oval, y que puede

aparecer de forma aislada o formando pares o cadenas. Son mesófilas y crecen a valores de

pH cercanos a la neutralidad. Su nombre deriva de su aislamiento en 1909 de leche fermentada

y en la actualidad, la producción de derivados lácteos es la principal aplicación de algunas

especies de este género, especialmente de Lactococcus lactis (Kim, 2014).

Filogenéticamente relacionado con el género Lactococcus se encuentra el género

Streptococcus, que incluye a 79 especie con morfología esférica u ovoide y que generalmente

aparecen en parejas o en cadenas. Son aerobios facultativos y tienen una temperatura óptima

de crecimiento a 37 ºC (Du Toit et al., 2014).

3. Fisiología de las bacterias ácido lácticas

Las bacterias ácido lácticas son organismos quimiotrofos, es decir, obtienen su energía

de la oxidación de compuestos químicos, concretamente azúcares o hexosas. La oxidación de

azúcares constituye la principal ruta metabólica para la producción de energía en bacterias

lácticas (Ribereau-Gayon et al., 2000).

Se trata de microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes, al necesitar

una gran variedad de sales minerales, vitaminas y aminoácidos. Su cultivo en medio sintético


9

es a menudo complejo y muestra un crecimiento escaso, debido en parte a que estas exigencias

nutricionales responden a necesidades específicas de cepa (Endo y Dicks, 2014).

3.1 Metabolismo de azúcares

Existen dos rutas metabólicas de asimilación de azúcares (hexosas) en las bacterias

ácido lácticas. Éstas son específicas de especie, lo que supone también un criterio para la

identificación de las mismas. Se trata del metabolismo heteroláctico o heterofermentativo y el

metabolismo homoláctico u homofermentativo (Fig. 3) (Khalid, 2011).

El metabolismo homoláctico emplea la ruta de Embden-Meyerjorf para obtener un

balance global de dos moles de ácido láctico (D o L dependiendo de la especie) y 2 ATPs por

mol de glucosa consumida (Fig. 3A) (Axelson, 1998; Liu, 2002; Muñoz et al., 2011). Esta ruta

se divide en dos fases, la primera incluye todas las reacciones de la glucólisis que conducen a

la formación de piruvato y NADH+H+; y en la segunda, el piruvato es reducido a ácido láctico

tomando los protones del NADH+H+ generado anteriormente (Ribereau-Gayon et al., 2000).

El metabolismo homoláctico es empleado por la mayor parte de las bacterias lácticas a

excepción de Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, y algunos Lactobacillus (Axelson, 2004).

El metabolismo heteroláctico emplea la ruta de las pentosas-fosfato (Fig. 3B). Tras la

entrada de la molécula de glucosa en el interior celular, ésta es fosforilada una vez y oxidada

dos veces hasta dar lugar a ribulosa-5-fostato que puede ser epimerizada bien a ribosa-5-

fosfato, componente de biomoléculas tan importantes como el ATP, CoA, ADN o ARN, o

bien a xilulosa-5-fosfato. La enzima xilulosa-5-P fosfoquetolasa cataliza la rotura de ésta

última molécula en acetil-fosfato y gliceraldehido-3-fosfato. A continuación, la ruta sigue dos

vías: por un lado el gliceraldehido-3-fosfato seguirá la misma ruta que en el metabolismo

homoláctico, para dar lugar a ácido láctico, mientras que el acetil-fosfato sufre, o bien

sucesivas reducciones para dar lugar a etanol o la intervención de una molécula de ADP para

dar lugar a ATP y acetato, en función de las condiciones del medio en que se encuentre el

organismo (Ribereau-Gayon et al., 2000; Liu, 2002).

Dadas las diferentes vías posibles, el resultado final de este metabolismo no es la

completa trasformación de la glucosa en ácido láctico, aunque sí es el principal producto. Se

originan además etanol y/o acetato, y CO2, en un balance final de 1 mol de ácido láctico, etanol


10

(o acetato, según la ruta), CO2 y ATP por cada mol de glucosa consumida (Liu, 2002; Muñoz

et al., 2011).

Figura 3: Rutas metabólicas para la fermentación de glucosa en bacterias ácido lácticas. A: Ruta

homofermentativa. B: Ruta heterofermentativa (Adaptado de Axelsson, 2004).


11

Las pentosas son incorporadas en la célula a través de permeasas donde son

rápidamente fosforiladas y convertidas en ribulosa-5-fosfato o xylulosa-5-fosfato e

incorporadas a las rutas antes mencionadas (Axelsson, 2004).

3.2 Metabolismo de ácidos orgánicos

3.2.1 Metabolismo del ácido málico

El metabolismo de ácidos orgánicos en general, y del ácido málico en particular ha

sido extensamente estudiado debido, principalmente, a las implicaciones que éste tiene en la

industria vínica (Ribereau-Gayón, 2000), al encontrarse dicho ácido en concentraciones de

hasta 20 g/L (Unden y Zaunmüller, 2009).

El ácido málico tiene su origen en la uva, y más concretamente en la semilla, cuya

concentración disminuye progresivamente según avanza la maduración, como consecuencia

del cambio de metabolizar azúcares a metabolizar dicho ácido a través de la ruta de los ácidos

tricarboxílicos o ciclo de Krebs. Esto tiene como consecuencia la reducción en la

concentración del mismo de más de 25 g/L a 4-6 g/L cuando se completa la maduración

(Volschenk et al., 2006).

En climas fríos, en cambio, la maduración de la uva no se completa, haciendo que

retengan elevadas concentraciones de ácido málico que es transferido al vino durante el

estrujado (Ribereau-Gayón, 2006).

Figura 4: Fermentación maloláctica. Estructura molecular del ácido málico y del ácido láctico


12

Algunas bacterias ácido lácticas son capaces de llevar a cabo la conversión del ácido

málico en ácido láctico del vino (Fig. 4) en un proceso denominado fermentación maloláctica

(MLF, del inglés “malolactic fermentation”), estableciendo así un subgrupo dentro de las

BAL, el de las bacterias malolácticas.

3.2.2 Metabolismo del ácido cítrico

El ácido cítrico tiene también un papel crucial al tratarse de un intermediario en la ruta

de síntesis de diacetilo, acetona o ácido acético, compuestos todos ellos de gran importancia

organoléptica de productos lácteos (Endo y Dicks, 2014) y vinos (du Toit et al., 2011). La

presencia del primero de estos compuestos en vino es aceptada hasta ciertos límites, aportando

complejidad en la cata hasta niveles de 2-3 mg/L en vinos blancos y 5 mg/L en vinos tintos,

pero sobrepasadas estas concentraciones, aporta un aroma a mantequilla que resulta

inaceptable (Ribereau-Gayón, 2006).

3.2.3 Metabolismo del ácido tartárico

Entre los ácidos orgánicos con mayor presencia en vino, el más abundante es el ácido

tartárico, pero la capacidad de las BAL para llevar a cabo su degradación es mucho menos

habitual que la mostrada para los dos casos anteriores, y generalmente implica a bacterias del

género Lactobacillus (Muñoz et al., 2011). Además, su degradación a menudo supone la

producción de ácido acético como producto final y con ello un incremento de la acidez volátil

del vino (Ribereau-Gayón, 2006; du Toit et al., 2011).

3.3 Metabolismo de proteínas y compuestos nitrogenados

Las bacterias ácido lácticas tienen una capacidad muy limitada para emplear el

nitrógeno inorgánico. Debido a esto, necesitan de una fuente exógena de aminoácidos y

vitaminas en el medio en el que se desarrollan y son, de hecho, la mayoría de las especies de

BAL auxótrofas para al menos un aminoácido. Así, L. plantarum parece ser la única especie

cuyo ADN codifica enzimas para la síntesis de todos los aminoácidos excepto leucina,

isoleucina y valina y, en el caso contrario, L. johnsonii es incapaz de sintetizar la mayor parte

de ellos (Mayo et al., 2010), si bien estos requerimientos son, nuevamente, dependientes de

cepa (Axelsson, 2004, Endo y Dicks, 2014).


13

Algunas especies presentan un sistema proteolítico que les permite la rotura de ciertas

proteínas presentes en el medio y el empleo de los aminoácidos resultantes de la misma para

su propio metabolismo. Estos sistemas proteolíticos tienen generalmente tres componentes

principales: proteinasas, o enzimas capaces de romper las proteínas en péptidos; un sistema de

transporte de estos al interior celular; y peptidasas en el citoplasma, encargados de convertir

estos péptidos en aminoácidos libres (Mayo et al., 2010). Este proceso proteolítico es de

especial importancia en la industria alimentaria en general y en la láctea en particular (Endo y

Dicks, 2014), donde los aminoácidos resultantes de la rotura de la caseína son a menudo

empleados por la célula bacteriana en la producción de sustancias aromáticas como alcoholes,

aldehídos, ácidos, esteres, y compuestos sulfurados.

Una situación similar ocurre en vinos, donde las proteínas procedentes de la uva y de

la lisis de las levaduras tras la fermentación alcohólica son transformados en péptidos y

aminoácidos libres cuyo catabolismo tiene importantes repercusiones organolépticas (Liu,

2002).

Las aminas biógenas, cuya repercusión sobre la salud del consumidor se tratará en

detalle más adelante, son también un producto del metabolismo de aminoácidos libres (Sumby

et al., 2014).

3.4 Metabolismo de lípidos

Los lípidos presentes en el vino tienen también su origen en la uva y las levaduras que

llevan a cabo la fermentación alcohólica (Liu, 2002).

La presencia de una excesiva concentración de ácidos grasos volátiles en vinos, como

resultado de la lipolisis llevada a cabo por las bacterias ácido lácticas, puede resultar negativa

para la características organolépticas de los mismos (Liu, 2002; Muñoz et al., 2011).

A pesar de que existen algunas referencias a este mecanismo en bacterias ácido lácticas

(Esteban-Torres et al., 2015), no se han estudiado en profundidad los sistemas lipolíticos

encargados de esta reacción en vinos (Mathews et al., 2004).


14

4. Las bacterias lácticas y el ser humano

Metchnikoff sugirió, a principios del siglo XX, que las bacterias ácido lácticas podían

contribuir positivamente a la salud del ser humano. Desde entonces han sido numerosos los

estudios realizados en ese ámbito (Quinto et al., 2014).

A pesar de que las bacterias lácticas se encuentran principalmente asociadas a

ambientes ricos en nutrientes como la leche, carne o vegetales, algunas especies pueden

encontrarse como componentes importantes en la boca, intestino y vagina de mamíferos

(Khalid, 2011).

El ser humano entra en contacto con estos microorganismos desde el momento del

nacimiento, al ser estas bacterias elementos principales de la microbiota vaginal. Una vez

comenzada la lactancia, la leche materna aporta en gran medida los organismos que

conformaran la microbiota intestinal del recién nacido (Mikelsaar et al., 1998). A partir de este

momento, las bacterias lácticas estarán presentes en diferentes biotopos, como la piel, intestino

o vagina, a lo largo de la vida del individuo, mientras éste se encuentre saludable.

Como se ha mencionado, los beneficios que las bacterias ácido lácticas pueden aportar

sobre la salud humana han sido ampliamente estudiados. Éstas forman parte esencial de la

microbiota intestinal humana, suponiendo una importante fuente de nutrientes como la

tiamina, riboflavina, ácido fólico o vitamina B12, que son absorbidos y empleados por el

hospedador (Ballongue, 2004).

En este aspecto, los géneros de BAL más representativos en la biota intestinal en

individuos sanos son Lactobacillus y Bifidobacterium, cuyas densidades celulares evolucionan

a lo largo de todo el tracto digestivo. Así, las especies de Lactobacillus ácido-tolerantes son

por lo general las principales bacterias asociadas al estómago, mientras que en el colon

predominan especies del genero Bifidobacterium. Esta distribución espacial de las BAL, así

como la estabilidad de la microbiota intestinal general se puede ver afectada por numerosos

factores como la dieta del individuo, la composición de la mucosa intestinal o la propia

capacidad adhesiva de los microorganismos (García-Ruiz et al., 2014).

Del mismo modo, son de sobra conocidas las actividades probióticas de este tipo de

microorganismos. En la actualidad existen evidencias de los efectos profilácticos y curativos


15

que las bacterias lácticas tienen sobre enfermedades como diarreas rinitis, patologías de la piel,

intolerancia a la lactosa o incluso cáncer (Sharma et al., 2014).

Un gran número de estudios están basados en la prevención y/o reducción de la

duración de episodios diarreicos de diferente origen, llevando a la confirmación de los efectos

beneficiosos de la aplicación de estos microorganismos. La administración por vía oral de

Lactobacillus reuteri se ha mostrado eficaz en la atenuación de diarreas causadas por rotavirus

(Villena et al., 2013), así como Lactobacillus GG, es capaz de reducir la duración de los

episodios de este tipo de diarreas, al mismo tiempo que previene la aparición de aquellas

causadas por la administración de antibióticos (Soomro et al., 2002; Salminen y Von Wright,

2004). La presencia de estos microorganismos supone además una barrera contra la

colonización de las vías gastrointestinales por parte de agentes patógenos bien sea por la

competición por los nutrientes y por los sitios de adhesión, como por la síntesis de sustancias

antimicrobianas. Así, por ejemplo, se ha demostrado la importancia de la concentración de

bacterias ácido lácticas en la prevención de la colonización por Clostridium difficile (Mikelsaar

et al., 2004). Por otra parte, la administración de Lactobacillus casei Shirota dio lugar a la

reducción de la colonización por Helicobacter pylori en individuos adultos (Cats et al., 2003).

El consumo habitual de ciertas especies de bacterias ácido lácticas como S.

thermophilus y/o L. bulgaricus, empleados habitualmente en la elaboración de yogurt, pueden

mejorar la digestión de lactosa debido a la presencia de la enzima β-galactosidasa (Martini et

al., 1991; London, 2015), reduciendo los síntomas de la intolerancia a dicho disacárido,

afección presente en entre un 5 y un 15% de la población europea (Hove et al., 1999; Guarner

y Malagelada, 2003; Salminen, y Von Wright, 2004).

Otro importante campo de estudio en la aplicación biomédica de las bacterias lácticas

es la prevención del cáncer en vías gastrointestinales. Este efecto antitumoral puede darse,

bien por la supresión de las enzimas activadoras de pro-carcinógenos, principalmente la β-

glucoronidasa, la nitrorreductasa y la azoreductasa, (Hove et al., 1999; Sharma et al., 2014),

o bien por la producción de sustancias antitumorales (p. ej. butirato) (Soomro et al., 2002).

Un gran número de especies de bacterias ácido lácticas han demostrado importantes

efectos antitumorales, especialmente en ensayos realizados en ratas, obteniendo reducciones

de hasta un 50% en la aparición de criptas aberrantes (precursoras de pólipos colorrectales) en


16

el intestino grueso tras 5 semanas de la administración de cepas de Bifidobacterium (Brady et

al., 2000). Aunque estas propiedades anticancerígenas no han sido verificadas en humanos, si

se ha demostrado la relación entre la presencia de estos microorganismos y una significativa

reducción de la actividad de las enzimas pro-carcinógenas mencionadas anteriormente tras la

ingesta de L. acidophilus (Hirayama et al., 2000).

A pesar de que sus efectos no se dirigen al tracto gastrointestinal, Lactobacillus casei

Shirota ha mostrado un importante efecto evitando la reaparición de cáncer de vejiga en

humanos (Yasui et al., 1999).

El efecto inmunomodulador viene principalmente determinado por su capacidad para

regular los niveles de linfocitos, inmunoglobulinas y citoquinas en el organismo. La

administración de leche fermentada, inoculada con L. casei DN-114001 (Actimel®), indujo un

incremento en el número de linfocitos circulantes tras 6 semanas de tratamiento en voluntarios

sometidos a estrés (Marcos et al., 2004). De LeBlanc et al. (2008) demostraron la capacidad

de esta cepa láctica para la estimulación de la producción de Inmunoglobulina A, así como de

macrófagos y células dendríticas en ratones.

Esta capacidad para regular el sistema inmune tiene como efecto colateral una

importante mejora en individuos que presentan alguna enfermedad atópica, como asma, rinitis

alérgica, etc. a través de la regulación de la síntesis de IgE mediante la estimulación de la

producción de citoquinas antinflamatorias (Yasui et al., 1999; Ouwehand et al., 2002).

5. Las bacterias lácticas en la industria alimentaria

Como se mencionaba anteriormente, las bacterias lácticas han sido empleadas en la

industria alimentaria desde su descubrimiento a finales del año 1800.

Desde sus primeras funciones como fermentos lácticos en la generación de queso y/o

leche agria, hasta la actualidad, el número de aplicaciones en esta industria se ha visto

enormemente ampliado debido, posiblemente, a la versatilidad y adaptabilidad de estas

bacterias a condiciones difíciles. Del mismo modo, la calificación de estas bacterias como

GRAS (Generally Regarded as Safe), ha impulsado la investigación en la aplicabilidad de estos

microorganismos para la sustitución de agentes químicos empleados en la conservación de


17

productos alimenticios, cuya reducción o desaparición es cada vez más demandada por los

consumidores (Crowley et al., 2013).

Los primeros cultivos comerciales de bacterias lácticas fueron preparados en el

laboratorio Chr. Hansen a finales del siglo XIX. Se trataba de cultivos mixtos de cepas

bacterianas desconocidas obtenidos de leches fermentadas (Stanley, 1998).

En la actualidad, los cultivos iniciadores de la fermentación (en adelante “estárteres”)

empleados en la industria alimentaria pueden clasificarte atendiendo a tres criterios: la

temperatura óptima de crecimiento, el modo de presentación y el número de especies o cepas

bacterianas que incluyan.

Basándose en el primer criterio, los estárteres se pueden denominar mesófilos,

aquellos que tienen su temperatura óptima de crecimiento alrededor de 30 ºC y crecen entre

10 y 40 ºC, y termófilos, que presentan una temperatura óptima de crecimiento entre 40 y 50

ºC (Stanley, 1998).

En el caso de los estárteres mesófilos, son las especies de Lactococcus y Leuconostoc

las más empleadas, mientras que las especies termófilas más utilizadas son S. salivarius subsp.

thermophilus y las especies de lactobacilos: L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus y

L. delbrueckii

Atendiendo al segundo criterio, los estárteres pueden ser, según Lawrence et al.

(1976):

- Estárteres de una sola cepa: presentan una sola cepa bacteriana.

- Estárteres multi-cepa: mezclas definidas de dos o más cepas de la misma especie.

- Estárteres multi-cepa mixtos: se trata de mezclas de cepas de varias especies. La

composición de los estárteres multi-cepa puede variar al realizar sub-cultivos.

Actualmente, la leche puede ser fermentada en más de 1000 productos, lo que ha

derivado en un gran esfuerzo a la hora de obtener fermentos específicos de producto, estables

y/o resistentes a bacteriófagos (Mäyrä-Maäkinen y Bigret, 1998).

En el caso de los yogures y leches fermentadas, las especies de bacterias lácticas más

habitualmente empleadas son S. salivarius subsp. thermophilus y L. delbrueckii subsp.


18

bulgaricus (Auclair y Accolas, 1983), previamente definidas como termófilas, y que por lo

general son inoculadas conjuntamente como fermento mixto (Stanley, 1998; Oberman y

Libudzisz, 1998).

Para el desarrollo de esta fermentación, se inocula la leche con entre un 0,5 y un 5%

de fermento tras la pasteurización y enfriado, y se incuba a temperatura de entre 30 y 45 ºC

(Auclair y Accolas, 1983).

En el caso de los quesos se emplean tanto fermentos mesófilos como termófilos, en

función del tipo del mismo que se desea producir. Así por ejemplo, los quesos Cheddar, Feta,

Brie o Edam se originan a partir de fermentos mesófilos mientras que los quesos suizos

Emmenthal y Gruyere, los italianos Parmigiano Reggiano y Mozzarella o el gorgonzola, tienen

lugar por la acción de fermentos termófilos (Stanley, 1998).

Además de la aplicación de los microorganismos en la producción propiamente dicha

de derivados lácteos, numerosos estudios de aplicación de las bacterias ácido lácticas derivan

hacia la obtención de sustancias bioactivas que aporten al consumidor un valor añadido a los

propios factores nutricionales.

La obtención de péptidos bioactivos está centrando el interés de numerosos

investigadores por los potenciales efectos beneficiosos sobre la salud de quien los consume.

Estos péptidos se originan tras la hidrólisis de proteínas lácteas. Se ha demostrado su acción

antihipertensiva al inhibir la actividad de la enzima conversora de la Angiotensina-I (Smachi

y Gobbetti, 2000; Haque y Chand, 2008), efecto antioxidante (Virtanen, 2005; Pihlanto, 2006),

efecto antitrombótico por inhibición de la unión del fibrinógeno a las plaquetas, e incluso la

inhibición de la actividad proteinasa del virus VIH (Smachi y Gobbetti, 2000). Las bacterias

lácticas presentan un sistema proteolítico anclado a su membrana así como numerosas

peptidasas intracelulares (Haque y Chand, 2008). Debido a esto, especies de bacterias lácticas

como Lactobacillus helveticus (Meisel y Bockelmann, 1999), S. thermophilus, L. bulgaricus

(Tsai et al., 2008), L. delbrueckii subsp. bulgaricus SS1 y L. lactis subsp. cremoris (Gobbetti

et al., 2000) han mostrado la capacidad de incrementar la concentración de dichos péptidos en

los productos lácteos en los que son añadidos.


19

Si bien la industria láctea sigue siendo el principal mercado de este tipo de

microorganismos, también las industrias vínica o cárnica han hecho de ellos una parte

fundamental de sus procesos productivos.

En el caso de productos cárnicos fermentados como las salchichas o el salchichón,

gran parte de los microorganismos que presentan provienen de la propia mezcla o el material

de trabajo. Sin embargo, la adicción de fermentos lácticos proporciona importantes ventajas

ya que aceleran los procesos de fermentación, mejoran las características organolépticas y

limitan la proliferación de microorganismos indeseados (Auclair y Accolas, 1983).

Se emplean generalmente tres tipos de estárteres, aquellos que contienen cepas de

Lactobacillus, los elaborados a base de Pediococcus y los que contienen cepas de

Staphylococcus.

El empleo de cultivos iniciadores basados en bacterias acido lácticas es también una

práctica habitual en la industria enológica. Generalmente basados en la especie O. oeni (du

Toit et al., 2011), cada vez más se introducen en estos productos cepas otros géneros de

bacterias lácticas (Nisiotou et al., 2014) como Lactobacillus, ya sea en cultivos mono o

multicepa, que han demostrado su utilidad a la hora de llevar a cabo la fermentación

maloláctica en vinos con alto contenido de ácido málico, donde este proceso juega un papel

crucial en la calidad del producto, por lo que será tratado exhaustivamente más adelante.

A pesar de que históricamente el uso mayoritario de este tipo de microorganismos ha

sido la producción de los productos anteriormente mencionados, en la actualidad está tomando

fuerza el estudio y explotación de otra de sus principales características: el control

microbiológico.

Este control microbiológico tiene tres vías principales: el consumo de los nutrientes

necesarios para la proliferación de los microorganismos no deseados, la reducción del pH del

medio, o la síntesis y liberación de sustancias antimicrobianas como ácido láctico, ácidos

volátiles, peróxido de hidrógeno o las bacteriocinas anteriormente mencionadas (Reis et al.,

2012).

Los aspectos beneficiosos de este tipo de bacterias son numerosos, y habitualmente,

los únicos que tienen lugar durante el proceso de producción de determinados alimentos (el


20

control de diversos parámetros del proceso productivo así trata de garantizarlo), sin embargo,

en ocasiones la presencia de las bacterias acido lácticas puede suponer un deterioro en la

calidad del producto final, o incluso, un problema de salud para aquel que lo consuma. En este

sentido, algunas cepas de bacterias ácido lácticas pueden dar lugar a sustancias potencialmente

perjudicares como el carbamato de etilo o las aminas biógenas.

El carbamato de etilo es una sustancia carcinógena encontrada en alimentos

fermentados y bebidas, y formada por la reacción química entre el etanol y un precursor con

un grupo N-carbamil como la urea, la citrulina, o el carbamil-fosfato. El primero es originado

por las levaduras durante la fermentación alcohólica, mientras que la citrulina y el carbamil-

fosfato son producidos por las bacterias ácido lácticas durante la fermentación maloláctica

(Muñoz et al., 2011).

Figura 5: Principales aminas biógenas, aminoácidos precursores y enzimas que llevan a cabo su

síntesis.

Las aminas biógenas en cambio, son directamente sintetizados por las bacterias ácido

lácticas, a partir de la descarboxilación de aminoácidos residuales presentes en el medio, como

la histidina, tirosina u ornitina (Muñoz et al., 2011; Sumby et al., 2014). Esta reacción es

llevada a cabo por medio de las enzimas histidina descarboxilasa, tirosina descarboxilasa u


21

ornitina descarboxilasa, dando lugar a histamina, tiramina o putrescina respectivamente (Fig.

5). Estas tres aminas, junto con la cadaverina, son las de mayor presencia en productos

alimentarios, seguidas de la feniletilamina, espermina o triptamina (Smit et al., 2008)

La importancia de estos compuestos orgánicos nitrogenados radica en las severas

implicaciones que pueden tener sobre la salud humana. Las aminas biógenas son esenciales

para muchas funciones fisiológicas (Zotou et al., 2003). Sin embargo, en caso de superar

determinados umbrales de concentración en el alimento consumido pueden ser causa de

dolores de cabeza, dificultad respiratoria, palpitaciones, hipo o hipertensión y desordenes

alérgicos severos (Landete et al., 2005). Estos efectos se pueden ver agravados si existe

sensibilidad por parte del consumidor debido a una baja actividad amino-oxidasa (enzima

encargada de su detoxificación) en el tracto intestinal, o por la ingesta de alcohol, el cual

también inhibe dicha enzima (Landete et al., 2007), siendo este último aspecto el que da

especial importancia a su control en bebidas alcohólicas como el vino o la cerveza.

En concreto, la amina biógena más habitualmente relacionada con intoxicaciones

alimenticias es la histamina, asociada principalmente a vinos (Landete et al., 2005) y

escómbridos, y de elevada actividad biológica. Esta amina, además de los efectos antes

mencionados, puede causar edema, vómitos y/o diarreas.

A la hora de determinar la presencia/ausencia de aminas biógenas en productos

alimenticios, el método más empleado es la cromatografía líquida de alta presión o HPLC (de

las siglas en inglés: High-Performance Liquid Chromatography) (Marcobal et al., 2006; Smit

et al., 2008), que a pesar de ser altamente sensible, necesita de un equipamiento costoso y

personal altamente cualificado.

Debido a esto, los métodos moleculares se han convertido en la alternativa y/o en un

complemento a las técnicas antes mencionadas, al ser rápidos, fiables y no excesivamente

caros.


22

6. Identificación de bacterias ácido lácticas

6.1. Identificación fenotípica clásica

Desde su descubrimiento a finales del siglo XIX, las técnicas de identificación de

bacterias malolácticas basadas en los caracteres fenotípicos, también denominadas “técnicas

clásicas”, han sido la base del estudio microbiológico de este grupo bacteriano y de sus

relaciones filogenéticas.

Los caracteres empleados por Orla-Jensen a principios del siglo XX continúan en

vigor actualmente y permiten establecer una primera identificación de estos organismos, que

deberá posteriormente ser completada con métodos más actuales (Vandamme et al., 2014).

El estudio de la morfología bacteriana, el carácter Gram, la reacción frente a catalasa,

la capacidad de esporulación o la movilidad suponen, generalmente, los primeros pasos en el

protocolo de identificación de bacterias ácido lácticas tras la obtención de un cultivo puro en

medio sólido (Muñoz et al., 2011). Un segundo paso es establecido por la capacidad

fermentativa de dichos aislados frente a las hexosas, del que se deducirá su carácter hetero u

homofermentativo (Ribereau-Gayon et al., 2006).

Tras este análisis, es posible realizar una aproximación a nivel de género, basándose

en la descripción fenotípica aportada por el Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

(Holt y Krieg, 1994).

Para alcanzar el nivel de especie en la identificación, tradicionalmente, se ha empleado

la prueba API 50CHL (Bio-Mérieux). Esta prueba permite establecer la capacidad de

asimilación de 49 carbohidratos, proporcionando perfiles específicos de especie.

A pesar de que este método ha sido empleado de forma rutinaria en laboratorios de

todo el mundo, los resultados arrojados por el mismo han de ser manejados con precaución

debido a las importantes diferencias encontradas entre perfiles de aislados pertenecientes a la

misma especie, hasta el punto de que algunos autores sostienen la no conveniencia de la

aplicación de este test a bacterias malolácticas provenientes de vino (Ribereau-Gayon, 2006).


23

6.2. Identificación genotípica

En la actualidad está ampliamente extendido y aceptado el empleo del ADN, ya sea

total o parcialmente, para la identificación bacteriana (Heyndrickx et al., 1996). Sin embargo,

en ocasiones, la dificultad a la hora de identificar aislados de bacterias ácido lácticas es tal que

solamente los estudios de homología ADN-ADN son capaces de resolver dicha identificación

(Axelsson, 1998).

En aquellos casos en que no se da una complicación tan elevada, existe una amplia

variedad de técnicas moleculares para la determinación a nivel de género, especie, subespecie

o incluso cepa, de un aislado de bacterias ácido lácticas (Muñoz et al., 2011).

Los métodos de identificación basados en ADN pueden dividirse en dos tipos: aquellos

que emplean técnicas de PCR y los que se basan en la hibridación.

6.2.1. Identificación basada en hibridación

Las técnicas basadas en hibridación se fundamentan en la capacidad de

desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos. Ya sea mediante agentes

químicos (como la urea, formamida o formaldehído), ácidos o bases, o por efecto de la

temperatura, las dos hebras del ADN pueden ser separadas. En este punto, la adición a la

mezcla de reacción de otros ADNs o ARNs que, una vez neutralizadas las condiciones de

desnaturalización, se unirán en mayor o menor medida a una de las dos hebras originales, da

como resultado la formación de tres posibles tipos de híbridos: los híbridos ADN-ADN, los

híbridos ARN-ARN y los híbridos ADN-ARN (Luque y Herráez, 2001), y con ello la

localización de la secuencia de interés.

El método basado en hibridación más empleado para identificación bacteriana es la

Hibridación fluorescente in situ o FISH (del inglés: Fluorescence in Situ Hybridization).

En esta técnica, la hibridación se produce con pequeños fragmentos de ADN (sondas)

marcados con compuestos fluorescentes (fluorocromos), que permite la detección posterior de

una determinada secuencia diana en el ADN o ARN bajo estudio (Pozo-Bayón et al., 2009).

Su efectividad depende del grado de especificidad en el apareamiento, también denominado

rigor, que hace referencia al grado de complementariedad entre la sonda y la secuencia diana.


24

6.2.2. Identificación basada en PCR

La PCR o reacción en cadena de la polimerasa consiste en la obtención in vitro de un

elevado número de copias de una determinada secuencia génica mediante el empleo de una

enzima polimerasa. Este gran número de copias es fácilmente identificable mediante una

electroforesis lo que permite detectar secuencias concretas en mezclas complejas, como por

ejemplo un homogeneizado celular o el resultado de una extracción de ADN (Ribéreau-Gayón

et al., 2006).

Existen en la actualidad numerosos genes empleados habitualmente para la

identificación bacteriana, como son el que codifica para el citocromo C, el gen recA

(codificante para la recombinasa A bacteriana), el gen tuf, codificante para el factor de

elongación Tu, el gen rpoB (codificante para la subunidad beta de la ARN polimerasa

bacteriana) o el ADN ribosómico 16S (Vandamme et al., 2014).

6.2.2.1. Análisis del ADN ribosómico

Las secuencias de ADN ribosómico codifican para ARN ribosómico que, junto con

una serie de proteínas, conforman el ribosoma procariota (Fig. 6), constituido por dos

subunidades: una subunidad grande (50S), compuesta a su vez por dos subunidades llamadas

23S y 5S; y una subunidad pequeña denominada 30S que incluye a la subunidad 16S y 21

proteínas (Puertas, 1999).

Figura 6: Ribosoma bacteriano y subunidades que lo conforman.

Subunidad menor

30S 21 proteínas ARNr 16S

Subunidad Mayor

50S 34 proteínas ARNr 23S

ARNr 5S

= +

= +


25

Su función es la traducción de las secuencias de ARN mensajero a proteínas, función

vital para la supervivencia de la célula por lo que cualquier modificación en la estructura

terciaria del mismo puede derivar en importantes consecuencias metabólicas o incluso la

muerte del organismo (Heyndrickx et al, 1996). Concretamente, el ARNr 16S permite el

reconocimiento de la secuencia Shine-Dalgarno del ARN mensajero, permitiendo el

posicionamiento correcto del mismo para el inicio de la traducción (Puertas, 1999).

Han sido numerosos los genes ribosómicos empleados tanto en la identificación

bacteriana como en la determinación de su posición filogenética. La secuencia codificante para

la subunidad 16S del ribosoma bacteriano, la codificante para la subunidad 23S o aquella que

codifica para la subunidad 5S han sido habitualmente empleadas para tales fines. Incluso las

secuencias existentes entre estos genes (23S-5S o 16S-23S) se han mostrado de gran utilidad

en este tipo de estudios (Nour, 1998).

Este hecho se debe principalmente a 5 aspectos (Eisen, 1995):

- Estos genes están presentes en todas las especies de vida libre conocidas, presentando

además una secuencia, estructura y función muy conservada.

- Se trata de genes relativamente fáciles de clonar y secuenciar, incluso cuando

provienen de bacterias no cultivables.

- La conservación de determinadas regiones permite el alineamiento de secuencias entre

especies.

- No parece probable la existencia de transferencia lateral de estos genes entre especies.

- Las elevadas tasas de sustitución entre especies permite inferir relaciones

filogenéticas.

En la actualidad, el gen más empleado tanto en identificación como en estudios

filogenéticos en bacterias, es el que codifica para la subunidad pequeña 16S del ribosoma

bacteriano, o secuencia ADNr 16S, debido en parte a su pequeño tamaño en comparación con

el 23S (Singh et al., 2009).

Esta secuencia cuenta con aproximadamente 1500 pares de bases, con dominios

altamente conservados a ambos extremos del gen, lo que supone un aspecto idóneo para la

elaboración de cebadores que permitan la obtención del gen completo por PCR (Heyndrickx


26

et al., 1996), y regiones variables que proporcionan la detección e/o identificación (Nour,

1998) .

Las secuencias ARNr 16S fueron originariamente empleadas para estudios

filogenéticos por Carl Woese en 1977, lo que le permitió identificar por primera vez el dominio

Archaea (Goldenfeld y Pace, 2013).

En la actualidad, las filogenias bacterianas derivan principalmente de las secuencias

ARNr 16S, y están basadas en más de 600000 secuencias completas, disponibles en las bases

de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), lo que ha hecho que el análisis de las

mismas se hayan convertido en la herramienta más fiable y rápida para la identificación

bacteriana.

Existe, sin embargo, una problemática en el empleo de la secuencia 16S para

diferenciar especies filogenéticamente cercanas, como es el caso de algunas especies

pertenecientes al género Lactobacillus. La secuenciación y posterior análisis comparativo de

este gen puede arrojar porcentajes de homología de más del 99% en algunas especies

consideradas diferentes, haciendo imposible su identificación a través de esta técnica. Un

ejemplo de ello son las especies L. casei y L. paracasei, cuyas secuencias 16S son

prácticamente idénticas a pesar de considerarse especies diferentes (Dellaglio et al., 2002), de

forma similar a lo que sucede con las especies L. plantarum, L. paraplantarum y L. pentosus

(Singh et al., 2009). Esto hace que a menudo sea necesario un análisis secuencial o el empleo

de varios genes para la completa identificación de estas especies (Vandamme et al., 2014).

Estas secuencias pueden ser empleadas de diversos modos en función del objetivo del

análisis:

6.2.2.1.1. Secuenciación

La secuenciación del ADNr 16S y su posterior análisis bioinformático es quizás la

técnica que proporciona mayor información al permitir establecer las distancias filogenéticas

(en la mayor parte de los casos). Así, la comparación de la secuencia o secuencias bajo estudio

con aquellas depositadas en las bases de datos, aporta la identificación del organismo y la

posición taxonómica del mismo (Heyndrickx et al., 1996).


27

6.2.2.1.2. ARDRA

La técnica denominada ARDRA (del inglés: Amplified Ribosomal DNA Restriction

Analysis), consiste en la amplificación de determinadas secuencias de DNA ribosómico y su

posterior corte con enzimas de restricción. Estas enzimas son seleccionadas en base a la

secuencia de corte (secuencia diana) así como a la presencia, ausencia o número de dianas en

el DNA bajo estudio. Tras su empleo, arroja perfiles de corte diferentes en función de la

especie o cepa, que puede ser comparado con el obtenido a partir de cepas de referencia

(Vandamme et al., 2014).

Se ha mostrado como un método altamente discriminatorio tanto a nivel de género

como de especie (Bomono et al., 2008; Soto et al., 2010), si bien puede presentar algunas

limitaciones en especies filogenéticamente muy relacionadas (Singh et al., 2009). Esta técnica

ha sido empleada con éxito en la identificación de bacterias ácido lácticas en numerosos

productos alimenticios como vino (Sato et al., 2000; Rodas et al., 2003 y 2005) o salchichas

(Bonomo et al., 2008).

6.2.2.1.3. Análisis de regiones hipervariables

Una importante característica del ADNr 16S es la presencia de 9 regiones

hipervariables en su secuencia denominadas con siglas que van desde V1 a V9 (Fig. 7). Estas

son secuencias que muestran un importante grado de variabilidad interespecífica, lo que las

convierte en una herramienta para la identificación bacteriana. Además, están flanqueadas por

regiones muy conservadas, lo que permite el diseño de cebadores y a su vez su amplificación

(Guo et al., 2013; Chaudhary et al., 2015).

Figura 7: Distribución de las regiones hipervariables dentro de la secuencia de ADNr 16S (www.gatc-

biotech.com).


28

Presentan la ventaja de que pueden ser empleadas para la identificación masiva de

comunidades microbianas (metagenómica) pero, por otro lado, tienen la desventaja de que no

pueden ser empleadas individualmente (Chakravorty et al., 2007).

6.2.2.1.4. Análisis de regiones espaciadoras intergénicas

La secuencia que se encuentra entre los genes 16S y 23S (en adelante ISR, del inglés:

“Intergenic Spacer Region”) ha sido empleada con éxito también para la identificación de

bacterias acido lácticas (Singh et al., 2009).

La secuencia ISR presenta una gran heterogeneidad tanto en el número de

repeticiones, como en la longitud y composición de las mismas entre especies bacterianas, lo

que permite una rápida identificación tras la amplificación de dicha secuencia (Nour, 1998).

6.2.2.2. Análisis del gen recA

Debido a la problemática asociada a los genes ribosómicos antes mencionada,

especialmente en lo que respecta a especies muy cercanas filogenéticamente, se han

desarrollado nuevos métodos de identificación molecular.

Uno de estos métodos emplea el gen recA, que se ha mostrado como una importante

ayuda en la discriminación de bacterias, concretamente de bacterias ácido lácticas.

