Upload
truongdung
View
241
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)PROTEOLITIK DARI KEFIR
(Skripsi)
Oleh
DIANA ISMAWATI
JURUSAN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG2018
ABSTRAK
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)PROTEOLITIK DARI KEFIR
Oleh
Diana Ismawati
Kefir merupakan salah satu produk fermentasi yang dapat dibuat dari susu hewanimaupun susu nabati dengan penambahan ragi sebagai mikroba starter. Mikrobayang diisolasi dari kefir berpotensi untuk menghasilkan enzim protease. Tujuanpenelitian ini adalah mendapatkan isolat dan karakter BAL dari kefir susu sapidan kefir susu kedelai yang memiliki kemampuan proteolitik berdasarkan ujimorfologi, biokimia, dan fisiologis serta mengetahui kemampuan proteolitik BALmelalui uji kualitatif menggunakan media MRS Agar + susu skim 1 %. Datadianalisis secara deskriptif dengan menampilkan data dalam bentuk tabel dangambar. Hasil penelitian menunjukan bahwa ditemukan 7 isolat BAL, 4 isolat darikefir susu sapi yaitu BAL S1, BAL S2, BAL S3, dan BAL S4, 3 isolat dari kefirsusu kedelai yaitu BAL K1, BAL K2, dan BAL K3. BAL dari kefir susu sapi dankefir susu kedelai yang mampu menghasilkan enzim protease. Isolat dari kefirsusu sapi dan susu kedelai tidak memiliki banyak perbedaan karakter baikmorfologi, biokimia maupun fisiologi. Isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefirsusu kedelai tidak memiliki perbedaan indeks proteolitik yang signifikan, isolatdari kefir susu sapi dengan kode BAL S2 memiliki IP tertinggi yaitu 2,92 dan IPterendah dimiliki oleh isolat BAL S3 dengan IP sebesar 1,53. Untuk indeksproteolitik isolat kefir susu kedelai IP tertinggi sebesar 2,71 dari isolat BAL K1dan IP terendah dari isolat BAL K2 sebesar 1,77 keduanya menunjukan aktivitasprotease sedang.
Kata kunci: BAL, kefir, proteolitik, susu kedelai, susu sapi.
ISOLASI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL)PROTEOLITIK DARI KEFIR
Oleh
DIANA ISMAWATI
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh GelarSARJANA SAINS
Pada
Jurusan BiologiFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG
2018
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di desa Podomoro kecamatan Pringsewu
pada tanggal 22 Februari 1995. Penulis merupakan anak
pertama dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Kisworo
dan Ibu Satina.
Penulis mengawali pendidikan di SD Negeri 1 Podomoro pada tahun
2001, Penulis melanjutkan pendidikan ke SMP Negeri 4 Pringsewu pada tahun
2007 dan dilanjutkan ke SMA Negeri 1 Pringsewu pada tahun 2010 dan lulus
pada tahun 2013.
Pada tahun 2014, Penulis diterima sebagai mahasiswi Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung melalui jalur
Seleksi Bersama Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN).
Selama menempuh pendidikan di kampus Penulis pernah menjadi asisten
praktikum mata kuliah Mikrobiologi Umum dan Mikrobiologi Tanah. Selain itu,
Penulis juga aktif Organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMBIO) FMIPA
Unila sebagai anggota biro Dana dan Usaha tahun 2014-2015.
Penulis melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Kabupaten Lampung
Tengah, Kecamatan Pubian, Desa Kota Batu pada bulan Januari – Maret 2017.
Penulis mengikuti seleksi proposal Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) dan
berhasil mendapatkan pendanaan hibah PKM Penelitian pada tahun 2017 dengan
vii
judul “Potensi Bakteri Asam Laktat Asal Tempoyak Sebagai Pengawet
Hayati Tahu”.
Penulis melaksanakan Kerja Praktik (KP) pada bulan Juli – Agustus 2017 di
SEAMEO BIOTROP Bogor dengan judul “Penentuan Kualitas Fisik, Populasi
Cendawan Perusak Pascapanen dan Kadar Air Biji Kopi Arabika
Menggunakan Cara Pengolahan Basah di SEAMEO BIOTROP”
vi
PERSEMBAHANDengan mengucapkan rasa syukur kepada ALLAH SWT atas segala
Rahmat, nikmat serta pertolongan yang selalu diberikan sehingga
berkat Ridho-NYA skripsi ini dapat terselesaikan. Kupersembahkan
karya ini untuk:
Bapak dan Ibu ku yang selalu mendoakanku setiap waktu, memberikan
kasih sayang yang tulus, tiada henti memberikan dukungan, nasihat
dan motivasi kepadaku, selalu menjadi penyemangat dan sumber
kekuatanku dalam meraih kesuksesan.
Adikku tersayang yang selalu memberikan semangat dan keceriaan.
Bapak dan ibu dosen yang telah mendidik dan memberikan begitu
banyak ilmu bermanfaat serta pembelajaran dalam kehidupan.
Saudara-saudaraku, sahabat-sahabatku, serta rekan-rekan
seperjuanganku yang telah memberikan banyak dukungan, semangat,
motivasi, saran, canda tawa serta pengalaman dan kenangan yang luar
biasa selama masa studi.
Almamater tercinta, Universitas Lampung.
vi
MOTTO
Allah akan mengangkat (derajat) orang-orang yang beriman diantaramu dan orang-orang yang diberi ilmu pengetahuan beberapa
derajat.”(Q.S. Al-Mujadalah : 11)
“Maka sesungguhnya bersama kesulitan itu ada kemudahan.Sesungguhnya bersama kesulitan itu ada kemudahan.”