La proteína recA es un péptido de 352 aminoácidos (en E. coli) aislada por primera

vez en 1965 por Clark y Margulis, y presenta importantes funciones dentro de la célula (Miller

y Kokjohn, 1990; Eisen, 1995; Karling et al., 1995):

- Juega un papel fundamental en la recombinación homóloga al facilitar el pareado e

intercambio entre hebras de ADN.

- Está directamente implicada en la reparación del ADN (forma parte del sistema SOS)

en caso de producirse lesiones por radiación ultravioleta.

- Induce la expresión de aproximadamente 15 genes del sistema SOS para la reparación

de ADN, al catalizar la proteólisis del represor de la proteína LexA.

- La proteína recA es necesaria para el proceso de mutagénesis.


29

La implicación directa en estas funciones vitales para la célula hace que la secuencia

de aminoácidos se encuentre evolutivamente muy conservada, manteniendo también la

estructura cuaternaria de la proteína. Sin embargo, sí se aprecian modificaciones en la

secuencia nucleotídica, modificaciones que se dan mayoritariamente en la tercera posición de

cada codón (Fig. 8) (Miller y Kokjohn, 1990).

Estos dos factores han conducido a que, desde principios de la década de los 90, el gen

recA haya sido propuesto como un marcador filogenético en procariotas (Torriani et al, 2001;

Rodríguez et al., 2007) ya que incluso la comparación entre árboles filogenéticos obtenidos a

partir de secuencias completas de ARNr 16S y recA bacterianos, han arrojado resultados

altamente similares (Eisen, 1995).

Figura 8: Fragmento del alineamiento de secuencias recA de cepas de Bifidobacterium. Se aprecia la

sustitución nucleotídica mayoritariamente en la tercera base de cada codón (Kullen et al., 1997).

Los métodos habituales de estudio de la secuencia recA se centran en el análisis

comparativo de las mismas mediante las actuales herramientas bioinformáticas. La

comparación de secuencias obtenidas a partir de cepas silvestres con aquellas obtenidas de

cepas de referencia, así como el análisis en base a las secuencias depositadas en las bases de

datos, permite tanto la diferenciación bacteriana como la inferencia de sus filogenias.

6.2.2.3. Otras secuencias de interés

La importancia capital de gran número de microorganismos en la industria y en la

medicina ha desembocado en la investigación y desarrollo de numerosos marcadores genéticos

que permitan una identificación rápida y fiable de los mismos.


30

Además de los descritos anteriormente, son de uso habitual para este fin los genes

rpoB, el factor de elongación tu o el citocromo C.

El gen rpoB codifica para la subunidad beta de la ARN polimerasa bacteriana, que

tiene una importancia clave en la célula bacteriana al encargarse de la transcripción. Su

presencia universal en bacterias, al igual que la secuencia de ADNr 16S, y la presencia de

regiones altamente conservadas, ha hecho que sea considerado como marcador genético y/o

cronómetro molecular (Bou et al., 2011).

Presenta, sin embargo, la desventaja de la existencia de un menor número de

secuencias disponibles en las bases de datos, siendo este de aproximadamente 150000, frente

a las más de 600000 del ADNr 16S (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), lo que supone un

problema a la hora de estimar filogenias.

Su efectividad en la identificación de bacterias acido lácticas ha sido demostrada por

Renouf et al. (2006), quienes fueron capaces de detectar la presencia de P. parvulus y O. oeni

de origen vínico.

Recientemente, González-Arenzana et al. (2013) consiguieron identificar cepas de las

especies O. oeni, L. mesenteroides, L. buchneri y P. parvulus mediante el empleo de este gen,

sin embargo, los mismo autores indican que el mayor número de especies analizadas en dicho

estudio fueron identificadas gracias al ADNr 16S.

El factor de elongación Tu, codificado por el gen tuf, cuya función en la célula

bacteriana radica en la traducción del ADN, ha sido menos empleado en la detección,

identificación y/o determinación de filogenias de bacterias ácido lácticas, aunque también se

ha demostrado su eficiencia para este fin (Chavagnat et al., 2002; Ventura et al., 2003).

6.2.2.4. PCR múltiple

En adición al análisis comparativo, existen otros métodos basados en los genes antes

mencionados que pueden ser empleados para la identificación bacteriana.

La técnica de PCR múltiple consiste en el empleo simultáneo de más de dos cebadores

en la misma reacción, que habitualmente son específicos de especie o cepa y por lo tanto dan

lugar a productos de amplificación también específicos (Markoulatos et al., 2002).


31

Torriani et al. (2001) emplearon una PCR múltiple para la obtención de fragmentos

que les permitieron identificar las especies L. plantarum, L. pentosus y L. paraplantarum.

Éstas se encuentran filogenéticamente muy cercanas y su identificación mediante el análisis

de ADNr 16S se hace a menudo improductiva al arrojar porcentajes de similitud en dicha

secuencia de más de un 99% (Torriani et al., 2001; Singh et al., 2009). El mismo método fue

empleado con éxito por Pang et al. (2011) para la identificación de bacterias ácido lácticas

procedentes de ensilados de maíz y por Nisiotou et al., (2014), para la identificación de cepas

aisladas en uvas y vino.

Petri et al. (2013) diseñaron un grupo de cebadores con los que fueron capaces de

identificar, mediante PCR múltiple, 13 especies de bacterias ácido lácticas pertenecientes a las

especies L. brevis, L. buchneri, L. curvatus, L. hilgardii, L. plantarum, L. mesenteroides, O.

oeni, P. acidilactici, P. damnosus, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus y Weissella

paramesenteroides, aisladas de vino.

Esta técnica destaca por su rapidez y fiabilidad, sin embargo su uso se limita a la

detección de especies o cepas determinadas, sin aportar información filogenética sobre las

mismas.

6.2.3. PCR/DGG

La técnica de PCR, combinada con la resolución de los fragmentos mediante

electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (PCR/DGG) permite la amplificación

y posterior separación de fragmentos de ADN, mostrando diferencias de incluso una sola base

entre las secuencias que se pretenden comparar. Esta pequeña diferencia supone también un

diferente punto de desnaturalización del ADN, y con ello, una diferente movilidad en el gel de

electroforesis (Fischer y Lerman, 1982).

Esta técnica resulta especialmente útil para el análisis de mezclas microbianas

complejas, eliminando la necesidad del aislamiento y cultivo de microorganismos (Fontana et

al., 2005).

Renouf et al. (2006) emplearon la amplificación por PCR del gen rpo, y su posterior

electroforesis en gradiente desnaturalizante, para el seguimiento de la evolución de bacterias

https://www.google.es/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwiOz-j5tODKAhWL5xoKHexPBtEQFggfMAA&url=https%3A%2F%2Fes.wikipedia.org%2Fwiki%2FElectroforesis_en_gel_con_gradiente_de_desnaturalizaci%25C3%25B3n&usg=AFQjCNGwPypnVGlFQyQ3DDIh4JDj8FVLzw&sig2=aWy6cNs7r4IoeNzpLpVbeA&bvm=bv.113370389,d.d2s


32

ácido láctica en varias áreas de la Denominación de Origen (D.O.) Burdeos, si bien los propios

autores reconocen la necesidad de complementar esta técnica con algún método cuantitativo.

Recientemente, Pérez-Martín et al., (2014) emplearon esta técnica sobre el gen ADNr-

16S para analizar la diversidad microbiológica de la D.O. Méntrida, permitiéndoles la

detección de O. oeni y Acetobacter sp. así como bacterias de la familia Enterobacteriaceae.

7. Aplicaciones de las bacterias lácticas

En apartados anteriores se han descrito una serie de aplicaciones de las bacterias

lácticas que van desde la reducción de la acidez del vino y elaboración de derivados lácteos y

cárnicos a la mejora de los sistemas de defensa naturales del cuerpo humano. Sin embargo, a

día de hoy son numerosas las aplicaciones que ofrecen este tipo de microorganismos, lo cual

ha impulsado un creciente interés por parte de laboratorios de todo el mundo.

Figura 9: Evolución en el número de entradas en NCBI relativas a bacterias ácido lácticas hasta 2012

(de Vos, 2011).

Un ejemplo de ello es el incremento en el número de estudios genéticos realizados en

bacterias ácido lácticas en los últimos 25 años (Fig. 9).

Algunas de estas aplicaciones se comentan a continuación.


33

7.1. Producción de enzimas de interés industrial y enológico

En vino e industria alimentaria en general, se están realizando importantes esfuerzos

en la obtención de enzimas de interés tanto para la conservación como para la mejora de

características físicas y/u organolépticas. La adicción de estas, libres o asociadas a

microorganismos, en procesos de elaboración de determinados productos alimenticios se ha

mostrado como una importante herramienta para la liberación de nuevas sustancias aromáticas

y la potenciación de otras ya presentes (Mathews et al., 2004).

Un ejemplo de este tipo de enzimas son las glucosidasas. Estas enzimas son capaces

de romper los enlaces que dan lugar a glucósidos o compuestos glucoconjugados formados

por la unión de un glúcido y una molécula aromática, generalmente monoterpenos,

norisoprenoides y compuestos alifáticos o fenólicos (D’Incecco et al., 2004; Sieiro et al.,

2012). La hidrólisis enzimática de estos enlaces permite la liberación de la molécula aromática

posibilitando también su percepción sensorial, convirtiéndose así en proceso de especial

importancia en vinos, donde aproximadamente el 95% de los compuestos aromáticos están en

forma de glucósidos (Matthews et al., 2004).

Grimaldi et al. (2005a) mostraron la existencia de actividad glucosidasa en cepas

vínicas de Lactobacillus y Pediococcus, así como en O. oeni (Grimaldi et al., 2005b).

Resultados similares fueron obtenidos por Hernandez-Orte et al. (2009) en cepas O. oeni, L.

casei y L. brevis aisladas de mosto y vino. En todos estos casos se da un incremento en la

concentración de sustancias aromáticas en el vino, lo que demuestra la potencialidad de estos

microorganismos en la mejora organoléptica del mismo.

Otras enzimas de interés, debido a la amplia variedad de sustratos sobre los que pueden

actuar, son las lacasas. Se trata de enzimas capaces de catalizar la rotura de substratos

orgánicos mediante la reducción de una molécula de oxígeno a dos moléculas de agua (Riva,

2006). Recientemente, Callejón et al. (2015) clonaron y caracterizaron una lacasa de L.

plantarum con capacidad para la degradación de aminas biógenas, tras demostrar que cepas

de esta especie eran capaces de degradar histamina, tiramina y putrescina, presentes en vino

(Callejón et al., 2014).


34

7.2. Biocontrol

Otro importante campo de estudio de aplicación de estos microorganismos es el

biocontrol, debido a la capacidad de las bacterias ácido lácticas para la inhibición o limitación

del crecimiento microbiano indeseado. Este efecto puede tener varios mecanismos

desarrollados de forma natural por las bacterias ácido lácticas, como la competencia por los

nutrientes, competencia por los sitios de adhesión o la acidificación del medio, sin embargo,

en ocasiones esta inhibición se da por la síntesis y liberación de agentes antimicrobianos, lo

que supone un importante aspecto desde el punto de vista de la industria alimentaria o la

medicina.

Ejemplos de estas sustancias son las bacteriocinas, nombre genérico empleado para

englobar a las sustancias antimicrobianas de origen bacteriano que tienen efecto inhibidor del

crecimiento sobre otras cepas o especies filogenéticamente cercanas al microorganismo

productor (Riley y Wertz, 2002).

La producción de bacteriocinas por parte de bacterias ácido lácticas ha sido estudiada

durante los últimos 30 años (Parente y Ricciardi, 1999) debido a su estabilidad en altas

temperaturas y el amplio rango de valores de pH en el que son activas (Pérez et al., 2014).

Dicha producción ha sido demostrada para bacterias de los géneros Pediococcus,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc Weissella (Yang et al., 1992; Crowley et al., 2013).

La nisina, un péptido de los considerados “lantibióticos”, fue la primera bacteriocina

y una de las más estudiadas en la actualidad, es empleada en la industria alimentaria como

conservante (Parente y Ricciardi, 1999; Pérez et al., 2014).

Aunque en ocasiones se desconoce el mecanismo de acción, el antagonismo entre

bacterias ácido lácticas frente a otras bacterias y hongos no deseados y/o patógenos ha sido

estudiado en profundidad, especialmente en aquellos casos relacionados con productos

alimenticios (Visser et al., 1986). Estos estudios a menudo ponen de manifiesto las potenciales

aplicaciones de estos microorganismos al ser capaces de inhibir a conocidos patógenos

alimenticios como levaduras pertenecientes al género Candida (Okkers et al., 1999), hongos

de los géneros Fusarium, Aspergillus (Sathe et al., 2007; Rouse et al., 2008) o Penicillium

(Rouse et al., 2008), todos capaces de producir micotoxinas; o bacterias del género Bacillus,

especialmente B. cereus (Yang et al., 2008), presente en un largo historial de intoxicaciones


35

alimentarias. En numerosas ocasiones, al ser organismos considerados GRAS, no es necesario

conocer el mecanismo de inhibición, ya que el microorganismo de interés puede ser inoculado

directamente sin suponer un riesgo para el consumidor.

La producción de antimicrobianos sigue siendo a día de hoy una importante línea de

investigación en laboratorios de todo el mundo, tanto por sus potenciales aplicaciones en la

industria alimentaria como en clínica, siendo este último ámbito especialmente prometedor al

haberse demostrado estos compuestos efectivos frente a cepas resistentes a antibióticos

convencionales (Pérez et al., 2014).

7.3. Síntesis de nanopartículas

En las últimas décadas se ha producido un preocupante incremento de casos clínicos

en los que el agente causante es un microorganismo resistente a antibióticos. Debido a esto, se

han desarrollado líneas de investigación paralelas con las que hacer frente a esta problemática.

Una de estas líneas que más interés ha despertado en los últimos años es el empleo de

nanopartículas (Pal et al., 2007) bien sea como tratamiento o como un elemento de asepsia en

el entorno clínico-hospitalario.

El concepto nanopartícula hace referencia generalmente a partículas con un tamaño

no superior a los 1000 nanómetros (Krumov et al., 2009). Éstas pueden estar compuestas por

elementos metálicos, orgánicos o combinaciones de ambos y presentan una amplia variedad

de aplicaciones. En medicina por ejemplo, las nanopartículas pueden ser empleadas como

transportadores de fármacos o como agentes anticancerígenos (Krumov et al., 2009). En la

línea de lo mencionado anteriormente, se evalúa su empleo como sustituto de los antibióticos

al no dar lugar a la aparición de resistencia (Pal et al., 2007). En biología, la variedad de

aplicaciones es elevada, entre las que destaca la obtención de superficies antimicrobianas

mediante recubrimiento con nanopartículas de plata.

Numerosos organismos son capaces de sintetizar nanopartículas, tanto procariotas

como levaduras, algas o plantas superiores. La primera bacteria en la que se identificó esta

capacidad fue Pseudomonas stutzeri (Krumov et al., 2009) y desde entonces se ha descrito en

una importante cantidad de microorganismos.


36

Las bacterias han sido descritas como agentes productores de nanopartículas de

manera tanto intra como extracelular. En ambos casos parece tratarse de mecanismos de

defensa frente a concentraciones elevadas de los iones metálicos que posteriormente

conformarán las nanopartículas (Bitton y Freihofer, 1977; Krumov et al., 2009).

Varios estudios muestran la capacidad de las bacterias lácticas para sintetizar

nanopartículas. Sintubin et al. (2009) demostraron la capacidad de 4 especies de Lactobacillus

(L. fermentum, L. plantarum, L. farciminis y L. rhamnosus) para la síntesis de nanopartículas

de plata tanto intra como extracelular, dependiendo de la especie. Nair y Pradeep (2002) han

reportado la síntesis de nanopartículas de oro, plata y combinaciones de oro-plata por parte de

cepas de Lactobacillus aisladas de mantequilla.

Este modo de síntesis de nanopartículas, que se tratará en profundidad en el capítulo

3, supone un importante salto hacia una obtención económica y respetuosa con el medio

ambiente, dos aspectos que lo diferencian de los métodos químicos, que a menudo emplean

elementos o compuestos químicos altamente contaminantes.

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS


39


La corrección de la excesiva acidez de los vinos mediante la denominada

fermentación maloláctica es una práctica habitual en el proceso de elaboración de muchos de

ellos. Tradicionalmente, y todavía en algunos casos en la actualidad, esta fermentación

transcurría espontáneamente con la microbiota indígena presente en el medio. Sin embargo,

la consecución óptima de este proceso de manera espontánea es difícil y falla con frecuencia.

Además, no siempre las cepas que consiguen desarrollarse son las más adecuadas para

conducir la fermentación pudiendo comprometer la calidad del producto final. Para tratar de

solventar estos problemas se comercializan cultivos iniciadores de bacterias malolácticas con

la finalidad de inducir y conducir de manera dirigida la mencionada fermentación. Sin

embargo, frecuentemente se ha constatado la imposibilidad de estos starters para llevar a

cabo la fermentación con éxito en los diferentes tipos de vinos, debido a su incapacidad para

implantarse y desarrollarse en los mismos. La situación descrita se da con frecuencia en los

vinos elaborados con la variedad Albariño en la comarca vinícola de Val do Salnés (D.O.

Rías Baixas) en Galicia. Es por ello, que en colaboración con una de las bodegas del sector

se planteó un proyecto de investigación (en el marco del cual se desarrolló esta Tesis), con la

finalidad principal de seleccionar cepas malolácticas autóctonas, adaptadas a los vinos de

Albariño de la citada comarca, capaces de realizar de manera óptima y segura la

fermentación maloláctica en los mismos.

Aunque uno de los principales usos de las bacterias del ácido láctico es la de ser

utilizadas como cultivos iniciadores para la elaboración y/o transformación de distintos

alimentos, entre ellos el vino, diferentes estudios han explorado y demostrado también su

potencial para otras aplicaciones de gran trascendencia. Dentro de ellas cabe resaltar, entre

otras, su interés para la producción industrial de distintos metabolitos (destacando las

bacteriocinas), su importancia como probióticos o su posible empleo como agentes

bioprotectores. Sin embargo, estos estudios se han llevado a cabo mayoritariamente con

bacterias lácticas aisladas de productos lácteos. Es por esta razón por la que, aprovechando la

colección de bacterias lácticas obtenidas del trabajo de la fermentación maloláctica de los

vinos de la comarca de Val do Salnés, se planteó también en esta Tesis el estudio de algunas

de sus otras posibles aplicaciones.


40

De acuerdo con todo lo expuesto, el objetivo general de la Tesis consistió en la selección

de bacterias lácticas asociadas los vinos de la comarca Val do Salnés para conducir de

manera eficiente y segura la fermentación maloláctica en estos vinos, así como en el estudio

del potencial de estas bacterias para ser utilizadas en otras aplicaciones. Este objetivo general

se desarrolló a través de los siguientes objetivos específicos:

1. Estudio de la biodiversidad de bacterias lácticas asociadas al vino Albariño

elaborado en la comarca arriba citada

2. Caracterización de las cepas aisladas en base a criterios que permitan la selección de

las más adecuadas para conducir la fermentación maloláctica en los vinos objeto de

estudio

3. Caracterización de la actividad antagónica de las cepas aisladas frente a

microorganismos patógenos y/o alterantes de alimentos: estimación de sus espectro

de actividad y efectividad

4. Evaluación de la capacidad bioprotectora de las cepas estudiadas frente a hongos

patógenos así como de su capacidad de fitoestimulación de cultivos vegetales

5. Evaluación de la capacidad de las bacterias lácticas del vino para sintetizar

nanopartículas de plata: optimización del método y determinación de su potencial

como antimicrobianos

CAPÍTULO I

CAPÍTULO I Introducción

43

BIODIVERSIDAD DE BACTERIAS MALOLÁCTICAS ASOCIADAS A LA

VARIEDAD ALBARIÑO: EVALUCIÓN DE SU POTENCIAL COMO

CULTIVOS INICIADORES

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Industria vitivinícola: geografía y producción

En España existen 68 Denominaciones de Origen (D.O.) (Fig. 1) que engloban una

gran cantidad de variedades enológicas, alcanzando una producción media total de 45000000

de hectolitros, de los cuales aproximadamente el 50% son de vino blanco (datos del Ministerio

de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente de España, para los años 2013- 2015).

Figura 1: Denominaciones de Origen de España.

Cinco de estas Denominaciones de Origen pertenecen a Galicia: Bierzo, Valdeorras,

Ribeira Sacra y Ribeiro en el valle del Rio Miño; y Rías Baixas (Fig. 2), al suroeste de esta

comunidad autónoma. Estas 5 D.O.s producen anualmente en torno a 40 millones de

kilogramos de uva, un 85% de ellos de variedades blancas.


44

Concretamente, la región que da nombre a la D.O. Rías Baixas se caracteriza por tener

un clima, en general, templado sub-mediterráneo, con temperaturas en torno a los 20 ºC de

media en agosto y 18 ºC en septiembre, meses de maduración de la uva (Fuente: Xunta de

Galicia y AEMET), un grado menos, por ejemplo, que la media en la región vitivinícola de los

vinos de rueda, y dos grados menos que en la región de La Rioja.

Figura 2: Localización geográfica de la Denominación de Origen Rías Baixas y posición de la sub-

zona de Val do Salnés (1) dentro de la misma.

Dentro de esta D.O se establecen a su vez las sub-zonas Val do Salnés, Condado do

Tea, Rosal y Ribeira do Ulla, zonas influenciadas por el Océano Atlántico (Vilanova y

Vilariño, 2005), en las que predomina el cultivar Albariño, uno de los más antiguos de la

región, siendo actualmente una de las variedades de uva más apreciadas de España (Diéguez

et al., 2003; Juega et al., 2014).

A pesar de esta influencia generalizada del Océano Atlántico, las sub-zonas de esta

región vitivinícola presentan diferencias climáticas que influyen directamente en el desarrollo

de las vides, y con ello, en las características y la calidad del vino producido en cada una de

ellas (Lorenzo et al., 2013). Así por ejemplo, la región de Rosal se diferencia de la región de

Val do Salnés, estudiada en este trabajo, por presentar temperaturas nocturnas más bajas, a

pesar de tratarse ambas de zonas templadas, mientras que la región de Condado do Tea está

incluida en un área de clima cálido (Queijeiro et al., 2006).


45

1.2. Origen del exceso de acidez

La acidez del vino viene determinada por la presencia de dos ácidos principales: el

ácido tartárico y el ácido málico (Ribéreau-Gayón, 2006).

Estos suponen más del 90% del total de ácidos de la uva, donde tienen su origen. La

concentración de ácido tartárico es relativamente constante, mientras que la de ácido málico

oscila en función del grado y condiciones de maduración, mostrando su mayor concentración

en la baya verde, contenido que se va reduciendo a medida que avanza dicha maduración

(Hidalgo, 2002). En consecuencia, los problemas derivados de la presencia de ácido málico en

el vino serán más marcados en climas fríos, donde a menudo la maduración no es completa y

por lo tanto hay una mayor transferencia de ese ácido al caldo durante el estrujado (Volschenk

et al., 2006).

A pesar de que la D.O. Rias Baixas no se encuentra entre las consideradas “de clima

frio” (Volschenk et al., 2006), las bajas temperaturas que se dan en esta zona durante el periodo

de maduración de la uva inciden directamente en la concentración de ácido málico (Sieiro et

al., 1990), que a menudo se encuentra en concentraciones en torno a los 4 - 5 g/L al final de la

fermentación alcohólica (FA).

Otro aspecto determinante en la presencia del ácido málico en vino es el procesado del

mismo. Mientras que los vinos blancos sufren una etapa de desfangado previo a la FA, donde

son retirados todos los elementos sólidos de la uva, los vinos tintos realizan dicha etapa en

presencia de la piel de la uva u hollejo, lo que, al encontrarse más tiempo en contacto con el

caldo, favorece el traspaso del ácido málico al mismo.

Debido a esto, los problemas de acidez ocasionados por este ácido son más habituales

en vinos tintos, pero su importancia se pone también de manifiesto en diferentes vinos blancos

(Nisiotou et al., 2014), siendo este el caso de la variedad Albariño cunado se cultiva en la ya

mencionada sub-zona de Val do Salnés.

1.3. Control de la acidez de los vinos

Como se ha mencionado, en aquellos vinos en los que la concentración de cualquiera

de los ácidos orgánicos antes mencionados es excesiva se hace necesaria la reducción de la


46

misma, existiendo principalmente dos formas de llevar a cabo esta corrección: la aplicación

de métodos químicos, y la conducción de la fermentación maloláctica (FML) (Ribéreau-

Gayón, 2006).

1.3.1. Control químico

El mezclado de vinos ha sido el método tradicional escogido por los enólogos y

viticultores de todo el mundo como la herramienta principal para corregir la excesiva acidez

de los vinos. Como su nombre indica, consiste en la mezcla de vinos de elevada acidez con

otros con una acidez mucho más baja en la proporción adecuada para la obtención de la acidez

deseada (Fugelsang y Edwards, 2007).

Los métodos de control de la acidez puramente químicos están basados principalmente

en la adición de carbonato cálcico o de bicarbonato potásico. Estos se combinan con el ácido

tartárico formando una sal insoluble que precipita y puede ser eliminado. Dicha precipitación

se puede dar también reduciendo la temperatura del vino tras la FA por lo que, a menudo, la

adición de dichas sales se emplea para facilitar este proceso (Volschenk et al., 2006).

Estos métodos presentan ciertos riesgos: la adicción de carbonato cálcico puede

derivar en un exceso de calcio en el vino y con ello en que este precipite tras el embotellado;

la desventaja de la adición de bicarbonato potásico es que a menudo tiene efectos

imprevisibles, lo que obliga a un estudio previo en laboratorio (Ribéreau-Gayón, 2006).

Además, el empleo de estos dos compuestos está limitado a la corrección del exceso de ácido

tartárico, no siendo aplicable a vinos en los que la elevada acidez deriva de un exceso de ácido

málico (Volschenk et al., 2006).

1.3.2. Control biológico: fermentación maloláctica

1.3.2.1. Concepto y factores físico-químicos que afectan al desarrollo

La corrección biológica de la acidez del vino se produce principalmente por la

conversión de ácido L-málico en ácido L-láctico a través de la FML. Esto conlleva una

reducción de la acidez total y sin afectar, en general, a las concentraciones de ácido tartárico

del vino (Ribéreau-Gayón et al., 2006; Muñoz et al., 2011), en un proceso que se da


47

generalmente en vinos tintos aunque también puede tener lugar en determinados blancos como

el Chardonnay (Juega et al., 2014).

La FML es llevada a cabo por bacterias malolácticas cuando las condiciones de pH y

temperatura, y las concentraciones de etanol y SO2, son las apropiadas (Bravo-Ferrada et al.,

2014).

Las bacterias ácido lácticas (BAL), en general, tienen un pH óptimo para su desarrollo

con valores que oscilan entre 4,2 y 4,5. El pH del vino se encuentra habitualmente entre 3 y 4

siendo el primero cercano al valor límite para la degradación de ácido málico, que se encuentra

en torno a pH 3,2. Aunque la conducción de la FML en estos valores supone por lo general

una ralentización en su desarrollo, evita la producción de ácido acético, al estar inhibida la

asimilación de azúcares por debajo de pH 3,5 (Hidalgo, 2002; Ribéreau-Gayón et al., 2006).

La temperatura óptima para crecimiento de las BAL, así como para el desarrollo de la

FML en vino se encuentra entre los 20 y los 25 ºC. Estas bacterias pueden desarrollarse a

temperaturas por debajo de estas temperaturas, aunque con una menor tasa de crecimiento, lo

que permite la conducción de dicha fermentación a las temperaturas habitualmente empleadas

en bodega, aunque de forma más lenta (van de Guchte et al., 2002; du Toit et al., 2011)

Las bacterias malolácticas son especialmente sensibles al proceso del sulfitado del

vino. Este proceso se realiza mediante la adición de metabisulfito potásico, de forma que

eliminan las bacterias que lo pueden deteriorar, mientras que se permite el desarrollo de las

levaduras, lo que tiene como consecuencia que, incluso a bajas concentraciones de SO, el

desarrollo de la FML puede verse afectado o incluso inhibido (Du Toit y Pretorius, 2000).

La presencia de etanol en el vino modifica la estructura de las paredes celulares de las

BAL, aumentando su permeabilidad y con ello la perdida de compuestos intracelulares (Bravo-

Ferrada et al., 2013). A partir de una concentración del 8% de etanol se empiezan a manifestar

estos efectos en las células, pero muchas especies de BAL son capaces de alterar sus paredes

celulares, incrementando también la concentración de etanol que son capaces de resistir

(Hidalgo, 2002).

Una adecuada selección de las cepas de bacterias malolácticas en base a su resistencia

a los parámetros anteriormente mencionados, facilita, por lo tanto, un correcto desarrollo de la

FML.


48

1.3.2.2. Impacto en vinos

1.3.2.2.1. Reducción de la acidez

La presencia desequilibrada de ácidos en el vino da lugar a sabores que habitualmente

se describen como inmaduros, verdes, o ácidos. La fermentación maloláctica es un proceso de

desacidificación biológica de los vinos consistente en la descarboxilación del ácido málico en

ácido láctico y CO2, dando lugar a una reducción en la acidez total del vino y a un ligero

aumento del pH (Ribereau-Gayon y Maujean, 2006).

El ligero incremento del pH del vino como consecuencia de la FML tiene efectos

colaterales en las características organolépticas del mismo. La conversión de ácido málico

sustituye el sabor agresivo de este por la acidez mucho más suave del ácido láctico (Lonvaud-

Funel, 1999).

1.3.2.2.2. Modificación del perfil aromático, color y textura

Además de la reducción de la acidez, las bacterias malolácticas pueden metabolizar

otros compuestos presentes en el vino, alterando la composición del mismo y aportando una

mayor complejidad en el aroma y el sabor (Sumby et al., 2014).

Por ejemplo, moléculas como terpenos, alcoholes alifáticos o norisoprenoides, se

encuentran formando glucósidos que no pueden ser detectados en la cata (Grimaldi et al.,

2005). Algunas BAL son capaces de romper los enlaces que mantienen unidas a estas

sustancias aromáticas gracias a la presencia de enzimas glucosidasas (Palmeri y Spagna, 2007;

Juega et al., 2013).

Del mismo modo, la presencia de enzimas esterasas, implicadas en la síntesis e

hidrolisis de esteres, también aporta al vino determinadas características organolépticas en

base a las diferentes concentraciones de esteres tras la FML (Liu, 2002).

A pesar de que, como se ha descrito, la FML es considerada habitualmente un proceso

favorable, en ciertas condiciones puede repercutir negativamente en la calidad del vino,

especialmente si se da de forma incontrolada.


49

En este sentido, destaca la capacidad de algunas BAL para liberar compuestos

fenólicos volátiles, que se encuentran de forma natural formando hidroxicinamatos, sustancias

imperceptibles al gusto y al olfato, pero pueden aportar sabores y aromas indeseados tras su

descarboxilación y reducción, y la consiguiente liberación de ácidos hidroxicinámicos (de las

Rivas et al., 2009; Sumby et al., 2014). Estos compuestos fenólicos tienen también una

incidencia directa sobre la astringencia del vino (Muñoz et al., 2011).

Por otra parte, la producción de diacetilo y acetoína por parte de las especies

heterofermentativas, como consecuencia del metabolismo del ácido cítrico, proporciona

aromas a mantequilla que son considerados negativos cuando sobrepasan los 5‐6 mg/L en los

vinos blancos y 8‐9 mg/L en los tintos (Liu, 2002).

En líneas generales, el desarrollo de la FML suele conducir a una reducción de los

aromas herbáceos, que son sustituidos por aromas más afrutados y mantecosos, en la medida

que se permita la liberación o formación de esteres y diacetilo. Otros aromas como los florales,

tostados, amargos o avainillados también pueden, en ocasiones, ser atribuidos a esta

fermentación (Muñoz et al., 2011).

La textura y el color del vino también se pueden ver afectadas durante el desarrollo de

la FML (Lonvaud-Funel, 1999; Muñoz et al., 2011).

Ciertas cepas de Pediococcus damnosus pueden dar lugar a un incremento indeseado

de la viscosidad del vino por la producción de polisacáridos, lo que puede afectar al “cuerpo”

del mismo e incluso a la etapa de filtrado, durante el su procesado (Liu, 2002).

El color puede verse afectado por una excesiva desacidificación, llevando a la

aparición de tonos azulados en el vino, en sustitución del color rojo esperado (du Toit y

Pretorious, 2000).

1.3.2.2.3. Estabilidad microbiológica

El incremento en la estabilidad microbiológica del vino está directamente relacionado

con el consumo y eliminación de los nutrientes que podrían ser metabolizados por

microorganismos indeseados. Entre estos se encuentran los ácidos cítrico y málico,


50

aminoácidos, vitaminas o azúcares residuales que no hayan sido empleados por las levaduras

durante la FA o liberados por las mismas durante su lisis (Volschenk et al., 2006).

Además, numerosas especies de BAL son capaces de producir compuestos

antimicrobianos capaces de inhibir el desarrollo de agentes contaminantes como hongos

filamentosos o levaduras (Rouse et al., 2007; Reis et al., 2012; Crowley et al., 2013).

1.3.2.2.4. Seguridad del producto

En adición al control de los efectos organolépticos anteriormente descritos, se ha de

garantizar también la seguridad del producto. Para ello, se han de evitar cepas productoras de

compuestos prejudiciales para la salud humana, como las aminas biógenas (ABs) o pro

carcinógenos como el carbamato de etilo (Leroy y De Vuyst, 2004).

La síntesis de ABs responde principalmente al proceso de descarboxilación de

aminoácidos por parte de los microorganismos presentes en el vino. Las bacterias acéticas, los

hongos filamentosos, las levaduras y las BAL han demostrados tener capacidad de síntesis de

estos compuestos nitrogenados (Smit et al., 2008), sin embargo, son los dos últimos grupos

microbianos los principales responsables de su producción. Los géneros de BAL

especialmente implicadas en dicha síntesis son Pediococcus, y Lactobacillus. Diferentes cepas

de Lactobacillus hilgardii han sido asociadas con la formación de histamina y putrescina en

vinos (Smit et al., 2008; Nannelli et al., 2008). O. oeni, principal especie implicada en

procesos de vinificación, también ha sido descrita como especie productora de ABs por

numerosos autores (Marcobal et al., 2004; Lucas et al., 2008).

La concentración de ABs en vinos no está en la actualidad regulada en la Unión

Europea por lo que en la mayoría de los países que la conforman solo existen recomendaciones

en cuanto al límite de concentración de estos compuestos. Así por ejemplo, el límite

recomendado de concentración para la histamina en Alemania es de 2 g/L, para Bélgica de

entre 5 y 6 g/L, de 8 g/L en Francia y de 10 g/L en Suiza (Landete et al., 2005; Yildirim et al.,

2007).


51

Estas restricciones responden a estudios que establecen la concentración de 20 mg/L

como el límite a partir del cual se pueden dar efectos sobre la salud del consumidor (Marcobal

et al., 2004).

El carbamato de etilo, es otro compuesto cuya producción ha de ser evitada por tratarse

de una sustancia pro carcinógena (Lonvaud-Funel, 1999). A pesar de que es producido

mayormente por las levaduras, algunas BAL pueden también originarlo a través del

metabolismo de la arginina (Volschenk et al., 2006).

1.3.2.3. Biodiversidad de BAL

Las BAL implicadas en los procesos de vinificación se engloban, principalmente,

dentro de los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus y Pediococcus. De todos ellos,

es probablemente el género Oenococcus el más estudiado y principal conductor de la FML en

vinos de todo el mundo, y más concretamente la especie O. oeni (Torriani et al., 2001; du Toit

et al., 2011) siendo, además, componente principal de la mayor parte de los cultivos

iniciadores comerciales.

El género Lactobacillus, es el segundo género más habitualmente encontrado en

procesos de vinificación, especialmente en aquellos vinos de pH superior a 3,5, en los que,

junto con especies del género Pediococcus, dominan sobre el resto de BAL (du Toit et al.,

2011). La presencia de estos microorganismos en el vino ha sido históricamente considerada

negativa para la calidad del mismo, sin embargo, en la actualidad se está poniendo énfasis en

el estudio de especies de estos géneros y su aplicación para la conducción de la FML (Juega

et al., 2014; Bartowsky et al., 2015).

Además de los géneros anteriormente mencionados, se ha descrito la presencia de

otros géneros vinculados a vino, como Lactococcus, Leuconostoc o Weissella (Valdés La Hens

et al., 2014; Nisiotou et al., 2015).

1.3.2.4. Dinámica poblacional

Las BAL están presentes durante todos los pasos que llevan a la transformación del

mosto o zumo de uva en vino. Su principal fuente se encuentra en las uvas y hollejos, pero un


52

importante número puede provenir de los utensilios empleados o de las cubas en última

instancia (Muñoz et al., 2011).

A lo largo de todo el procesado del vino se pueden apreciar variaciones en las

dinámicas poblacionales de las bacterias lácticas (Fig. 3). Esto es debido principalmente a los

cambios en la composición química del vino en cuanto a la composición de azúcares y

concentración de etanol, así como a la disponibilidad de nutrientes, partiendo de una densidad

de BAL en el mosto y fases tempranas de la FA en un rango de entre 102 y 104 UFC/mL.

Una vez comenzado el desarrollo de las levaduras y la consiguiente liberación de

etanol como consecuencia de la FA, la densidad de bacterias lácticas se ve reducida

drásticamente hasta aproximadamente 102-103 UFC/mL en las primeras fases de la FA

pudiendo caer hasta las 102 UFC/mL al término de la misma. Este desplome en términos de

densidad celular se ve reflejado también en una caída en la variedad de especies de BAL.

Figura 3: Evolución de la población de BAL en las diferentes fases de vinificación (Ribéreau-Gayón

et al., 2006).

Terminada la fermentación, las bacterias comienzan a multiplicarse debido a la

presencia de nutrientes derivados de la lisis de las levaduras y a unas condiciones de pH y

temperatura más adecuadas para su desarrollo. En este punto, las bacterias lácticas alcanzan

Días

Inicio de la FML

Fin de la FML

Latencia

FA

Log

(UFC

/mL)


53

un pico de densidad poblacional de en torno a las 106 - 107 UFC/mL y, en caso de tratarse de

las cepas apropiadas (la capacidad de asimilación y transformación del ácido málico es

variable en función de la cepa bacteriana -Sumby et al., 2014- ), comienzan la FML, que durará

entre 5 días y 2-3 semanas (Muñoz et al., 2011).

La alternancia que se da entre levaduras y bacterias asegura unas óptimas condiciones

de vinificación, ya que la asimilación de los azúcares por parte de las primeras impide que las

bacterias empleen la ruta heterofermentativa para asimilarlos, lo que incrementaría la acidez

volátil del caldo (Ribéreau-Gayón et al., 2006).

Del mismo modo que existe una alternancia bacteria-levadura durante las etapas de

elaboración del vino, también se da una alternancia entre grupos bacterianos, principalmente

entre bacterias heterofermentativas y homofermentativas. Aunque la supervivencia de unas u

otras especies bacterianas depende principalmente de su adaptabilidad a las duras condiciones

de acidez y grado alcohólico del medio (Ribéreau-Gayón et al., 2006), en líneas generales

predominan las especies homofermentativas en las primeras fases del procesado (por ej. las

pertenecientes al género Pediococcus), que darán paso a las especies heterofermentativas,

habitualmente Lactobacillus, Leuconostoc y/u Oenococcus, pero sin que las primeras lleguen

a desaparecer completamente (Blasco-Escrivá, 2009).