(Q.S. Al-Insyirah: 5-6)
”Barang siapa yang keluar untuk mencari ilmu maka ia berada dijalan Allah hingga ia pulang”.
(HR. Turmudzi)
Lakukan yang terbaik, sehingga aku tak akan menyalahkan dirikusendiri atas segalanya.(Magdalena Neuner)
Kamu selalu melalui kegagalan di jalanmu menuju kesuksesan.(Mickey Rooney)
x
SANWACANA
Segala puji dan syukur Penulis haturkan kepada ALLAH SWT, Dzat Maha Esa,
dan Maha Agung,yang telah melimpahkan Rahmat dan Karunia-NYA sehingga
penulis mampu menyelesaikan skripsi yang berjudul “ISOLASI DAN
KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) PROTEOLITIK
DARI KEFIR”. Penulis menyadari bahwa banyak sekali bantuan yang
didapatkan selama proses penyelesaian skripsi ini. Ucapan terima kasih penulis
haturkan kepada semua pihak yang telah berperan dalam memberikan bimbingan,
masukkan, saran dan kritik sehingga skripsi ini dapat terselesaikan, terutama
sebagai berikut:
1. Ibu dan bapakku yang selalu memberikan doa, kasih sayang yang tulus,
nasihat, motivasi dan dukungan baik materil maupun non-materil serta segala
pengorbanan yang telah diberikan.
2. Adikku satu-satunya Sendi Ismawan yang selalu memberikan keceriaan dan
penyemangat kepada Penulis.
3. Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si. selaku Pembimbing I yang dengan sabar
membimbing, mengarahkan, memberikan saran, solusi, serta ilmu yang sangat
bermanfaat selama perkuliahan, proses penelitian sampai terselesaikannya
skripsi ini.
4. Bapak Dr. Sumardi, M.Si. selaku pembimbing II yang dengan sabar
membimbing, mengarahkan, memberikan saran, perhatian, solusi, serta ilmu
xi
yang sangat bermanfaat selama perkuliahan, proses penelitian sampai
terselesaikannya skripsi ini.
5. Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si. selaku Pembahas yang telah memberikan
masukan, saran, dukungan dan nasihat serta ilmu yang sangat bermanfaat
selama perkuliahan, proses penelitian sampai terselesaikannya skripsi ini.
6. Ibu Dr. Endang Nurcahyani, M.Si. selaku Pembimbing Akademik yang telah
memberikan arahan dan motivasi selama perkuliahan maupun dalam
penyusunan skripsi.
7. Bapak Prof. Dr. Ir. Hasriadi Mat Akin, M.P. selaku Rektor Universitas
Lampung.
8. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
9. Ibu Dr. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Lampung.
10. Seluruh Dosen dan Staf Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung, terima
kasih telah banyak memberikan ilmu dan pengalaman selama perkuliahan.
11. Rekan seperjuangan tim penelitian kefir, Rosmaida La Sinurat, Agung Setia
Ningsih, Ketut Mahendri dan Benny Hartanto, terima kasih atas segala
bantuan, kebersamaan, perhatian, semangat, kerja sama dan sarannya selama
perjalanan penelitian sampai proses pengerjaan skripsi.
12. Sahabat-sahabat seperjuanganku selama perkuliahan Nurjulia Jashinda Akas,
Rosmaida La Sinurat, Titin Aprilia, Agung Setia Ningsih, Komang Rima,
Rizka Oktavia, Ketut Mahendri, Nandia Putri Aulia, Indria Ratna Anggraeni,
Theodorius Aprienta, Benny Hartanto, terima kasih atas kebersamaan, canda
xii
tawa, semangat, dukungan, perhatian, pengalaman dan kenangan yang tak
terlupakan selama perkuliahan.
13. Saudaraku tercinta Nuzulul Istikomah yang selalu memberikan semangat,
perhatian, canda tawa serta tempat berbagi cerita.
14. Sahabat-sahabatku sedari SMA Adilah Tazkia Azzahra, Lailatus Syifa dan
Indra Intan Saputri terima kasih atas semangat, dukungan dan perhatian yang
telah diberikan walaupun kita jauh dan jarang bertemu, semoga silaturahmi kita
dapat terjalin sampai kapan pun.
15. Teman-teman Microholic 2014 Milsa Solva Diana, Suminta Frida, Rismayanti,
Sesti, Syahnas, Tryana terima kasih atas canda tawa, kebersamaan dan kerja
samanya selama bergabung di Lab. Mikrobiologi.
16. Kakak-kakak Microholic 2013, terima kasih atas saran, masukan, dan nasihat
yang telah diberikan.
17. Teman-teman seperjuangan Biologi 2014 terima kasih atas kebersamaan, canda
tawa, kerja sama dan kenangan yang indah selama perkuliahan.
18. Kakak kosan selama KP di Bogor, Kak Iean dan Kak Mei, terima kasih atas
perhatian, canda tawa dan semangat yang diberikan.
19. Teman-teman sekamarku Shindy Dwiyanti, Evi Muharoroh, Eka Sari, Wahyu
Wijiati, dan Gita Elisia terima kasih atas kebersamaan, keceriaan dan semangat
yang diberikan.
20. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu-persatu yang telah
memberikan penulis bantuan, dukungan, berbagai kritik dan saran.
21. Almamaterku tercinta, Universitas Lampung.
xiii
Semoga segala kebaikan yang telah diberikan mendapat balasan kebaikan pula
dari Allah SWT. Penulis berharap skripsi ini dapat memberikan manfaat dan
wawasan kepada setiap orang yang membacanya.