Como es obvio, estas densidades poblacionales están estrictamente relacionadas con

numerosos parámetros implicados en la vinificación, como las condiciones climáticas de la

región, las técnicas empleadas en el proceso de elaboración o las características específicas de

cada vino (Ribéreau-Gayón et al., 2006).

1.3.3. Fermentación malo-alcohólica con Schizosaccharomyces pombe

El empleo de levaduras del género Schizosaccharomyces ha sido también estudiado

para la corrección del exceso de acidez en vinos. Éstas son capaces de llevar a cabo la

degradación del ácido málico a través de un proceso denominado fermentación malo-

alcohólica, que conduce a la transformación de entre un 75% y un 100% de este ácido orgánico

en etanol (Suárez-Lepe et al., 2012). Sin embargo, es la producción de ácido acético

nuevamente el mayor inconveniente para su empleo (Benito et al., 2013), sumado a que la


54

temperatura óptima a la que lleva a cabo esta fermentación está en torno a 30 ºC, lo que podría

afectar negativamente a las características del vino (du Toit y Pretorius, 2000).

1.3.4. Enzima maloláctico

Otra opción que ha sido objeto de estudio para llevar a cabo la FML ha consistido en

la adición directa de la enzima maloláctica al vino. Esto tiene obvias ventajas al no existir la

posibilidad de desarrollo de ninguno de los aspectos negativos derivados del metabolismo de

las BAL, pero parece que su funcionamiento en las condiciones del vino no es el óptimo, al

verse inhibida por numerosas componentes del mismo (Ribéreau-Gayón et al., 2006).

La aplicación de esta enzima inmovilizada parece mejorar la estabilidad de la misma,

pero el hecho de que su pH óptimo se encuentre en torno a 6, y la necesidad de adición de

cofactores para el que la enzima desarrolle su actividad (Maicas, 2001), supone un hándicap

en su aplicación en procesos de vinificación (Sumby et al., 2014).

1.3.5. Mejora genética de cepas vínicas

La aplicación de técnicas de ingeniería genética ha intentado en los últimos años dar

solución a una parte de la problemática anteriormente mencionada.

Betteridge et al. (2015) han recopilado recientemente las principales técnicas de

mejora genética en O. oeni. En líneas generales, los principales mecanismos de mejora

genética incluyen las técnicas de genética molecular que conducen a la sobreexpresión de

genes de interés propios o a la expresión de genes ajenos a la especie bajo estudio, la

mutagénesis, que produce mutaciones al azar (y exige la consiguiente selección de los aislados

con las características deseadas), la evolución dirigida (mediante la que se inducen cambios

fisiológicos a través de la multiplicación continuada de estos organismos), y el “genome

shuffling”, técnica empleada principalmente para la obtención de cepas con características

deseadas a partir de la combinación de las características de su cepas parentales, generalmente

por fusión de protoplastos.

Desde hace aproximadamente 20 años, se han llevado a cabo estudios para la

clonación del gen maloláctico en diferentes especies (Sumby et al., 2014), con la finalidad de


55

obtener buenos rendimientos malolácticos evitando las desventajas del uso de cepas de BAL.

Este desvío de recursos hacia este campo da idea de las dificultades para conseguir una cepa

maloláctica óptima para su empleo en procesos de vinificación.

La introducción de genes malolácticos en cepas vínicas no está exenta de problemas,

siendo el principal que la enzima maloláctica resultante de su expresión es intracelular. Esto

obliga a la entrada del ácido málico en el interior celular en un proceso llevado a cabo por

proteínas transportadoras (Ribereau-Gayon, 2006) que han de estar presentes en la célula, o

expresarse junto con el gen maloláctico, lo que, o bien reduce el abanico de cepas receptoras,

o complica clonación.

En este sentido, se están llevando a cabo numerosos intentos de clonación de este gen

en cepas de Lactobacillus que ya dispongan de la proteína transportadora. Schümann et al.

(2013), consiguieron expresar un gen maloláctico de O. oeni en una cepa de L. plantarum pero,

aunque consiguieron la conversión del ácido málico sin necesidad de una adaptación previa

de las células a las condiciones del vino, la expresión de la enzima maloláctica fue inhibida

rápidamente.

No sin detractores, la mayor barrera que alguna de estas técnicas y los productos de

las mismas encuentran para su aplicación son las restricciones legales presentes en la mayor

parte de los países productores de vino del mundo, así como la reticencia de la sociedad al

consumo de organismos modificados genéticamente o sus derivados.

1.4. Tecnología de la fermentación maloláctica

1.4.1. Fermentación espontánea

El desarrollo de la FML puede tener lugar de forma espontánea si no se ejerce un

control sobre las condiciones de almacenamiento y/o de la microbiota asociada al vino

pudiendo conllevar, como se ha dicho, serios riesgos de un detrimento de su calidad.

En numerosas bodegas se permite su desarrollo de forma intencionada, sin embargo,

su consecución es a menudo variable, siendo habitual que esta no se desarrolle completamente,

que sea extremadamente lenta, o que tan siquiera se inicie (Ribéreau-Gayón et al., 2006; Ruiz

et al., 2010; du Toit et al., 2011).


56

1.4.2. Fermentaciones dirigidas con cultivos iniciadores

La alternativa al problema referido previamente es la inducción de la FML con cultivos

iniciadores. Esto supone la adicción de las bacterias malolácticas en forma líquida o

deshidratada que pueden tener su origen en la propia bodega, a través del aislamiento y

selección de los mismos, o bien tratarse de cultivos iniciadores comerciales.

Existen en el mercado multitud de productos basados en BAL para la conducción de

la FML. Marcas como AEB Ibérica, Lallemand o Laffort, entre otras, han desarrollado

numerosos cultivos iniciadores, la mayor parte de ellos basados en O. oeni.

Sin embargo, el mal funcionamiento de esta especie en determinados vinos ha hecho

que, en la actualidad, alguna de estas empresas este introduciendo en el mercado cultivos

iniciadores basados en especies de Lactobacillus, o cultivos mixtos. Así por ejemplo, AEB

ibérica ha optado por la inclusión en sus estárteres de hasta 4 cepas de O. oeni a fin de

garantizar una FML satisfactoria en un rango más amplio de condiciones de vinificación.

Anchor Wine Yeast ha desarrollado cultivos iniciadores que incluyen cepas de O. oeni y L.

plantarum con los que garantizan la no formación de ácido acético o aminas biógenas y

Lallemand cuenta con ML Prime™ a base exclusivamente de L. plantarum, con el que afirman

degradar ácido málico en concentraciones de 3 g/L, pero a valores de pH de 3,4, y entre 20 y

26 ºC.

1.4.2.1. Momento de la inoculación

Existen dos modalidades principales para conseguir una FML dirigida: la inoculación

con bacterias malolácticas durante las primeras etapas de la FA, es decir, co-inoculadas con la

levadura, o al final de la misma (post-FA) (du Toit et al., 2011; Bartowsky et al., 2015). Ambas

prácticas presentan ventajas e inconvenientes, por lo que su empleo ha de establecerse en base

a las características de cada vino y/o de la cepa o especie de bacteria láctica empleada.

La inoculación post-FA minimiza la interacción entre las bacterias y las levaduras,

reduciendo el riesgo de inhibición mutua del crecimiento y con ello de una parada de la FA o

el no inicio de la FML. En cambio, se corre el riesgo de que, de no existir una adaptación

previa a las condiciones de vinificación, se ralentice el inicio de la FML, permitiendo el

desarrollo de microorganismos indeseados (Fugelsang y Edwards, 2007).


57

La co-inoculación permite la adaptación de las bacterias lácticas a las condiciones del

vino, lo que, en general, acelera el desarrollo de la FML (Bartowsky et al., 2015). Sin embargo,

si no se realiza una selección apropiada, puede interferir en el desarrollo de las levaduras o dar

lugar a un incremento de la acidez a través de la producción de ácido acético. Es por esto, que

esta modalidad está más indicada para vinos de elevada acidez y alta concentración de azúcares

(y la consiguiente alta concentración de etanol al final de la FA) (Sumby et al., 2014).

Abrahamse y Bartowsky (2012) analizaron los efectos de la co-inoculación de O. oeni

(Viniflora oenos™), así como de la inoculación a la mitad de la FA y al final de la misma, en

vino tinto Shiraz, obteniendo como resultado una más rápida FML en el primer caso, sin

afectar al desarrollo de las levaduras. Paralelamente se registraron concentraciones de ácido

acético superiores a las de aquellos vinos sin FML, aun siendo este incremento similar en las

dos modalidades de inoculación.

Respecto a este último parámetro, Guzzon et al. (2013) obtuvieron resultados

similares tras estudiar el efecto de la co-inoculacion con varios preparados de bacterias

malolácticas comerciales en vinos Merlot, Cabernet Sauvignon, Teroldego y Marzemino.

Ésta producción de ácido acético parece ser la principal causa de que el sector

vitivinícola este dividido entre los que apoyan esta práctica y los que la rechazan, ya que la

mayor parte de los estárteres comerciales están basados en cepas de la especie O. oeni, especie

heterofermentativa que puede dar lugar a ácido acético a través del metabolismo de los

azúcares del mosto (Bartowsky et al., 2015).

La alternativa sería el empleo de especies homofermentativas o heterofermetativas

facultativas como L. plantarum, evitando así el riesgo de producción de dicho ácido

(Ribéreau-Gayón et al., 2006). Así por ejemplo, empresas como Lalleman o Anchor Wine

Yeast reservan para co-inoculación los cultivos iniciadores que contienen cepas de L.

plantarum.

1.5. Problemática en la consecución de la FML

La inducción de la FML con cultivos iniciadores comerciales es una de las

herramientas más empleadas para la reducción de la acidez en vinos de todo el mundo. Sin

embargo, esta práctica no está exenta de problemas.


58

Como se ha mencionado, los estárteres comerciales a menudo están compuestos por

una sola cepa bacteriana o una única especie (generalmente O. oeni). Los requerimientos

nutricionales de ésta pueden verse o no satisfechos en función del vino en el que sea inoculado,

lo que hace que en ocasiones la FML no sea satisfactoria o no llegue a iniciarse.

A esto hay que sumar que, cuando estos cultivos iniciadores se inoculan tras la FA,

generalmente requieren de un período de latencia más largo, debido a la necesidad de las

células bacterianas de adaptarse a unas duras condiciones para su desarrollo. Este período

supone un riesgo de proliferación de organismos indeseados, prolongando además el tiempo

de consecución de una FML aceptable (Abrahamse y Bartowsky, 2012).

1.6. Obtención de cultivos iniciadores

Para la consecución de una FML satisfactoria han de seleccionarse bacterias

malolácticas que respondan adecuadamente a las condiciones de pH, temperatura y

concentración de etanol y SO2 que se van a encontrar una vez sean inoculadas, especialmente

en cultivos iniciadores que vayan a ser inoculados en etapas posteriores a la FA, al no existir

la posibilidad de adaptación de éstos a dichas condiciones (du Toit et al., 2011).

Sumado a esto, se ha de garantizar la seguridad del cultivo iniciador evitando aquellos

que produzcan aminas biógenas o carbamato de etilo, y aquellas que lleven a un detrimento de

la calidad final del producto. En este sentido se ha de analizar la capacidad de las mismas para

liberar compuestos aromáticos indeseados, o para alterar las características del vino en cuanto

a color y textura (Volshenk et al., 2006) del modo que se ha descrito anteriormente.

Cuando los cultivos iniciadores van a ser empleados en co-inoculación, adquiere una

especial importancia la selección de cepas homofermentativas debido a la presencia de

azúcares en elevadas concentraciones. El empleo de estos azúcares por parte de las cepas

heterofermentativas a menudo desemboca en la producción de ácido acético, y con ello de un

incremento indeseado de la acidez del vino. Del mismo modo, las bacterias inoculadas en esta

modalidad han de ser compatibles con la levadura conductora de la FA, a fin de evitar la

inhibición del crecimiento de las bacterias malolácticas por esta (Fugelsang y Edwards, 2007).


59

Si, además, se pretende comercializar el estárter, es recomendable que la cepa soporte

los procesos de liofilizado, ya que, aunque también puede distribuirse en forma líquida, lo

habitual es su comercialización en polvo (González et al., 2011; du Toit et al., 2011).

El aislamiento de cepas de bacterias lácticas asociadas al propio vino en el que serán

inoculadas supone, a menudo, la mejor opción a la hora de conducir la FML. Estas cepas están

adaptadas a las condiciones de vinificación, siempre que se haga un mantenimiento adecuado

de las mismas, reduciendo así el tiempo de desarrollo en el vino, y con ello, favoreciendo una

FML más eficiente (La Hens et al., 2014; Sumby et al., 2014).

CAPÍTULO I Materiales y Métodos

60

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Medios de cultivo

Medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe 1960, Panreac): Peptona 10 g/L, Extracto de

carne 5 g/L, Extracto de levadura 5 g/L, D (+)-Glucosa 20 g/L, Di-potasio hidrogeno fosfato

2 g/L, Di-amonio hidrogeno citrato 2 g/L, Acetato sódico 5 g/L, Sulfato de magnesio 0,1 g/L,

Sulfato de manganeso 0,05 g/L, pH 6,5. Este medio fue suplementado con jugo de tomate

(10%) cuando fue necesario. Para la elaboración de medio sólido se añadió una concentración

de 15 g/L de agar.

Medio MLO (Medio para Leuconostoc oenos; Caspritz y Radler, 1983): Triptona 10

g/L, Extracto de levadura 5 g/L, Glucosa 10 g/L, Fructosa 5 g/L, Sulfato de magnesio 0,2 g/L,

Sulfato de manganeso 0,05 g/L, Citrato de diamonio 3,5 g/L, 1 ml de Tween 80, Cisteína HCl

0,5 g/L, ácido l-málico 10 g/L, pH 5,5. Cuando fue necesario se solidificó con agar a una

concentración de 20 g/L.

“Agar Vino” (diseñado en nuestro laboratorio): se preparó un medio utilizando como

base el mismo vino empleado en el estudio. Para ello se ajustó el pH del mismo a 4,5, mediante

la adición de NaOH 10N y se esterilizó a través de membranas con un tamaño de poro de 0,22

µm. Cuando fue necesario solidificarlo, se esterilizó en autoclave la cantidad apropiada de

agar, disuelta en agua, (1,5% p/v del total de vino empleado). Paralelamente, se mantuvo el

vino en incubación a 50 ºC en un frasco con tapón de rosca (minimizando así la evaporación

de alcohol) a fin de evitar la solidificación inmediata del agar al añadirlo al mismo, y

permitiendo una mezcla homogénea.

Todos los medios, excepto el que incluye vino natural, fueron esterilizados en

autoclave a 121 ºC durante 15 min, 1 atm de presión.

Los medios de cultivo destinados al aislamiento de bacterias ácido lácticas fueron

suplementados con 100 µg/mL de cicloheximida (CH) para evitar la proliferación de levaduras

y hongos filamentosos.


61

2.2. Aislamiento de bacterias ácido lácticas

Para llevar a cabo el muestreo se escogió la Bodega Condes de Albarei en la región

del Salnés perteneciente a la D.O Rías Baixas. Esta bodega fue seleccionada ya que funciona

en régimen de cooperativa y recibe uvas de las diferentes sub-zonas que componen la citada

región, todas ellas pertenecientes a la variedad Vitis vinifera Albariño.

Durante dos cosechas consecutivas (años 2007 y 2008), se tomaron muestras de 1L de

diferentes tanques de la bodega correspondientes a las etapas de: mosto sulfitado (M),

fermentación alcohólica (FA) y fermentación maloláctica (FML). Las muestras se

centrifugaron a 22000 x g, durante 10 min a 4 ºC. Obtenido el precipitado, éste fue

resuspendido en 10 mL de solución salina (NaCl 0,8%), volumen que fue posteriormente

dividido en 3 alícuotas de 3 mL que serían tratadas independientemente. La primera de las

alícuotas fue conservada a -20 ºC. Las otras dos alícuotas fueron empleadas para llevar a cabo

una siembra directa en placas de MRS y MLO suplementadas con CH (200 µL de muestra por

placa) e incubadas en anaerobiosis a 30 ºC durante 5 días.

Una primera selección de los aislados de presuntas bacterias malolácticas fue realizado

en base a su morfología celular, a su carácter Gram, y a la reacción frente a peróxido de

hidrógeno (catalasa). Se seleccionaron bacterias de forma cocoide o bacilar, Gram-positivas y

catalasa negativas.

2.3. Otras cepas bacterianas utilizadas en este estudio

Los métodos de identificación y caracterización que se describen a continuación tienen

su base en la comparación tanto de secuencias de ADN como de características bioquímicas

de los aislados de hipotéticas bacterias malolácticas frente a aislados de especies conocidas,

para lo cual se emplearon las cepas de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Tabla

1):


62

Tabla 1: Cepas de la Colección Española de Cultivos Tipo empleadas en la

identificación de los aislados de bacterias lácticas.

2.4. Conservación de los aislados bacterianos

Las cepas fueron conservadas en medio MRS o MLO suplementado con un 30% de

glicerol, a una temperatura de -20 ºC.

2.5. Elaboración del perfil bioquímico de asimilación de azúcares

Se empleó el kit comercial API® 50CHL (bioMérieux® SA). Para ello se inoculó el

medio incluido en el kit con una concentración celular correspondiente al grado 2 de la escala

de McFarland, proveniente de un cultivo crecido previamente en medio MRS a 30 ºC durante

2-7 días en función de la especie.

Se añadió este medio a las celdillas en la cantidad apropiada y se cubrieron con aceite

de parafina estéril para crear una atmosfera anaerobia. La incubación se realizó a 30 ºC y la

lectura se llevó a cabo tras 48 h, agrupando los aislados en base a la tabla de identificación

proporcionada por el fabricante.

Especie Cepa

Lactobacillus brevis CECT 5354

Lactobacillus casei CECT 475

Lactobacillus helveticus CECT 403

Lactobacillus hilgardii CECT 4786

Lactobacillus paraplantarum CECT 5787

Lactobacillus pentosus CECT 4023

Lactobacillus plantarum CECT 220

Lactobacillus rhamnosus CECT 288

Lactobacillus paracasei subsp. tolerans CECT 4175

Lactococcus lactis subsp. lactis CECT 185

Oenococcus oeni CECT 217

Pediococcus damnosus CECT 793


63

2.6. Manipulación de ácidos nucleicos

2.6.1. Extracción de ADN

Para la extracción del ADN cromosómico, las bacterias fueron cultivadas durante 5 -

7 días en tubos con 10 mL de medio MRS suplementado con un 10% de jugo de tomate, a 30

°C. Un mililitro de cada cultivo fue transferido a viales Eppendorf y centrifugado a 14000 x g

durante 5 minutos (Microfuge® 22R Centrifuge, Beckman Coulter™). Una vez eliminado el

sobrenadante, el sedimento fue tratado con el kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit

(Promega).

Para ello las células se resuspendieron en 480 µL de EDTA (50 mM, pH 8), incluyendo

en este punto un paso consistente en un choque térmico, realizando un ciclo previo de

congelación/descongelación (-80 °C, 5 min; 80 °C, 5 min) para, en adelante, continuar con los

pasos indicados en dicho kit.

2.6.2. Amplificación del ADNr 16S

Para la amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) del fragmento

codificante del ADNr 16S bacteriano se preparó la siguiente mezcla de reacción en un volumen

total de 100 µL: 40-50 ng de ADN, 8,8 µM de cebador directo (5'- CCGAATTCGTC

GACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'), 8,8 µM de cebador inverso (5’- CC

CGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACCT -3'), empleados previamente por

Weisburg et al. (1991), 5 mM de mezcla de los 4 oligonucleótidos, 2 mM de MgCl2, 2,5 U de

Taq Polimerasa (BIOTAQ DNA polimerasa, Bioline).

Las condiciones utilizadas para amplificación utilizando un termociclador (Primus 96

plus, MWG AG Biotech) fueron: 1 ciclo a 95 °C durante 1 min para la desnaturalización

inicial, 30 ciclos de: 95 °C durante 1 min para la desnaturalización cíclica, 62 °C durante 1:30

min para hibridación, 72 °C durante 1:30 min para la elongación, y un último ciclo a 72 °C

durante 5 min para la elongación final.


64

2.6.3. Amplificación de la región espaciadora intergénica (ISR) 16S/23S

Para la amplificación de esta región del ADN bacteriano se empleó el método descrito

anteriormente por Moreira et al. (2005). Los cebadores empleados fueron: 16-1A: 5’-

GAATCGCTAGTAATCG -3’ como directo y 23-1B: 5’- GGGTTCCCCCATTCGGA -3’

como reverso.

La mezcla de reacción empleada fue la misma que para la amplificación del ADNr

16S y las condiciones de amplificación utilizadas fueron: 94 ºC durante 2 min, 35 ciclos de:

94 ºC durante 30 s, 55 ºC durante 1 min, 72 ºC durante 1 min, y una elongación final a 72 ºC

durante 10 min, en el termociclador Primus 96 plus, MWG AG Biotech.

En esta amplificación se observaron 3 bandas de diferente tamaño debido a que en

ocasiones esta región puede contener 1 o 2 genes, dependiendo de la especie (Moreira et al.

2005). La banda de tamaño más pequeño se correspondería con dicha región sin genes, la

banda de tamaño mediano se correspondería con el ISR más un gen, y la banda de mayor

tamaño se correspondería con el ISR más dos genes. Por ello se aisló, a partir del gel de

agarosa, la banda de 600 pares de bases (pb), correspondiente con la secuencia sin la inserción

de ningún gen, y que fue purificada con el kit Geneclean® Kit (MP Biomedicals, LLC).

2.6.4. Amplificación del gen recA

Para la amplificación del gen recA se empleó el método descrito por Torriani et al.

(2001). Se realizaron dos tipos de PCR, una múltiple con cebadores específicos de especie y

una PCR estándar con cebadores degenerados.

Los cebadores específicos de especie empleados fueron:

- paraF: 5’-GTCACAGGCATTACGAAAAC-3’ (Directo), específico de la especie L.

paraplantarum.

- pentF: 5’-CAGTGGCGCGGTTGATATC-3’ (Directo), específico de la especie L.

pentosus.

- planF: 5’-CCGTTTATGCGGAACACCTA-3’ (Directo), específico de la especie L.

plantarum.

- pREV: 5’-TCGGGATTACCAAACATCAC-3’ (Reverso)


65

La mezcla de reacción se preparó en un volumen de 25 µL, a los que se añadieron 40

ng de ADN bacteriano. El resto de componentes de la mezcla de reacción fueron añadidos a

las concentraciones siguientes: cebadores paraF, pentF y pREV a 0,25 µM cada uno, el

cebador planF a 0,12 µM, 12 µM de la mezcla de los 4 oligonucleótidos (3 µM cada uno), 1,5

mM de MgCl2 y 1 U de Taq Polimerasa (BIOTAQ DNA polimerasa, Bioline).

Las condiciones utilizadas para la amplificación fueron: desnaturalización inicial a 94

ºC durante 3 min, 30 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC, 30 s, anillamiento a 56 ºC, 10 s,

elongación: 72 ºC, 30 s, y extensión final a 72 ºC durante 5 min.

Los cebadores degenerados empleados fueron: RecAFw: 5’- TTYATH

GAYGCNGARCAYGC -3’ y RecARev: 5’- CCWCCWGKWGTHGTYTCNGG -3’. Las

condiciones de amplificación fueron las siguiente: desnaturalización inicial a 94 ºC durante 1

min, 30 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC, 1 min; anillamiento a 55 ºC, 1 min y 30 s y

elongación a 72 ºC durante 1 min, con una extensión final a 72 ºC durante 5 min.

La mezcla de reacción consistió en 50 ng de ADN, 50 µM de cada cebador, 100 µM

de la mezcla de oligonucleótidos, 50 mM de MgCl2 y 2,5 U Taq Polimerasa, en un volumen

total de 25 µL.

2.6.5. Purificación de fragmentos de ADN a partir de gel de agarosa

Los productos de las amplificaciones de ADN por PCR fueron, en ocasiones,

purificados a partir de geles de agarosa a fin de llevar a cabo re-amplificaciones sin secuencias

de ADN interferente o no deseado y/o el corte con enzimas de restricción.

Para ello, la banda que contenía el ADN de interés fue cortada con una cuchilla y el

fragmento depositado en un vial Eppendorf de 1,5 mL, y tratado con el kit Geneclean® Kit

(MP Biomedicals, LLC).

2.6.6. Secuenciación

Las secuencias de ADN amplificado y purificado fueron secuenciadas mediante el

método de Sanger (Sambrook y Russell, 2001).


66

2.6.7. Digestión de ácidos nucleicos con enzimas de restricción

El fragmento de ADN correspondiente a la región codificante para el ADNr 16S

bacteriano fue digerido con las enzimas de restricción MseI, BfaI, AluI, HaeIII, BtgZI (New

England Biolabs® INC.) y la región ISR 16S-23S con VspI (Fermentas).

La selección de estas enzimas de restricción, en base a las referencias mostradas en la

Tabla 2, fue complementada con el corte in sílico de las secuencias de interés mediante el

programa pDRAW32.

Tabla 2: Enzimas de restricción empleadas en los análisis ARDRA.

Enzima Concentración BSA Tiempo Temp.

(ºC) Sitio de corte

Secuencia

diana Referencia

MseI 2 U 100

µg/ml

1 hora 37 T▼TAA 16S Rodas et al.

(2003)

BfaI 2 U - 1 hora 37 C▼TAG 16S Rodas et al. (2003)

AluI 2 U - 1 hora 37 AG▼CT 16S Rodas et al.

(2005)

HaeIII 2 U - 1 hora 37 GG▼CC 16S Rodas et al.

(2005)

BtgZI 2 U 100 µg/ml

2 horas 60 GCGATG(N)10▼ 16S Este estudio

VspI 1 µL - 10 min. 37 AT▼T AAT ISR Moreira et al.

(2005)

La enzima BtgZI se seleccionó en base al alineamiento de las secuencias de ADNr 16S

de L. rhamnosus (D16552.1, AFZY01000009.1 y AF243146.1), L. casei (D86518.1,

D16549.1 y AB008204.1) y L. paracasei (NR_025880.1, D79212.1 y HQ423165.1), que

mostró una diana de reconocimiento (GCGATG (N) 10) en estas dos últimas especies, no

siendo así en L. rhamnosus. Dicho alineamiento se muestra en la Fig. 4.

L. casei (D86518.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. casei (D16549.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. casei (AB008204.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. paracasei (NR_025880.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. paracasei (D79212.1) TAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. paracasei (HQ423165.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. rhamnosus (D16552.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. rhamnosus (AF243146.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG

L. rhamnosus (AFZY01000009.1) TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCC GAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGG ********************************** ************************************************

Figura 4: Fragmento del alineamiento de las secuencias ADNr 16S de las especies L. casei, L. paracasei

y L. rhamnosus. Diana de reconocimiento de la enzima BtgZI marcada en verde. La flecha indica el

sitio de corte.


67

2.7. Análisis bioinformático

2.7.1. Bases de datos y herramientas bioinformáticas empleadas

Las bases de datos del NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information), fueron

empleadas para la búsqueda de las secuencias de ADN que serían incluidas en los árboles

filogenéticos para verificar el agrupamiento.

BlastN (Basic local alignment search tool) (Altschul et al., 1990), fue empleado para

realizar la comparación entre las secuencias obtenidas de las cepas objeto de estudio y aquellas

depositadas en las bases de datos. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

ClustalW (Larkin et al., 2007), fue empleado para realizar el alineamiento de las

secuencias de ADN obtenidas tanto de las bases de datos como a partir de las cepas aisladas

en este estudio. http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.

MEGA versión 5.0 (Tamura et al., 2011), fue empleado para la elaboración de los

árboles filogenéticos.

pDRAW32 “DNA analysis software” (AcaClone), fue empleado para llevar a cabo la

predicción virtual de los cortes con las enzimas de restricción que serían posteriormente

empleadas. http://www.acaclone.com/.

2.7.2. Elaboración del árbol filogenético 16S y recA

Para obtener los árboles filogenéticos, utilizando las secuencias del gen 16S de un

fragmento del gen recA, se emplearon los programas ClustalW2 (Chenna et al., 2003) y

MEGA versión 5 (Tamura et al., 2011).

El primero de ellos proporcionó el alineamiento de las secuencias una vez acotadas al

tamaño de 1378 pb para el gen ADNr 16S y de 245 pb en el fragmento del gen recA.

Este alineamiento se trasladó al programa MEGA 5, con el que finalmente se obtuvo

dicho árbol. Se estableció un bootstrap de 1500 réplicas para elaborar un árbol de máxima

similitud y se empleó el modelo de sustitución de Tamura-Nei.


68

2.8. Microfermentaciones

Las microfermentaciones se llevaron a cabo en frascos de vidrio que contenían 100

mL de vino de la bodega Condes de Albarei, previamente centrifugado a 9800 x g durante 15

min. Las características químicas de dicho vino eran: Ácido málico: 4,8 g/L, Ácido Tartárico:

2,6 g/L, acidez total: 6,28 g/L, acidez volátil: 0,23 g/L, glicerol 5,2 g/L, SO2 total: 75 mg/L.

Un grado alcohólico del 12% y un pH de 3,8.

Se prepararon cultivos frescos de las diferentes cepas sembrando los mismos en Agar-

Vino (pH 4,5), a 28 ºC. Una vez crecidos en este medio, fueron inoculados en un medio líquido

compuestos por el mismo vino, suplementado con un 10% de MRS (pH final = 4) para preparar

los inóculos. Estos se utilizaron para inocular las microfermentaciones a una densidad celular

de 105 células/mL. El vino sin inocular se incluyó como control. La fermentación transcurrió

a 20 ºC durante 15 días, tras los cuales los vinos fueron centrifugados y conservados para su

posterior análisis. Los ensayos se realizaron por duplicado.

Los vinos resultantes de las microvinificaciones fueron analizados con el equipo

WineScan™ (Foss) para la determinación de la concentración de ácido málico, ácido láctico y

acidez volátil (concentración de ácido acético).

2.9. Determinación molecular de la presencia de genes codificantes de enzimas

descarboxilasas de ácidos fenólicos

Se determinó la capacidad de las bacterias seleccionadas en base a su actividad

maloláctica para la liberación de ácidos fenólicos en vino. Para ello se trató de detectar la

presencia del gen pdc, codificante para la enzima descarboxilasa de ácidos fenólicos, siguiendo

el protocolo descrito por Mtshali et al. (2009).

Se emplearon los cebadores PAD-1 (5’-AARAAYGAYCAYACYRTTGAT TACC-

3’) como directo y PAD-3 (5’-TTCTTCWACCCAYTTHGGGAAGAA-3’) como reverso, a

una concentración de 0,4 µM cada uno, en un volumen total de reacción de PCR de 50 µL. El

resto de componentes fueron: y 10 ng de ADN, 0,25 mM de mezcla de oligonucleótidos, 1,5

mM de MgCl2 y 1,25 U de Taq polimerasa (Takara),


69

Las condiciones de amplificación fueron las siguiente: desnaturalización inicial a 94

ºC durante 2 min, 35 ciclos de: desnaturalización a 94 ºC, 40 s; anillamiento a 50 ºC, 1 min y

elongación a 72 ºC durante 30 s , con una extensión final a 72 ºC durante 5 min.

Se empleó la cepa de L. brevis CECT 5354 como control positivo, ya que había sido

previamente descrita su capacidad para producir ácidos fenólicos (Curiel et al., 2010).

2.10. Determinación de la actividad β-glucosidasa

La determinación de la capacidad para producir β-glucosidasa se llevó a cabo en las

cepas de bacterias malolácticas seleccionadas en base a su actividad maloláctica.

Para determinar la actividad β-glucosidasa se empleó el método descrito por Grimaldi

et al. (2005) con algunas modificaciones. La cuantificación de la actividad β-glucosidasa se

llevó a cabo en células vivas.

2.10.1. Actividad β-glucosidasa en células vivas

Las cepas de bacterias malolácticas fueron cultivadas en medio MRS a 30 ºC durante

el tiempo necesario hasta que alcanzaron la fase estacionaria (dato basado en las curvas de

crecimiento de cada una de ellas realizadas previamente).

En este punto se tomaron 10 mL de cultivo de cada una de las cepas y se centrifugaron

a 2894 x g durante 15 min. Se retiró el sobrenadante, que fue conservado a -20 ºC para el

estudio de la actividad β-glucosidasa.

El precipitado fue lavado dos veces con solución salina (NaCl 0,85%) a 13000 x g

durante 3 min tras lo cual las células fueron resuspendidas en dicha solución (1 mL).

A partir de ésta, se prepararon suspensiones celulares en un volumen de 5 mL para

cada una de las cepas a una densidad óptica de 1, medida a 600 nm, las cuales serían empleadas

en las reacciones posteriores.

La mezcla de reacción se llevó a cabo en un volumen total de 160 µL, de los cuales

80 µL corresponden a tampón McIlvaine (McIlvaine, 1921) 200 mM (ácido cítrico 0,1 M y


70

K2HPO4 0,2 M), preparado a pH 4,0. Cuarenta microlitros corresponden a la suspensión celular

descrita anteriormente, y los restantes 40 µL corresponden al sustrato 4-nitrofenil β-D-

glucopiranósido (Sigma-Aldrich GmBH), preparado a una concentración 4 mM en H2O

MilliQ, para obtener una concentración final de 1 mM. Se determinó la actividad β-glucosidasa

a 18 ºC, por ser esta una de las más habitualmente empleadas en procesos de vinificación.

Las reacciones se llevaron a cabo durante 1 hora, por duplicado, tras lo cual se

detuvieron mediante la adición de 320 µL de Na2CO3 0,5 M.

La determinación del p-nitrofenol liberado se llevó a cabo a 400 nm en un

espectrofotómetro (Thermo Scientific Evolution 201) empleando como blanco la misma

mezcla de reacción sin adición de células.

La recta patrón para cuantificación de la actividad enzimática se realizó midiendo la

absorbancia, a 400 nm, del producto de la reacción catalizada por la β-glucosidasa, 4-nitrofenol

(Sigma-Aldrich GmBH), preparado a diferentes concentraciones.

Una unidad enzimática se definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1

µM de 4-nitrofenol en un minuto de reacción a 18 ºC.

2.11. Determinación de la capacidad de producción de aminas biógenas

La capacidad de síntesis de aminas biógenas se determinó nuevamente para los

aislados de bacterias malolácticas que mejor actividad maloláctica mostraron. Además se

empleó la cepa L. brevis CECT 5354 como control positivo para el gen tdc, la cepa L.

helveticus CECT 403 como control positivo para el gen odc y la cepa L. rhamnosus CECT 288

como control positivo para el gen hdc.

2.11.1. Determinación molecular de la capacidad de producción de ABs

A fin de estimar la capacidad de producción de ABs se llevó a cabo la identificación

de aquellas cepas portadoras de los genes hdc, tdc y odc, codificantes para las enzimas histidina

descarboxilasa, tirosina descarboxilasa y ornitina descarboxilasa, enzimas implicadas en las

rutas de síntesis de las ABs histamina, tiramina y putrescina respectivamente.


71

Para ello se emplearon tres PCRs por cada cepa estudiada, con los cebadores descritos

por de las Rivas et al. (2005), mostrados en la Tabla 3. La mezcla de reacción consistió en:

ADN 30 ng, 200 µM cada oligonucleótido, 2,5 mM de MgCl2 y 2,5 U de Taq polimerasa

(Takara) en un volumen total de 50 µL. Los cebadores empleados se añadieron a la mezcla de

reacción a las concentraciones: 2 µM para los cebadores P1-rev y P2-for, 0,3 µM para los

cebadores JV16HC y JV17HC, y 1 µM para los cebadores Nº 3 y Nº 16.

Las condiciones de amplificación, empleando un termociclador MyCycler™ (Bio-

Rad), fueron: desnaturalización inicial a 95 ºC durante 5 min, 30 ciclos de: desnaturalización

a 95 ºC durante 1 min, anillamiento a 52 ºC durante 1 min, elongación a 72 ºC durante 2 min,

y un período de extensión final a 72 ºC de 5 min.

A pesar de que los autores de este protocolo llevan a cabo el mismo a modo de PCR

múltiple, en nuestro caso se realizó de forma independiente para cada uno de los genes, ya que

la amplificación inespecífica de otras secuencias puede dar lugar artefactos que solapen las

bandas de interés, y por lo tanto, arrojar falsos positivos o negativos.

Tabla 3: Cebadores empleados en la determinación molecular de la presencia de los genes hdc, tdc y

odc.

Gen Cebador Secuencia

hdc JV16HC 5’- AGATGGTATTGTTTCTTATG - 3’

JV17HC 5’- AGACCATACACCATAACCTT - 3’

tdc P1-rev 5’- CCRTARTCNGGNATAGCRAARTCNGTRTG - 3’

P2-for 5’- GAYATNATNGGNATNGGNYTNGAYCARG - 3’

odc Nº 3 5’- GTNTTYAAYGCNGAYAARACNTAYTTYGT - 3’

Nº 16 5’- TACRCARAATACTCCNGGNGGRTANGG - 3’

2.11.2. Cuantificación de la producción de ABs

Tras la determinación, a nivel molecular, de la capacidad de producción de ABs por

parte de las cepas de BAL objeto de estudio, se llevó a cabo la determinación cuantitativa de

las mismas en vino siguiendo el método descrito por Self et al., (2011), a fin de confirmar los

resultados de las pruebas moleculares.

La cuantificación de ABs en el vino resultante de las microvinificaciones


72

anteriormente descritas, se realizó mediante LC/MS-MS (Liquid Chromatography - Mass

Spectrometry).

2.11.2.1. Reactivos y patrones

Se emplearon agua y acetonitrilo (Grado LC/MS) de Panreac (Barcelona, España) y

Metanol (grado de HPLC). Se empleó también ácido clorhídrico (pureza del 37%) (Merck,

Barcelona, España). El ácido fórmico (98 - 100% de pureza), el formiato de amonio (pureza ≥

99%), la tiramina (TYR, HOC6H4CH2CH2NH2, PM = 137,18 g/mol, pureza del 99%), la

putrescina (PUT, NH2 (CH2) 4NH2, PM = 88,15 g/mol, pureza del 99%) y la histamina (HIS,

C5H9N3 2HCl, PM = 184,07 g/mol, pureza ≥ 99%) fueron proporcionados por Sigma-Aldrich

Madrid, España.

2.11.2.2. Preparación de soluciones estándar y muestras de vino

Se prepararon soluciones patrón con concentraciones de 10 mg/mL de cada amina

biógena (TYR, PUT y HIS) en 1% v/v de HCl y se almacenaron a 4 ºC. A partir de éstas se

prepararon semanalmente soluciones de trabajo en metanol acuoso (50% v/v) en

concentraciones entre 0,25 y 2,5 μg/mL.

Las muestras de vino se diluyeron en fase móvil y se filtraron a través de un filtro de

PVDF con un tamaño de poro de 0,2 μm (PVDF Membrana, Millipore, Cork, Irlanda).

2.11.2.3. Análisis UHPLC-MS / MS

La separación cromatográfica se realizó usando un sistema Agilent 1290 Infinity

UHPLC (Ultra-High Performance Liquid Chromatography). Las aminas biógenas se

separaron usando una columna HILIC: Aquity UPLC® BEH Amida, Lote número 0104191311

(2,1 mm x 50 mm, 1,7 μm) de Waters, a 40 °C. La fase móvil A fue agua al 100% conteniendo

30 mM de formiato de amonio y 1 ml de ácido fórmico, y la fase móvil B consistió en 100%

de acetonitrilo. Se llevó a cabo un programa en gradiente con un caudal de 0,6 mL/min,

comenzando con un gradiente lineal de 100% a 30% de B en 14 minutos. Después de un tiempo

de espera isocrática de 1 min a 100% de B, el tiempo total de ejecución fue de 15 minutos. La


73

detección por MS se realizó usando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent

G6460A equipado con una fuente ESI Agilent Jet Stream. Las condiciones de fuente e interfaz

se optimizaron para el análisis de aminas biógenas en modo de ionización positiva y se

ajustaron para obtener la mejor sensibilidad para las tres aminas biógenas anteriormente

mencionadas. El voltaje capilar se ajustó a 3,5 kV en modo positivo. Se seleccionó un flujo de

gas de secado (N2) de 10 L/min a una temperatura de 300 ºC, una presión de gas de

nebulización de 45 psi y un flujo de gas de envoltura de 11 L/min a una temperatura de 250

ºC. Las energías de colisión y voltajes de los aceleradores se optimizaron para cada analito

utilizando el software Mass Hunter Optimizer. La transición con mayor intensidad se utilizó

para la cuantificación (Q) y aquella con la menor intensidad (q) para la confirmación. La

histamina con el ion precursor 112.1 proporciona una Q = 95.1 y q = 68.1 (energía de

fragmentación a 70 V y energía de colisión 13 V y 21 V respectivamente), la putrescina con

un ion precursor 89.1 proporciona una Q = 72.1 y q = 55.1 (energía de fragmentación a 70 V

y energía de colisión a 9 V y 21 V respectivamente) y la tiramina con ión precursor 138.1

proporciona una Q = 121.1 y q = 77.1 (energía de fragmentación a 60 V y energía de colisión

a 9 V y 29 V respectivamente).

2.11.2.4. Parámetros de cuantificación

La calibración se llevó a cabo utilizando soluciones estándar de una mezcla de aminas

biógenas que incluía putrescina, tiramina e histamina, en un intervalo de 0,25 a 10 μg/mL

(Tabla 4). Se inyectó un control como blanco antes y después de los conjuntos de calibración

para comprobar la posible sobrecarga de la columna.

Tabla 4: Datos de calibración derivados de una calibración de siete puntos para la histamina, tiramina

y putrescina, utilizando el método HILIC-MS/MS para la determinación de aminas biógenas en el vino.

Compuesto Rango Lineal

(µg/mL) Pendiente Intersección

Coeficiente de

determinación

(R2)

LDD a

(µg/mL)

LDC b

(µg/mL)

Histamina 0,25-10 1265111,40 1724726,02 0,9839 0,010 0,034

Tiramina 0,25-10 808162,85 1172034,52 0,9953 0,003 0,010

Putrescina 0,25-10 62363,37 167677,48 0,9939 0,007 0,024

(a) Límite de detección

(b) Límite de cuantificación


74

Para el cálculo de los límites de detección y de cuantificación (LOD y LOQ)

respectivamente, se utilizó la relación señal/ruido (S / N = 3 y S / N 10) utilizando la solución

de calibrado más baja preparada en disolvente y basada en inyección triplicada.

2.12. Análisis de ácidos nucleicos mediante electroforesis en geles de agarosa

Para la comprobación del éxito en la extracción de ADN se realizó una electroforesis

en gel de agarosa (1% agarosa, TAE - 40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8-, 100 v). Se

cargó 1 µL del ADN extraído y se empleó un marcador comercial de 200 a 10000 pb

(HyperLadder™ I - Bioline).

Los productos de amplificación de la secuencia ISR y ADNr 16S se analizaron

mediante electroforesis en gel de agarosa (1 % agarosa, TAE -40 mM Tris/Acetato, 1 mM

EDTA, pH 8-, 85 v). Se cargaron 15 µL del producto de amplificación y se empleó,

nuevamente, el marcador comercial HyperLadder™ I (Bioline) de 200 a 10000 pb.

Los productos de amplificación del gen recA fueron comprobadas mediante

electroforesis en gel de agarosa (2 % agarosa, TAE - 40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH

8 -, 60 v) empleándose un marcador comercial de 200 a 10000 pb (HyperLadder™ I - Bioline

-) en el caso de las amplificaciones obtenidas con los cebadores degenerados y de 100 a 1000

pb (Low Ladder - Sigma-Aldrich -) tras el empleo de los cebadores específicos.

Los cortes enzimáticos fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa (2

% agarosa, TAE - 40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8 -, 50 v), empleándose un marcador

comercial de 200 a 10000 pb (HyperLadder™ I - Bioline -), a excepción del corte realizado

con la enzima BtgZI sobre el ADNr 16S y con la enzima VspI sobre la secuencia ISR, para los

que se empleó un marcador de 100 a 1000 pb (Low Ladder - Sigma-Aldrich -).

Los productos de amplificación de los genes codificantes para las enzimas amino

descarboxilasas se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (2 % agarosa, TAE -

40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8-, 80 v) empleándose un marcador comercial de 100

a 1000 pb (Biorom).

Los productos de amplificación de los genes codificantes para las enzimas


75

descarboxilasas de ácidos fenólicos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (3

% agarosa, TAE -40 mM Tris/Acetato, 1 mM EDTA, pH 8-, 90 v) empleándose un marcador

comercial de 100 a 1000 pb (Biorom).

2.13. Determinación de la capacidad de degradación de ABs

Se determinó la capacidad de las cepas seleccionadas para degradar las aminas

biógenas: histamina, tiramina y putrescina.

Se empleó el método descrito por Callejón et al. (2014) con algunas modificaciones.

Para ello, las cepas de bacterias malolácticas fueron cultivadas en MRS suplementado con

histamina, tiramina y putrescina, cada una de ellas a 10 mg/L, a 30 ºC hasta alcanzar la fase

exponencial, en un volumen de 50 mL. Posteriormente, los cultivos fueron centrifugados a

2894 x g durante 10 min, lavadas con 40 mL de tampón fosfato (50 mM, pH 7,4) y, finalmente

resuspendidas en el mismo tampón suplementado con el inhibidor de proteasas fluoruro de

fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM.

Para obtener el extracto celular, las células se rompieron mecánicamente con perlas de

vidrio de 107 µm (Sigma-Aldrich), mediante vortex durante 10 min, tras lo cual se

centrifugaron a 25000 x g durante 15 min y el sobrenadante se conservó a -20 ºC hasta su uso.

La detección de actividad degradadora de aminas biógenas se llevó a cabo en gel de

poliacrilamida (PAGE) en condiciones no-desnaturalizantes. Para ello, el gel concentrador se

preparó a una concentración del 4% mientras que el gel separador contenía una concentración

del 8% de poliacrilamida. Se cargaron 25 µL de cada uno de los extractos mezclados con 5 µL

de tampón de carga (Glicerol 10%, Tris-HCl 50 mM, verde de bromocresol 0,02%, pH 6,8), y

se llevó a cabo la electroforesis a 200 V durante 60 min, en tampón Tris-Glicina (Tris-Base 25

mM, Glicina 0,19 M). Tras este tiempo, los geles (uno por cada amina) se trasladaron a tampón

fosfato (50 mM, pH 7,4) suplementado con cada una de las aminas a una concentración de 1

mM durante 15 min.

El revelado se realizó en el mismo tampón suplementado con 1 U/ml de peroxidasa

(Sigma) y 0,25 mM de 3,3’-diaminobenzidina (Sigma) como agente cromogénico durante 1:30

h.

CAPÍTULO I Resultados y Discusión

76

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La región vinícola Val do Salnés, perteneciente a la D.O. Rías Baixas en España, posee

un clima Atlántico de temperaturas suaves (Lorenzo et al., 2013), diferenciado por presentar

temperaturas nocturnas bajas, y que cultiva mayoritariamente la variedad blanca Vitis vinifera

Albariño.

Los vinos obtenidos con esta variedad en esta zona, debido a su exceso de acidez,

deben completar en muchas ocasiones la FML. Sin embargo, con frecuencia, se ha constatado

la dificultad para conseguir un exitoso desarrollo de este proceso de manera espontánea o la

implantación de cultivos iniciadores comerciales en estos vinos. Estas razones han justificado

llevar a cabo este estudio sobre la biodiversidad de BAL asociada a los vinos de esta región,

así como su caracterización con objeto de determinar su potencial para la preparación de

nuevos starters autóctonos.

3.1. Aislamiento de bacterias lácticas

Durante dos cosechas consecutivas (2007 y 2008) se llevó a cabo el aislamiento de

bacterias malolácticas en fermentaciones realizadas con la variedad Vitis vinífera Albariño

cultivada en la región Val do Salnés-España, perteneciente a la Denominación de origen Rías

Baixas. Se seleccionó para ello la bodega “Condes de Albarei” considerada representativa de

la zona ya que funciona en régimen de cooperativa y recibe uvas de los diferentes viñedos de

la misma. Las muestras se tomaron de mosto (M), fermentación alcohólica (FA) y

fermentación maloláctica (FML). De entre todos los aislados se seleccionaron como

potenciales bacterias del ácido láctico las Gram positivas/catalasa negativas. En el año 2007

el 8,7 % (2) de los aislados se obtuvieron de FA y un 93% (21) de FML. En el año 2008 el

46,2% (6) de los aislados se obtuvieron de M y el 53,8% (7) de FML. En total se consiguieron

35 aislados (UVI-1 - UVI-35).

Analizando la distribución de estas especies en base a las etapas de procesado del vino

se aprecia que la gran mayoría de las cepas se aíslan durante la fase de fermentación

maloláctica con un 77,1% (27) de éstas, mientras que solo un 5,7% (2) se obtienen durante la


77

fermentación alcohólica. En la etapa de mosto se aislaron un 17,1% (6) del total de cepas,

siguiendo la progresión habitual, descrita previamente (Pardo et al. 1989; Sieiro et al. 1990;

Renouf et al. 2006).

Esta frecuencia de aislamiento puede calificarse como baja o muy baja si se compara

con los datos de muchas regiones vinícolas estudiadas (Mesas et al., 2011; Sebastian et al.,

2011), sobre todo si se tiene en cuenta que fue necesario concentrar las muestras para conseguir

aislar las bacterias, aunque frecuencias de aislamiento bajas han sido reportadas también en

otras regiones productoras (Bae et al., 2006; Valdés La Hens et al., 2014). Los resultados

encontrados en el presente estudio son consistentes con las dificultades para la consecución

exitosa de la fermentación maloláctica en la región objeto de estudio, manifestadas

frecuentemente por los productores.

3.2. Identificación de los aislados mediante perfil bioquímico de asimilación de

azúcares

El empleo del kit comercial API® 50CHL permitió la elaboración del perfil de

asimilación de azúcares de cada uno de los aislados bajo estudio, comparativamente con el

obtenido a partir de las cepas de colección de las especies de bacterias lácticas más

comúnmente encontradas en vino. Dichos perfiles bioquímicos se muestran en la Fig. 5.

Los resultados obtenidos no permitieron una identificación concluyente de todos los

aislados, como ya había sido descrito en trabajos previos que emplearon este mismo test (Testa

et al., 2014). Sin embargo, sí permitió un primer agrupamiento de los aislados.

Doce de ellos fueron agrupados como potencialmente pertenecientes a la especie

Lactobacillus hilgardii, 3 a la especie Pediococcus damnosus, uno a la especie Lactococcus

lactis, 6 de ellos fueron agrupados como Lactobacillus casei/Lactobacillus paracasei y 4

fueron incluidos en el grupo Lactobacillus plantarum/Lactobacillus

paraplantarum/Lactobacillus pentosus, al no ser este test válido para discriminar entre las

especies incluidas en estos dos últimos grupos. Para el resto de los aislados no fue posible

obtener un perfil claro de asimilación de carbohidratos debido a su débil crecimiento.


78

Fig

ura

5:

Per

file

s b

ioq

uím

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s d

e as

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ació

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al A

PI®

50

CH

L.


79

El grupo de las cepas potencialmente pertenecientes a L. hilgardii se caracterizó por

su capacidad para asimilar D-xilulosa (DXYL) en un 100% de los aislados, coincidiendo así

con los datos mostrados en el Manual Bergey de Sistemática Bacteriológica, 1-Metil-D-

glucósido (MDG) en el 76% (el 24% restante incluye a la cepa de colección) y melecitosa

(MEL) en el 69% de los casos.

El grupo L. plantarum / L. paraplantarum / L. pentosus se caracterizó por ser positivos

para glicerol (GLY), L-arabinosa (LARA), rhamnosa (RHA) y D-arabitol (DARL), y en él se

incluyen 5 cepas.

El grupo L. rhamnosus / L. casei / L. paracasei agrupó a 7 aislados, que fueron los

únicos capaces de asimilar tagatosa (TAG) lo que concuerda con los datos aportados por

Collins et al. (1989).

En un estudio llevado a cabo en cepas de colección, Dicks y Endo (2009) analizan la

capacidad de asimilación de 6 carbohidratos: amigdalina, celobiosa, manitol, melibiosa,

rafinosa y sacarosa, en cepas de colección de bacterias ácido lácticas. Según este estudio, el

grupo L. casei /paracasei/ rhamnosus es capaz de emplear amigdalina, celobiosa, manitol y

sacarosa en sus rutas metabólicas, no siendo así en el caso de los carbohidratos melibiosa y

rafinosa. Los mismos resultados se han obtenido en este estudio, excepto para la cepa de

colección de L. paracasei CECT 4175.

En el mismo estudio, estos autores describen características fenotípicas para la

diferenciación de P. damnosus frente a otras especies del mismo género, estableciendo en esta

especie la capacidad de asimilación de galactosa, y la incapacidad para el metabolismo de

arabinosa, lactosa, ribosa y xilosa, del mismo modo que ocurre en el grupo de aislados objeto

de este estudio, potencialmente pertenecientes a la especie P. damnosus.

El método no fue válido para determinar la asimilación de carbohidratos de las cepas

que posteriormente fueron identificados como O. oeni, ni tampoco para algunos de los aislados

incluidos en la especie P. damnosus.

Si bien el estudio de asimilación de carbohidratos permitió discernir los grupos de

microorganismos arriba mencionados, no mostró diferencias claras que permitan identificar, a

nivel de especie, sobre todo a los aislados pertenecientes a los dos grupos más homogéneos.


80

Por otra parte, es interesante destacar las importantes diferencias encontradas entre los

perfiles de asimilación de carbohidratos de los aislados y sus respectivas cepas de referencia.

Estas diferencias pueden tener su explicación en los distintos medios de los que fueron

aisladas. Un ejemplo claro se encuentra en los aislados vínicos del grupo L. plantarum, que se

mostraron incapaces de asimilar lactosa, al contrario que las cepas de referencia incluidas en

dicho grupo y que fueron aisladas de productos lácteos. Este medio presenta una elevada

concentración de este carbohidrato y las cepas aisladas a partir del mismo están adaptadas para

su utilización.

Aunque el test API 50CH no permitió la identificación definitiva de los aislados, sí

pone de manifiesto diferencias en la asimilación de carbohidratos entre la mayoría de ellos.

Por esta razón y debido al número relativamente bajo de aislados se continuó la identificación

molecular con todos ellos.

3.3. Identificación de los aislados mediante pruebas moleculares

La secuenciación del ADNr 16S de las bacterias aisladas en este trabajo y su posterior

comparación con la misma región disponible en las bases de datos, agrupó los 35 aislados en

6 grupos (Tabla 4): grupo Lactobacillus hilgardii, grupo Oenococcus oeni, grupo Lactococcus

lactis, grupo Pediococcus damnosus, grupo Lactobacillus paracasei/ casei y grupo

Lactobacillus plantarum/ pentosus.

En el caso de los 4 primeros grupos, la secuenciación del ADNr 16S permitió la

identificación de los aislados pertenecientes a dichas especies, aunque ésta fue confirmada con

posterioridad mediante el análisis ARDRA.

La identificación de los aislados pertenecientes a la especie Lactococcus lactis fue

llevada a cabo únicamente mediante secuenciación del ADNr 16S y posterior análisis con el

programa blastn. Este programa arrojó un porcentaje de identidad del 100% únicamente con

secuencias de dicha especie depositadas en las bases de datos.


81

Tabla 4: Identificación de los aislados mediante secuenciación del ADNr 16S.

* La columna “Especie según 16S” refleja la especie o especies en que sería incluido el aislado si solo

se tuviese en cuenta el porcentaje de identidad de la secuencia 16S (no mostrado) arrojado por el

programa blastn de Blast® (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

En aquellos grupos que incluyen dos especies, el porcentaje de identidad obtenido fue

del 100% para cualquiera de las dos, corroborando los agrupamientos realizados mediante el

test API® 50CHL. En ambos casos se incluyó en el análisis una especie filogenéticamente

cercana, L. rhamnosus CECT 288 en el grupo L. casei/paracasei y L. paraplantarum CECT

5787 en el grupo L. plantarum/ pentosus, a fin de verificar la ausencia de las mismas entre los

aislados incluidos en dichos grupos.

A partir de las secuencias génicas codificantes para la subunidad 16S del ribosoma

bacteriano de los aislados utilizados en este trabajo, así como de las depositadas en los bancos

de datos, se pudo establecer un árbol filogenético (Fig. 6) que agrupó los aislados en 6 grupos,

4 de ellos coincidentes con los grupos establecidos mediante el perfil de asimilación de

carbohidratos. Además, permitió incluir en algunos de estos grupos los aislados que no

pudieron ser incluidos en el test API® 50CHL por su pobre crecimiento y permitió el

agrupamiento de los aislados pertenecientes a las especies O. oeni y L. lactis.

Nombre del aislado Especie según 16S* Nombre del aislado Especie según 16S*

UVI-1 L. paracasei/casei UVI-19 L. paracasei/casei

UVI-2 L. paracasei/casei UVI-20 L. hilgardii


UVI-4 L. hilgardii UVI-22 L. hilgardii


UVI-6 L. plantarum/ pentosus UVI-24 O. oeni

UVI-7 L. paracasei/casei UVI-25 O. oeni

UVI-8 L. plantarum/ pentosus UVI-26 L. hilgardii

UVI-9 L. plantarum/ pentosus UVI-27 L. lactis

UVI-10 L. plantarum/ pentosus UVI-28 P. damnosus

UVI-11 L. plantarum/ pentosus UVI-29 O. oeni

UVI-12 L. paracasei/casei UVI-30 L. lactis

UVI-13 L. hilgardii UVI-31 P. damnosus





UVI-18 L. hilgardii


82

Figura 6: Árbol filogenético de máxima verosimilitud del gen ADNr 16S para las especies objeto de

estudio elaborado mediante los programas ClustalW2 y MEGA 5. Bootstrap de 1500 réplicas.

Tal como se indicó anteriormente, la identificación de los aislados fue completada y/o

confirmada mediante un análisis ARDRA. La digestión enzimática del ADNr 16S con enzimas

de restricción permitió confirmar las cepas pertenecientes a los géneros Oenococcus y

Pediococcus, así como las de la especie L. hilgardii.


83

Concretamente, el corte enzimático del ADNr 16S con BfaI y AluI resultó en el mismo

perfil de bandas para las cepas UVI-24 , UVI-25 y UVI-29 que el obtenido para la cepa O.

oeni CECT 217, incluyendo a los aislados obtenidos en este estudio dentro de dicha especie

(Fig. 7).

Figura 7: Perfil de restricción obtenido tras el

corte de los fragmentos de ADNr 16S con las

enzimas AluI (A) y BfaI (B). M: Marcador

HyperLadder™ I (Bioline); 1: O. oeni CECT 217;

2: Perfil correspondiente a los aislados UVI-24,

UVI-25 y UVI-26.

El corte de esta secuencia génica con HaeIII y, de nuevo con AluI, confirmó la

pertenencia de los aislados UVI-28, UVI-31, UVI-33, UVI-34, y UVI-35 a la especie

Pediococcus damnosus (Fig. 8).

Figura 8: Perfil de restricción obtenido tras el corte de

los fragmentos de ADNr 16S con las enzimas AluI (A)

y HaeIII (B). M: Marcador HyperLadder™ I (Bioline);

1: P. damnosus CECT 793; 2: Perfil correspondiente a

los aislados UVI-28, UVI-31, UVI-33, UVI-34, y UVI-

35.

A B

A B

C


84

El corte con MseI, tanto de las muestras analizadas en este estudio como de las cepas

de colección correspondientes, proporcionó el mismo patrón de bandas en los aislados UVI-4,

UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-17, UVI-18, UVI-20, UVI-21, UVI-26 y en la cepa

de colección perteneciente a la especie L. hilgardii. La pertenencia de los aislados a esta

especie fue verificada, además, mediante la digestión con AluI y HaeIII. El patrón de digestión

de estos aislados con las enzimas AluI y HaeIII y MseI se muestra en la Fig. 9.

Figura 9: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los fragmentos de ADNr 16S con las enzimas

MseI (A), AluI (B) y HaeIII (C). M: Marcador HyperLadder™ I (Bioline); 1: Lactobacillus hilgardii

CECT 4786; 2: Perfil correspondiente a los aislados UVI-4, UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-

17, UVI-18, UVI-20, UVI-21 y UVI-26.

Recientemente, Nisiotou et al. (2014) realizaron un estudio similar, obteniendo una

identificación satisfactoria de L. hilgardii mediante el corte de la secuencia de ADNr 16S con

MseI, cuyo patrón de bandas fue igual al obtenido en el presente estudio. La misma técnica

había sido empleada por Rodas et al. (2005) para la identificación de esta especie mediante las

enzimas BfaI y MseI.

Del mismo modo que en el estudio de Rodas et al. (2005), el corte enzimático de esta

secuencia génica con BfaI (Fig. 10) nos permitió establecer la diferenciación entre los dos

grupos más homogéneos anteriormente descritos: L. casei/ paracasei y L. plantarum/

pentosus/ paraplantarum. Dada la proximidad entre las especies del primero de estos grupos

y L. rhamnosus, se introdujo en el análisis ARDRA la cepa de colección L. rhamnosus CECT

400-

A B C


85

288 para descartar la presencia de esta especie entre los aislados obtenidos en este trabajo. Esta

enzima proporciona un patrón de bandas diferente en cada uno de ellos, corroborando el

agrupamiento realizado previamente. Tras este corte enzimático se procedió a trabajar con

cada uno de ellos de forma independiente.

Figura 10: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los fragmentos de ADNr 16S con la enzima

BfaI. (A): M: Marcador HyperLadder™ I (Bioline); 1: L. rhamnosus CECT 288; 2: L. casei CECT 475;

3: L. paracasei CECT 4175; 4: Perfil correspondiente a los aislados UVI-2, UVI-12, UVI-1, UVI-5,

UVI-3 y UVI-7 (grupo L. casei/ paracasei/ rhamnosus). (B): M: marcador HyperLadder™ I (Bioline);

1: L. plantarum CECT 220; 2: L. pentosus CECT 4023; 3: L. paraplantarum CECT 5787; 4: Perfil

correspondiente a los aislados UVI-6, UVI-8, UVI-10, UVI-11 y UVI-19 (grupo L. plantarum/

pentosus/ paraplantarum).

En el primero de ellos (L. casei/ paracasei/ rhamnosus), el proceso de identificación

continuó con la digestión del ADNr 16S con BtgZI, lo que descartó la presencia de L.

rhamnosus entre las cepas aisladas en el presente trabajo, al ser la cepa de colección en la única

en la que no se apreció corte enzimático tal y como se esperaba tras realizar cortes in sílico de

las secuencias depositadas en las bases de datos (Fig. 11).

Tanto en las digestiones correspondientes a los aislados que se estudian en este trabajo,

como en las pertenecientes a las cepas de L. casei y L. paracasei de la CECT, se obtuvieron

dos fragmentos de 250 y 1.250 pb aproximadamente, lo que de nuevo coincide con los cortes

in sílico realizados previamente.

B

B

C

A

B

C


86

Figura 11: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los

fragmentos de ADNr 16S con la enzima BtgZI: M: Marcador

PCR 100 bp Low Ladder (Sigma-Aldrich); 1: L. casei CECT

475; 2: L. paracasei CECT 4175; 3: L. rhamnosus CECT 288;

4: Perfil correspondiente a los aislados UVI-2, UVI-12, UVI-

1, UVI-5, UVI-3, UVI-7, UVI-19.

En este punto, y debido a la similitud entre las secuencias del ADNr 16S (100% de

identidad), se hizo imprescindible el empleo adicional de otras herramientas moleculares como

la región intergénica 16S/23S (ISR o “intergenic spacer region”) y el gen recA. Esta similitud

ya había sido descrita por Dellaglio et al. (2002) para las cepas de la ATCC (American Type

Culture Collection) de dichas especies, proponiendo la inclusión de ambas especies en la

especie L. casei.

Figura 12: Perfil de restricción obtenido tras el corte de los

fragmentos ISR con la enzima VspI. M: Marcador PCR 100 bp

Low Ladder (Sigma- Aldrich); 1: L. casei CECT 475; 2: L.

paracasei CECT 4175; 3: L. rhamnosus CECT 288; 4: Perfil

correspondiente a los aislados UVI-2, UVI-12, UVI-5, UVI-3,

UVI-7, UVI-1 y UVI-19.

La secuencia ISR había sido empleada con éxito por Moreira et al. (2005) para la

identificación de especies pertenecientes al género Lactobacillus. El análisis RFLP de esta


87

secuencia con la enzima VspI nos aportó la identificación definitiva de los aislados de ese

grupo como pertenecientes a la especie L. paracasei, al proporcionar fragmentos de 250 y 350

pares de bases, tanto en los aislados como en la cepa de colección CECT 4175, no siendo así

en L. casei CECT 475, confirmando la utilidad de dicha secuencia como herramienta a la hora

de discernir entre estas especies. En la Fig. 12 se puede apreciar el perfil de restricción

obtenido para la cepa de L. paracasei CECT 4175, mientras que la enzima no presenta ningún

sitio de corte sobre el ISR de L. casei CECT 475. En este análisis se introdujo nuevamente L.

rhamnosus que había sido descartada anteriormente, a fin de verificar dicho descarte y con

ello confirmar la utilizad de la enzima BtgZI para la identificación de las especies de este grupo

filogenéticamente próximo.

A continuación se procedió a la diferenciación de las especies en el segundo grupo de

aislados (L. plantarum/ paraplantarum/ pentosus) utilizando el gen recA.

La amplificación con los cebadores específicos de especie empleados por Torriani et

al. (2001) permitieron descartar la presencia de L. pentosus entre los aislados, sin embargo no

fue suficiente para diferenciar entre L. plantarum y L. paraplantarum.

Figura 13: Amplificación del gen recA con cebadores específicos: M: Marcador HyperLadder™ I

(Bioline); 1: L. plantarum CECT 220; 2: L. pentosus CECT 4023; 3: L. paraplantarum CECT 5787; 4:

Perfil correspondiente a los aislados UVI-6, UVI-8, UVI-9, UVI-10 y UVI-11.


88

Se esperaba, tras la amplificación del gen recA con sus cebadores específicos, un

fragmento de 107 pb en la especie L. paraplantarum CECT 5787, sin embargo lo obtenido fue

un producto de PCR similar al de L. plantarum CECT 220 (318 pares de bases). Dichas

amplificaciones se muestran en la Fig. 13.

Este resultado sólo podría ser explicado asumiendo una identificación incompleta de

la cepa proporcionada por la Colección Española de Cultivos Tipo. Muchas de las cepas

depositadas en las distintas colecciones de microorganismos han sido identificadas solamente

empleando métodos bioquímicos, insuficientes para una identificación correcta a nivel de

especie. Además, el alineamiento de las secuencias recA de estas dos cepas (L. plantarum

CECT 220 y de L. paraplantarum CECT 5787), obtenidas con los oligonucleótidos

degenerados, aporta un 100% de identidad entre las 245 pares de bases alineadas, lo que

confirma esta posibilidad.

El alineamiento de las secuencias recA de 245 pares de las cepas aisladas en nuestro

laboratorio y las disponibles en las bases de datos generó unos agrupamientos con una marcada

diferenciación interespecífica, permitiendo identificar a los aislados estudiados en este trabajo

(UVI-6, UVI-8, UVI-9, UVI-10 y UVI-11) como L. plantarum. Este agrupamiento se aprecia

claramente en el árbol filogenético generado a partir de dicho alineamiento (Fig. 14).

Figura 14: Árbol filogenético de máxima verosimilitud obtenido con un fragmento de 245 pares de

bases del gen recA elaborado mediante el programa MEGA 5. Bootstrap de 1500 réplicas.

UVI-6

UVI-10

L.paraplantarum CECT 5787

L.plantarum AJ2861191


L.plantarum CECT 220

UVI-9

UVI-8


L.paraplantarum AJ2719631



L.pentosus AJ2861181

100

100

0.02


89

En consecuencia con lo anteriormente expuesto, la cepa de L. paraplantarum CECT

5787 quedó incluida dentro del “cluster” de L. plantarum (Fig. 14).

Por lo tanto, los resultados de este análisis corroboran la utilidad del gen recA para la

identificación de estas especies del género Lactobacillus que se encuentran filogenéticamente

muy cercanas, como ya había sido propuesto anteriormente (Torriani et al., 2001; Rodríguez

et al., 2007), e identifican los aislados incluidos en este grupo como L. plantarum.

Desde el punto de vista de la diversidad intraespecífica, todos los aislados mostraron

perfiles diferentes en la prueba API 50CH, a excepción de UVI-4, UVI-22 y UVI-23 en el

grupo de L. hilgardii, y UVI-9 y UVI-10 en el grupo de L. plantarum. Atendiendo a este

criterio, dichos aislados podrían ser considerados la misma cepa quedando el grupo L. hilgardii

reducido a un total de 10 cepas diferentes y el grupo L. plantarum a 3 cepas diferentes. En el

grupo L. paracasei no hay coincidencias entre perfiles por lo que mantendría el numero

mencionado previamente. Lo mismo sucede con los aislados identificados como O. oeni, L.

lactis y P. damnosus, si bien algunos de los aislados no pudieron ser incluidos en el análisis

API 50CH y por lo tanto este criterio no pudo ser utilizado para determinar si son cepas

diferentes.

El estudio realizado en este trabajo muestra que, aunque el ADNr 16S puede ser

utilizado con éxito en la identificación a nivel de especie de algunos microorganismo, en

muchos casos no es suficiente, al igual que ocurre con las pruebas bioquímicas. En estos casos

es necesario recurrir a otro tipo de estudios, que serán diferentes en función del grupo de

microorganismos del que se trate, y que deben ser utilizados conjuntamente con los primeros

en una identificación polifásica.

3.4. Esquema general del proceso de identificación

Como resumen de todo lo expuesto anteriormente se muestra en la Fig. 15 y en la Tabla

5, de manera esquemática, la secuencia de procedimientos y el resumen de las técnicas que

condujo a la identificación de los aislados.


90

Figura 15: Esquema general del proceso de identificación de los aislados de bacterias ácido lácticas.


91

Tabla 5: Tabla resumen del proceso de identificación de los aislados de bacterias lácticas.

*M= Mosto FA= Fermentación alcohólica MLF= Fermentación maloláctica

Nombre Año de

Aislamiento Etapa de

muestreo* API 50CH

Secuenciación ADNr 16S

16S-ARDRA (enzima/s)

Análisis restricción

ISR (enzima/s)

Secuenciación gen recA

L. plantarum CECT 220

L. paraplantarum CECT 5787

UVI-6

2007

FML

L. plantarum/L. paraplantarum/L.

pentosus


pentosus


pentosus (BfaI)

- L. plantarum

UVI-8 L. plantarum/L.

paraplantarum/L. pentosus





UVI-11 -

l. casei CECT 475

L. paracasei CECT 4175

L. rhamnosus CECT 288

UVI-1

2007 FML

L. casei/L. paracasei/ L. rhamnosus

L. casei/L. paracasei/ L. rhamnosus

L. casei/L. paracasei/ L. rhamnosus (BfaI, BtgZI)

L. paracasei (VspI)

-

UVI-2 L. casei/L.

paracasei/ L. rhamnosus

UVI-3 L. casei/L.


UVI-5 L. casei/L.


UVI-7 L. casei/L.


UVI-12 -

UVI-19 L. casei/Lb.

paracasei/ Lb. rhamnosus

L. hilgardii CECT 4786

UVI-4

2007

FML

L. hilgardii L. hilgardii L. hilgardii

(MseI, AluI, HaeIII) - -

UVI-13

UVI-14

UVI-15

UVI-16

UVI-17

UVI-18

UVI-20

UVI-21

UVI-22 FA

UVI-23 FA

UVI-26 2008 M

O. oeni CECT 217

UVI-24 2008 M - O. oeni

O. oeni (AluI, BfaI)

- - UVI-25

UVI-29

P. damnosus CECT 793

UVI-28

2008 FML

-

P. damnosus P. damnosus (AluI, HaeIII)

- -

UVI-31 P. damnosus

UVI-32 -

UVI-33 P. damnosus

UVI-34 -

UVI-35 P. damnosus

L. lactis CET 185

UVI-27 2008 M

Lc. lactis Lc. lactis - - -

UVI-30 -


92

3.5. Ecología de las bacterias lácticas aisladas

Al término del aislamiento y a la vista de todos los datos aportados en la identificación

bioquímica y molecular, se procedió al análisis ecológico de bacterias ácido lácticas en los

vinos estudiados.

La distribución anual de las distintas especies aisladas se presenta en la Fig. 16. En

2007 se observó una clara prevalencia de L. hilgardii con un 45% (9) de los aislados mientras

que en 2008 fue la especie Pediococcus damnosus la dominante al suponer el 50% (6) de los

aislados.

Figura 16: Distribución anual de las especies de bacterias lácticas aisladas.

Se apreciaron importantes diferencias en cuanto a la ecología de bacterias lácticas

entre los años 2007 y 2008, tanto cuando se tomaron los datos en su conjunto como cuando se

analizan en función de la fase de vinificación en la que fueron aisladas. Las diferencias entre

anualidades también habían sido descritas previamente en otras regiones vinícolas (Ruiz et al.,

2010).

Estas diferencias se manifestaron desde la primera fase de muestreo. En 2007 no se

obtuvieron aislados en mosto, mientras que, en 2008, la variedad de especies aisladas en éste

estuvo compuesta por O. oeni 50% (3), L. lactis 33,3% (2) y L. hilgardii 16,7% (1), especies

descritas previamente como parte de la microflora de las uvas (Lafon-Lafourcade et al., 1983;

Agrelo et al. 1987; Bae et al., 2006), y que explicaría su presencia en el mosto analizado.

Tanto el número de aislados como su diversidad ecológica sufrieron una fuerte

reducción en la fase de fermentación alcohólica en 2008, debido probablemente al incremento

100%

42%

21%

37%

0%

25%

50%

75%

100%

M FA FML

2007

L. paracasei

L. plantarum

L. hilgardii

17%

50%100%

33%

0%

25%

50%

75%

100%

M FA FML

2008

Lc. lactis

P. damnosus

O. oeni

L. hilgardii


93

en la concentración de etanol, a la competencia con las levaduras y a la caída en la

concentración de azúcares (Sieiro et al., 1990; Renouf et al., 2006). En 2007, los primeros

aislamientos se obtienen en esta fase, pertenecientes a la especie L. hilgardii (1 aislado).

La especial resistencia de la especie L. hilgardii a elevadas concentraciones de etanol

(Couto et al., 1997) podrían explicar el hecho de que, analizando ambas anualidades, esta

especie sea la única aislada en esta etapa de vinificación.

En FML, se obtuvieron también resultados dispares entre ambas vendimias. En 2007,

fue el año en que se encontró la mayor diversidad de bacterias ácido lácticas, con aislados

pertenecientes a las especies: L. plantarum, L. paracasei y L. hilgardii, en proporciones muy

similares (21% -4-, 37% -7- y 42% -8-, respectivamente). En 2008, en cambio, la fermentación

estuvo dominada exclusivamente por P. damnosus, con un total de 6 aislados.

Datos aportados por otros autores (Mesas et al., 2011; González-Arenzana et al.,

2013), muestran una mayor diversidad en las etapas previas a la fermentación maloláctica de

vinos tintos, lo que, en nuestro caso solo se cumple el segundo año.

Analizando los resultados de los dos años en conjunto, destaca L. hilgardii como la

única especie encontrada en FA, además de dominar en la etapa de FML, etapa en la que

comparte presencia con L. paracasei, L. plantarum y P. damnosus. En la primera etapa del

proceso de vinificación sería O. oeni la especie dominante, aunque, de nuevo, L. hilgardii tiene

una presencia importante, junto con L. lactis (Fig. 17).

Considerando los aislados en su totalidad e independientemente de la fase de

muestreo, destaca L. hilgardii como especie mayoritaria abarcando a un 31,3% (10) de los

aislados, seguida por L. paracasei con un 21,9% (7) del total de 32 aislados, y P. damnosus

con un 18,8% (6) de los aislados. Las especies L. plantarum, O. oeni y L. lactis resultaron las

especies minoritarias, con un 12,5, 9,4 y 6,3% de los aislados, respectivamente. Estas

proporciones se muestran en la Fig. 18.


94

Figura 17: Distribución de los aislados (gráfico central) y diversidades microbiológicas (gráficos

adyacentes) por especie en función de la etapa de vinificación. Verde: FML; Naranja: FA; Azul: M.

Figura 18: Distribución de los aislados de BAL en función de especie, teniendo en cuenta las dos

anualidades.

31,3%

21,9%

18,8%

12,5%

9,4%

6,3%

Proporciones de BAL por especie

L. hilgardii

L. paracasei

P. damnosus

L. plantarum

O. oeni

L. lactis


95

En total se han identificado 6 especies diferentes lo que podría estimarse como una

elevada diversidad dado el bajo número de aislados analizado. Además es destacable que, a

diferencia de lo que se ha descrito para la mayoría de las regiones vinícolas estudiadas

tradicionalmente (Ruiz et al., 2010; González-Arenzana et al., 2012; Pérez-Martín et al.,

2015), las especies de BAL predominantes en los vinos de la variedad Albariño cultivada en

esta región pertenecen al género Lactobacillus y no a la especie O. oeni que, además, no se ha

encontrado en FML en ninguno de los años analizados. Sin embargo, nuestros datos coinciden

con los de algunas regiones vinícolas estudiadas recientemente para las que también se han

descrito como predominantes las especies del género Lactobacillus (Bravo-Ferrada et al.,

2013; Testa et al., 2014; Henríquez-Aedo et al., 2016).

Los primeros estudios sobre bacterias malolácticas llevados a cabo en Galicia, y

pioneros en España, se realizaron en el laboratorio del Prof. Tomás G. Villa (Universidad de

Santiago) en vinos de las sub-zonas de Rosal y Condado do Tea (Sieiro et al., 1990) situadas

al sur de la D.O. Rías Baixas. Estos vinos se elaboran con una mezcla de variedades de uva,

mayoritariamente Albariño y Treixadura en la primera de ellas y Albariño y Loureira en la

segunda. El estudio de estas zonas, junto con el presentado en este trabajo sobre la sub-zona

Val do Salnés, situada más al norte de la D.O., y cuyos vinos están elaborados exclusivamente

con la variedad Albariño, ponen de manifiesto que la especie O. oeni no solo no es dominante

ni lleva a cabo la FML en ninguna de las sub-zonas, sino que se encuentra en muy baja

proporción con respecto a las otras especies aisladas. Sin embargo, analizando el resto de las

especies encontradas se aprecia una importante variabilidad entre las sub-zonas del sur y la del

norte. Así, mientras en las comarcas de Rosal y Condado do Tea aparece un único género

(Lactobacillus) alternativo a Oenococcus, la comarca Val do Salnés muestra una mayor

diversidad con tres géneros alternativos distintos (Lactobacillus, Lactococcus y Pediococcus).