Bandar Lampung, 1 Agustus 2018
Diana Ismawati
xiv
DAFTAR ISI
Halaman
COVER DEPAN .................................................................................................... i
ABSTRAK ............................................................................................................. ii
COVER DALAM ........................................................................................ ........iii
HALAMAN PERSETUJUAN ................................................................... ........iv
HALAMAN PENGESAHAN ...............................................................................v
RIWAYAT HIDUP ..................................................................................... ........vi
PERSEMBAHAN ...................................................................................... ........viii
MOTTO ....................................................................................................... ........ix
SANWACANA ......................................................................................................x
DAFTAR ISI .................................. ....................................................................xiv
DAFTAR TABEL .............................................................................................. xvi
DAFTAR GAMBAR........................................................................................ xviii
I. PENDAHULUAN ..............................................................................................1
A. Latar Belakang................................................................................................1
B. Tujuan Penelitian ............................................................................................3
C. Manfaat Penelitian ..........................................................................................3
D. Kerangka Pikir................................................................................................3
E. Hipotesis ........................................................................................................5
xv
II. TINJAUAN PUSTAKA....................................................................................6
A. Kefir ...............................................................................................................6B. BAL .............................................................................................................10C. Enzim Protease ............................................................................................12D. Bakteri Proteolitik.........................................................................................14E. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim ..............................................15
III. METODE PENELITIAN .............................................................................17
A. Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................17
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................................27
A. Karakterisasi BAL Proteolitik dari Kefir Susu sapi dan Kefir Susu
Kedelai .......................................................................................................27
B. Uji Kualitatif Proteolitik BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai ...36
V . SIMPULAN DAN SARAN ............................................................................39
A. Simpulan ....................................................................................................39
B. Saran ..........................................................................................................39
DAFTAR PUSTAKA……………………………………………..………….…40
LAMPIRAN..........................................................................................................46
B. Alat dan Bahan ...........................................................................................17
C. Metode Penelitian.......................................................................................18
D. Analisis Data ..............................................................................................18
E. Prosedur Kerja ..........................................................................................18
F. Diagram Alir ..............................................................................................26
xvi
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Kandungan Gizi dalam tiap 100 gram Biji Kedelai Kering......................7
Tabel 2. Komposisi Gizi Susu Kedelai Cair dan Susu Sapi (dalam 100 gram) ......8
Tabel 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ............................................21
Tabel 4. Morfologi Koloni Isolat Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai ..........27
Tabel 5. Pengamatan Mikroskopis Hasil Isolasi Kefir Susu Kedelai ....................28
Tabel 6. Hasil Uji Biokimia Isolat Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai .......30
Tabel 7. Hasil Uji Katalase dan Motilitas Isolat Kefir Susu Sapi dan KefirSusu Kedelai ...........................................................................................35
Tabel 8. Hasil Uji Biokimia Isolat Kefir Susu Sapi ...............................................47
Tabel 9. Hasil Uji Biokimia Isolat Kefir Susu Kedelai..........................................47
Tabel 10. Jumlah Bakteri Berdasarkan Standar Kekeruhan Mc. Farland .............48
Tabel 11. Komposisi lautan Standar Mc. Farland ................................................48
Tabel 12. Nilai Absorbansi Larutan Standar .........................................................49
Tabel 13. Nilai Absorbansi Uji pH Optimum Isolat Kefir Susu Sapi....................51
Tabel 14. Nilai Absorbansi Uji pH Optimum Isolat Kefir Susu Kedelai...............51
Tabel 15. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri Pada Uji pH Optimum IsolatKefir Susu Sapi ......................................................................................52
Tabel 16. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri Pada Uji pH Optimum IsolatKefir Susu Kedelai .................................................................................53
Tabel 17. Nilai Absorbansi Uji Suhu Optimum Isolat Kefir Susu Kedelai ...........53
xvii
Tabel 18. Nilai Absorbansi Uji Suhu Optimum Isolat Kefir Susu Sapi.................54
Tabel 19. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri pada Uji Suhu Optimum IsolatKefir Susu Sapi ......................................................................................54
Tabel 20. Hasil Perhitungan Jumlah Bakteri pada Uji Suhu Optimum IsolatKefir Susu Kedelai ..............................................................................55
Tabel 21. Hasil Perhitungan Uji Kualitatif Isolat BAL Proteolitik .......................56
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Penentuan Indeks Proteolitik Secara Kualitatif....................................25
Gambar 2. Diagram Alir Penelitian .......................................................................26
Gambar 3. pH Optimum Isolat BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir SusuKedelai .................................................................................................33
Gambar 4. Suhu Optimum Isolat BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir SusuKedelai. ...............................................................................................34
Gambar 5. Hasil Uji Kualitatif Proteolitik BAL Kefir Susu Sapi dan SusuKedelai .................................................................................................36
Gambar 6. Hasil Pewarnaan Gram Isolat Kefir Susu Sapi ....................................56
Gambar 7. Hasil Pewarnaan Gram Isolat Kefir Susu Kedelai ...............................57
Gambar 8. Hasil Pewarnaan spora Isolat Kefir Susu Sapi .................................... 57
Gambar 9. Hasil Pewarnaan Spora Isolat Kefir Susu Kedelai ...............................58
Gambar 10. Kefir Susu Kedelai dan Susu Sapi Inkubasi 24 Jam ..........................58
Gambar 11. Hasil Foto Uji Biokimia ....................................................................59
Gambar 12. Hasil Foto Uji Motilitas .....................................................................59
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kefir merupakan salah satu produk fermentasi yang dapat dibuat dari susu
nabati maupun hewani yang telah ditambahkan bibit kefir (kefir grain/kefir
granule) atau ragi. Bahan baku susu nabati dapat diperoleh dari kacang
kedelai, kacang merah atau kacang hijau sedangkan susu hewani dapat
diperoleh dari susu sapi, susu kambing atau susu kuda.