Además, analizando las especies del género compartido por las dos zonas (Lactobacillus) se

observa que, excepto L. plantarum, que es la mayoritaria en las comarcas del sur, pero

minoritaria en la del norte, el resto de las especies difieren en Val do Salnés de las aisladas en

las comarcas del sur. Estos datos pueden ser explicados por las conclusiones a las que han

llegado recientemente Bokulich et al. (2014) en un estudio metagenómico sobre los vinos

blancos y tintos del Napa Valley (California), que demuestra una adaptación de las

comunidades microbianas a la variedad de uva y, sobre todo, a la zona vinícola.


96

3.6. Caracterización enológica de las cepas de bacterias lácticas

3.6.1. Actividad maloláctica

La baja frecuencia de aislamiento de BAL en la región vinícola estudiada podría estar

relacionada con las constatadas dificultades en la consecución de la FML en los vinos de la

misma. Por otra parte, el hecho de que la especie O. oeni ni es predominante en esta región ni

se ha aislado en la fermentación maloláctica, cuestiona la idoneidad de los starters comerciales

existentes para conducir la fermentación maloláctica en los vinos de Albariño de esta región.

A ello hay que añadir que se ha demostrado que el éxito de un starter depende de la cepa

utilizada y de su adaptación a las condiciones específicas de cada vino (Ruiz et al., 2010). Por

todo ello, en el presente trabajo se planteó evaluar el potencial de las BAL aisladas en esta

región para ser utilizadas en la consecución de la FML.

Varios criterios se han establecido para la selección de cepas BAL como cultivos

iniciadores en enología (Volschenk et al., 2006). Un rápido crecimiento en vino, una elevada

actividad maloláctica, la no producción de aminas biógenas (principalmente histamina) o

aromas desagradables, entre otros, son factores importantes a considerar para esta selección.

Para llevar a cabo la caracterización enológica de las bacterias lácticas aisladas en este

trabajo, en una primera selección se escogieron los aislados que mostraron mejor crecimiento

en los medios de laboratorio y agar vino, y que presentaron un perfil diferente de asimilación

de azucares en la prueba API 50CH: 1 aislado de la especie L. plantarum (UVI-9), 2 aislados

de O. oeni (UVI-25), 3 aislados de la especie L. paracasei (UVI-2, UVI-3 y UVI-5) y 10

aislados de la especie L. hilgardii (UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-17, UVI-18, UVI-

20, UVI-21, UVI-23 y UVI-26).

Se descartaron todos los aislados pertenecientes a la especie P. damnosus ya que,

debido a su débil crecimiento, no permitieron alcanzar en los medios de laboratorio las

densidades celulares adecuadas para la inoculación de las microvinificaciones. Con las cepas

seleccionadas (16) se llevó a cabo un ensayo de microvinificación en vino Albariño de esta

región y los resultados sobre el consumo de ácido málico y producción de ácido láctico y ácido

acético se muestran en la Tabla 6.


97

Del total de cepas de bacterias ácido lácticas incluidas en el estudio, el 50% (8) fueron

capaces de llevar a cabo una fermentación maloláctica satisfactoria tras 15 días de incubación

a 22 ºC, alcanzando una reducción en el contenido de ácido málico de más de un 75% (Fig.

19), dejando su concentración por debajo de 1,5 g/L. La actividad maloláctica fue altamente

variable entre y dentro de las especies estudiadas, desde un 2,67% en la cepa UVI-3 a un 76,7%

en la cepa UVI-17 (Fig. 19).

Tabla 6: Ensayos de microvinificación con las cepas seleccionadas: Concentración de ácido málico,

ácido láctico, y acidez volátil tras 15 días de fermentación a 22 ºC.

Cepa Ácido málico g/L Ácido láctico g/L Acidez volátil g/L b

Control a 3,95 (± 0,39) 0,67 (± 0,43) 0,21 (± 0,01)

UVI-2 (L. paracasei) 0,98 (± 0,11) 3,40 (± 0,07) 0,12 (± 0,01)

UVI-3 (L. paracasei) 3,65 (± 0,07) 0,08 (± 0,04) 0,22 (± 0,00)

UVI-5 (L. paracasei) 2,48 (± 0,25) 1,95 (± 0,28) 0,18 (± 0,00)

UVI-9 (L. plantarum) 3,48 (± 0,04) 0,10 (± 0,00) 0,23 (± 0,01)

UVI-13 (L. hilgardii) 3,58 (± 0,04) 0,08 (± 0,04) 0,22 (± 0,01)

UVI-14 (L. hilgardii) 1,23 (± 0,04) 3,68 (±0,04) 0,21 (± 0,03)

UVI-15 (L. hilgardii) 3,55 (± 0,07) 0,03 (± 0,04) 0,23 (± 0,01)

UVI-16 (L. hilgardii) 3,55 (± 0,07) 0,03 (± 0,04) 0,22 (± 0,01)

UVI-17 (L. hilgardii) 1,03 (± 0,04) 4,00 (± 0,07) 0,22 (± 0,01)

UVI-18 (L. hilgardii) 1,05 (± 0,00) 3,35 (± 0,14) 0,11 (± 0,03)

UVI-20 (L. hilgardii) 1,18 (± 0,04) 3,93 (± 0,04) 0,23 (± 0,01)

UVI-21 (L. hilgardii) 1,10 (± 0,14) 3,78 (± 0,25) 0,16 (± 0,02)

UVI-23 (L. hilgardii) 1,08 (± 0,11) 3,90 (± 0,00) 0,19 (± 0,01)

UVI-24 (O. oeni) 3,55 (± 0,07) 0,03 (± 0,04) 0,23 (± 0,00)

UVI-25 (O. oeni) 3,48 (± 0,04) 0,18 (± 0,04) 0,23 (± 0,01)

UVI-26 (L. hilgardii) 4,03 (± 0,25) 0,83 (± 0,18) 0,33 (± 0,01)

Medias ± desviación estándar. a: Vino sin inocular; b: acidez volátil expresada como g/L de ácido acético.

Los aislados pertenecientes a la especie O. oeni (UVI-24 y UVI-25) incluidos en este

estudio no mostraron actividad maloláctica apreciable, en contra de los numerosos estudios en

los cuales O. oeni es la especie que mejor conduce la fermentación maloláctica. En nuestro

caso, fueron los aislados incluidos dentro del género Lactobacillus los que mejor rendimiento

maloláctico proporcionaron.


98

Las cepas que mostraron mayor actividad se incluyen dentro de la especie

Lactobacillus hilgardii, a excepción de la cepa UVI-2, perteneciente a la especie Lactobacillus

paracasei. Otra cepa de esta especie, UVI-5 (L. paracasei), fue capaz de reducir el contenido

de ácido málico en un 50%. Es importante destacar que la acidez volátil no sufrió

modificaciones importantes con ninguna de las cepas ensayadas.

Figura 19: Porcentaje total de ácido málico consumido por cada uno de los aislados tras 15 días de

incubación a 22 ºC.

Estos resultados son consistentes con los obtenidos por Juega et al. (2009) en vinos

blancos Albariño y Caíño, en los cuales ni las cepas autóctonas de O. oeni ni las comerciales,

inoculadas al final de la fermentación alcohólica, fueron capaces de llevar a cabo una

fermentación maloláctica satisfactoria. Du Toit et al. (2011) describen también una mejor

actividad maloláctica de varias especies de Lactobacillus frente a la obtenida tras la

inoculación de O. oeni en vinos con un pH superior a 3,5, como es el caso del vino empleado

en el presente estudio (pH 3,8).

En el presente estudio se confirma, por lo tanto, que L. hilgardii no solo es capaz de

llevar a cabo la fermentación maloláctica en vino blanco Albariño, sino que lo hace con un

rendimiento similar a otras especies de Lactobacillus, como L. paracasei, que cuenta con un

historial más amplio en cuanto a su utilización como cepa para conducir la FML, y mejor que

los aislados pertenecientes a la especie O. oeni.

0102030405060708090

100

Co

nsu

mo

de

ác. m

álic

o (

%)

Aislado


99

3.6.2. Formación de ABs

Las bacterias lácticas son consideradas las principales responsables del incremento en

aminas biógenas de los vinos (Landete et al., 2007). Las aminas biógenas, dependiendo de su

concentración, pueden ocasionar numerosos efectos adversos sobre la salud (Shalabay, 1996).

En concreto, la histamina da lugar a una toxicidad significativa, sobre todo en personas con

especial sensibilidad (Landete et al., 2005).

Por ello, esta capacidad debe ser testada a la hora de proponerlas como estárteres

malolácticos. La habilidad para la síntesis de las tres principales aminas biógenas presentes en

los vinos (histamina, tiramina y putrescina) (García-Ruiz et al., 2011) fue evaluada en las ocho

cepas que mostraron una mayor actividad maloláctica. En una primera aproximación se intentó

poner de manifiesto esta capacidad a nivel molecular mediante la amplificación por PCR de

los genes hdc (histidina descarboxilasa implicada en la ruta de síntesis de histamina), odc

(ornitina descarboxilasa implicada en la síntesis de putrescina) y tdc (de la ruta de síntesis de

tiramina) de acuerdo con el protocolo de De las Rivas et al., 2005. Los resultados se muestran

en la Fig. 20.

Figura 20: Amplificación de los genes tdc (A), odc (b) y hdc (B) en las BAL seleccionadas. M: 1 kb

Ladder (Biorom); 1: Control positivo (A: L. brevis CECT 5354 para el gen tdc, B: L. helveticus CECT

403 para el gen odc y C: L. rhamnosus CECT 288 para el gen hdc); 2: UVI-14; 3: UVI-5; 4: UVI-20;

5: UVI-17; 6: UVI-18; 7: UVI-21; 8: UVI-23; 9: UVI-22; 10: UVI-2.

A

B

C

1000 -

700 -

2000 -

1500 -

500 -

300 -

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12

pb


100

Al tratar de amplificar el gen tdc se obtuvo una banda de menor tamaño al esperado y

que sí se amplificó en el control positivo L. brevis CECT 5354 con su tamaño correcto (Fig.

20A). Ante lo dudoso de este resultado, tres de la bandas amplificadas se secuenciaron

comprobándose, efectivamente, que no corresponden a la tirosina descarboxilasa, por lo que

este método no resultó concluyente para las especies L. hilgardii y L. paracasei. El gen odc

solo fue amplificado en la cepa UVI-5 y en la cepa de L. helveticus CECT 403 empleada como

control positivo, encontrándose ausente en el resto de las cepas estudiadas (Fig. 20B). Por

último, el gen hdc no fue amplificado a partir de ninguna de las cepas analizadas

comparativamente con la cepa L. rhamnosus CECT 288 utilizada como control positivo (Fig.

20C). Estos datos coinciden con los obtenidos por Nisiotou et al. (2004) quienes también

encontraron una muy baja presencia del gen codificante para la histidina descarboxilasa en

bacterias lácticas.

En segundo lugar, la capacidad de las citadas 8 cepas para liberar aminas biógenas al

vino fue estudiada mediante LC/MS-MS. La separación completa de las tres aminas biógenas

en muestras de vino se llevó a cabo satisfactoriamente usando cromatografía de interacción

hidrofílica (HILIC). Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7: Presencia de los genes hdc, odc y tdc, y concentraciones de histamina, tiramina y putrescina

detectadas en los análisis de vino mediante LC/MS-MS, tras 15 días de fermentación con las cepas de

bacterias ácido lácticas seleccionadas.

Cepa Especie Aminas biógenas†

hdc odc tdc

UVI-2 L. paracasei - - nd (0,035)

UVI-5 L. paracasei - + nd (0,065)

UVI-14 L. hilgardii - - nd


UVI-18 L. hilgardii - - nd (0,152)




† Presencia (+) o ausencia (-) de los genes tdc, odc y/o hdc (incremento en concentración de la

correspondiente amina biógena frente al control, en mg/L). nd: no detectado. SD < 0,01.


101

Se observó un incremento en los niveles de tiramina en el caso de las cepas de L.

paracasei UVI-2 y UVI-5 y en dos cepas de L. hilgardii (UVI-18 y UVI-22), no detectándose

en el resto de las cepas de L. hilgardii. No se ha encontrado incremento en los niveles de

putrescina ni histamina con ninguna de las cepas analizadas.

En los vinos inoculados con la cepa UVI-5, que presenta el gen odc, no se detectó

putrescina, lo que puede ser explicado teniendo en cuenta que el incremento significativo en

aminas biógenas en el vino depende no solo de la capacidad de la cepa para producirlas sino

de la concentración de los precursores presentes en el mismo (Lonvaud-Funel, 2001). Esto

explica también que la concentración de aminas biógenas sea habitualmente superior en vinos

tintos que en blancos en los que estos precursores aparecen generalmente en menor

concentración (Bauzá et al., 1995; Smit et al., 2008).

El análisis de los resultados obtenidos en relación a la capacidad para producir aminas

biógenas por parte de las cepas estudiadas confirma que se trata más de una característica de

la cepa que de la especie, no solo para el género Lactobacillus sino también para las cepas de

O. oeni (Landete et al., 2005), sosteniendo la necesidad de estudiar este carácter para la

selección de starters malolácticos y confirmando la idoneidad de las cepas seleccionadas de

las especies del género Lactobacillus para ser empleadas como cultivos iniciadores.

3.6.3. Determinación de la capacidad de degradación de ABs

Se ha demostrado que algunas bacterias del ácido láctico pueden degradar aminas

biógenas mediante enzimas amino oxidasas (Capozzi et al., 2012). Esta característica está

considerada también de interés en los estárteres malolácticos. Utilizando el método descrito

por Callejón et al. (2014) se intentó determinar la capacidad para sintetizar enzimas amino

oxidasas en las cepas malolácticas seleccionadas. La ausencia de éstas tras los análisis

realizados descartan la capacidad para degradar aminas biógenas en las cepas de bacterias

lácticas incluidas en dicho análisis.


102

3.6.4. Actividades β-glucosidasa y descarboxilasa de ácidos fenólicos

La influencia de la FML en la composición aromática del vino ha sido puesta de

manifiesto por diferentes autores (Pérez-Martín et al., 2012; Michlmayr y Keneyfel, 2014).

Entre las principales ventajas atribuidas a las especies del género Lactobacillus a la hora de

considerarlas como posibles starters cabe destacar su potencial capacidad para sintetizar

enzimas implicadas en el perfil aromático de los vinos. Entre las enzimas con mayor impacto

en los aromas están las β-glucosidasas y las descarboxilasas de ácidos fenólicos diferenciando,

en este sentido, favorablemente al género Lactobacillus del género Oenococcus.

Teniendo en cuenta que en los genomas de las especies de L. paracasei y L. hilgardii

hay genes que codifican β-glucosidasas, esta actividad se testó, en un valor medio del rango

de condiciones desfavorables en que transcurre la fermentación en la bodega (18 ºC, pH 4),

para las ocho cepas que presentaron carácter maloláctico y los resultados se muestran en la

Tabla 8.

Todas las cepas producen actividad β-glucosidasa, en cantidades variables

dependiendo de la cepa, destacando la cepa de L. paracasei UVI-2. Muchos precursores de los

aromas se encuentran en forma de moléculas glicosiladas sensorialmente imperceptibles

(Michlmayr et al., 2010). La actividad de las β-glucosidasas puede liberar la aglucona

olfativamente activa que contribuye al perfil sensorial de los vinos (Palmeri y Spagna, 2007).

En consecuencia, las cepas malolácticas caracterizadas en este estudio podrían contribuir a

potenciar y diferenciar el perfil aromático de los vinos de la región estudiada, aportando

tipicidad a los mismos.

Tabla 8: Actividad β-glucosidasa en las ocho cepas seleccionadas por su actividad maloláctica.

Cepa Especie Actividad β-glucosidasa (U)*

UVI-2 L. paracasei 36,9 (± 1,7)

UVI-5 L. paracasei 23,6 (± 5,0)

UVI-14 L. hilgardii 14,7 (± 0,8)






* Media (± SD).


103

A pesar del gran número de estudios sobre O. oeni, son escasas las referencias acerca

de la actividad β-glucosidasa tanto en L. paracasei como en L. hilgardii. Marazza et al. (2008)

encontraron actividad β-glucosidasa en cepas de L. paracasei, con una gran variabilidad entre

las cepas estudiadas, y Honi et al. (2013) y Pérez-Martin et al. (2012) encontraron dicha

actividad en cepas de L. paracasei aisladas de productos lácteos. Hasta donde nosotros

sabemos, solamente el estudio de Pérez-Martin et al. (2012) analiza cepas vínicas de la especie

L. hilgardii en busca de actividad β-glucosidasa, obteniendo resultados negativos, aunque

Mtshali et al. (2010) han demostrado la presencia de genes codificantes para esta enzima en

cepas vínicas de L. hilgardii, lo que es consistente con los resultados obtenidos en este estudio.

Además, algunos autores han estudiado esta actividad en especies cercanas, como L. casei

(Coulon et al., 1998) o L. plantarum (Sestelo et al., 2004; Spano et al., 2005).

Las bacterias malolácticas pueden también metabolizar ácidos fenólicos presentes en

el vino mediante descarboxilasas de ácidos fenólicos. De las Rivas et al. (2009) encontraron

una relación directa entre la presencia del gen que codifica una descarboxilasa de ácidos

fenólicos y la capacidad de las bacterias ácido lácticas para producir fenoles volátiles a partir

de ácidos hidroxicinámicos. Para determinar la capacidad para liberar fenoles volátiles por

parte de las bacterias malolácticas caracterizadas en este trabajo, se testó la presencia en su

genoma del gen pdc que codifica una descarboxilasa de ácidos fenólicos. Los resultados se

muestran en la Fig. 21, comparativamente con el control positivo (L. brevis CECT 5354), en

la que se puede observar que ninguna de las cepas analizadas es portadora del gen pdc.

Figura 21: Amplificación mediante PCR del gen pdc. M: Marcados 100 pb Bioron Plus Ladder; 1: L.

brevis CECT 5354; 2: UVI-21; 3: UVI-20; 4: UVI-23; 5: UVI-17; 6: UVI-18; 7: UVI-14; 8: UVI-5; 9:

UVI-2.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pb

400 -

300 -

200 -


104

Los fenoles volátiles producidos por las bacterias malolácticas pueden añadir

complejidad aromática al vino o impactar negativamente en sus características sensoriales

dependiendo de su concentración (Mtshali et al., 2010). En concreto, en algunos estudios, se

ha cuestionado la idoneidad de L. hilgardii como bacteria maloláctica de interés al atribuírsele

la capacidad de impactar negativamente en el aroma del vino debido a la producción de fenoles

volátiles (du Toit et al., 2011). Al igual que en otras características estudiadas, nuevamente,

en este caso, se demuestra que se trata de una propiedad de la cepa más que de la especie y,

las caracterizadas en este estudio, no presentarían el riesgo referido anteriormente.

En resumen, el estudio ecológico de la diversidad de bacterias lácticas asociadas a

mostos y vinos de la región Val do Salnés (Denominación de origen Rías Baixas) se presenta

en este trabajo. Los aislados fueron agrupados en 4 géneros y 6 especies: L. hilgardii, L.

paracasei, L. plantarum, L. lactis, P. damnosus y O. oeni. A diferencia de lo descrito para la

mayoría de las regiones vinícolas las especies predominantes fueron L. hilgardii, L. paracasei

y L. plantarum y no O. oeni.

La capacidad de 16 aislados para conducir la FML en las condiciones y características

de los vinos de esta región se evaluó en microfermentaciones. Ocho de las cepas estudiadas

mostraron una capacidad notable para consumir ácido málico (30-78%) sin incrementar los

niveles de ácido acético. Estas cepas fueron caracterizadas, además, por su capacidad para

incrementar el contenido en aminas biógenas del vino demostrándose que cinco carecen de

capacidad aminogénica y el resto incrementa alguna de las aminas biógenas probadas en

cantidades muy bajas y, en cualquier caso, muy inferiores a los valores permitidos más

restrictivos.

Por otra parte, la capacidad para producir fenoles volátiles que pudieran afectar

negativamente al aroma del vino fue descartada en las ocho cepas que mostraron actividad

maloláctica. Por último, tanto las cepas de L. hilgardii como L. paracasei mostraron capacidad

para producir β-glucosidasa en distintas concentraciones por lo que podrían contribuir a

mejorar y diferenciar el perfil aromático de los vinos de la región estudiada confiriéndoles

tipicidad. Los resultados muestran que las cepas del género Lactobacillus seleccionadas en

este trabajo (en particular L. paracasei UVI-2 y L. hilgardii UVI-23) son buenas candidatas


105

para estudios de vinificación a escala piloto y ser propuestas como nuevos starters

malolácticos autóctonos.

CAPÍTULO II

CAPÍTULO II Introducción

109

BACTERIAS MALOLÁCTICAS COMO AGENTES DE BIOCONTROL

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Microorganismos fitopatógenos y alterantes de los alimentos

El desarrollo de determinados hongos, bacterias y/o levaduras tanto en vegetales como

en productos alimenticios supone un problema, tanto en términos económicos como de salud

pública, de escala global.

En agricultura, el desarrollo de estos microorganismos puede darse en dos etapas del

procesado, en cada una de las cuales muestra efectos claramente diferenciados; se trata de la

etapa pre-cosecha, en la que la infección por fitopatógenos y sus consecuentes daños se

producen sobre la planta, y la etapa post-cosecha, en la que la infección se da sobre los frutos,

o los productos derivados de la etapa anterior. En ambos casos, la aplicación de agentes para

el control de los microorganismos implicados es diferente, siendo la regulación especialmente

restrictiva en el segundo caso, al tratarse de productos más próximos al consumo (Janisiewicz

y Korsten, 2002; Hasan et al., 2013; Abdel-Aziz et al., 2014; Mari et al., 2014).

En productos alimenticios, la proliferación de microorganismos indeseados es

favorecida por dos factores principales: la elevada cantidad de agua en muchos de ellos,

especialmente en frutas y verduras, y las pequeñas heridas o cortes que sirven de vía de entrada

a estos microorganismos y que aparecen como resultado de la inevitable manipulación, ya sea

en su origen, en su distribución o en su venta, lo que suele desembocar en el deterioro del

mismo, y con ello en su descarte (Spadaro y Gullino, 2004; Trias et al., 2008a).

El desarrollo de estos microorganismos en alimentos y, especialmente, los productos

resultantes de su metabolismo, alteran las características sensoriales de los mismos (Remenant

et al., 2015). Estas alteraciones pueden ser daños físicos, alteraciones químicas como

oxidaciones y cambios en la coloración, apariciones de aromas desagradables o el desarrollo

de texturas indeseadas como viscosidad (Gram et al., 2002).

Concretamente, la proliferación de levaduras indeseadas tiene especial impacto en

derivados lácteos como queso o yogurt, mientras que los vegetales y las frutas son


110

especialmente afectados por hongos filamentosos como Fusarium, Alternaria o Botritis

(Maurya et al., 2015).

1.2. Impacto económico

El desarrollo de hongos filamentosos, bacterias y levaduras indeseadas supone una de

las principales causas de deterioro de alimentos y cultivos (Gerez et al., 2013; Mari et al.,

2014).

Las pérdidas debidas a la proliferación de microorganismos se estiman en torno a un

25% de la producción mundial de alimentos (Gram et al., 2002) y de un 50% en países en vías

de desarrollo, por la falta de instalaciones adecuadas de almacenaje (Nunes, 2012). En

agricultura, se ha estimado que la proliferación de los hongos causa entre un 5 y un 10% de

pérdidas en la producción mundial total (Rouse et al., 2008) y que el 25% de los cultivos

alimentarios mundiales se ven afectados por estos microorganismos (www.FAO.org). Como

ejemplo, se estima que las pérdidas derivadas del desarrollo de hongos en el pan es de en torno

a 250 millones de euros solo en la parte occidental de Europa (Schnürer y Magnusson, 2005).

1.3. Implicaciones sobre la salud

Incluso cuando el crecimiento de estos organismos no alcanza el punto de obligar a

desechar el producto alimenticio, su mera presencia puede suponer un serio peligro para la

salud humana en base a las sustancias tóxicas que pueden sintetizar, de las cuales se conocen

efectos como la inducción de tumores o la supresión del sistema inmune (Filtenborg et al.,

1996; Sathe et al., 2007).

La producción de toxinas es el principal problema asociado a la proliferación

incontrolada de hongos. Éstas se engloban en seis clases: aflatoxinas, fumonisinas,

acratoxinas, patulinas, tricotecenos y zearalenonas, las cuales presentan una amplia variedad

de efectos nocivos sobre la salud, entre los que destacan la carcinogénesis, la hepatotoxicidad,

la inmunotoxicidad o la neurotoxicidad (Dalié et al., 2010).

En el caso de las bacterias, los efectos del consumo de determinadas especies son de

sobra conocidos y expuestos en la bibliografía médica. Las infecciones por Salmonella, por


111

ejemplo, pueden causar dolores abdominales, náusea, vómito y diarrea, mientras que aquellas

producidas por Clostridium presenta un cuadro clínico que va desde una diarrea acuosa con

dolores abdominales de diferente intensidad, a una enterocolitis hemorrágica necrosante (Acha

y Szyfres, 2005).

1.4. Deterioro causado por hongos

Los hongos filamentosos son microorganismos que aparecen habitualmente asociados

al deterioro de productos agroalimentarios como frutas, patatas, queso o cereales (Schürer y

Magnuson, 2005; Hasan et al., 2013). Entre estos, los más habituales son incluidos dentro de

los géneros Botritis, Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium, Phytophthora o

Penicillium (Filtenborg et al., 1996; Sathe et al., 2007).

Especies de Fusarium son importantes contaminantes pre-cosecha en plantaciones de

cereal y grano. En éstas, pueden dar lugar a toxinas como el deoxinivalenol, capaz de soportar

sin degradarse todo el procesado post-cosecha, y llegar al consumidor final en industrias como

la cervecera (Filtenborg et al., 1996). Aspergillus o Penicillium aparecen ya en el

almacenamiento post-cosecha, especialmente en frutas y cereales, y pueden también producir

toxinas (Ström, 2005; Rouse et al., 2008).

En enología, los hongos pueden tener un impacto variable. Su presencia puede ser

considerada positiva en determinados vinos (por ejemplo, el vino Mâcon del Domaine de la

Bongran, elaborado tras la contaminación con Botritis), sin embargo, en la mayoría de los

casos son tratados como contaminantes que han de ser erradicados, a fin de evitar la pérdida

total del producto. Especies de Aspergillus aparecen habitualmente asociadas a la uva.

Concretamente, A. niger, supone la especie de Aspergillus más común en este fruto, siendo

además una de las principales fuentes de ocratoxina A (Hocking et al., 2007). En la vid, los

principales hongos patógenos incluyen las especies Botritis cinerea, Uncinula necátor (Oídio),

Plasmopara vitícola (Mildiu o “Mildew”), Guignardia bidwellii (podredumbre negra o “Black

rot”), Phomopsis vitícola (excoriosis de la vid), Eutipa lata (Cantoral y Collado, 2011) y

Fusarium oxysporum (Omer et al., 1999).

Aunque las referencias a este tipo de hongos es mucho menor, la proliferación

incontrolada de levaduras puede llevar también a una caída importante en la calidad del


112

producto, especialmente en alimentación (Huis in’t Veld, 1996). La presencia de algunas

especies de los géneros Rhodotorula, Zygosaccharomyces o Candida están a menudo

asociadas al deterioro de frutas y verduras (Rouse et al., 2008), así como especies de los

géneros Zygosaccharomyces, que aparecen asociados a contaminaciones de vinos (Alonso et

al., 2015) o Yarrowia, en leche y carnes (Nagy, 2014), lo que hace que su control sea también

un aspecto importante en el procesado de dichos productos.

1.5. Deterioro causado por bacterias

Ciertos géneros o especies bacterianos presentan la misma problemática mencionada

anteriormente, asociada a su desarrollo indeseado o incontrolado en productos alimenticios.

Escherichia coli, Bacillus cereus, Salmonella sp. o Staphylococcus aureus son habitualmente

encontrados en productos alimenticios (Pepe et al., 2003), lo que supone un grave riesgo para

la salud humana por su largo historial patológico.

Desde el punto de vista de la alteración organoléptica de los productos alimenticios,

el abanico de especies con efectos negativos es aún más amplio. Por ejemplo, especies de

Enterococcus, como E. faecium y E. faecalis, aparecen habitualmente asociados al

reverdecimiento de productos cárnicos, y especies de Leuconostoc como L. gelidum o L.

mesenteroides, pueden producir gas y sustancias viscosas (Remenant et al., 2015).

Esta problemática se ve agravada cuando la contaminación se produce con especies

psicrófilas o psicrotolerantes, cuyo control con los métodos convencionales de conservación

en frio se hace imposible. Es el caso de Brochothrix thermosphacta, importante contaminante

de productos cárnicos por su capacidad para crecer a 4 ºC, y en condiciones anaerobias

(Gribble et al., 2014) o del género Listeria, capaz de crecer en las condiciones de conservación

anteriormente descritas, y que tiene importantes implicaciones sobre la salud (Fang et al.,

2013).


113

1.6. Control de microorganismos indeseados

1.6.1. Control químico y su problemática

En la permanente lucha contra los agentes que afectan tanto a la industria agrícola

como a la alimentaria, a menudo y de manera recurrente se han empleado pesticidas de origen

químico como mecanismo de control frente a las bacterias, hongos, nematodos o insectos que

las causan. Así, es habitual el empleo de organofosforados, carbamatos y/o hidrocarburos

clorados en el tratamiento o prevención de plagas en cultivos (Koul, 2011). Sin embargo,

muchos de estos compuestos permanecen inalterados a lo largo de la cadena alimentaria,

alcanzando al consumidor final, además de las graves implicaciones medioambientales que

supone su uso indiscriminado.

Tras la cosecha, y en productos alimenticios procesados, los principales compuestos

químicos empleados para el control de microorganismos indeseados son el ácido benzoico y

el benzoato de sodio. El antibiótico natamicina, que es empleado para el control de levaduras,

es efectivo también contra algunos hongos filamentosos y es empleado habitualmente en la

conservación de queso (Schnürer y Magnusson, 2005). En el caso de las bacterias es habitual

el uso de metabisulfito potásico en frutas y vino, o de nitratos y nitritos en carnes

(http://www.fao.org/).

A pesar de que el empleo de conservantes químicos es, a menudo, la principal opción

para el tratamiento o prevención de este tipo de problemas (Spadaro y Gullino, 2004; Nunes,

2012), el consumidor demanda cada vez más el uso de bioconservantes debido a los riesgos

que los primeros suponen para la salud, en forma de alergias o problemas gástricos (Ström,

2005; Sathe et al., 2007; Gerez et al., 2013), así como el posible o probable efecto

carcinogénico de algunos de ellos (Guyton et al., 2015).

La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC, del inglés

“International Agency for Research on Cancer”), organismo perteneciente a la Organización

Mundial de la Salud, clasifica a muchos de estos compuestos en 5 categorías (Guyton et al.,

2015):

- Grupo 1 (Carcinógeno para humanos)

- Grupo 2A (Probable carcinógeno para humanos)


114

- Grupo 2B (Posible carcinógeno para humanos)

- Grupo 3 (No es clasificable en cuanto a carcinogenicidad en seres humanos)

- Grupo 4 (Probablemente no carcinógeno para los seres humanos)

Así, por ejemplo, pesticidas como el malatión, insecticida de uso generalizado en todo

el mundo, se encuentran en el grupo 2A, y fungicidas como el clorotalonil, es clasificado como

posible carcinógeno (Grupo 2B).

Sus efectos sobre el medio ambiente alimentan también la discrepancia en torno a su

empleo, así como la aparición de cepas patógenas resistentes a los mismos (Mari et al., 2014)

y motivan la búsqueda de nuevos agentes de biocontrol frente a estos microorganismos

(Spadaro y Gullino, 2004; Schnürer y Magnusson, 2005; Hasan et al., 2013). Todo esto se

suma al hecho de que muchos de ellos no pueden ser aplicados una vez realizada la cosecha

(Trias et al., 2008) por lo que la tendencia de los diferentes gobiernos es a la restricción de su

empleo.

1.6.2. Control biológico

El empleo de organismos vivos y/o productos derivados de los mismos para el control

de plagas, pestes y microorganismos indeseados para la industria alimentaria y agrícola, ha

experimentado un fuerte auge en los últimos 150 años. Esto se ha reflejado en un incremento

de un 10% anual del mercado de este tipo de productos, frente al 1-2% de incremento de

aquellos basados en agentes químicos (Koul, 2011).

Agentes de control biológico (ACB) incluyen bacterias, hongos, virus, y/o nematodos,

que han demostrado una elevada eficiencia en el control de organismos perniciosos, con el

valor añadido de ser poco o nada nocivos para el medio ambiente.

Se han establecido 3 clases de agentes de biocontrol (Chandler et al., 2011):

- ACB bioquímicos: se trata de metabolitos de plantas que son empleados de forma

natural por las mismas para evitar el ataque de los herbívoros. En más empleado es el aceite

de neem que actúa como insecticida natural.


115

- ACB semioquímicos: un agente semioquímico consiste en una señal producida por un

organismo, que altera el comportamiento de individuos de la misma o diferentes especies. Un

ejemplo de esto son las feromonas sexuales de insectos, tratándose también de uno de los ACB

semioquímicos más ampliamente empleados.

- ACB microbianos: emplean organismos vivos e incluyen bacterias, hongos, virus, y/o

nematodos, y que han demostrado una elevada eficiencia en el control de agentes perniciosos,

con el valor añadido de ser poco o nada nocivos para el medio ambiente. Uno de los más

empleados es Bacillus thuringiensis, que produce una endotoxina que resulta nociva para los

insectos una vez entra en su sistema digestivo. En el caso de los antifúngicos, destacan especies

del género Trichoderma (AgroGuard® WG - LST S.A.-), Candida, como C. oleophila (Aspire®

-Ecogen-) o C. sake (Candifruit® -IRTA-), del género Pseudomonas (Bio-Save® -JET Harvest

Solutions-) o de Bacillus (Rhizo-Plus® -FZB Biotechnik GmbH-) entre otros (Mari et al.,

2014).

Recientemente, Di Francesco et al. (2016) revisaron los 4 mecanismos de control

biológico de agentes microbianos: competencia por los nutrientes y el espacio, antibiosis,

resistencia inducida y parasitismo.

La competencia entre microorganismos supone la ventaja competitiva del agente de

biocontrol sobre el agente patógeno. Para ello, el primero ha de crecer rápidamente, reduciendo

así la disponibilidad de nutrientes para el patógeno (Nunes et al., 2012).

En el grupo de los mecanismos mediados por antibiosis, Di Francesco et al. (2016)

incluyen a todas aquellas sustancias que inhiben el desarrollo de microorganismos, sin ser

necesariamente antibióticos propiamente dichos. Así, destacan la iturina, producida por

Bacillus sp., o la pirrolnitrina y la siringomicina, producidas por especies Pseudomonas

(Nunes, 2012). En otro orden dentro de este grupo, aparecen los compuestos orgánicos

volátiles, como el 2-metil-1-butanol y el 3-metil-1-butanol, producidos por Aureobasidium

pullulans y que son activos frente a Botritis o Penicillium. Otras sustancias como el peróxido

de hidrógeno, reuterina o ácidos orgánicos como el ácido fenil-láctico han sido también

descritos como agentes inhibidores del desarrollo de diversos microorganismos patógenos

(Dalié et al., 2010).


116

La resistencia inducida se basa en la estimulación por parte del agente de biocontrol,

de la activación de enzimas defensivas, refuerzo de paredes celulares o producción de

compuestos antimicrobianos en la planta tratada (Janisiewickz y Korsten, 2002; Nunes et al.,

2012).

El parasitismo es un mecanismo que se da especialmente sobre hongos, al suponer la

adhesión del agente de biocontrol a las hifas, sobre las que induce algún tipo de cambio o

bloquea su acceso a los nutrientes, reduciendo así su viabilidad (Nunes, 2012; Di Francesco et

al., 2016).

Nunes (2012) definió 9 parámetros de interés para la selección de un agente

microbiano de biocontrol:

- El agente ha de ser genéticamente estable

- Debe ser efectivo a bajas concentraciones

- Debe sobrevivir bajo condiciones ambientales adversas

- Tener requerimientos nutricionales simples

- Barato de producir

- Fácil de aplicar

- Compatible con las técnicas de procesado

- No patógeno para la salud humana

1.6.2.1. Biocontrol mediante bacterias del ácido láctico

La capacidad de las bacterias lácticas para el biocontrol de estos organismos

perjudiciales, ya sean bacterias, hongos filamentosos y/o levaduras, ha sido descrita

previamente en cepas de diferentes orígenes (Laitila et al., 2002; Lowe et al., 2004; Schnürer

y Magnusson, 2005; Ström, 2005; Rouse et al., 2007; Hassan y Bullerman, 2008a; Trias et al.,

2008; Sathe et al., 2007; Dalié et al., 2010).

A pesar de que en numerosas ocasiones, su presencia en productos alimenticios y

agrícolas conduce a un deterioro de los mismos, especialmente cuando su presencia es

incontrolada (Remenant et al., 2015), son varias las especies de BAL que han sido empleadas


117

para evitar o reducir el impacto que los microorganismos más perniciosos tienen sobre estos

productos.

Las BAL además, cumplen la mayor parte de los criterios establecidos por Nunes

(2012) para la selección de agentes de biocontrol mencionados en el apartado anterior, a

excepción de sus necesidades nutricionales, que a menudo son relativamente complejas

aunque dependen de la cepa utilizada. Sin embargo, las condiciones que encuentran en la

mayor parte de los productos alimenticios proporcionan aquellas sustancias que las BAL

necesitan para su desarrollo, al tratarse muchos de ellos del hábitat natural de estos

microorganismos, como es el caso de frutas y verduras, o derivados de los mismos (Douillard

y de Vos, 2014).

Estos microrganismos son capaces de liberar un gran número de sustancias

antimicrobianas como bacteriocinas, ácidos orgánicos (fundamentalmente láctico), peróxido

de hidrogeno, etc., que actúan sobre el resto de microrganismos presentes en el medio,

inhibiendo su desarrollo total o parcialmente (Schnürer y Magnusson, 2005; Ström, 2005;

Sathe et al., 2007; Garcha et al., 2012). Por ejemplo, muchas BAL son capaces de producir

peróxido de hidrógeno que, como se ha mencionado, es un importante compuesto

antimicrobiano, así como ácido acético, diacetilo, etc. (Ström, 2005), si bien su presencia en

productos alimentarios puede resultar perjudicial.

Quizás los compuestos antimicrobianos más ampliamente estudiados sean aquellos de

naturaleza proteica. A pesar de que los efectos antibacterianos de las BAL están ampliamente

documentados, existen pocos autores que hayan evidenciado la síntesis de agentes fungicidas

de esta naturaleza (Schnürer y Magnusson, 2005). El efecto, posiblemente sinérgico de estos

compuestos, junto con otros que a menudo son producidos por estas bacterias (reuterina,

diacetil, dióxido de carbono, etc.), proporcionarían el efecto antimicrobiano de algunas de

estas bacterias (Schnürer y Magnusson, 2005).

Las especies de Lactobacillus, L. plantarum (Laitila et al., 2002; Sathe et al., 2007;

Trias et al., 2008), L. paracasei (Hassan y Bullerman, 2008), L. acidophilus (Garcha et al.,

2012), L. casei o L. fermentum (Wang et al., 2011) así como especies del género Pediococcus:

P. pentosaceus (Rouse et al., 2008) y Lactococcus: L. lactis (Trias et al., 2008), han


118

demostrado su eficiencia en el biocontrol de hongos, levaduras y bacterias causantes de

contaminaciones alimenticias, así como en especies perniciosas en la industria agrícola.

Todo esto, sumado a su consideración de microorganismos GRAS (del inglés

“Generally Regarded As Safe”) los convierte en candidatos idóneos para su empleo en las

industrias alimentaria y agrícola.

1.7. Microorganismos como promotores del crecimiento vegetal

La interacción entre las plantas y la microbiota de su entorno tiene un efecto crucial

para el desarrollo de las primeras. Como se ha mencionado, la presencia de microorganismo

patógenos conlleva cuantiosas pérdidas ya sea por la pérdida del o de los frutos producidos

por la especie vegetal, como por una significativa reducción de las tasas de crecimiento de las

mismas.

Sin embargo, a menudo la presencia de microorganismos asociados a los vegetales,

especialmente a las raíces, tiene un efecto positivo sobre su desarrollo. Existen varios

mecanismos para la promoción del crecimiento vegetal por parte de microorganismos entre

los que destacan la síntesis de hormonas vegetales, o la mejora de la captación de nutrientes a

través de la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfato inorgánico o la mineralización

de fosfatos orgánicos (Shrestha et al., 2014; Giassi et al., 2016).

Los microorganismos más estudiados para esta finalidad han sido los asociados a la

rizosfera. Concretamente, especies de los géneros Bacillus, Azospirillum o Rhizobium han

demostrado tener efectos beneficiosos sobre la germinación y sobre el crecimiento de

determinadas plantas (Vaikuntapu et al., 2014; Giassi et al., 2016). Aunque en menor medida,

varios autores han estudiado también la capacidad de las BAL para la estimulación del

crecimiento vegetal. Concretamente, Limanska et al. (2013) pusieron de manifiesto esta

habilidad sobre plántulas de tomate y Shrestha et al. (2014) mostraron que cepas de bacterias

lácticas eran capaces de estimular el crecimiento de plantas de pimiento, lo que justifica la

búsqueda de efectos fitoestimuladores entre algunas de las bacterias lácticas aisladas de otros

orígenes, en particular de las aisladas en el capítulo anterior.

CAPÍTULO II Materiales y Métodos

119


2.1. Cepas de bacterias, hongos filamentosos y levaduras utilizadas en este estudio

Para comprobar el efecto antimicrobiano de las cepas aisladas e identificadas en el

capítulo anterior sobre bacterias, levaduras y hongos, se emplearon las cepas testigo

relacionadas en la Tabla 1:

Tabla 1: Cepas empleadas en la determinación del efecto antimicrobiano de las bacterias lácticas.

CECT: Colección Española de Cultivos Tipo

Las cepas de bacterias ácido lácticas (BAL) utilizadas fueron aquellas pertenecientes

a las especies Lactobacillus hilgardii (UVI-13, UVI-14, UVI-15, UVI-16, UVI-17, UVI-18,

UVI-20, UVI-21, UVI-23 y UVI-26), Lactobacillus plantarum (UVI-6, UVI-8 y UVI-10),

Lactobacillus paracasei (UVI-3, UVI-5, UVI-1, UVI-2, UVI-7, UVI-11, UVI-12 y UVI-19)

y Lactococcus lactis (UVI-27).

2.2. Medios de cultivo

Medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe, Panreac): ver composición en el Capítulo 1,

Sección 1.1. Este medio fue utilizado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas de

bacterias ácido lácticas.

Microorganismo Especie Cepa

Hongos filamentosos Aspergillus niger CECT 2088

Fusarium oxysporum subsp. lycopersici CECT 2715

Levaduras Saccharomyces cerevisiae UVI-SC (Nuestro laboratorio)

Cándida glabrata CECT 1448

Bacterias

Bacillus cereus CECT 193

Bacillus thuringiensis CECT 4497

Staphylococcus epidermidis CECT 231

Staphylococcus aureus subsp. aureus CECT 4439

Xanthomonas campestris CECT 97


120

Medio Glucosa-Sabouraud (Panreac): D (+)-Glucosa 40 g/L, Peptona 10 g/L. Este

medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas comerciales de hongos

filamentosos.

Medio Mueller-Hinton (Panreac): Almidón 1,5 g/L, Infusión de carne 2 g/L y Peptona

de caseína hidrolizada 17,5 g/L. Este medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento

de las cepas de los géneros Xanthomonas, Staphylococcus y Bacillus.

Caldo Nutritivo (Panreac) suplementado con MRS (MRS-CN): Extracto de carne 3

g/L y Peptona de gelatina 5 g/L, pH 6,7. Este medio fue suplementado con medio MRS

(Panreac) a un 50% de la concentración recomendada por el fabricante. Este medio fue

empleado para los ensayos de inhibición in vitro.

Medio YEPD: Extracto de levadura 20 g/L, Peptona bacteriológica 10 g/L, Glucosa

20 g/L. Este medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de las levaduras.

Para la elaboración de medio sólido se añadió, en todos los casos, agar a una

concentración de 20 g/L. Todos los medios, tanto sólidos como líquidos, fueron esterilizados

mediante autoclave a 121 ºC y 1,1 atmósferas de presión, durante 15 min.

2.3. Determinación in vitro del efecto antagónico de las BAL frente a bacterias y

levaduras

La estimación del antagonismo entre las bacterias lácticas seleccionadas y las bacterias

objeto de biocontrol se llevó a cabo en medio MRS+CN a fin de permitir el crecimiento de

todos los microorganismos ensayados, lo cual fue verificado previamente.

Las bacterias susceptibles de inhibición se cultivaron en el medio de cultivo y

temperaturas adecuadas hasta alcanzar la fase exponencial. A continuación se preparó una

suspensión de 106 células/mL empleando la escala McFarland y 100 µL de la misma se

sembraron por extensión en placas Petri de 90 x 15 mm. Paralelamente, las cepas de bacterias

lácticas se cultivaron también en el medio apropiado, a 30 ºC, hasta la fase exponencial de

crecimiento y se preparó una suspensión de las mismas a una concentración de 106 células/mL.

Cinco microlitros de esta suspensión se depositaron sobre la placa sembrada con la bacteria a


121

inhibir y fue incubada a la temperatura óptima de crecimiento de las bacterias susceptibles de

inhibición (recomendada por el proveedor) durante 48 h.

La determinación del antagonismo frente a levaduras se realizó en placas de medio

YEPD. Para ello, las levaduras se cultivaron previamente en medio YEPD líquido hasta

alcanzar una densidad de 106 células/mL y se siguió el mismo método descrito anteriormente

para bacterias. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

2.4. Determinación in vitro del efecto antagónico de las BAL frente a hongos

filamentosos

La determinación de la capacidad antagónica de las cepas de bacterias lácticas frente

a los hongos se llevó a cabo placas Petri de 60 x 15 mm, y en medio MRS, previa

comprobación de que los dos tipos de microorganismos se desarrollan en el citado medio. Para

ello, los hongos filamentosos (Tabla 1) fueron previamente cultivados en MRS líquido, a las

temperaturas recomendadas por el proveedor.

Una vez crecidos éstos, se realizó un raspado de la superficie de los mismos y se añadió

solución salina (NaCl 0,8%) a fin de obtener una suspensión de esporas o conidios que fue

posteriormente ajustada a 104 conidios/mL.

La suspensión celular de las cepas de BAL seleccionadas para el estudio fue obtenida

como se ha indicado en el apartado anterior. La densidad celular de cada una de las cepas de

bacterias lácticas se ajustó a 106 células/mL.

Para el ensayo en placa se añadió una gota de 5 µL de la suspensión de conidios a un

centímetro del borde de la placa. Del mismo modo, se depositó una gota de 5 µL de suspensión

de la cepa de bacteria láctica correspondiente en el extremo opuesto de la placa y, de nuevo, a

un centímetro del borde de la misma. Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.

Este ensayo se realizó contemplando dos variantes: en una de ellas se sembraron las

bacterias y los hongos simultáneamente, mientras que en la otra se estableció un tiempo de

incubación de 48 h entre la inoculación de las bacterias y la de los hongos (en ese orden).

Como controles, se dispusieron placas sembrando cada uno de los hongos, como se indicó


122

anteriormente, sin la presencia de bacterias. En ambos casos, las placas se incubaron durante

72 horas en el caso de A. niger y 144 h en el caso de F. oxysporum, a 28 ºC.

2.5. Determinación in vivo del antagonismo BAL – F. oxysporum

Una vez seleccionadas las BAL en base a su capacidad para el biocontrol in vitro de

F. oxysporum, se realizó un ensayo para determinar su potencial aplicación en cultivos reales.

Al tratarse de un hongo patógeno, entre otros cultivos, del tomate, se emplearon semillas de

Lycopersicum esculentum de la variedad Marmande Cuarenteno (Eurogarden Iberica S.A.)

como modelo para llevar a cabo los ensayos in vivo.

Para el ensayo de germinación de las semillas se siguió el protocolo descrito por

Browne y Cooke (2005). Se analizó el efecto que la presencia del hongo tiene sobre la

germinación de las semillas de dicha especie y la capacidad de las bacterias lácticas L.

plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12 para reducir o inhibir tal efecto, para lo cual se

siguió también el método descrito por Browne y Cooke (2005). Para ello, se procedió a realizar

una cobertura de las semillas con los microorganismos. Las semillas fueron previamente

esterilizadas por inmersión en NaClO al 2,5% durante 2 min y posteriormente lavadas con

agua destilada estéril. Se tomaron 30 semillas por tratamiento y se realizaron 4 tratamientos.

Los controles consistieron en un tratamiento sin cobertura de BAL, donde las semillas se

mantuvieron en agua corriente estéril; un tratamiento con cobertura de hongo F. oxysporum,

donde las semillas se incubaron durante 6 h en una suspensión densa de conidios (108

conidios/mL) de dicho hongo, en solución salina estéril; y dos tratamientos con la cobertura

fúngica descrita anteriormente a la que se sumó la cobertura de la correspondiente suspensión

de bacterias lácticas (L. plantarum UVI-10 o L. paracasei UVI-12) a una densidad de 106

células/mL mediante pulverizado.

La tasa de germinación se calculó tras el recuento de las semillas que, después de 6

días de incubación, mostraron una longitud de raíz de al menos 0,5 cm.

Por otra parte, se analizó el efecto que la presencia del hongo tiene sobre plantas de

tomate y la capacidad de las BAL para reducir dicho efecto, para lo cual se siguió el protocolo

descrito por Omar et al. (2006) con algunas modificaciones. Las semillas se mantuvieron a

remojo durante 3 h, tras lo cual se trasladaron a un germinador donde se mantuvieron durante


123

5 días, en oscuridad. Posteriormente se trasladaron a cultivo en sustrato natural Compo Sana®

Universal (Nutrientes: N = 200 - 450 mg/L, P2O5 = 200 - 500 mg/L, K2O = 1500 - 2200 mg/L,

pH = 5,0 - 6,5) donde se desarrollaron durante 10 días. Transcurrido este tiempo fueron

trasplantadas a macetas individuales de 4 x 4 cm con el mismo sustrato.

Tras 4 días de adaptación post-trasplante, se inoculó en la base del tallo 1 mililitro de

una suspensión de conidios (108 conidios/mL) de F. oxysporum, tras lo cual se añadió en la

base de la planta un mililitro de una suspensión de la correspondiente cepa láctica (L. paracasei

UVI-12 o L. plantarum UVI-10) a una densidad celular de 106 células/mL en agua corriente

estéril.

Todas las plantas fueron regadas cada 4 días con 13 mL de agua corriente estéril por

planta, aplicada desde la base de la maceta para evitar el lavado de bacterias, y con un mililitro

de suspensión bacteriana (106 células/mL) aplicada en la base del tallo. Cada tratamiento

estuvo conformado por 13 réplicas. Se establecieron dos controles: uno de ellos tratado solo

con el hongo, inoculado del modo y a la densidad antes mencionados, y otro sin adición de

hongo ni de bacteria.

El experimento se desarrolló durante 30 días al cabo de los cuales se cosecharon las

plantas y se determinó su peso seco (Wilson et al., 1999; Vaikuntapu et al., 2014).

2.6. Determinación del efecto fitoestimulador de las BAL

Se procedió también a determinar si las BAL seleccionadas podían mostrar un efecto

estimulador sobre el desarrollo de las plantas de tomate. Para la determinación del efecto

estimulador de la germinación de las semillas y el efecto promotor del crecimiento en la planta

tras la germinación se siguieron los protocolos descritos en el apartado anterior disponiendo

un experimento adicionando cada una de las BAL probadas y un control sin ningún aditivo.

El experimento se desarrolló, como en el apartado anterior, durante 30 días.


124

2.7. Metodología de análisis realizados y tratamiento estadístico

El grado de inhibición del crecimiento de las bacterias y levaduras probadas por parte

de las cepas lácticas bajo estudio se determinó mediante la medición del radio del halo de

inhibición de las mismas en torno a la gota de la suspensión de las BAL.

En el caso del antagonismo BAL- hongo filamentoso, esta determinación se llevó a

cabo mediante la estimación del radio de la colonia del segundo, medido en dirección al centro

del inóculo de la bacteria láctica correspondiente. Se determinó el centro de la colonia fúngica

en los primeros estadios de crecimiento, en los cuales presenta una morfología circular. Este

punto se trasladó a siguientes puntos de medida en los que la colonia adquiere forma ovalada

debida, por un lado a la inhibición si la hubiese, y por otro, al contacto con el límite de la placa

Petri. De esta manera se garantiza la toma de datos desde el centro real de la colonia, evitando

el desplazamiento de este por el crecimiento en una u otra dirección.

En ambos casos, la medidas se tomaron empleando el programa de edición fotográfica

Adobe® Photoshop® CS3 versión 10.0.

Los análisis estadísticos fueron realizados empleando el programa SPSS® Statistics

versión 22 (IBM® Corp.). En todos los casos, se llevó a cabo una comparación de medias

mediante ANOVA y el test Dunnet (Gerez et al., 2013), aceptando un nivel de significación

del 95% (p ≤ 0,05) tras la comprobación de normalidad mediante la prueba Kolmogorov-

Smirnov y asumiendo igualdad de varianzas.

CAPÍTULO II Resultados y Discusión

125


Numerosos alimentos y cultivos son altamente perecederos debido en parte a que su

superficie y/o composición suponen un hábitat idóneo para determinados microorganismos,

cuyo desarrollo generalmente desemboca en la pérdida total o parcial de los mismos

(Remenant et al., 2015).

En estos nichos ecológicos, los microorganismos comparten espacio y compiten por

los nutrientes de forma natural, lo que ha estimulado en estos el desarrollo de mecanismos que

les proporcionen una ventaja competitiva, facilitando así su supervivencia (Gram et al., 2002).

A ello hay que añadir que cuando los microorganismos desarrollados son determinados hongos

filamentosos, su capacidad para producir toxinas puede convertir al alimento en un producto

tóxico (Cheong et al., 2014).

Para evitar este problema, convencionalmente, se utilizan preservativos químicos que

inhiben el desarrollo de los citados microorganismos pero que no están exentos de efectos

adversos para los humanos, el resto de los animales, ni para el medio ambiente (Mnif y Ghribi,

2015). En consecuencia, en particular en la Unión Europea, la legislación que regula el uso de

los pesticidas se hace cada vez más restrictiva (Chandler et al., 2016). Además, un problema

añadido al ya expuesto es la constante aparición de resistencias frente a los pesticidas químicos

desarrollados (Varsha y Nampoothiri, 2016). Debido a ello existe un interés creciente en la

búsqueda y desarrollo de nuevos preservativos naturales, carentes de riesgos, para reemplazar

a los tratamientos químicos. Este interés se ve intensificado por el hecho de que los

consumidores están cada vez más concienciados del problema y sus riesgos y demandan

alimentos más seguros (Kivanç et al., 2011).

El biocontrol y la biopreservación hacen referencia al uso de microrganismos o

sustancias antimicrobianas producidas por estos para ser utilizadas en el control de plagas

agrícolas o para prolongar la vida útil de los alimentos (Koul et al., 2011). Las bacterias ácido

lácticas (BAL) forman parte de la microbiota asociada a muchos de los hábitats mencionados

en el primer párrafo y han desarrollado múltiples formas de competencia frente a hongos y

bacterias de su entorno (Trias et al., 2008; Dalié et al., 2010; Gerez et al., 2013; Emerenini et

al., 2014). La producción de ácidos orgánicos, sustancias antimicrobianas o peróxido de

hidrógeno son algunos de estos mecanismos y conducen a una inhibición total o parcial del


126

crecimiento del microorganismo competidor, cuando no a su muerte (Schnürer y Magnusson,

2005).

La consideración de las BAL como microorganismos GRAS, sumado a esta propiedad

demostrada de inhibición de determinados microorganismos patógenos, justifica que puedan

ser utilizadas como agentes biopreservativos y/o de biocontrol. Aunque la capacidad de

biocontrol mostrada por las BAL ha sido puesta de manifiesto en cepas procedentes de

productos lácteos o asociadas a distintos vegetales (Cheong et al., 2014; Sathe et al., 2007;

Askari et al., 2012), nunca se había estudiado con anterioridad en cepas ácido lácticas de

mostos y vinos. Muchas de estas cepas, provenientes de la vid, están adaptadas al ambiente

hostil que representa el vino, con escasez de nutrientes, elevadas concentraciones de etanol y

SO2.

3.1. Antagonismo BAL - bacteria y BAL – levadura

Con objeto de determinar el posible efecto antimicrobiano de las cepas de bacterias

lácticas asociadas a la fermentación maloláctica de los vinos, de entre las cepas caracterizadas

en el Capítulo 1, se escogieron 22 para este ensayo. Dadas las dificultades de crecimiento que

manifiestan algunas cepas de este origen, la selección se realizó, en primer lugar, atendiendo

a este criterio y escogiendo las que presentaban una mayor tasa de crecimiento y, en segundo

lugar, a la diversidad específica optando por cuatro especies distintas: L. plantarum, L.

hilgardii, L. paracasei, y L. lactis.

Como microorganismos susceptibles de inhibición se eligieron las siguientes cepas de

especies de bacterias y levaduras de importancia ambiental o que pueden comportarse como

patógenos y/o alterantes de alimentos: Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis, Staphylococcus

epidermidis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Xanthomonas campestris, Saccharomyces

cerevisiae y Candida glabrata.

La actividad antimicrobiana de las cepas de BAL frente a las bacterias y levaduras

escogidas como testigos se puso de manifiesto y se cuantificó mediante el bioensayo en placa

de antagonismo microbiano descrito en Materiales y Métodos. La Fig. 1 muestra algunos

ejemplos de los halos obtenidos y el conjunto de los resultados se presentan en la Tabla 2.


127

Figura 1: Halos de inhibición mostrados por algunas de las cepas lácticas frente a Bacillus cereus CECT

193 (A) y Bacillus thuringiensis CECT 4497 (B).

Tabla 2: Efecto antagónico mostrado por cada una de las cepas objeto de estudio en función del halo

de inhibición.

L. hilgardii

Cepa

BAL

Cepas testigo

B. cereus B. thuringiensis S.

epidermidis

S.

aureus

X.

campestris

S.

cerevisiae C. glabrata

UVI-26 * ** - - - - -

UVI-13 - * - - - - -

UVI-14 * ** - - - - -

UVI-15 * *** - - - - -

UVI-16 * ** - - - - -

UVI-17 * * - - - - -

UVI-18 * * - - - - -

UVI-20 * ** - - - - -

UVI-21 ** - - - - - -

UVI-23 * ** - - - - -

L. plantarum

UVI-6 - nd *** ** - - -

UVI-8 - - - - - - -

UVI-10 - ** ** ** - - -

L. paracasei

UVI-3 * * * ** - - -

UVI-5 - * * ** - - -

UVI-1 * * ** *** - - -

UVI-2 *** nd - - - - -

UVI-7 * * ** ** - - -

UVI-11 * * *** ** - - -

UVI-12 * * ** *** - - -

UVI-19 * * ** ** - - -

L. lactis UVI-27 *** nd *** ** - - -

(-) no inhibición; (*) radio de inhibición < 3,6 mm; (**) radio de inhibición entre 3,6 y 6,1 mm, (***) radio de

inhibición > 6,1 mm; (nd) no determinado.


128

En primer lugar se observa que ninguna de las cepas ensayadas fue capaz de inhibir el

desarrollo de las levaduras probadas, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Rouse

et al. (2007) quienes fueron también incapaces de inhibir el crecimiento de cepas de los

géneros Saccharomyces o Cándida, mediante el empleo de una cepa de L. plantarum. En este

estudio se demuestra, además, que las especies L. hilgardii, L. paracasei y L. lactis tampoco

tienen capacidad para inhibir el crecimiento de las levaduras.

En segundo lugar, se aprecia también que ninguna de las cepas probadas tiene

capacidad para inhibir a la bacteria Gram negativa X. campestris, patógena de plantas. En este

sentido, Anas et al. (2008) describen un mayor efecto inhibidor frente a bacterias Gram

positivas que sobre Gram negativas tras la aplicación de varias cepas de Lactobacillus,

observación que concordaría con los resultados del presente estudio. Sin embargo, la ausencia

de efectos inhibitorios sobre dicha bacteria fitopatógena discrepa con otros resultados descritos

previamente en los que se aprecia un importante antagonismo de algunas cepas de L.

plantarum o L. casei frente a esta especie (Visser et al., 1986, Trias et al. 2008).

Con respecto a las cepas Gram positivas utilizadas como testigo, se observa que todas

ellas fueron inhibidas por, al menos, una de las especies de bacterias lácticas mencionadas

anteriormente apreciándose, además, una elevada variabilidad intraespecífica tanto en el grado

de inhibición como en el espectro de actividad. Es destacable también que una de las cepas

lácticas probadas, L. plantarum UVI-8, no mostró capacidad para inhibir a ninguno de los

microorganismos testigo. Esta cepa, aunque no tendría utilidad aplicada, podría ser de gran

interés en próximos estudios encaminados a dilucidar el/los mecanismos de inhibición

utilizados por las cepas efectivas.

Es destacable la especificidad de la especie L. hilgardii, que inhibe solamente a las

cepas del género Bacillus (Fig. 2); tanto B. cereus, patógeno tradicional alterante de alimentos

como, B. thuringiensis, considerado recientemente por la EFSA (Allende et al., 2016) de igual

potencial riesgo para la salud pública. Hasta donde nosotros sabemos, esta es la primera vez

que se describe el efecto inhibidor de esta especie de bacteria láctica frente al género Bacillus.

En contraposición, las cepas de L. plantarum probadas en este trabajo resultaron más efectivas

frente al género Staphylococcus, tanto para la especie patógena S. aureus como para S.

epidermidis que, aunque comensal, puede comportarse como oportunista (Otto et al., 2009) y,


129

recientemente, ha sido descrita como responsable de los elevados niveles de histamina

encontrados en algunos vinos (Benavent-Gil et al., 2016).

La mayor efectividad, considerando tanto el grado de inhibición como el número de

especies inhibidas, fue mostrada por las cepas de L. lactis y L. paracasei. L. paracasei mostró

antagonismo frente a un abanico más amplio de cepas testigo, manifestando efectos

inhibitorios sobre las 4 especies Gram positivas ensayadas, si bien el mayor efecto fue

detectado frente a las especies del género Staphylococcus. Aunque Anas et al. (2008) habían

demostrado previamente el potencial de esta especie láctica para la inhibición de S. aureus,

hasta el momento no había sido descrito su efecto antagónico frente a las especies B. cereus,

B. thuringiensis y S. epidermidis.

Diferentes estudios han mostrado el efecto antagonista de las BAL de distintos

orígenes frente a microorganismos patógenos (Anas et al., 2008; Amin et al., 2009; Askari et

al., 2012). Khandakar et al. (2014) describen un antagonismo variable de ciertas cepas de BAL

aisladas de derivados lácteos frente a S. aureus. Esta misma variabilidad fue encontrada por

Kivanç et al. (2009) al testar la capacidad inhibitoria de 24 cepas de L. plantarum aisladas de

boza (bebida a base de trigo fermentado) frente a cepas patógenas entre las que se encontraban

S. aureus y B. cereus.

Figura 2: Distribución interespecífica de las medidas de los halos de inhibición frente a cada uno de las

de las cepas testigo. Los resultados se muestran como la media entre los radios de cada especie ± SD.


130

El presente trabajo, estudiando las bacterias procedentes de la fermentación

maloláctica de los vinos, confirma que tanto el espectro de actividad como el poder inhibitorio

son dependientes de la cepa, ya no sólo entre las cepas de la especie L. plantarum, sino en la

totalidad de las especies probadas en el mismo. Esto indica la necesidad de la caracterización

a este nivel, previa a un posible empleo de estos microorganismos como agentes

bioprotectores.

Aunque con anterioridad habían sido descritas las propiedades de algunas

bacteriocinas producidas por bacterias lácticas de origen vínico (Saad et al., 1993; Navarro et

al., 2000; Ndlovu, 2015; Dündar, 2016), la actividad antimicrobiana de las bacterias lácticas

procedentes de la fermentación maloláctica de los vinos no había sido estudiada hasta ahora.

La actividad antibacteriana mostrada por las cepas lácticas aisladas de este origen las convierte

en microorganismos con potencial interés como agentes biopreservativos. Esta propiedad

puede tener, en primer lugar, un gran interés durante el propio proceso de elaboración de los

vinos ya que podría permitir una reducción en la cantidad de conservantes químicos añadidos

a los mismos, particularmente SO2, cuyos efectos perjudiciales para la salud han sido

fehacientemente constatados (Lester, 1995). Este interés se ve incrementado debido a la

capacidad, puesta de manifiesto en este trabajo, de algunas cepas de bacterias lácticas para

inhibir el desarrollo de la especie S. epidermidis, responsable del incremento en aminas

biógenas de algunos vinos (Benavent-Gil et al., 2016) hecho que, además, enfatiza la

importancia y el interés del género Lactobacillus para preparar estárteres malolácticos. Pero

además, la caracterización de la actividad antimicrobiana de diferentes especies de bacterias

lácticas (además de la más estudiada hasta ahora, L. plantarum), permitió seleccionar distintas

cepas de amplio espectro así como otras más específicas, identificando nuevas especies

efectivas frente a microorganismos alterantes no deseables. Estas cepas, utilizadas de manera

individual o bien combinadas entre ellas o con cepas de otros orígenes, podrían ser utilizadas

como conservantes naturales, seguros, para reemplazar a productos sintéticos y alargar la vida

útil de los alimentos.

3.2. Antagonismo BAL - hongo filamentoso

Distintas especies de Lactobacillus, Lactococcus o Pediococcus de diferentes fuentes

han mostrado importantes efectos inhibidores sobre el crecimiento de determinados hongos


131

(Hamed et al., 2011; Gerez et al., 2013; Gomah y Zohri, 2014) debido a su capacidad para

producir y liberar metabolitos como reuterina, ácidos orgánicos como el ácido láctico, o

compuestos fenólicos (Dalié et al., 2010) o a la producción de sustancias antifúngicas de

naturaleza proteica (Gerez et al., 2013). Sin embargo, la posible capacidad antifúngica de las

bacterias lácticas procedentes del vino no había sido estudiada con anterioridad. Por esta razón,

se decidió probar también en este trabajo el posible efecto inhibitorio de las bacterias

malolácticas sobre hongos fitopatógenos y/o alterantes de alimentos.

Para llevar a cabo el estudio se seleccionaron las cepas lácticas de L. paracasei y L.

plantarum por ser las que presentaron en el estudio anterior un más amplio espectro de acción

y un mayor grado de inhibición frente a las bacterias. Como hongos susceptibles de ser

inhibidos se escogieron los hongos filamentosos Aspergillus niger y Fusarium oxysporum, dos

hongos fitopatógenos, que pueden aparecer también como contaminantes de semillas y como

alterantes de frutos post-cosecha y alimentos (Tournas, 2005) y cuyo desarrollo acarrea

importantes pérdidas en agricultura. Concretamente, el segundo de ellos ha sido clasificado en

el 5º puesto del ranking de hongos patógenos de plantas elaborado por Dean et al. (2012).

Ambos están emergiendo además, como potenciales patógenos humanos, especialmente en

pacientes inmunodeprimidos (Schuster et al., 2002; Nucci y Anaissie, 2007).

La actividad antimicrobiana de las cepas de bacterias lácticas frente a los hongos

escogidos como testigos se puso de manifiesto y se cuantificó mediante el bioensayo en placa

de antagonismo microbiano descrito en Materiales y Métodos. El efecto antagónico en este

bioensayo se estimó en base la reducción del radio de la colonia del hongo enfrentada al cultivo

de la bacteria láctica probada, comparativamente con el control. El grado de inhibición se

estimó a las 144 horas de incubación, al ser este el momento en el que se alcanzaron los valores

máximos, y a partir de los cuales se apreció una leve reducción de la misma, posiblemente por

la entrada en fase de declive de las BAL ensayadas.

Para cada bacteria probada se realizaron dos ensayos, uno en el que el hongo y la

bacteria se sembraron simultáneamente y otro en el que se cultiva la bacteria previamente

durante 48 h, antes de sembrar el hongo. Un ejemplo de este bioensayo se muestra en la Fig.

3 y el conjunto de los resultados se presentan en las Fig. 4 y 5.


132

Figura 3: Efecto antimicrobiano de la cepa L. plantarum UVI-10 frente F. oxysporum (B) y control

mostrando el crecimiento normal del hongo en ausencia de la bacteria (A).

Primeramente se observa que ninguna de las cepas bajo estudio fue capaz de inhibir

al hongo Aspergillus niger, cuyo crecimiento alcanzó a cubrir la placa de medio de cultivo en

menos de 72 horas, sin apreciarse reducción de su desarrollo en aquellas que contenían

suspensión de BAL. Este resultado concuerda con un estudio llevado a cabo por Hassan y

Bullerman (2008), en el que ninguna de las cepas de bacterias lácticas ensayadas, y aisladas

de estárteres comerciales de levadura, fue capaz de reducir el crecimiento de A. niger NRRL

326. Su rápido desarrollo en medio MRS podría estar detrás de esta observación, al no permitir

la proliferación suficiente de las bacterias y con ello la formación de las sustancias

antimicrobianas implicadas en la inhibición. Sin embargo, parece más probable que sea debido

a la incapacidad de las cepas probadas para sintetizar sustancias inhibitorias ya que, la

inhibición del crecimiento de este hongo por parte de cepas de bacterias lácticas como L. casei

o L. plantarum ha sido descrito en otras ocasiones (Dalié et al., 2010; Gerez et al., 2013).

Todas las cepas ensayadas, en cambio, fueron capaces de inhibir in vitro el

crecimiento de Fusarium oxysporum, en mayor o menor grado, tanto cuando fueron pre-

incubadas durante 48 h antes de sembrar el hongo, como cuando fueron inoculadas

simultáneamente.

A B


133

Figura 4: Inhibición del crecimiento de F. oxysporum, expresado como % de reducción del radio de la

colonia en presencia de cada una de las cepas lácticas ensayadas tras la inoculación simultanea de ambos

microorganismos (barras de rayas) y con una incubación de 48 horas de la batería láctica previa a la

inoculación del hongo (barras de puntos). Se presenta la media ± SD. Los asteriscos indican diferencias

significativas (p ≤ 0,05) entre las dos modalidades de inoculación antes mencionadas.

Si tomamos las cepas en su conjunto y comparamos los dos ensayos para cada una de

ellas (Fig. 4), se observa que para 4 (UVI-3, 5, 7 y 10), el efecto inhibitorio es

significativamente mayor cuando las bacterias tienen la posibilidad de desarrollarse antes de

enfrentarse al hongo, sin embargo, para las otras cuatro no; aunque en todos los casos parece

detectarse una tendencia en el sentido de un efecto favorecedor de la pre-incubación de la

bacteria antes de la inoculación del hongo.

Comparando el grado de inhibición del hongo por parte de las distintas cepas de

bacterias lácticas, sin (Fig. 5A) y con (Fig. 5B) pre-cultivo de la bacteria láctica, se observa

una cierta variabilidad en el poder inhibitorio de las distintas cepas probadas, manifestada por

las diferencias significativas encontradas ente ellas, siendo el grado de inhibición del hongo

superior al 44% en todos los casos. Las diferencias oscilan entre un 44% para la cepa UVI-5

y un 55% para la cepa UVI-10, en el caso del ensayo en el que la bacteria y el hongo se

siembran simultáneamente y, entre un 56% para la cepa UVI-12 y un 76% para la cepa UVI-

7, en el caso del ensayo en el que la bacteria se incuba previamente. Cuando se comparan estos

resultados con los mejores datos obtenidos por otros autores con cepas de otros orígenes, se

constata una vez más la alta eficacia antifúngica en el caso de las bacterias malolácticas. Laitila


134

et al. (2002) describen inhibiciones de F. oxysporum de en torno al 50%, mientras que en

nuestro caso es posible alcanzar hasta un 76 % cuando las cepas son previamente cultivadas

durante 48 horas. A este hecho hay que añadir que Wang et al. (2011) demuestran un marcado

efecto del pH sobre la actividad antifúngica antes mencionada, con una drástica caída a partir

de valores de pH superiores a 6. En el caso del presente estudio, los ensayos fueron realizados

a pH 6,7, por lo que presumiblemente la actividad antifúngica mostrada por las cepas bajo

estudio podría ser incluso superior a pH más ácido.

Figura 5: Inhibición del crecimiento de F. oxysporum en presencia de cada una de las cepas lácticas

ensayadas tras la siembra simultanea de ambos microorganismos (A) y con una incubación de 48 horas

de la bacteria láctica previa siembra del hongo (B). Se presenta la media ± SD. Letras diferentes indican

diferencias significativas (p ≤ 0,05).

En estudios previos, la capacidad de las bacterias lácticas para inhibir a las especies

del genero Fusarium resultó controvertida. Los trabajos llevados a cabo por Hassan y

Bullerman (2008) revelaron un importante efecto inhibidor de cepas de L. paracasei, aisladas

a partir de boza, sobre dos especies de Fusarium (F. graminearum, F. proliferatum). En

cambio, en el lado contrario, Gomah y Zohri (2014) obtuvieron una escasa o nula reducción

del crecimiento de F. graminearum, F. proliferatum y F. culmorum al aplicar cepas de la

especie L. plantarum. En el presente trabajo se demuestra la efectividad de las bacterias

lácticas de origen vínico sobre este género al inhibir las cepas de L. plantarum y L. paracasei

el desarrollo de la especie F. oxysporum.


135

Si bien cepas de L. plantarum de distintos orígenes han sido estudiadas en diferentes

trabajos como herramientas de biocontrol de hongos fitopatógenos (entre ellos Fusarium y

más concretamente F. oxysporum y patógenos de humanos), mostrando un importante efecto

inhibidor en la mayoría de los casos (Schürer y Magnusson, 2005; Rouse et al., 2007; Dalié et

al., 2010), en el caso de L. paracasei, a excepción del trabajo llevado a cabo por Liang et al.

(2010) estudiando una cepa de origen humano, no existen prácticamente datos respecto al

antagonismo de esta especie frente a F. oxysporum.

La actividad antifúngica de las bacterias lácticas ha sido atribuida, en particular en el

género Lactobacillus, a su capacidad para producir y liberar metabolitos como reuterina,

ácidos orgánicos como el ácido láctico, o compuestos fenólicos (Dalié et al., 2010), así como

a la producción de sustancias antifúngicas de naturaleza proteica (Gerez et al., 2013). Es

además probable que otros compuestos estén implicados, como por ejemplo las enzimas

quitinolíticas, que pueden tener una marcada actividad antifúngica (García-Fraga et al., 2015).

Esta actividad enzimática ha sido descrita en L. lactis (da Silva et al., 2016, in press) y la

presencia de secuencias codificantes de estas proteínas demostrada en otras cepas/especies del

género Lactobacillus (LOCK919_0612, LOCK919_0378). El efecto combinado y sinérgico

de algunos, o de todos, estos factores sería el responsable del espectro de actividad (generando

una mayor o menor especificidad de acción), así como de la variabilidad en los niveles de

efectividad antimicrobiana.

Las cepas de L. plantarum y L. paracasei de origen vínico estudiadas en el presente

trabajo mostraron una actividad antifúngica frente a F. oxysporum variable, confirmando que

la capacidad inhibitoria responde a una especificidad a nivel de cepa, de ahí la necesidad y el

interés de los estudios a este nivel. En cuanto a la efectividad mostrada, no solo puede

considerarse competitiva respecto a la descrita para otras cepas, sino que en algunos casos

superan la presentada por cepas de otros orígenes estudiadas con anterioridad. Todo ello las

convierte en cepas de potencial utilidad para el biocontrol de F. oxysporum en cultivos y

productos post-cosecha. Por otra parte, su actividad antifúngica en combinación la actividad

antibacteriana demostrada en el apartado anterior, incrementa su potencial interés como

agentes biopreservativos. Su demostrada incapacidad para inhibir el crecimiento de A. niger y

de las levaduras probadas en este estudio, les confiere un cierto grado de especificidad si se

comparan con otras cepas de más amplio espectro (Hassan y Bullerman, 2008; Rouse et al.,


136

2008; Gerez et al., 2013), propiedad ésta que depende también de la cepa, justificando

nuevamente el screening a este nivel, y que puede considerarse muy deseable de cara a su uso

como bioconservantes en productos en cuya elaboración y/o composición se requiere la

presencia de hongos o levaduras viables, como en el caso del queso, pan o vino. Además de

las ya mencionadas ventajas, en relación con la seguridad alimentaria, del uso de las bacterias

lácticas como bioconservantes alternativos a los productos sintéticos, su desarrollo puede tener

otros beneficios. Gomah y Zohri, (2014) y Shi et al. (2014), demostraron que además del efecto

antifúngico, el crecimiento de estas bacterias junto al hongo alterante puede acarrear un

importante descenso en la producción de micotoxinas (entre el 50 y el 75%), así como una

reducción de su concentración por la unión de estas a la biomasa bacteriana (Dalié et al., 2010).

De gran interés para un futuro próximo será poder indagar y profundizar más sobre los

mecanismos utilizados por estos microorganismos para inhibir el desarrollo de otras bacterias

y/o hongos.

3.3. Capacidad de biocontrol de las BAL

Una vez determinada la capacidad de las bacterias lácticas de origen vínico para inhibir

in vitro el desarrollo del hongo fitopatógeno F. oxysporum, se llevó a cabo un primer estudio

con el fin de estimar el potencial efecto protector que dichas bacterias pueden tener in vivo

sobre las plantas de Lycopersicon esculentum var. Marmande Cuarenteno. Se escogieron para

ello las cepas L. plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12, seleccionadas en base a una

elevada actividad antifúngica en los ensayos previos.