Susu kedelai mengandung komposisi gizi (dalam 100 gram) sebagai berikut
protein 3,50 gram, kalsium 50 mg, karbohidrat 5,00 gram, fosfor 45 gram,
lemak 2,5 gram besi 0,70. Susu sapi juga memiliki kandungan gizi
diantaranya adalah protein 3,20 gram, kalsium 143 mg, karbohidrat 4,30
gram, fosfor 60 gram, lemak 3,50 gram dan besi 1,70 gram yang terkandung
setiap 100 gram susu sapi (Aman dan Hardjo, 1973). Walaupun komponen
yang terkandung dalam susu kedelai hampir sama dengan susu sapi namun
jumlah nutrisi yang terkandung pada susu kedelai dan susu sapi terlihat
adanya perbedaan. Perbedaan jumlah nutrisi ini akan mempengaruhi
karakter mikrobanyang aktif pada fermentasi kefir. Mikroba yang berperan
dalam fermentasi kefir didominasi oleh BAL. BAL dapat ditemukan pada
ragi tape diantaranya Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum
(Rahayu, 2003), Weisella, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus spp., dan
Enterococcus spp. (Sujaya et al., 2010). Menurut Ernawati (1997),
2
penggunaan ragi tape sebanyak 1 % menghasilkan curd yang lebih lembut
dan aroma yang lebih baik untuk fermentasi kefir.
Kwok dan De Vos (1994) mengatakan bahwa beberapa strain bakteri asam
laktat diketahui mempunyai sistem proteolitik sehingga memungkinkan
tumbuh pada substrat yang kaya akan protein seperti susu.
Hal ini dibuktikan oleh penelitian Putranto (2007) bahwa salah satu strain
BAL yaitu Lactobacillus acidhopilus memiliki kemampuan mengekskresikan
ekstraseluler protease. Melliawati et al. (2015) menemukan BAL dari dadih
dan danke. Dadih adalah makanan fermentasi susu yang berasal dari
Sumatera Barat sedangkan danke merupakan makanan dari susu yang
dikoagulasi menggunaan getah buah papaya. Dari penelitian ini diperoleh 18
isolat BAL yang memiliki kemampuan proteolitik dan Lactobacillus
plantarum strain LAB12 memiliki aktivitas enzim protease paling tinggi yaitu
0,598 unit/mL selama proses fermentasi 72 jam. Menurut Putranto (2006)
salah satu jenis BAL yaitu Lactobacillus acidophilus dalam fermentasi susu
sapi perah mampu mengekskresikan enzim protease ekstraseluler dengan
aktivitas tertinggi pada jam ke-18 sebesar 0,752 U/mg. Aktivitas proteolitik
juga ditemukan pada isolat BAL dari susu kedelai yang terfermentasi spontan
(Yusmarini, 2009).
Sejauh ini informasi tentang BAL proteolitik dari kefir dengan starter ragi
tapi belum banyak diketahui, oleh karena itu perlu dilakukan penelitian
tentang isolasi dan karakterisasi bakteri asam lakat proteolitik dari kefir
dengan starter ragi tape.
3
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah:
1. Mendapatkan isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai yang
memiliki kemampuan proteolitik.
2. Mengetahui karakter isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai
berdasarkan uji makroskopis, mikroskopis, biokimia, dan fisiologis.
3. Mengetahui kemampuan proteolitik BAL dari kefir susu sapi dan kefir
susu kedelai melalui uji kualitatif proteolitik.
C. Manfaat Penelitian
Hasil dari penelitian ini diharapkan mampu menjadi bahan kajian dan
informasi ilmiah tentang BAL proteolitik untuk penelitian lebih lanjut
maupun aplikasi di bidang mikrobiologis.
D. Kerangka Pikir
Pembuatan kefir umumnya berlangsung dengan bantuan starter kultur
tertentu yang disebut bibit kefir (kefir grains) yang mengandung kumpulan
BAL dan khamir nonpatogen yang masing-masing berperan dalam
pembentukan cita rasa dan struktur kefir. Starter yang dapat digunakan
adalah ragi tape. Menurut Ernawati (1997), penggunaan ragi tape sebanyak
1 % menghasilkan curd yang lebih lembut dan aroma yang lebih baik
dibandingkan penggunaannya sebanyak 3 %. Mikroorganisme yang
terkandung dalam ragi umumnya berupa kultur campuran yang terdiri dari
kapang, khamir, dan bakteri. Menurut Gandjar (2003), ragi tape terdiri dari
4
kapang (Rhizopus oryzae , Mucor ), khamir (Sacharomyces cerevisiae,
Sacharomyces verdomanni ) dan bakteri Pediococcus sp.
Menurut Park et al. (2007), air susu kaya akan protein, lemak, karbohidrat
terutama laktosa, vitamin dan mineral. Oleh karena itu susu dapat menjadi
substrat yang ideal bagi pertumbuhan mikroorganisme. Protein yang
terkandung dalam susu merupakan kelompok molekul yang sangat
heterogen, terdiri dari lima kategori yaitu kasein, protein whey, protein globul
lemak susu, enzim dan protein minor lainnya (Ng-Kwai-Hang, 2003). Protein
yang ada dalam susu sebagian besar adalah kasein (76 %) dan protein whey
(18 %) (Susilorini, 2006). Kasein terdiri dari campuran tiga komponen
protein, yaitu protein alpha (40-60 %), kasein beta (20-30 %), dan kasein
gamma (3-7 %). Setelah kasein dipisahkan dari air susu, sisanya yang
merupakan larutan dinamakan whey. Kira-kira 0,5-0,7 % dari bahan protein
yang dapat larut dan tertinggal dalam whey yaitu protein laktoglobulin dan
laktalbumin (Astuti, 1995).
Karena molekul protein terlampau besar untuk dapat melewati membran,
bakteri mengekskresikan enzim yang disebut protease yang berfungsi untuk
menghidrolisis protein tersebut menjadi peptida-peptida. Bakteri
menghasilkan peptidase yang menguraikan peptida menjadi asam-asam
amino, yang kemudian dikatabolisme melalui cara yang bergantung pada tipe
asam aminonya dan spesies atau galur bakteri yang menguraikannya. BAL
yang mampu menghidrolisis ikatan peptida pada protein merupakan BAL
dengan kemampuan proteolitik atau disebut BAL penghasil enzim protease.
5
Kemampuan proteolitik BAL selain dipengaruhi oleh faktor nutrisi substrat
seperti protein, karbohidrat, lemak, mineral dan vitamin, juga dipengaruhi oleh
faktor suhu dan pH . Kondisi lingkungan yang berbeda di setiap substrat
mengakibatkan karakter setiap jenis BAL akan berbeda. BAL akan
menyesuaikan diri dengan lingkungan sesuai dengan ketahanannya.
E. HIPOTESIS
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah:
1. Isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai mampu
menghasilkan enzim protease.
2. Adanya perbedaan karakter BAL proteolitik dalam kefir susu sapi dan
kefir susu kedelai yang dipengaruhi oleh faktor nutrisi, pH, dan suhu
inkubasi.
3. Adanya perbedaan kemampuan proteolitik antara BAL dari kefir susu
sapi dan kefir susu kedelai.
6
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Kefir
Susu merupakan sumber kalsium, fosfor, dan vitamin A yang sangat baik.
Kandungan air di dalam susu sangat tinggi, yaitu sekitar 87,5 %, dengan
kandungan gula susu (laktosa) sekitar 5 %, protein sekitar 3,5 %, dan lemak
sekitar 3-4 % (Widodo, 2002).
Menurut Toruan (2008) sumber makanan yang mengandung asam amino
lengkap adalah protein hewani dan satu satunya tumbuhan yang memiliki
asam amino lengkap seperti hewan adalah kedelai. Sumber susu dari hewani
seperti susu sapi adalah salah satu sumber protein yang paling baik dan ini
dapat dikaitkan dengan konten yang kaya protein berkualitas. Protein dalam
susu sapi murni mengandung asam amino esensial yang dibutuhkan oleh
tubuh. Sedangkan kedelai dikenal sebagai salah satu makanan yang memiliki
tingkat protein nabati yang sangat tinggi. Toruan (2008) mengatakan bahwa
kedelai merupakan salah satu sumber protein nabati yang sangat baik
dikonsumsi, dalam jumlah gram yang sama, kandungan protein yang terdapat
dalam kedelai lebih tinggi dibandingkan dengan yang terdapat dalam daging
ayam.
Kedelai dipilih sebagai bahan baku susu karena memiliki kandungan gizi
yang tinggi. Di antara kacang-kacangan, kadar protein kedelai memang
7
paling tinggi. Kandungan gizi kedelai ditunjukkan pada Tabel 1. Pada
dasarnya semua biji-bijian dapat diproses menjadi susu. Dengan diolah
menjadi susu akan menaikkan nilai cerna dari biji-bijian tersebut. Susu
kedelai memiliki bentuk menyerupai susu sapi, cara menyiapkannya mudah
sehingga memungkinkan untuk menjadi minuman bergizi di negara-negara
berkembang. Pembuatan susu kedelai pada dasarnya adalah memproses biji
kacang kedelai untuk diambil sarinya.
Tabel 1. Kandungan Gizi dalam Tiap 100 gram Biji Kedelai Kering
Kandungan Gizi Proporsi nutrisidalam biji
Protein (gram) 268,00
Lemak (gram) 30,90
Karbohidrat (gram) 15,10
Kalori (kal) 30,10
Kalsium (mgram) 196,00
Fosfor (mgram) 506,00
Zat besi (mgram) 6,90
Vitamin A (SI) 95,00
Vitamin B1 (mgram) 0,93
Vitamin C (mgram) 0,00
Air (gram) 20,00
Bagian yang dapat dimakan (%) 100,00
Sumber: Rahmat Rukmana, 1997
Susu kedelai yang mengandung protein nabati yang tidak kalah gizinya
dengan susu yang berasal dari hewan (susu sapi). Komposisi gizi di dalam
8
susu kedelai dan susu sapi dapat dilihat pada Tabel 2. Dapat dilihat bahwa
kandungan protein dalam susu kedelai hampir sama dengan kandungan
protein dalam susu sapi.