En primer lugar, se evaluó la capacidad de las dos bacterias lácticas para proteger a

las semillas de la acción perniciosa del hongo evaluando su efecto sobre la tasa de

germinación. Como se muestra en la Fig. 6, y a diferencia de lo descrito para bacterias lácticas

de otros orígenes (Abdel-Aziz et al., 2014), no se encontraron diferencias significativas en la

tasa de germinación entre los ensayos que incluían las semillas inoculadas con el hongo y

aquellos en los que se adicionaron además las bacterias probadas, no permitiendo concluir un

efecto protector por parte de las bacterias malolácticas en las condiciones de este experimento.

Sin embargo, sí parece apreciarse una tendencia en el sentido de un efecto favorable cuando

se añaden las bacterias lácticas.


137

Figura 6: Tasa de germinación de semillas de tomate inoculadas con conidios de F. oxysporum y, en

su caso, con las bacterias L. plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12. Se muestran las medias ± SD.

(p ≤ 0,05).

Tras determinar el efecto de las bacterias en la protección de las semillas, se procedió

a comprobar su potencial para llevar a cabo el biocontrol en las plantas infectadas por el hongo.

En este caso tanto el efecto del hongo como el posible efecto protector de las bacterias, se

estimaron determinando su influencia en el peso seco de la planta al haber demostrado estudios

previos el efecto de la presencia de determinados hongos sobre la cantidad de biomasa

acumulada por la planta (Maron et al., 2011) y que es un parámetro más adecuado que la

determinación del efecto sobre partes individuales de la planta (Vaikuntapu et al., 2014). El

peso seco, además, está estrechamente relacionado con la producción de fruto (Koning, 1994).

En la Fig. 7 se observa, cualitativamente, el efecto sobre las plantas del tratamiento

con el hongo o con el hongo y las bacterias, que posteriormente fue analizado

cuantitativamente.


138

Figura 7: Efecto cualitativo de la inoculación de las plantas de tomate con F. oxysporum y con las

combinaciones F. oxysporum + L. paracasei UVI-12 y F. oxysporum + L. plantarum UVI-10.

En la primera parte del experimento se estudió el efecto de la infección del hongo

sobre la planta. Los resultados se muestran en la Fig. 8 en la que se observa una reducción

significativa (de casi un 20%) en el peso seco de las plantas infectadas, tras 30 días de cultivo.

Figura 8: Efecto de la inoculación de las

plantas de tomate con F. oxysporum. Se

presenta la media ± SD. Letras diferentes

indican diferencias significativas (p ≤ 0,05).

En una segunda parte del ensayo se evaluó el posible efecto protector de las bacterias

lácticas seleccionadas sobre la infección inducida en la planta con F. oxysporum. Los

resultados se muestran en la Fig. 9 en la que se aprecia una reducción significativa del 24 %

sobre el efecto dañino de F. oxysporum, usado como control, en las plantas tratadas con L.


139

plantarum UVI-10. No se apreciaron diferencias significativas en el tratamiento con la cepa

L. paracasei UVI-12.

Figura 9: Efecto de la inoculación de las plantas de tomate con F. oxysporum y con las combinaciones

F. oxysporum + L. paracasei UVI-12 y F. oxysporum + L. plantarum UVI-10. Se presenta la media ±

SD. Letras diferentes indican diferencias significativas (p ≤ 0,05).

Son relativamente pocos los estudios que hacen referencia a la inhibición in vivo de F.

oxysporum por parte de bacterias lácticas, a pesar de que el interés en el control de este hongo

con métodos biológicos se ha visto incrementado desde el año 2000 (Raza et al., 2016) debido

a las importantes repercusiones económicas que tiene para la industria agroalimentaria. En la

mayor parte de los casos, son especies o géneros bacterianos y/o fúngicos propios de la

rizosfera los empleados en dichos estudios. Especies de Trichoderma, Bacillus, Burkholderia

o Pseudomonas (Larkin y Fravel, 1998; Mao et al., 1998; Omar et al., 2006) han demostrado

un notable efecto inhibidor de este hongo tras su aplicación en plantas de tomate. Sin embargo,

hasta donde alcanza nuestro conocimiento, solo Hamed et al. (2011) han demostrado, en un

experimento que exige la protección previa de la semilla, la capacidad de las bacterias lácticas

(aisladas a partir de productos lácteos), para la bioprotección de plantas frente al ataque o los

efectos perniciosos de F. oxysporum.


140

Estudios previos han demostrado que, en el caso de las bacterias de la rizosfera, su

eficacia como agentes de biocontrol depende de que sean utilizadas para proteger al cultivo a

partir del cual fueron aisladas, mostrando escasa o nula eficacia en la protección de otros

cultivos (Vaikuntapu et al., 2014), lo que implicaría la necesidad de obtener agentes de

biocontrol específicos. En el presente estudio se demuestra que la cepa maloláctica L.

plantarum UVI-10 es capaz de reducir el efecto pernicioso de F. oxysporum en plantas de

tomate proviniendo de un hábitat distinto demostrando así su potencial interés como agente de

biocontrol y, probablemente, una eficacia más transversal.

3.4. Capacidad fitoestimulante de las BAL

En la agricultura convencional, además del uso de pesticidas sintéticos para el control

de plagas agrícolas, los fertilizantes químicos se emplean también extensivamente para

fortalecer, estimular y acelerar el crecimiento de las plantas. Este uso de fertilizantes químicos,

además de sus posibles efectos perjudiciales para los seres vivos, da lugar a importantes

alteraciones ambientales, en particular la eutrofización de las aguas (Savci, 2012). Los

planteamientos más innovadores relativos a la producción agrícola demandan nuevos

fertilizantes de base biológica como alternativa a los agroquímicos. Estos biofertilizantes están

basados en microorganismos que pueden estimular el crecimiento de las plantas y son

conocidos como BPCP (Bacterias Promotoras del Crecimiento de Plantas) o PGPB (en inglés

Plant Growth-Promoting Bacteria) (Bhardwaj et al., 2014.).

Este efecto ha sido previamente estudiado en una gran diversidad bacteriana que, de

manera habitual, se encuentra asociada a las raíces conformando el microbioma de la rizosfera

(Urrea et al., 2011; Vaikuntapu et al., 2014; Giassi et al., 2016). Este tipo de estudios, sin

embargo, no se habían realizado con bacterias lácticas de origen vínico por lo que,

paralelamente a los estudios de biocontrol, en este trabajo, se trató de determinar si las cepas

lácticas seleccionadas L. plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12 podían afectar

positivamente al desarrollo vegetal, empleando nuevamente plantas de tomate como modelo.

Con esta finalidad se realizó un estudio de estimulación del crecimiento en plantas

jóvenes con las dos bacterias vínicas arriba mencionadas, estimando su efecto también

mediante la determinación del peso seco.


141

Los resultados obtenidos muestran un incremento en el contenido en materia seca en

las plantas de tomate inoculadas con las cepas de BAL seleccionadas, y de manera significativa

(en un 24%) en aquellas que fueron regadas con L. plantarum UVI-10, cuando se comparan

con el control no tratado con las bacterias (Fig. 10A). Este incremento representaría alrededor

de un 41% con respecto a las plantas infectadas por F. oxysporum (Fig. 10B), lo que parece

indicar que la bioprotección que ejerce la bacteria sobre las plantas infectadas puede ser debida

a una combinación de su acción antagónica sobre el patógeno y su efecto fitoestimulante sobre

la planta.

Figura 10: Efecto del tratamiento de las plantas de Lycopersicon esculentum con las bacterias L.

plantarum UVI-10 y L. paracasei UVI-12 (A) y comparativa con las plantas infectadas con F.

oxysporum (B). Se presenta la media ± SD. Letras diferentes indican diferencias significativas (p ≤

0,05).

Esta estimulación del desarrollo vegetal de Lycopersicon esculentum por parte de

cepas de L. plantarum había sido descrita por Limanska et al. (2013) para cepas obtenidas de

orígenes diferentes a los empleados en el presente estudio. En este trabajo se demuestra

también el potencial de las bacterias malolácticas para ser utilizadas como potenciales

biofertilizantes.

La capacidad de los microorganismos para actuar como biofertilizantes ha sido

atribuida al hecho de que mantienen el suelo rico en micro y macronutrientes vía fijación de

nitrógeno, solubilización de fosfato y potasio, liberación de sustancias reguladoras del

crecimiento vegetal del tipo de las auxinas, producción de antibióticos y biodegradación de la

materia orgánica del suelo (Compant et al., 2005; Gangwar y Sinha, 2014). En este sentido

sería interesante encaminar los estudios futuros para llegar a dilucidar exactamente los


142

mecanismos responsables del efecto fitoestimulador de los microorganismos, en particular de

las bacterias acido lácticas, sobre las plantas.

En conclusión, los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que las bacterias

lácticas asociadas a los vinos, seleccionadas adecuadamente, podrían ser potencialmente

utilizadas como agentes biopreservativos, de biocontrol y como biofertilizantes, bien de

manera individual o en tratamientos integrales con otras sustancias y/o prácticas, permitiendo

la producción de alimentos más seguros en el marco de una agricultura más sostenible. En este

sentido, sería de gran interés repetir y reproducir los resultados de este experimento en un

estudio más amplio, así como probar la actividad de las bacterias estudiadas en este trabajo

frente a otros patógenos y en diferentes cultivos. Por otra parte, el uso real de estos

microorganismos para las citadas aplicaciones dependerá también de que se siga

profundizando en el estudio de los mecanismos responsables de su actividad antimicrobiana y

de sus propiedades fitoestimuladoras, pero sobre todo, de la puesta a punto de protocolos de

campo eficaces para su aplicación.

CAPÍTULO III

CAPÍTULO III Introducción

145

BIOSÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS DE PLATA MEDIANTE

BACTERIAS MALOLÁCTICAS: EVALUACIÓN DE SU POTENCIAL

COMO ANTIMICROBIANOS

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Definición

El término “nanopartícula” (NP) hace referencia a aquellas con un tamaño

comprendido entre los 0,2 y los 100 nm (Rudramurthy et al., 2016). En comparación, una

molécula de ADN mide aproximadamente 2,5 nm de ancho y un pelo humano unos 10000 nm

de grosor (Thakkar et al., 2010). Este pequeño tamaño le aporta a estas partículas propiedades

únicas como una elevada relación superficie - volumen, propiedades ópticas particulares

debido a la absorción del plasmon en superficie, o comportamientos eléctricos y térmicos

específicos (Singh et al., 2015).

La primera de ellas permite la funcionalización de su superficie, es decir, la adhesión

de moléculas a las mismas, y con ello, una de sus principales aplicaciones, la administración

dirigida de fármacos o “drug delivery” (Mittal et al., 2014). Además, esta elevada superficie

proporciona también una mayor interacción con células vivas, lo que deriva en, por ejemplo,

un mayor efecto microbicida cuando son aplicadas con este propósito (Rudramurthy et al.,

2016).

Existen en la actualidad varios tipos de nanopartículas, que son generalmente

clasificadas en base a su naturaleza química, esto es NPs orgánicas, inorgánicas y mixtas, si

bien se han clasificado también en base a su forma o en función de la disposición de sus átomos

o subpartículas.

Nos referiremos aquí a la primera de las clasificaciones, al tratarse de la más

fundamental y por definir en gran medida el uso al que serán destinadas. Así, en el caso de las

nanopartículas orgánicas, se incluyen nanomateriales como micelas, dendrímeros o liposomas,

mientras que el segundo grupo incluye fulerenos, puntos cuánticos, NPs de sílice o NPs


146

metálicas entre otros.

1.2. Mecanismo de síntesis de NPs

Aunque se han descrito dos mecanismos principales de síntesis de NPs (Grzelczak y

Liz-Marzán, 2014), en el caso de las NPs metálicas, y más concretamente en la síntesis de

nanopartículas de plata (AgNPs), en líneas generales el proceso comienza con la reducción de

iones Ag+ liberando Ag0. Los agentes que llevan a cabo esta reducción son los que determinan

la naturaleza química o biológica del proceso. Esta plata cero-valente conforma el núcleo de

las futuras nanopartículas, que sufrirán un engrosamiento por adhesión de más Ag0 (Sudeep

et al., 2005; Pacioni et al., 2015) en un proceso denominado “nucleación/crecimiento” (Fig.

1).

Figura 1: Proceso general de síntesis de AgNPs a partir de AgNO3. Adaptado de Sudeep y Kamat,

(2005).

Como se ha mencionado, es en el primer paso en la formación de nanopartículas de

plata, la reducción del ion Ag+ en Ag0, y el mecanismo por el cual tiene lugar esta reacción, el

que define la naturaleza del proceso de producción, pudiendo éste ser llevado a cabo por

métodos químicos, o por métodos biológicos.

1.2.1. Métodos químicos

Los procesos de producción química de NPs generalmente se llevan a cabo mediante

la reducción de los iones metálicos en soluciones que contienen compuestos químicos o la

reducción por exposición a altas temperaturas en presencia de determinados gases

(Raveendran et al., 2002).


147

Estos compuestos químicos reductores son a menudo altamente tóxicos lo que en

ocasiones imposibilita su aplicación biomédica, o encarece los costes de producción al añadir

pasos de eliminación de los mismos en las NPs sintetizadas, cuando no son los propios agentes

reductores los que son extremadamente caros (Wei et al., 2012; Mittal et al., 2014). Ejemplos

de los agentes reductores utilizados en la síntesis química de AgNPs son el borohidruro de

sodio: corrosivo, inflamable y toxico por inhalación; el hidrógeno elemental: inflamable; el

reactivo de Tollens: puede ser explosivo; o la N, N-dimetilformamida (DMF): inflamable y

tóxica por inhalación y contacto (Iravani et al., 2014).

En cambio, como característica favorable se puede destacar que, al tratarse de

mecanismos y/o mezclas de reacción de los que se conocen todos sus componentes, se facilita

el control de la síntesis, sobre todo en lo que respecta a la forma y al tamaño de las NPs (Iravani

et al., 2014).

1.2.2. Métodos biológicos

Numerosos autores han descrito la producción biológica (o síntesis verde) de

nanopartículas por parte de microorganismos y organismos superiores, o los productos

derivados de su desarrollo. En este sentido, se ha comprobado la capacidad de bacterias,

hongos y algas para la síntesis de NPs metálicas (Mohampuria et al., 2008; Krumov et al.,

2009; Dhanjal y Cameotra, 2010; Arockiya et al., 2012).

La biosíntesis de estas partículas puede tener lugar de manera intracelular en un

proceso, por lo general, mediado por enzimas, que puede aparecer en organismos de

metabolismo quimiolitótrofo, con funciones microbianas especiales como la orientación por

magnetosomas, o con capacidad para la detoxificación para la supervivencia en medios tóxicos

(Krumov et al., 2009). Esta biosíntesis se ha visto también en otros microorganismos. Ejemplo

de esto es la síntesis intracelular de AgNPs llevada a cabo por Kalimuthu et al. (2008) en

bacterias de la especie Bacillus licheniformis, proponiendo un mecanismo mediado por una

enzima nitrato reductasa.

La síntesis extracelular, en cambio, responde aparentemente a un mecanismo de

óxido-reducción en el que intervienen componentes celulares reductores como proteínas,


148

glúcidos y/o sales liberados al medio de forma natural o artificial (Sintubin et al., 2009).

En base a la forma de liberación de agentes reductores, la síntesis extracelular de NPs

se ha llevado a cabo de dos modos diferentes: en uno de ellos se emplea el sobrenadante

obtenido tras la eliminación de las células del medio de cultivo, donde los agentes reductores

son liberados de forma natural por los microorganismos. En el otro, en cambio, se emplean

extractos procedentes del lavado o rotura de las células, generalmente en agua, aunque también

pueden emplearse diferentes medios tamponados (Sintubin et al., 2012).

Dos especies del género Bacillus, Bacillus flexus y Bacillus cereus, fueron empleadas

por Priyadarshini et al. (2013) y Babu y Gunasekaran (2013) respectivamente para la síntesis

extracelular de AgNPs a partir de medio de cultivo, mientras que Thiruneelakandan et al.

(2013) llevaron a cabo la síntesis de este tipo de NPs a partir de un extracto acuoso obtenido

del lavado de L. plantarum.

El empleo de hongos ha arrojado también resultados positivos en la síntesis de

nanopartículas en general y de AgNPs en particular, predominando los estudios de biosíntesis

a partir de hongos filamentosos, frente a aquellos que emplean levaduras (Mohampuria et al.,

2008; Sintubin et al., 2009). En el caso de las levaduras, Gericke y Pinches (2006) y Agnihotri

et al. (2009) describen la síntesis en medio acuoso de NPs mediante el empleo de Pichia

jadinii y Yarrowia lipolytica respectivamente, así como Eugenio et al. (2016), quienes

lograron sintetizar AgNPs a partir de células de Candida lusitaniae, de manera extracelular,

en el medio de crecimiento de dicha levadura.

En el caso de los hongos filamentosos es el género Fusarium el más estudiado para la

biosíntesis de NPs, si bien cabe destacar también el empleo del género Aspergillus para tal fin

(Taranath et al., 2014), dándose, en la mayor parte de los casos, de manera extracelular

(Mohampuria et al., 2008; Sintubin et al., 2009; Poulose et al., 2014). En el caso de las AgNPs,

son numerosas las referencias sobre su producción mediante estos hongos (Mukherjee et al.,

2001; Ahmad et al., 2003; Bhainsa y D’ Souza, 2006; Duran et al., 2011).


149

1.3. Actividad antimicrobiana de las AgNPs

Los mecanismos de acción mediante los cuales las AgNPs ejercen su actividad

antimicrobiana están siendo objeto de numerosas investigaciones, y hasta el momento han sido

solo parcialmente esclarecidos. La mayor parte de los estudios se han realizado en bacterias.

Tras su aplicación, las AgNPs tienen su primera diana en las envueltas celulares

(Morones et al., 2005; Lok et al., 2006) actuando, posteriormente, sobre otras estructuras

celulares (Fig. 2).

Figura 2: Diferentes mecanismos de acción antimicrobiana de las AgNPs (Pandey et al., 2014).

Se ha demostrado la afinidad de los iones Ag+ por los grupos hidroxilo de los azúcares

y el ion carboxilato de los aminoácidos presentes en estas cubiertas (Lin et al., 2005).

Mirzajani et al. (2011) han sugerido que el principal efecto se da sobre la pared de

peptidoglucano en bacterias Gram positivas, generando huecos en la misma por la liberación

de unidades de ácido n-acetil murámico procedente del peptidoglucano. Estas modificaciones

en la estructura y morfología de la pared celular y el consiguiente acceso de las NPs a

membrana plasmática, inducirían un incremento de la permeabilidad de la misma y,

finalmente, llevarían a la muerte celular (Morones et al., 2005).


150

Lok et al. (2005) plantean un mecanismo de acción de las AgNPs sobre las envueltas

celulares de E. coli según el cual estas partículas podrían romper ciertos componentes

(lipopolisacáridos) de la membrana externa de bacterias Gram negativas. Al mismo tiempo, la

liberación de iones Ag+ induciría una caída de la fuerza protón motriz, llevando a una pérdida

masiva de potasio intracelular. Esta pérdida de la fuerza protón motriz podría darse por la

unión de los iones Ag+ a los grupos tiol de las proteínas transportadores de membrana lo que

lleva a su inactivación (Feng et al., 2000).

Este mismo mecanismo podría, por lo tanto, explicar la rotura de la membrana

plasmática en bacterias Gram positivas, ya que según los datos aportados por Mirzajani et al.

(2011), la rotura del peptidoglucano conlleva la liberación de iones Ag+, con la consiguiente

alteración del potencial de membrana.

La liberación de oxígeno activo (ROS) es otro de los mecanismos por los cuales las

AgNPs ejercen su acción antimicrobiana. Este oxígeno activo puede reducirse a H2O2 o grupos

OH, entre otros radicales libres, que provocan importantes daños en las células microbianas

(Dakal et al., 2016).

Otra diana de las AgNPs se encuentra en el interior celular. Los iones Ag+ tienen

tendencia a unirse y reaccionar con compuestos que presentan fósforo en su estructura

molecular (Morones et al., 2005). Uno de los principales compuestos intracelulares de estas

características es el ADN, sobre el que las AgNPs ejercen su actividad inhibiendo la

replicación y la expresión de proteínas vitales para la célula (Pal et al., 2007).

También se han obtenido efectos microbicidas importantes sobre levaduras silvestres

(Kim et al., 2007). Rodríguez-Argüelles et al. (2011) describen los efectos microbicidas de

NPs compuestas de plata y quitosano sobre Candida glabrata, mostrando un importante

incremento de dicho efecto frente al observado tras la aplicación de AgNO3. A pesar de esta

mejora en la capacidad microbicida, las concentraciones de AgNPs necesarias para la

inhibición de levaduras resultan por lo general mayores que en el caso de las bacterias (Kim

et al., 2007; Egger et al., 2009; Rodríguez-Argüelles et al. 2011), lo que podría ser explicado

por la presencia de una pared celular, de estructura y composición variable dependiendo de la

levadura de la que se trate, que podría dificultar el acceso de las NPs a las dianas descritas

anteriormente.


151

Del mismo modo, los hongos filamentos han sido también objeto de estudio para su

control mediante AgNPs. Así por ejemplo, Kim et al. (2012) consiguieron inhibir el desarrollo

de un importante número de hongos fitopatógenos, mediante la aplicación de AgNPs, si bien

éstas fueron producidas por métodos químicos. Vivek et al. (2011) mostraron un importante

efecto inhibidor del crecimiento de Mucor indicus, Fusarium dimerum, Trichoderma reesei y

Humicola insolens tras la aplicación de AgNPs producidas de manera biológica.

El mecanismo de acción antimicrobiana de las AgNPs frente a hongos parece ser

similar al expuesto anteriormente en el caso de las bacterias, con una diana principal en las

envueltas celulares causando la desestructuración de las mismas y el consiguiente colapso

celular (Kim et al., 2009)

CAPÍTULO III Materiales y Métodos

152


2.1. Cepas de bacterias y levaduras utilizadas en este estudio

Se emplearon 3 cepas de tres especies distintas pertenecientes al género Lactobacillus,

aisladas e identificadas previamente, a partir de vino, en el Capítulo 1 de esta Tesis: L. hilgardii

UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6.

Para la determinación de la actividad antimicrobiana de las nanopartículas se

emplearon las cepas testigo: Candida glabrata CECT 1448, Klebsiella sp. (aislada en nuestro

laboratorio) y Bacillus cereus CECT 193.

2.2. Medios y condiciones de cultivo

Medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe, Panreac): ver composición en el Capítulo 1,

Sección 1.1. Este medio fue utilizado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas de

bacterias ácido lácticas.

Medio Glucosa-Sabouraud (Panreac): ver composición en el Capítulo 2, Sección 1.1.

Este medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de la cepa de referencia C.

glabrata CECT 1448.

Medio Mueller-Hinton (Panreac): ver composición en el Capítulo 2, Sección 1.1. Este

medio fue empleado para el crecimiento y mantenimiento de las cepas testigo Klebsiella sp. y

B. cereus CECT 193. Este medio se utilizó para los ensayos de actividad antimicrobiana.

Todos los medios, tanto sólidos como líquidos, fueron esterilizados mediante

autoclave a 121ºC y 1,1 atmósferas, durante 15 minutos.

C. glabrata CECT 1448 fue cultivada en medio Sabouraud a 30 ºC, Klebsiella sp. fue

cultivada en medio Mueller-Hinton a 37 ºC y B. cereus CECT 193 se cultivó en medio

Mueller-Hinton a 30 ºC.


153

2.3. Reactivos

Se empleó una solución 100 mM de nitrato de plata (AgNO3, Sigma-Aldrich) en agua

destilada esterilizada por filtración a través de membranas de 0,22 µm. Se empleó también una

solución 1N de NaOH (Panreac).

2.4. Obtención del extracto reductor

La obtención del extracto acuoso para preparar las nanopartículas se realizó según

describe Durán et al. (2007) con modificaciones. Se partió de cultivos de bacterias ácido

lácticas en medio MRS a 30 ºC y en anaerobiosis, crecidos hasta alcanzar la fase exponencial

tardía. En este punto las células se recuperaron mediante centrifugación, se estimó su peso

húmedo y se realizó un lavado de las mismas con H2O destilada estéril para, posteriormente,

ajustar la concentración celular a 7 g/L mediante la adición del volumen apropiado de H2O

destilada estéril. Las suspensiones de células (100 ml) fueron posteriormente transferidas a

matraces de 500 mL donde se mantuvieron durante 72 horas a 30 ºC, con una agitación de 200

rpm. Transcurrido este tiempo el sobrenadante fue recuperado por centrifugación (10000 x g /

20 min) y conservado a 4 ºC hasta su utilización.

2.5. Síntesis de nanopartículas de plata

Se realizó un ensayo para verificar la capacidad de producción de nanopartículas de

plata en los extractos obtenidos de cada una de las cepas lácticas bajo estudio. Para ello se

añadió AgNO3 a 5 ml de cada uno de los extractos de las bacterias lácticas a una concentración

final 1 mM.

Realizada esta comprobación, se trató de determinar el efecto que tienen la luz, la

temperatura y la agitación sobre la síntesis de AgNPs. Para ello, se llevaron a cabo tres ensayos

independientes modificando cada una de estas tres variables:

- Luz: Luz / oscuridad.

- Agitación: 200 rpm / estático.

- Temperatura de incubación: 22 ºC / 35 ºC / 45 ºC.


154

Todos los ensayos se realizaron en tubos de vidrio de 3 cm de diámetro a los que se

añadieron 5 mL de extracto celular y AgNO3 (1 mM).

Para llevar a cabo los citados ensayos se elaboraron contenedores con un

compartimento opaco para permitir la determinación de la producción de AgNPs en

condiciones de oscuridad, y un compartimento expuesto a la luz generada por una bombilla de

40 W (OSRAM Spot).

Se fabricaron 6 de estos contenedores que, además, permitieron determinar de forma

simultanea los parámetros luz/oscuridad, agitación/estático y temperatura antes indicados. El

efecto de la agitación se determinó colocando estos recipientes en agitación de 200 rpm,

mientras que el blanco se mantuvo en estático. El efecto de la temperatura se determinó

mediante la incubación de los mismos a las temperaturas indicadas anteriormente. Este ensayo

se muestra de manera esquemática en la Fig. 3.

Figura 3: Esquema del ensayo simultaneo del efecto de las diferentes variables en la producción de

AgNPs a partir de los tres extractos.

Para determinar el efecto de la concentración de NaOH, este compuesto se añadió a

los extractos obtenidos a partir de las bacterias en concentraciones de 0,2, 0,4, 0,8 y 1,2 mM,

tras lo cual fueron esterilizados por filtración a través de membranas con un tamaño de poro

de 0,22 µm. La síntesis se llevó a cabo según se ha indicado, pero utilizando las condiciones

óptimas determinadas en el apartado anterior. Se estableció un control negativo para cada

concentración de NaOH mencionada, en el que el extracto reductor fue sustituido por agua

destilada.


155

2.6. Determinación de la producción de nanopartículas

La formación de AgNPs se verificó tanto de manera visual, por el cambio de

coloración del blanco al marrón/rojo de la muestra, como mediante la determinación

espectrofotométrica del espectro UV-Vis entre 250 y 750 nm (Thermo Scientific Evolution

201). Esta última se llevó a cabo a las 0, 24, 48 y 72 h desde la adición de AgNO3 en los

ensayos de estimación del efecto de la luz, la agitación y la temperatura, y a las 0, 1 y 2 horas

de incubación en el ensayo de determinación del efecto del NaOH.

2.7. Caracterización de nanopartículas de plata

La confirmación de la síntesis de AgNPs en los extractos, así como la determinación

de la forma y tamaño de las mismas, se realizó mediante Microscopía Electrónica de

Transmisión (TEM) (llevada a cabo en el Centro de Apoyo Científico Tecnológico a la

Investigación –CACTI-, Universidad de Vigo). Las observaciones y medidas fueron

realizadas en un microscopio JEOL JEM-1010, operando a un voltaje de 80 kV. Para la

observación de las AgNPs, se depositó 1 µL de suspensión de las mismas sobre una rejilla con

un tamaño de malla de 40 x 40 µm y con recubrimiento de carbono. Esta rejilla fue

posteriormente incubada a 30 ºC durante una noche para proporcionar un secado suave de

dicha suspensión.

Las imágenes TEM fueron analizadas con el programa Image J

(http://imagej.nih.gov/), mediante el cual se realizó la medida de 220 NPs.

La localización celular de las AgNPs utilizadas en los ensayos de actividad

antimicrobiana también se llevó a cabo mediante TEM, procediendo de la siguiente manera:

se tomó 1 mL (107 células/mL) de un cultivo de B. cereus en medio Mueller-Hinton a 30 ºC,

que fue concentrado 2X por centrifugación (15000 x g / 15 min) y resuspendida en H2O MilliQ,

a la que le fueron añadidos 100 µL de suspensión de AgNPs. Tras permanecer una noche en

incubación a 30 ºC se tomó una alícuota de 500 µL a la que se le realizaron dos lavados

(centrifugación a 22000 x g / 2 min y resuspensión en 500 µL de H2O MilliQ) para, finalmente,

añadir 1 µL de una dilución 1:25 de esta suspensión en una rejilla 40 x 40 µm. El secado de la

misma se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.


156

2.8. Determinación de la actividad antimicrobiana de las AgNPs

Para preparar los inóculos para estos ensayos, los microorganismos testigo fueron

cultivados en medio Sabouraud en el caso de C. glabrata y Mueller-Hinton en el caso de las

bacterias. La incubación se llevó a cabo hasta que las células alcanzaron la fase exponencial

(durante 24 - 48 horas), a 30 ºC para las especies C. glabrata CECT 1448 y B. cereus CECT

193, y a 37 ºC en el caso de Klebsiella sp.

2.8.1. Ensayo cualitativo

Se realizó un ensayo cualitativo del efecto antimicrobiano de las AgNPs. Para ello se

empleó el método descrito por Wei et al. (2012) con algunas modificaciones: las cepas testigo

fueron sembradas por extensión (100 µL de una suspensión de 106 células/mL) en placas de

los medios apropiados (Sección 2.2). Estas placas se dividieron en tres segmentos, en cada uno

de los cuales se añadió una gota de 5 µL de suspensión de AgNPs y se incubaron a las

temperaturas mencionadas anteriormente durante el tiempo necesario para la aparición de un

césped denso.

2.8.2. Ensayo cuantitativo

La determinación cuantitativa de la capacidad de las nanopartículas para inhibir el

crecimiento microbiano se realizó mediante la estimación de la Concentración Mínima

Inhibitoria (CMI) realizada utilizando el método de microdilución en caldo (Balouiri et al.,

2016). La capacidad de las mismas para matar a estos mismos microorganismos se determinó

mediante la estimación de la Concentración Mínima Microbicida (CMM).

Para ello se realizaron diluciones seriadas del extracto con NPs a partir de una

concentración correspondiente 50 µg/mL de Ag+, cuando su producción se encontraba en los

valores 0,5 y 1 de absorbancia, en microtubos con los medios de cultivo mencionados

anteriormente.

Para la determinación de la CMI, se inoculó en cada tubo de dilución una

concentración celular de 106 células/mL en caso de las bacterias y 103 células/mL en las

levaduras y la incubación se realizó a las temperaturas mencionadas previamente. La lectura

se llevó a cabo mediante determinación visual de la aparición de turbidez tras 24 horas de

incubación, frente a un control negativo.


157

La CMM se estimó mediante la realización de subcultivos de 100 µL de cada tubo en

el que no se apreció crecimiento microbiano tras la estimación de la CMI, en 1 mL de medio

de cultivo fresco y determinando la presencia/ausencia de crecimiento, según se indicó

anteriormente, tras 24 h de incubación.

Como control negativo se realizó el mismo ensayo para estimar la CMI y CMM del

extracto celular sin AgNPs siguiendo el mismo procedimiento. Todos los ensayos fueron

realizados por duplicado.

CAPÍTULO III Resultados y Discusión

158


La nanotecnología ha experimentado un creciente interés debido principalmente a la

versatilidad de las nanopartículas para su empleo en ámbitos tan dispares como la óptica, la

electrónica o la biomedicina (Mittal et al., 2014). En este último campo, destacan aplicaciones

como el anclaje de moléculas en su superficie, el almacenamiento de moléculas bioactivas en

su interior o las propiedades antimicrobianas y antitumorales de muchas de ellas (Sintubin et

al., 2009; Raveendran et al., 2013).

Debido a las propiedades antimicrobianas de la plata, el empleo las AgNPs ha sido

principalmente orientado al control de agentes patógenos. Su síntesis química, sin embargo, a

menudo implica el empleo de sustancias altamente perjudiciales para la salud y para el medio

ambiente (Thakkar et al., 2010) por lo que el número de referencias a síntesis biológica de

estas nanopartículas, mucho más respetuosa con el medio ambiente y de costes más reducidos,

ha crecido exponencialmente en los últimos años (Singh et al., 2015). En este sentido, se ha

descrito el empleo de bacterias, hongos, plantas, etc. para llevar a cabo esta síntesis, ya sea a

partir del sobrenadante obtenido tras su desarrollo, a partir de su biomasa o a partir de extractos

de los mismos (Poulose et al., 2014).

Las bacterias ácido lácticas han demostrado también capacidad para sintetizar

nanopartículas (Nair y Pradeep, 2002; Sintubin et al., 2009; Korbekandi et al., 2011; Dhoondia

et al., 2012; Priyadarshini et al., 2013; Matei et al., 2015; Sásková et al., 2016), en este caso

centrándose los estudios existentes principalmente en la especie Lactobacillus plantarum y en

cepas aisladas a partir de productos lácteos. En cambio, esta capacidad no había sido estudiada

previamente en cepas malolácticas de origen vínico.

3.1. Obtención de extractos acuosos reductores

Se escogieron para probar su posible capacidad para sintetizar nanopartículas tres

cepas pertenecientes al género Lactobacillus: L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L.

plantarum UVI-6, de entre las aisladas e identificadas en el capítulo 1 de esta Tesis.

Mediante la incubación de las células de estas cepas en agua destilada, según se indica

en Materiales y Métodos, se obtuvieron tres extractos acuosos con potencial capacidad


159

reductora para sintetizar NPs. Esta actividad ha sido atribuida a la presencia de diferentes

biomoléculas liberadas por las células bacterianas al medio, como exopolisacáridos

(Raveendran et al., 2013) o aminoácidos (Saifuddin et al., 2009), entre otras.

Hasta el momento, para llevar a cabo la síntesis de nanopartículas mediante

microorganismos, se han utilizado mayoritariamente los sobrenadantes de los cultivos o las

propias células microbianas (Poulose et al., 2014). El empleo de estas dos formas tiene el

inconveniente de que implica la necesidad de purificar las nanopartículas, agravado en el caso

del uso de células por el hecho de que es necesario romperlas previamente.

El uso de los extractos con potencial actividad reductora, preparados según se describe

en este trabajo tendría la ventaja de que no requeriría de la purificación de las nanopartículas,

sería muy sencillo y muy económico.

3.2. Evaluación de la capacidad de los extractos acuosos para producir AgNPs

En un primer ensayo se trató de determinar si los extractos eran capaces de producir

AgNPs. Tras la adición del AgNO3 a los extractos de L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-

2 y L. plantarum UVI-6 y su posterior incubación, se apreció visualmente la formación de

nanopartículas mediante el cambio en la coloración de los mismos de transparente a naranja-

marrón (Fig. 4). Esta coloración depende de la excitación de las NPs y ésta, a su vez, de su

tamaño, de su forma y de su concentración. Debido a que lo extractos utilizados consisten,

muy probablemente, en mezclas heterogéneas de diferentes moléculas reductoras y sales, lo

habitual es que se formen distintos tipos de nanopartículas con diferentes morfologías y en

concentraciones variables, lo que explica las diferentes coloraciones encontradas entre los

extractos reductores (Nair y Pradeep, 2002; Kalimuthu et al., 2008; Babu et al., 2013;

Priyadarshini et al., 2013; Poulose et al., 2014).

Figura 4: Cambio de coloración de los extractos debido a la formación de AgNPs.


160

La obtención de los espectros UV-Vis verificó la formación de AgNPs, mostrando un

pico de absorbancia con un máximo a 448 nm en el extracto de L. paracasei UVI-2, a 420 nm

en el extracto obtenido a partir de la cepa L. plantarum UVI-6 y a 435 nm en el extracto de L.

hilgardii UVI-18, tras 24 horas de incubación a 30 ºC y en presencia de luz natural (Fig. 5).

Además, se aprecia otro pico de absorbancia a 275 nm. Este pico se ha atribuido a la presencia

de los aminoácidos triptófano y tirosina en el medio, que podrían estar implicados en la síntesis

de AgNPs (Saifuddin et al., 2009) y aparece también en el presente estudio (Fig. 5). Además,

parece apreciarse una relación directa entre el valor de absorbancia de este pico y el

correspondiente a las NPs, si bien esta observación no concuerda con los resultados obtenidos

posteriormente en este trabajo y reflejados en la Fig. 6 (L. hilgardii UVI-18) en la que se

observa también un aumento de este pico al mismo tiempo que del correspondiente a las NPs.

Figura 5: Espectros UV-Vis obtenidos tras 24 horas de incubación a 30 ºC de los extractos procedentes

de las cepas L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6, en presencia de AgNO3.

Por otra parte, se ha constatado que el incremento en los valores de absorbancia está

relacionado con una mayor síntesis de AgNPs (Korbekandi et al., 2012) por lo que en adelante

se empleará este parámetro como indicador de la misma. Atendiendo a ello, los extractos L.

hilgardii UVI-18 y L. paracasei UVI-2 permitirían sintetizar cantidades de nanopartículas

muy superiores (entre 3 y 4 veces) a L. plantarum UVI-6 (Fig. 5).

3.3. Efecto de la luz, agitación, temperatura y NaOH sobre la síntesis de AgNPs

La producción biológica de nanopartículas de plata es dependiente de distintos parámetros

físico-químicos (Korbekandi et al., 2011; Singh et al., 2015).


161

Debido a ello se estudió el efecto de las siguientes variables sobre la producción de

nanopartículas por parte de los extractos objeto de estudio: Luz/Oscuridad, Agitación/Estático

y las temperaturas 22, 35 y 45 ºC. En este caso las mediciones se realizaron a las 24, 48 y 72

horas de incubación.

Los espectros obtenidos tras la medición de la absorbancia UV-Vis a los tres tiempos

confirmaron la producción de nanopartículas en los tres extractos, aunque los niveles de

síntesis más altos se observaron en todos los casos a las 72 h (Fig. 6).

Del estudio de los espectros UV-Vis, se comprobó que en ningún caso la síntesis de

nanopartículas se da cuando la incubación se lleva a cabo en ausencia de luz (Fig. 6A), a

diferencia de lo que había sido descrito en estudios previos en los que la síntesis se llevaba a

cabo en oscuridad (Zaki et al., 2011; Thiruneelakanda et al., 2013; Matei et al., 2015; Sásková

et al., 2016). En contraposición a esta observación, cuando los extractos fueron sometidos a

luz continua producida por un foco de 40 W, se obtuvieron espectros UV-Vis característicos

de la plata coloidal, con picos entre los 350 y los 460 nm (Zaki et al., 2011) (Fig. 6B).