Tabel 2. Komposisi Gizi Susu Kedelai Cair dan Susu Sapi (dalam 100 gram)
Komponen Susu Kedelai Susu SapiKalori (Kkal) 41,00 61,00
Protein (gram) 3,50 3,20
Lemak (gram) 2,50 3,50
Karbohidrat (gram) 5,00 4,30
Kalsium (mg) 50,00 143,00
Fosfor (gram) 45,00 60,00
Besi (gram) 0,70 1,70
Vitamin A (SI) 200,00 130,00
Vitamin B1 (tiamin)(mgram)
0,08 0,03
Vitamin C (mgram) 2,00 1,00
Sumber: Aman dan Hardjo, 1973
Salah satu produk fermentasi susu yang dikenal adalah kefir. Di Indonesia
kefir relatif lebih banyak dibuat sendiri di rumah-rumah. Ilmu dan bahan
yang di perlukan untuk membuat kefir oleh sebagian besar masyarakat kita
diperoleh dari Arab dan Timur Tengah. Kefir, seperti halnya yogurt,
merupakan salah satu minuman susu fermentasi yang tertua sebab sudah
dikenal dan diminum sejak beribu-ribu tahun. Kefir mirip dengan yogurt,
tetapi kefir lebih encer dan gumpalan susunya lebih lembut. Selain itu kefir
9
mengandung gelembung gas karbondioksida dan juga sekitar 1 % alkohol.
Keunikan kefir di bandingkan susu fermentasi lain adalah cara pembuatannya
yang menggunakan biji-biji kefir (Widodo, 2002).
Biji kefir merupakan kumpulan berbagai jenis mikroba yang menempel di
permukaan kasein (protein susu). Jenis mikroba yang ada pada biji kefir
cukup banyak tetapi semua hidup bersama-sama dan saling mempengaruhi.
Bakteri penghasil asam laktat yang ditemukan pada biji kefir umumnya
adalah Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
kefir, Lactococcus lactis, bakteri penghasil asam cuka Acetobacter sp. serta
ragi Torula, Saccharomyces cerevisiae, Candida kefir dan dua bakteri yogurt
L.bulgaricus dan S. thermophilus dalam jumlah relatif sedikit. Ukuran dan
jumlah biji kefir dapat bertambah dari waktu ke waktu, bahkan berlipat ganda
karena mikroba yang berkembangbiak dan protein susu kasein yang
menempel pada permukaan biji kefir (Widodo, 2002).
Kefir adalah produk fermentasi susu yang mengandung probiotik yang sangat
berguna bagi kesehatan tubuh. Kefir merupakan susu fermentasi yang
mengandung alkohol 0,5-1 %. Kefir mempunyai kelebihan dibandingkan
dengan susu segar karena asam yang terbentuk dapat memperpanjang masa
simpan, mencegah pertumbuhan mikroorganisme pembusuk sehingga
mencegah kerusakan susu, dan mencegah pertumbuhan mikroorganisme
patogen sekaligus meningkatkan keamanan produk kefir (Haryadi, 2013).
Adesokan et al. (2011) mengatakan nilai pH sangat berkaitan dengan kadar
asam yang dihasilkan. Peningkatan kadar asam dan penurunan pH pada
10
fermentasi susu dengan kultur bakteri asam laktat sudah terlihat selama
inkubasi 24 jam. Proses fermentasi akan mengubah laktosa dalam susu
menjadi glukosa dan galaktosa oleh aktivitas kultur starter sehingga akan
mengurangi gangguan pencernaan bila mengonsumsinya. Produk susu
fermentasi dibedakan berdasarkan jenis bakteri asam laktatnya. Bakteri asam
laktat akan menghidrolisis laktosa yang di dalam susu menjadi berbagai
macam senyawa karbohidrat lebih sederhana. Proses fermentasi
mengakibatkan aktivitas mikroba meningkat, penurunan pH, dan peningkatan
kadar asam dalam produk fermentasi (Afriani, 2010).
B. Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat merupakan kelompok bakteri Gram positif, berbentuk
bulat atau batang, tidak membentuk spora, mampu memfermentasi
karbohidrat, bersifat katalase negatif dan merupakan kelompok mikroaerofilik
(Axelsson, 2004). Secara umum yang termasuk kelompok BAL adalah
Lactococcus, Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Leuconostoc dan Lactobacillus (Salminen et al., 2004). Menurut Suardana
(2007) Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii adalah bakteri
berbentuk batang, Gram positif dan sering berbentuk pasangan dan rantai dari
sel-selnya.
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan golongan bakteri yang dapat
menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir fermentasi. BAL
memiliki cici-ciri, yaitu berbentuk batang atau kokus, tidak motil, tidak
11
dapat menghasilkan spora, katalase negatif, Gram positif, tahan
terhadap kondisi asam dan bersifat anaerob fakultatif (Hutkins, 2006).
BAL umumnya bersifat mesofilik namun ada beberapa jenis yang
dapat tumbuh pada suhu 4 oC. BAL memiliki pH pertumbuhan 4,0-4,5
namun beberapa galur tahan pada pH 3,2 dan pH di atas 9,0 (Bamforth,
2005).
Menurut Suardana (2007) BAL dapat dibedakan menjadi 2 kelompok
berdasarkan hasil fermentasinya, yaitu:
1. Bakteri homofermentatif, dimana glukosa difermentasi menghasilkan
asam laktat sebagai satu-satunya produk. Contohnya yaitu Streptococus,
Pediococcus, dan beberapa Lactobacillus.
2. Bakteri heterofermentatif, glukosa difermentasikan selain menghasilkan
asam laktat juga memproduksi senyawa-senyawa lainnya yaitu etanol,
asam asetat dan CO2. Contohnya yaitu Leuconostoc dan beberapa spesies
Lactobacillus.
Secara alami susu mengandung BAL dan umumnya digunakan untuk
pembuatan kultur starter pada berbagai produk olahan. Bakteri asam laktat
asal susu juga berpotensi dikembangkan sebagai probiotik untuk
pengembangan pangan fungsional. Beberapa peneliti telah berhasil
mengidentifikasi BAL dari berbagai sumber. Menurut Guessas dan Kihal
(2004) hasil identifikasi BAL pada susu adalah Lactococcus sp. (76,16 %),
S. thermophilus (14,78 %), dan Leuconostoc sp. (8,6 %).
12
Jumlah populasi bakteri asam laktat dalam suatu produk susu fermentasi
menjadi indikator kualitas mikrobiologis produk tersebut. Menurut Fuller
(1992) bahwa jumlah bakteri asam laktat yang diperlukan untuk dikonsumsi
dan baik untuk kesehatan adalah berkisar antara107-109.
Bakteri asam laktat telah lama dikenal sebagai kelompok bakteri yang
menguntungkan. Pemanfaatannya sangat luas baik untuk pangan maupun
pakan. Pemilihan bakteri asam laktat sebagai probiotik sangat berkaitan
dengan sifatnya yang memenuhi kriteria aman untuk dikonsumsi sehingga
mampu bertahan hidup baik dari ransum dan saluran pencernan. Bakteri
asam laktat juga memiliki sifat seperti antimikroba, aktivitas antikolestrol,
efek stimulasi sistem imun, meningkatkan penyerapan laktosa oleh tubuh,
mencegah diare, dan aktivitas antimutagenik sehingga dapat mencegah
penyakit kanker usus ( Surono, 2004 dan Hill, 1995).
C. Enzim protease
Protease disebut juga peptidase atau proteinase, merupakan enzim golongan
hidrolase yang akan memecah protein menjadi molekul yang lebih sederhana,
seperti menjadi oligopeptida pendek atau asam amino, dengan reaksi
hidrolisis pada ikatan peptide. Enzim ini diperlukan oleh semua mahkluk
hidup karena bersifat esensial dalam metabolisme protein. Protein ini
memiliki banyak struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix yang sangat
pendek (Poliana, 2007).
13
Enzim protease dapat dihasilkan dari berbagai sumber, yaitu bakteri, jamur,
virus, tumbuhan, hewan, dan manusia. Protease yang dihasilkan dari
berbagai bakteri kebanyakan bersifat basa dan netral, sedangkan protease
yang dihasilkan oleh berbagai jamur dapat bersifat asam, netral, dan basa
(Rao et al., 1998).
Salah satu sumber penghasil enzim protease yang banyak diteliti adalah
bakteri. Pemilihan bakteri sebagai sumber enzim protease disebabkan
beberapa alasan yaitu:
a. bakteri lebih mudah tumbuh dengan kecepatan yang lebih cepat
dibandingkan makhluk hidup lainnya.
b. skala produksi enzim mudah ditingkatkan.
c. biaya produksi enzim relatif rendah.
d. kondisi produksi tidak tergantung pada musim dan waktu proses produksi
enzim lebih pendek (Poernomo, 2003).
Untuk menguji suatu biakan bakteri menghasilkan enzim protease
ekstraseluler, maka bakteri tersebut harus ditumbuhkan pada medium padat
yang mengandung kasein yaitu Skim Milk Agar (Fardiaz, 1993). Kasein
adalah salah satu jenis protein. Hidrolisis kasein digunakan untuk
memperlihatkan aktivitas hidrolitik protease yang memutuskan ikatan peptida
CO-NH. Hidrolisis protein ditunjukkan dengan adanya zona jernih di
sekeliling pertumbuhan bakteri (Susanti, 2003). Pengujian secara kualitatif
bakteri penghasil enzim protease ekstraseluler dilakukan dengan cara
mengamati zona jernih yang berada disekitar koloni bakteri, kemudian
14
membagi diameter zona jernih dengan diameter koloni bakteri. Hasil bagi
diameter tersebut dinyatakan sebagai aktifitas protease secara relatif (Sastono,
2008). Besar-kecil diameter zona menunjukkan konsentrasi dan aktivitas
enzim yang dihasilkan (Palmer, 1995).
D. Bakteri Proteolitik
Bakteri proteolitik merupakan bakteri yang mampu memproduksi enzim
protease ekstraseluler, yaitu enzim yang mampu memecah protein yang
diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel (Abraham et al.,
1993). Pada umumnya bakteri proteolitik adalah bakteri dari genus Bacillus,
Pseudomonas, Proteus (Schlegel, 1994), Steptobacillus, Staphylococcus
(Akmal, 1996). Aktivitas proteolitik merupakan tingkat keaktifan enzim
untuk menghidrolisis protein. Aktivitas proteolitik BAL memecah protein
menjadi peptida-peptida menyebabkan penurunan kadar protein. Peningkatan
asam laktat akibat proses fermentasi oleh BAL akan meningkatkan aktivitas
lipolitik dalam mereduksi lemak susu sehingga terjadi penurunan kadar lemak
dalam susu fermentasi (Sunarlim dan Setiyanto, 2008). Jumlah asam lemak
bebas akan mengalami peningkatan karena lemak akan terhidrolisis oleh
enzim lipase yang dihasilkan oleh BAL sehingga terbentuk asam lemak
bebas (Murti dan Hidayat, 2009).
15
E. Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim
1. Suhu
Suhu sangat mempengaruhi aktivitas suatu enzim, karena sejumlah panas
tertentu dibutuhkan enzim untuk dapat aktif. Peningkatan suhu
akan menyebabkan aktivitas enzim juga meningkat hingga titik optimum
tercapai. Aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali
lipat seiring peningkatan suhu sebsesar 10 oC di atas suhu minimum.