Si bien el mecanismo exacto continúa pendiente de dilucidar, algunos autores han

propuesto mecanismos mediante los cuales la interacción de la luz con determinadas

biomoléculas liberaría agentes reductores fuertes, como los radicales acetilo, que a su vez

aceleran la reducción de los iones Ag+ en Ag0 (McGilvray et al., 2006; Stamplecoskie y

Scaiano, 2010). Este proceso, origina los núcleos que posteriormente darán lugar a las

nanopartículas, ya sea por agregación o por engrosamiento de los mismos debido a la adhesión

de Ag0 en su superficie (Grzelczak y Liz-Marzán, 2014).

Esto explicaría los resultados obtenidos por numerosos autores, que muestran una

producción de AgNPs mucho más lenta en oscuridad, con rangos que van desde las 24 horas

a los 7 días (Zaki et al., 2011; Thiruneelakanda et al., 2013; Matei et al., 2015; Sásková et al.,

2016) frente a aquellas producidas en presencia de luz ambiental (Ranganath et al., 2012; Wei

et al., 2012). En nuestro caso, la ausencia de producción en condiciones de oscuridad podría

ser explicada por el corto período de tiempo en el que se llevó a cabo la síntesis.


162

Figura 6: Espectros UV-Vis obtenidos a partir de los extractos de las cepas L. hilgardii UVI-18, L.

paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6, tras 72 horas de incubación en presencia de AgNO3 1 mM a

diferentes temperaturas y en presencia de luz o en oscuridad.

En general, las muestras sometidas a una agitación de 200 rpm mostraron picos de

absorbancia superiores a aquellas incubadas en estático, a excepción del extracto procedente

de la cepa L. hilgardii UVI-18, que dio lugar a un pico de absorbancia superior a 1 al ser

incubado en estático a una temperatura de 22 ºC, por encima de valores obtenidos en agitación

a otras temperaturas. Las temperaturas consideradas óptimas fueron 22 ºC en L. hilgardii UVI-

18 y L. paracasei UVI-2 y de 35 ºC en el extracto procedente de la cepa L. plantarum UVI-6.

No parece existir una correlación entre la producción de AgNPs y el incremento de la

temperatura de reacción, contrariamente a lo descrito por Gurunathan et al. (2009) para la


163

síntesis de AgNPs en Medio Nitrato tras el crecimiento de E. coli. Estos autores mostraron un

incremento de la producción de nanopartículas paralelo al incremento en la temperatura de

reacción, hasta alcanzar su óptimo a 60 ºC. En nuestro caso, la formación de las AgNPs a

temperaturas más moderadas permitiría una importante reducción en los costes de producción

de las mismas.

Considerando los datos en su conjunto se observa una dependencia en la formación de

AgNPs de la temperatura y la agitación, variable, a su vez, según la cepa utilizada, lo que

confirma el efecto de los factores probados y justifica la necesidad de su optimización para

una producción óptima. Así, tras 72 horas de incubación, los mayores valores de absorbancia

se obtuvieron en las condiciones de luz, agitación y 35 ºC para el extracto obtenido de la cepa

L. plantarum UVI-6 y luz, agitación y 22 ºC para los extractos de las cepas L. paracasei UVI-

2 y L. hilgardii UVI-18 (Fig. 6B), siendo el extracto obtenido a partir de esta última cepa el

que permite unos niveles de producción notablemente superiores a los conseguidos con las

otras dos cepas estudiadas.

Tras los ensayos anteriores, y teniendo en cuenta las referencias previas (Guranathan

et al., 2009; Sintubin et al., 2009) que sugieren una mayor producción de AgNPs a valores de

pH del medio alcalinos y a la implicación de los grupos hidroxilo en dicha producción, se

procedió a determinar el efecto de la adición de NaOH sobre la formación de nanopartículas

utilizando los extractos obtenidos en este estudio. Para ello, en este caso, la obtención de los

espectros UV-Vis se realizó tras dos horas de incubación.

En todas las condiciones probadas se puso de manifiesto la formación de

nanopartículas mediante el cambio de color en los extractos (Fig. 7B) lo cual fue confirmado,

nuevamente, mediante la determinación de los espectros UV-Vis (Fig. 7A).

En cualquiera de las concentraciones ensayadas se alcanzaron valores de absorbancia

mayores o iguales a las observadas en ausencia de dicho compuesto, con una importante

reducción del tiempo de síntesis (Fig. 7). Este pasó de las 72 horas iniciales necesarias para

alcanzar un valor de absorbancia de aproximadamente 1 en el extracto L. hilgardii UVI-18, a

dos horas para obtener el mismo valor tras la adición de una concentración 0,8 mM de NaOH.

Los controles que contenían solamente NaOH no permitieron la formación de nanopartículas.


164

Los mayores valores de absorbancia se obtuvieron en los tres extractos con una

concentración de NaOH de 1,2 mM (Fig. 7B). Esta mejora de la síntesis de AgNPs en extracto

celulares alcalinos había sido descrita por Sintubin et al. (2009), quienes obtuvieron su óptimo

de producción de estas nanopartículas en medio básico, a partir de biomasa celular de L.

fermentum.

Figura 7: A: Espectros UV-Vis obtenidos tras la incubación de los extractos L. hilgardii UVI-18, L.

paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6 durante 2 horas, en presencia de AgNO3 (1 mM) y a diferentes

concentraciones de NaOH. B: Cambio de coloración de los extractos por la formación de AgNPs a las

diferentes concentraciones de NaOH.


165

3.4. Determinación de los valores máximos de producción. Estabilidad de las AgNPs

Una vez establecidas las condiciones óptimas de síntesis se procedió a la

determinación de los valores máximos de producción de AgNPs en los extractos L. hilgardii

UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum UVI-6, utilizando conjuntamente todas las

condiciones optimizadas y determinándolos a intervalos de 1 hora durante 5 horas.

En primer lugar se observó que la síntesis de partículas aumentó con el tiempo de

incubación. Los picos máximos de absorbancia se muestran en la Fig. 8A y fueron obtenidos

tras 5 horas de incubación en presencia de AgNO3 en las especies L. plantarum UVI-6 y L.

paracasei UVI-2. En el primero de los casos, transcurrido este tiempo se alcanzó un valor de

absorbancia de 1,74 en el punto del espectro UV-Vis correspondiente a los 440 nm, mientras

que en el extracto correspondiente a la cepa L. paracasei UVI-2, el valor máximo de

absorbancia alcanzado fue de 2,11 en los 432 nm. En el caso del extracto de L. hilgardii UVI-

18 el valor máximo de absorbancia se obtuvo al cabo de tres horas tras la adición de AgNO3

alcanzando un valor de 1,75 en los 442 nm.

Tal como se indicó más arriba, se realizó un seguimiento periódico de la síntesis de

AgNPs tomando los valores de absorbancia correspondientes a la longitud de onda del pico

máximo obtenido en cada uno de los extractos. Dicho seguimiento mostró, además, una

tendencia al desplazamiento del pico de absorbancia a valores ligeramente superiores a medida

que aumenta el tiempo de incubación, en concordancia con lo descrito por Kalimuthu et al.

(2008) debido, probablemente, a los cambios en las morfologías y proporciones de las

nanopartículas, y/o a su agregación.

A diferencia de lo encontrado por el citado autor, quien describió una evolución lineal

en la síntesis de AgNPs a lo largo del tiempo, en nuestro caso, solamente uno de los extractos

mostró esta tendencia (L. plantarum UVI-6), mientras que los extractos de L. paracasei UVI-

2 y L. hilgardii UVI-18 mostraron una evolución de tipo logarítmico en la formación de las

mismas (Fig. 8B).


166

Figura 8: A: Picos máximos de absorbancia obtenidos para cada uno de los extractos en las condiciones

óptimas. B: Evolución de la formación de AgNPs en cada uno de los extractos a lo largo del tiempo.

Otro aspecto importante en los procesos de síntesis de nanopartículas es conseguir

partículas que se mantengan estables en suspensión durante el mayor tiempo posible ya que,

en muchos casos, se ha demostrado que la tendencia de las mismas es a precipitar (Raveendran

et al., 2013). Las AgNPs sintetizadas en las condiciones establecidas en el presente estudio

permanecieron en suspensión durante al menos un mes sin alteración apreciable. Este hecho

podría explicarse asumiendo que las nanopartículas se recubren de moléculas orgánicas

(presentes en el extracto) durante el proceso de formación, cuya carga superficial puede influir

en gran medida en la estabilidad de las partículas evitando su precipitación a través de la

repulsión electrostática entre ellas (Wei et al., 2012; Zhang et al., 2014).


167

Algunos autores habían descrito previamente la utilidad de las bacterias ácido lácticas

para la síntesis biológica de AgNPs (Sintubin et al., 2009; Nair y Pradeep, 2002; Korbekandi

et al., 2011; Matei et al., 2015), sin embargo, en todos los estudios previos el origen de las

cepas eran los productos lácteos siendo esta la primera vez que se describe dicha capacidad

para las bacterias malolácticas de los vinos. Además, este estudio describe también por primera

vez la capacidad de las especies L. paracasei y L. hilgardii para sintetizar AgNPs, siendo

ambas las que mejores resultados mostraron en términos de producción, si se comparan con la

especie más estudiada L. plantarum.

3.5. Caracterización de las AgNPs mediante Microscopía Electrónica de

Transmisión (TEM)

El tamaño y la forma de las nanopartículas en general y de las AgNPs en particular

tienen un papel crucial en su comportamiento físico-químico (Burda et al., 2005). Por esto se

procedió, en primer lugar, a verificar la formación de las AgNPs para a continuación estimar

el tamaño medio y la forma de las mismas mediante Microscopía Electrónica de Transmisión

(TEM).

Debido a que no se observaron grandes diferencias en los picos de absorción máxima

mostrados por los tres extractos se emplearon las muestras obtenidas a partir del extracto de

L. paracasei UVI-2 para su caracterización mediante microscopía electrónica, ya que se trata,

además, de la especie con la que se han obtenido los mejores resultados.

En la Fig. 9 se pueden apreciar la frecuencia de cada uno de los tamaños obtenidos

tras la biosíntesis de AgNPs, tamaño que osciló entre los 3 y los 26 nm de diámetro, y una

media de 10 ± 3,3 nm. Sin embargo, como se puede apreciar en la Fig. 9, la mayor parte de las

AgNPs (un 70%) se encuentran en un rango entre los 4 y los 12 nm, mientras que las de mayor

tamaño suponen solamente un 27 % del total de nanopartículas analizadas. Las nanopartículas

de este tamaño (10 nm e inferiores) han demostrado ser las mejores candidatas para su

aplicación como agente antimicrobiano debido a que son las que presentan una mayor

capacidad para atravesar las envueltas celulares microbianas e inducir la muerte por los

mecanismos anteriormente descritos (Morones et al., 2005). Las micrografías de la muestra se

presentan en la Fig. 10.


168

Figura 9: Distribución de los tamaños obtenidos a partir de una muestra de 220 AgNPs.

Se ha descrito el tamaño de 2 nm como límite inferior de las AgNPs sintetizadas de

manera biológica, mientras que el límite superior parece definido entre los 40 y los 50 nm

(Zaki et al., 2011; Priyadarshini et al., 2013). Nair y Praded (2002) obtuvieron, de manera

intracelular en células de género Lactobacillus, AgNPs en un rango de entre 15 y 500 nm, si

bien las de tamaño más grande parecían ser agregados de las primeras. Más recientemente,

Matei et al. (2015) emplearon el sobrenadante obtenido tras el cultivo de L. plantarum para la

obtención de AgNPs de tamaños comprendidos entre los 15 y los 20 nm. El conjunto de estos

datos parece indicar que el tamaño depende de la especie, tal vez de la cepa, y del método

utilizado para la síntesis. El tamaño de las AgNPs obtenidas a partir de la cepa L. paracasei

UVI-2 utilizada en este estudio se encuentra dentro de los descritos pero más bien desplazado

hacia los límites inferiores, lo que podría resultar de interés a la hora de proponerlas para

aplicaciones que requieran su entrada dentro de las células.


169

Figura 10: Microfotografía TEM de las AgNPs sintetizadas con el extracto L. paracasei UVI-2 en

condiciones óptimas. Las Fig. A, B y C muestran las morfologías circular, hexagonal y triangular

respectivamente.

Con relación a la morfología de las AgNPs sintetizadas, más del 90% presentaron

morfología circular (Fig. 10A), y en menor proporción, formas hexagonales (Fig. 10B) y

triangulares (Fig. 10C), siendo éstas las formas características de las AgNPs sintetizadas por

microorganismos (Wei et al., 2012), y las más activas en cuanto a sus efectos antimicrobianos

(Pal et al., 2007). Si bien en la imagen solo se pueden apreciar NPs como figuras planas,

probablemente se trate de diferentes formas tridimensionales de las mismas.

Como se ha señalado, la forma de las nanopartículas define sus propiedades físico-

químicas (Burda et al., 2005), lo que a su vez influye sobre la interacción de las mismas con

las moléculas con las que pueden entrar en contacto, incluyendo los componentes celulares de

bacterias, hongos y organismos superiores, en el caso de su aplicación sobre células vivas. Así,

Pal et al. (2007) demostraron la dependencia entre la forma de la nanopartícula y la interacción

que esta tiene sobre la bacteria Gram negativa E. coli. En dicho estudio se muestra que la

morfología triangular, seguida de la circular poseen un gran efecto biocida. Dada la presencia

de estas morfologías entre las AgNPs obtenidas con la cepa L. paracasei UVI-2 cabría esperar

por parte de las mismas un importante efecto antimicrobiano.


170

3.6. Capacidad de las AgNPs sintetizadas para penetrar las células y efecto

antimicrobiano

Muchas de las aplicaciones de las nanopartículas, por ejemplo su empleo como

antimicrobianos, requieren de su entrada dentro de las células. Por ello se procedió también a

comprobar si las AgNPs sintetizadas en las condiciones establecidas en este estudio tenían la

capacidad de penetrar en las células, en concreto en las microbianas. Para ello, un cultivo de

la especie Bacillus cereus fue tratado durante 24 h con las AgNPs obtenidas a partir de la cepa

L. paracasei UVI-2 según se explica en la sección de metodología. Las células tratadas fueron

analizadas mediante TEM y los resultados se muestran en la Fig. 11A.

Figura 11: A: Imagen TEM de las AgNPs en el interior de una célula de B. cereus; B: Desestructuración

de la pared celular bacteriana (señalada con flechas azules) tras el tratamiento con AgNPs; C: Imagen

amplificada de las NPs en el interior celular. Las flechas rojas señalan las nanopartículas.

Las imágenes muestran la capacidad de las AgNPs para desestructurar las envueltas

celulares externas (Fig. 11, inserto B) y penetrar al interior de la célula (Fig. 11, inserto C). En

base a ello, las nanopartículas sintetizadas en este trabajo podrían ejercer una actividad

antimicrobiana mediante cualquiera de los mecanismos propuestos hasta ahora y descritos en


171

la introducción de este capítulo (Morones et al., 2005; Pal et al., 2007; Mirzajani et al. 2011;

Singh et al., 2015). El empleo de las AgNPs como microbicidas está recibiendo un creciente

interés, especialmente desde la irrupción y diseminación de los agentes patógenos resistentes

a antibióticos ya que han sido propuestas como una alternativa en estas situaciones al haber

demostrado actividad antimicrobiana frente a bacterias de importancia clínica y, en menor

medida, frente a hongos (Morones et al., 2005; Rudramurthy et al., 2016; Tashi et al., 2016).

Teniendo en cuenta la capacidad mostrada por las nanopartículas sintetizadas en este

estudio para desestructurar y penetrar en el interior de las células microbianas, se procedió

seguidamente a probar su actividad antimicrobiana como un estudio preliminar de su potencial

aplicación en el control de microorganismos indeseados.

Dentro de las bacterias, las especies más utilizadas para probar el efecto

antimicrobiano de las AgNPs han sido Escherichia coli (como Gram-negativa) y

Staphylococcus aureus (como Gram-positiva). Para testar el efecto antimicrobiano de las

AgNPs sintetizadas en este trabajo se ha escogido, como bacteria Gram-negativa, una cepa de

Klebsiella sp. debido a la creciente atención que las autoridades sanitarias tienen que prestar a

las cepas de esta bacteria que se han convertido en resistentes a todos los antibióticos (Arana

et al., 2016; Utt y Wells, 2016) y, como Gram-positiva, una cepa de Bacillus cereus

responsable de intoxicaciones alimentarias e infecciones graves asociadas a pacientes

inmunodeprimidos, resistente también a numerosos antibióticos, entre ellos las cefalosporinas

de 3ª generación (Kervick et al., 1990). Además, para evaluar la actividad antimicrobiana de

las nanopartículas frente a los hongos, se ha incluido en el estudio la levadura Candida

glabrata, considerada un patógeno emergente con un alto número de cepas resistentes a los

antifúngicos triazólicos (Tapia, 2008).

En primer lugar, se realizó un ensayo cualitativo utilizando las especies B. cereus y C.

glabrata como representantes de agentes patógenos procariotas y eucariotas respectivamente,

para lo cual se llevaron a cabo ensayos de inhibición en placa (Fig. 12).

Estos ensayos mostraron una inhibición completa del crecimiento de B. cereus en las

zonas en las que se inoculó la suspensión de AgNPs, siendo esta inhibición equivalente con

los tres extractos (Fig. 12A). En el caso de la inoculación sobre un cultivo de C. glabrata (Fig.

12B), la inhibición del crecimiento no fue completa, aunque sí se produce un menor desarrollo


172

del cultivo en aquellas zonas en las que hay presencia de nanopartículas. En todos los casos se

comprobó que la inhibición no era producida por compuestos sintetizados por las propias

bacterias ácido lácticas empleadas y que pudieran estar presentes en el extracto, reproduciendo

con el extracto celular sin AgNPs el ensayo descrito, lo que arrojó resultados de negativos.

Figura 12: Efecto antimicrobiano de las AgNPs sobre B. cereus y C. glabrata.

En segundo lugar, se estimaron la CMI y la CMM para todos los microorganismos

escogidos. En el ensayo se probaron dos muestras de nanopartículas con distintas

absorbancias, 0.5 y 1. Los resultados se muestran en la Tabla 1, en la que se observa que las

AgNPs obtenidas a partir de las tres cepas de bacterias lácticas estudiadas muestran actividad

antimicrobiana frente a todas las cepas testigo probadas, siendo más efectivas frente a las

bacterias que contra la levadura. Además, se observa también que, atendiendo a la CMI, el

extracto obtenido a partir de L. hilgardii UVI-18 se mostró más efectivo, aunque estas

diferencias no son tan claras cuando se analiza la CMM. Las diferencias en la efectividad

antimicrobiana encontradas entre los tres extractos utilizados podría deberse a las diferencias

en las concentraciones de cada una de las morfologías de las AgNPs, tal como se describió

con anterioridad. A esto podrían sumarse las diferencias en las moléculas adheridas en la

superficie de las nanopartículas, lo que influiría en su carga, y con ello en su capacidad de

atracción y unión a las paredes celulares, si bien el mecanismo de acción antimicrobiana de

las AgNPs aún no ha sido completamente esclarecido (Singh et al., 2015; Gupta et al., 2016).

B. cereus C. glabrata A B


173

Tabla 1: Actividad antimicrobiana de las AgNPs, expresada como CMI y CMM, (en µg/mL de Ag+).

CMI CMM

L. hilgardii

UVI-18

L. paracasei

UVI-2

L. plantarum

UVI-6

L. hilgardii

UVI-18

L. paracasei

UVI-2

L. plantarum

UVI-6

Ab

s. 0

,5

C. glabrata 1,56 3,125 1,56 6,25 6,25 6,25

Klebsiella sp. ≤ 0,78 1,56 1,56 3,125 3,125 3,125

B. cereus 1,56 1,56 1,56 6,25 1,56 1,56

Ab

s. 1

C. glabrata 1,56 3,125 3,125 6,25 6,25 6,25

Klebsiella sp. ≤ 0,78 ≤ 0,78 1,56 6,25 1,56 1,56

B. cereus ≤ 0,78 1,56 1,56 3,125 3,125 1,56

Con respecto a la concentración de AgNPs en la muestra, no se observó una clara

mayor efectividad con la muestra más concentrada (Absorbancia = 1), dándose incluso la

situación contraria, lo que podría ser atribuido a una mayor agregación de las NPs en la muestra

más concentrada dando lugar a tamaños mayores, lo que reduciría su actividad antimicrobiana

(Singh et al., 2015; Rudramurthy et al., 2016).

Algunos autores (Kim et al., 2007; Jain et al., 2010) han descrito un mayor efecto

antimicrobiano de las AgNPs sobre las bacterias Gram-negativas en comparación con las

Gram-positivas y lo han atribuido a la mayor dificultad para desestructurar y atravesar las

paredes celulares de estas últimas. Sin embargo, otros investigadores (Suresh et al., 2010; Wei

et al., 2012; y Rahisuddin et al., 2015), han descrito el efecto contrario, en concreto utilizando

nanopartículas de síntesis biológica. En el caso de las NPs sintetizadas en este trabajo, la

eficacia parece más bien dependiente del extracto (tipo de nanopartículas presentes) utilizado

y la cepa a la que se enfrenta, como había sido descrito previamente (Rodríguez-Arguelles et

al., 2015) para AgNPs sintetizadas en diferentes tipos de quitosano.

Los distintos estudios existentes hasta el momento, utilizan diferentes métodos

(bioensayos en placa, métodos de microdilución) así como distintas cepas testigo para

determinar la actividad antimicrobiana de las nanopartículas, la cual expresan en diferentes

unidades (ppm, μg/mL, molaridad). Al no existir una metodología de trabajo unificada resulta

difícil poder comparar los resultados obtenidos en diferentes trabajos.

Con respecto a las AgNPs sintetizadas en este estudio, las CMI obtenidas para

Klebsiella sp. y B. cereus (≤ 0,78 – 1,56 μg/mL) son muy inferiores a las encontradas por


174

Pourmand et al. (2013) para K. pneumoniae (10 μg/mL) y por Buszewski et al. (2016) para B.

subtilis (6,25 μg/mL). Esto mismo ocurre cuando se comparan con las diferentes CMI

recogidas en Durán et al. (2016) o en Rudramurthy et al. (2016) para distintas cepas de

diferentes especies de bacterias y levaduras, lo que pone de manifiesto para las AgNPs

obtenidas a partir de las bacterias lácticas estudiadas en este trabajo una potente actividad

antimicrobiana destacando, además, que es la primera vez que se describe para las especies L.

paracasei y L. hilgardii.

En resumen, el presente estudio demuestra que las bacterias ácido lácticas procedentes

del vino pueden ser empleadas para la síntesis de AgNPs, utilizando un método sencillo,

económico, no tóxico y respetuoso con el medio ambiente, siendo la primera vez que se usan

con esta finalidad las especies L. paracasei y L. hilgardii.

Tabla 2: Síntesis de AgNPs por diferentes especies bacterianas.

Referencia Especie Sistema

Reductor (a)

[AgNO3 ]

(mM)

[Células]

(g/L)

Tamaño

(nm) Forma(b)

Tiempo

de

síntesis

Producción

(Abs.)

Chaudhari et al. 2012 Lactobacillus spp. Medio de

cultivo (LC) 1 - 39-41 C 3 días 3

Dhoondia et al. 2012 L. mindensis Biomasa 0,5 - 2-20 C/T 7 días 2,7

Guranathan et al., 2014 E. coli Medio de

cultivo (LC) 42-89 C 24 horas 2,3

Korbekandi et al. 2011 L. casei Biomasa 6 5 10-25 - 50 horas 4

Matei et al. 2015 L. plantarum Medio de

cultivo (LC 1 - 15-20 C/H 24 horas -

Ranganath et al. 2012 Lactobacillus spp. Biomasa 1 - 2-20 C 12 horas 0,7

Saifudin et al., 2009 B. subtilis Medio de

cultivo (LC) 5-50 C/ T 5 días 0,9

Sásková et al. 2016 L. casei Biomasa 4 - 12-27 - 21 días -

Sintubin et al. 2009

L. farciminis

L. parabuchneri

L. plantarum

L. fermentum

L. brevis

L. rhamnosus

Biomasa 5,8 5 5-15 - 1 min -

Thiruneelakandan et al. 2013 L. plantarum Extracto

acuoso 1 4 - - 24 horas 0,8

Zaki et al., 2011

Acinetobacter sp.

Stenotrophomonas maltofilica

E. coli

B. megaterium

Medio de

cultivo (LC) 3,5 - 15-50 C 6 días 4

Zhang et al. 2014 L. fermentum Biomasa 9 10 3-10 C 24 horas 2,3

Este estudio

L. paracasei

L. plantarum

L. hilgardii

Extracto

acuoso 1 7

3-26

-

-

C/H/T

-

-

5 horas

5 horas

3 horas

2,11

1,74

1,75

(a) LC: libre de células

(b) C: Circulares; H: Hexagonales; T: Triangulares


175

Los datos obtenidos utilizando el método de síntesis puesto a punto en este trabajo

muestran una excelente relación entre los niveles de producción y los cortos tiempos de

producción utilizados, si se comparan con otros estudios que también utilizan cepas

bacterianas (Tabla 2), originando NPs de tamaño adecuado para ser utilizadas en diferentes

aplicaciones biológicas. Pero además, este método, a diferencia de la mayoría de los descritos

(Tabla 2), parte de un extracto reductor libre de células y componentes de medio de cultivo,

preparado en agua, evitando así la necesidad de recuperar las nanopartículas del interior de las

células o adheridas a ellas. Por otra parte, la evaluación de su actividad biológica, mostró que

presentan una potente actividad antimicrobiana, en particular frente a microorganismos

patógenos, cuando se compara con la mayoría de las otras AgNPs descritas.

Con respecto a las perspectivas de futuro, sería interesante probar la actividad

antimicrobiana de estas nanopartículas frente a otros microorganismos, bien utilizadas de

manera individual o combinadas con otras drogas para potenciar su actividad, así como evaluar

otras posibles aplicaciones biomédicas y ambientales. Igualmente, sería de interés probar la

capacidad de los extractos reductores obtenidos a partir de las bacterias lácticas de los vinos

para sintetizar otras nanopartículas metálicas. Por otra parte, sería también de gran

importancia, llegar a identificar y caracterizar el/los componentes de carácter reductor

presentes en el extracto utilizado para llevar a cabo la síntesis.

CONCLUSIONES

CONCLUSIONES

179

- La combinación de las técnicas de secuenciación del ARNr 16S, ARDRA, análisis de la

región intergénica 16S/23S y el gen recA, se mostró adecuada para la identificación de las

bacterias del ácido láctico asociadas a mosto y vino de la variedad Albariño cultivada en la

región vinícola de Val do Salnés (D.O. Rías Baixas).

- El estudio de la diversidad de bacterias lácticas aisladas a partir de mosto y vino de la variedad

Albariño cultivada en la región estudiada permitió agruparlas en cuatro géneros y seis especies:

L. hilgardii, L. paracasei, L. plantarum, L. lactis, P. damnosus y O. oeni, predominando, a

diferencia de lo que ocurre en la mayor parte de las regiones vinícolas, el género Lactobacillus

y no el género Oenococcus y mostrando una distribución biogeográfica característica.

- Ocho de las cepas aisladas presentaron capacidad para consumir ácido málico en distinto

grado, sin incrementar significativamente la acidez volátil, en las condiciones y características

de los vinos de la región objeto de estudio, resultando esta una característica dependiente de

la cepa y no de la especie.

- El análisis de las cepas que mostraron actividad maloláctica puso de manifiesto que carecen

de capacidad aminogénica que pueda comprometer la seguridad del producto elaborado, que

no producen fenoles volátiles que puedan impactar negativamente en el aroma del vino y que

sintetizan, en distintas concentraciones, beta-glucosidasas que pueden contribuir a potenciar y

diferenciar el perfil aromático del vino, confiriéndole tipicidad regional.

- Atendiendo a los criterios aplicados en este estudio, se seleccionan como más adecuadas para

conducir la FML en los vinos de la variedad Albariño de la región de Val do Salnés, las cepas

L. paracasei UVI-2 y L. hilgardii UVI-23 que, además, se proponen como potenciales nuevos

estárteres malolácticos autóctonos.

- Las cepas malolácticas (pertenecientes a las especies L. plantarum, L. hilgardii, L. paracasei

y L. lactis) estudiadas en este trabajo mostraron actividad antimicrobiana frente a bacterias

Gram positivas pertenecientes a los géneros Bacillus y Staphylococcus. Todas las cepas testigo

fueron inhibidas por al menos una cepa láctica apreciándose variabilidad intraespecífica tanto

en el grado de inhibición como en el espectro de actividad. La mayor especificidad fue

mostrada por las cepas de L. hilgardii que inhibieron solamente al género Bacillus. En cambio,

la mayor efectividad, considerando tanto el grado de inhibición como el número de especies

inhibidas, fue mostrado por las cepas de L. paracasei y L. lactis.

CONCLUSIONES

180

- Todas las cepas malolácticas analizadas presentaron capacidad para inhibir in vitro, en mayor

o menor grado, el crecimiento de F. oxysporum. En cuatro de las cepas probadas se observó

un incremento significativo en el grado de inhibición del hongo tras un periodo previo de

crecimiento de la bacteria de 48 h. Además, se encontró una variabilidad significativa en el

grado de inhibición de F. oxysporum entre algunas de las cepas bacterianas probadas,

alcanzándose con la cepa más efectiva (L. paracasei UVI-7) una inhibición del crecimiento

del hongo del 76%.

- El estudio de la capacidad de las bacterias malolácticas probadas para llevar a cabo el

biocontrol de la infección por F. oxysporum en plantas de Lycopersicum esculentum mostró

que la cepa L. plantarum UVI-10 puede reducir significativamente el efecto causado por el

hongo sobre la planta. Por otra parte, el análisis de la capacidad fitoestimulante de dichas

bacterias puso de manifiesto que la cepa UVI-10 puede también estimular significativamente

el desarrollo vegetal en la citada planta.

- El antagonismo microbiano y efecto bioprotector y fitoestimulante mostrados por las

bacterias malolácticas, unido a la variabilidad observada entre cepas, en relación con su mayor

o menor efectividad y especificidad de acción, las convierte en microrganismos de potencial

interés como biopreservativos, agentes de biocontrol y agentes biofertilizantes.

- La biomasa de las cepas vínicas L. hilgardii UVI-18, L. paracasei UVI-2 y L. plantarum

UVI-6 permitió la obtención de un extracto acuoso reductor con capacidad para sintetizar

nanopartículas de plata, describiéndose por primera vez esta capacidad en las especies L.

hilgardii y L. paracasei. La síntesis resultó estimulada mediante la adición de NaOH y la

aplicación de una fuente lumínica de 40 W. La caracterización mediante TEM, utilizando las

nanopartículas obtenidas con el extracto de la cepa UVI-2, puso de manifiesto que tenían un

tamaño medio de 10 nm (oscilando entre 3-26) y una morfología mayoritariamente esférica

aunque aparecen también formas triangulares y poliédricas. Las nanopartículas presentaron

capacidad para penetrar en el interior de las células bacterianas y una potente actividad

antimicrobiana.

- Atendiendo a los niveles de producción en relación al tiempo de síntesis, así como al tipo y

tamaños de partículas obtenidas y la actividad antimicrobiana mostrada, el método puesto a

punto en este estudio puede considerarse muy competitivo y ventajoso en relación a otros

métodos descritos previamente.

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183

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CURRICULUM VITAE

MAYO 2017


1. INFORMACIÓN PERSONAL

Nombre y Apellidos: Jacobo López Seijas

Fecha de nacimiento: 22 de Mayo de 1982

2. FORMACIÓN ACADÉMICA

- Licenciado en Biología. Facultad de Biología. Universidad de Vigo. 25/02/2010.

- Máster en Biotecnología Avanzada. Facultad de Ciencias. Universidades de Vigo y A

Coruña. 21/06/2012.

3.1. Participación en proyectos de investigación

1. Título: Estudio: Variabilidad espacial en base a la calidad de la uva y microbiota

asociada de tipo no Saccharomyces para las variedades Tinto Fino y Cabernet

Sauvignon (IDI-20150484). Centro para el Desarrollo Tecnológico Industrial

(CDTI), Ministerio de Economía y Competitividad. Investigador Principal:

Carmen Sieiro Vázquez. 2015-2017.

2. Título: Nuevos biocatalizadores con actividad quitinolítica y evaluación de sus

potenciales aplicaciones (10PXIB310278PR). Xunta de Galicia. Investigador

Principal: Carmen Sieiro Vázquez. 2010-2013.

3. Título: Estudio de la microbiota maloláctica asociada al Val do Salnés

(PGIDIT06RAG018E). Xunta de Galicia. Investigador Principal: Carmen Sieiro

Vázquez. 2007-2010.

3.2. Publicaciones científicas

1. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. 2016. Optimizing the

expression of a heterologous chitinase: A study of different promoters.

3. EXPERIENCIA INVESTIGADORA

Bioengineered 38: 1-5. ISSN: 2165-5987.

2. García-Fraga B, Da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. 2015. Optimized expression

conditions for enhancing production of two recombinant chitinolytic enzymes

from different prokaryote domains. Bioprocess and Biosystems Engineering

38: 2477-2486. ISSN: 1615-7605.

3. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. 2015. A novel family 19

chitinase from the marine-derived Pseudoalteromonas tunicata CCUG 44952T:

heterologous expression, characterization and antifungal activity. Biochemical

Engineering Journal 93: 84-93. ISSN: 1369-703X.

4. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. 2014. Characterization and

optimization of heterologous expression in Escherichia coli of the chitinase

encoded by the chiA gene of Bacillus halodurans C-125. Process Biochemistry

49: 1622-1629. ISSN: 1359-5113.

5. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. 2014. Functional expression

and characterization of a chitinase from the marine archaeon Halobacterium

salinarum CECT 395 in Escherichia coli. Applied Microbiology and

Biotechnology 98: 2133-2143. ISSN: 0175-7598.

6. Sieiro C, García-Fraga B, López-Seijas J, da Silva AF, Villa TG. 2012. Microbial

pectic enzymes in the food and wine industry. In: Food Industrial Processes –

Methods and Equipment. Valdez B (ed). InTech, Croatia. Pp. 201-218.

3.3. Comunicaciones en congresos nacionales e internacionales

1. López-Seijas J, Fernández Sestelo AB, García-Fraga B, da Silva AF, Carballeira L,

Sieiro C. Ecology of malolactic bacteria associated with Albariño musts and wines

from the Salnés region, in Northwestern Spain. Microbiotec. 1-3 Diciembre 2011.

Braga, Portugal.

2. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. Estudio de la quitinasa

codificada por el gen chiA1 de la arquea marina Halobacterium salinarum. IV

Congreso de Microbiología Industrial. 14-16 Noviembre 2012. Salamanca,

España.

3. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. Optimización de la

producción de una quitinasa de Lactococcus lactis subsp. lactis. IV Congreso de

Microbiología Industrial. 14-16 Noviembre 2012. Salamanca, España.

4. García-Fraga B, da Silva AF, López-Seijas J, Sieiro C. Purification and

characterization of a chitinase from the marine archaea Halobacterium salinarum.

Microbiotec. 1-3 Diciembre 2011. Braga, Portugal.

5. Da Silva AF, García-Fraga B, López-Seijas J, Sieiro C. Clonation and

characterization of a chitinase from Lactococcus lactis subsp. lactis. Microbiotec.

1-3 Diciembre 2011. Braga, Portugal.

3.4. Estancias en centros de investigación

1. Centro: Universidad Técnica de Viena.

Ciudad: Viena. Country: Austria

Fecha: 28/01/2013 - 03/05/2013. Duración: 14 semanas

Tema: Desarrollo y validación de un método para la detección de ácidos

benzoicos fluorados en agua mediante cromatografía de gases con

espectrometría de masas (GC/MS).

3.5. Becas disfrutadas

1. Beca-contrato pre-doctoral. Desde el 01/02/2014 al 31/01/2016. Universidad de

Vigo.

2. Beca de formación en el extranjero del Programa Leonardo Da Vinci, otorgada

por la Excma. Diputación Provincial de Lugo en colaboración con el Organismo

Autónomo de Programas Educativos Europeos (APEE). 2013. 14 semanas.

4.1. Docencia universitaria reglada

A. Año académico: 2013/2014:

1. Asignatura: Técnicas Básicas de Laboratorio. Titulación: Grado en

Biología. Universidad de Vigo. 16 horas.

2. Asignatura: Principios de Microbiología Marina. Titulación: Grado en

Ciencias del Mar. Universidad de Vigo. 29 horas.

3. Asignatura: Parasitología y Microbiología Marina. Titulación: Grado en


B. Año académico: 2014/2015:

1. Asignatura: Microbiología I. Titulación: Grado en Biología. Universidad de

Vigo. 13 horas.

2. Asignatura: Técnicas Básicas de Laboratorio. Titulación: Grado en

Biología. Universidad de Vigo. 35 horas.

3. Asignatura: Parasitología y Microbiología Marina. Titulación: Grado en


C. Año académico: 2015/2016:

1. Asignatura: Microbiología I. Titulación: Grado en Biología. Universidad de

Vigo. 58,7 horas.

2. Asignatura: Contaminación. Titulación: Grado en Biología. Universidad de

Vigo. 1,3 horas.

4.2. Codirección de Trabajos Fin de Grado y Master

1. Título: Estudio de la diversidad de levaduras no-Saccharomyces asociadas a la

variedad tempranillo en la Ribera del Duero. Grado en Biología. Autora: Mª

Ángeles Pichardo Gallardo. Universidad de Vigo. 2017.

4. EXPERIENCIA DOCENTE

2. Título: Caracterización de una nueva levadura con capacidad de degradar

colorantes. Master en Biotecnología Avanzada. Autor: Rubén Simón Cortés.

Universidad de A Coruña. 2015.

5. OTROS MÉRITOS

1. Formación investigadora

a. Seminario “IDEA PUZZLE” sobre gestión de tesis de doctorado, impartido

por la Universidad de Vigo. Octubre de 2016.

b. Curso “Creación de Empresas basadas en el conocimiento universitario”

impartido por la Universidad de Vigo. Mayo de 2015. 8 horas.

c. Curso “Scientific Writing Part A (IMRad) and Part B (Language)”

impartido por la University of Vigo (16-17 de Julio de 2014). 10 horas.

d. Curso “Gestión de proyectos con MS Project 2010” impartido por la

Universidad Nacional de Educación a Distancia (UNED). (Marzo y Abril

de 2012). 26 horas.

e. Curso “La fisiología vegetal para estudiantes” impartido por la Sociedad

Española de Fisiología Vegetal (Zaragoza, 8-11 Septiembre de 2009).

2. Otros cursos

a. Curso de Prevención de Riesgos Laborales (Adecco Formación, S.A.).

Octubre de 2005.

b. Prácticas pre-profesionales en el Servicio de Medio Ambiente y Energías

Renovables. Excma. Diputación Provincial de Lugo. Septiembre de 2012.

c. Idiomas:

i. Rumano nivel principiante (Universidad Alexandru Ioan Cuza – Rumanía).

ii. Alemán nivel elemental 2 (Asociación Amadeus, Viena).

iii. Gallego/español (idiomas nativos).

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IS DE DOCTORAD Vitis vinifera L.) Val do Salnés