Aktivitas enzim akan terus meningkat hingga tercapai titik optimum.
Akan tetapi peningkatan suhu melebihi titik optimum akan
menyebabkan aktivitas enzim mengalami penurunan (Pratiwi, 2008).
Suhu maksimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi.
Denaturasi terjadi karena struktur protein terbuka dan gugus nonpolar
yang berada di dalam molekul menjadi terbuka keluar. Hal ini
menyebabkan kelarutan protein di dalam air menjadi turun, sehingga
aktivitas enzim juga mengalami penurunan (Lehninger, 2005).
2. pH
Kenaikan dan penurunan pH akan mempengaruhi efektivitas enzim dalam
membentuk kompleks enzim-substrat. Peningkatan pH di atas titik
optimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi sehingga
mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim (Winarno, 1989).
16
3. Aktivator dan Inhibitor
Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya.
Aktivator adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan
kecepatan reaksi enzimatis. Ion logam yang dapat bertindak sebagai
aktivator, diantaranya Ca, Mg, Zn, dan Fe yang menginduksi aktivitas
enzim protease ( Emmanuelle, 2013). Aktivitas enzim juga dipengaruhi
oleh senyawa penghambat enzim (inhibitor). Inhibitor dapat bersaing
dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim sehingga dapat
terjadi pengurangan laju reaksi. Inhibitor biasanya menyerupai substrat
normal dengan bentuk tiga dimensinya. Karena persamaan ini, enzim
dapat berikatan dengan inhibitor (Pratiwi, 2008).
17
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2018 sampai dengan bulan
Maret 2018 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini, yaitu cawan petri, tabung
reaksi, tabung Durham, erlenmeyer, gelas ukur, mikropipet, mikrotip, gelas
objek, gelas beaker, botol akuades, oven, low inkubator, inkubator, pH meter,
timbangan digital, shaker incubator, laminar air flow cabinet, autoclave, hot
plate magnetic stirer, mikroskop, water bath, vortex mixer, alumunium foil,
jarum ose, sarung tangan, dan masker.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, susu sapi segar, susu
kedelai, ragi tape, susu skim, MRSA (De Man Rogosa and Sharpe Agar,
MRS Broth (De Man Rogosa and Sharpe Broth), cat Gram, dan cat spora
(larutan kristal violet, larutan iodin, larutan safranin, larutan malachite green),
larutan hidrogen peroksida (H2O2), HCL 1 M, NaOH 1 M alkohol 70 %,
akuades, garam fisiologis, dan spirtus.
III. METODE PENELITIAN
18
C. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan 2 tahap. Tahap I adalah isolasi dan karakterisasi
BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai. Karakterisasi isolat meliputi
morfologi makroskopis dan mikroskopis, karakter biokimiawi dan fisiologis.
Karakter morfologi BAL secara makroskopis antara lain warna koloni,
elevasi, serta bentuk tepian koloni dan mikrokopis yaitu mengamati
morfologi koloni dengan pengecatan Gram dan spora. Karakter biokimia
meliputi uji fermentasi gula yaitu glukosa, laktosa, sukrosa, dan galaktosa
sedangkan karakter fisiologis yaitu penentuan pH optimum dengan variasi pH
2,3,4,5, dan 6, pengujian suhu pertumbuhan dengan variasi suhu 20, 30, 40,
50, dan 60 oC, uji motilitas dan uji katalase. Tahap II yaitu pengujian
kemampuan proteolitik bakteri asam laktat (BAL) secara kualitatif
menggunakan media MRS Agar + susu skim 1 %. Kemampuan proteolitik
pada BAL ditentukan dengan adanya zona jernih pada medium skim agar
dan aktivitas proteolitik diukur berdasarkan rasio diameter zona jernih/
diameter koloni (R).
D. Analisis Data
Data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis secara deskriptif.
E. Prosedur Kerja
1. Pembuatan Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai
Susu segar (susu sapi dan susu kedelai) masing-masing sebanyak 50 ml
dipasteurisasi, yaitu dipanaskan pada suhu 60 oC selama 30 menit,
19
kemudian didinginkan sampai mencapai suhu kamar (±28 oC).
Selanjutnya ke dalam susu pasteurisasi dimasukkan ragi tape 1 % sebagai
starter dan diaduk merata. Kemudian dibiarkan/diinkubasi selama 24
jam (semalam) pada suhu kamar (suhu 25-37 oC) agar proses fermentasi
berlangsung. Bila susu sudah menggumpal lalu disaring dengan
menggunakan saringan plastik untuk mendapatkan butir-butir kefir
kembali. Butir-butir kefir yang diperoleh dicuci dengan air matang dingin
yang dapat dipakai sebagai starter atau biji kefir kembali. Kefir yang
sudah disaring yang akan digunakan untuk penelitian (Usmiati, 2007).
2. Isolasi BAL dari Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai
Isolasi dilakukan dengan mengencerkan masing-masing 1 ml sampel
kefir susu sapi dan susu kedelai ke dalam tabung reaksi steril yang berisi
9 ml larutan pengencer garam fisiologis 0,85 % kemudian dihomogenkan
menggunakan vortex mixer ( suspensi 10-1). Media MRS agar yang telah
ditambahkan susu skim 1 %, dituang ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan memadat. Suspensi diambil menggunakan jarum ose, kemudian
diinokulasikan secara goresan (streak ) pada media padat dan diinkubasi
pada suhu 37 oC selama 24 jam. Zona jernih yang terbentuk disekitar
koloni bakteri menandakan BAL proteolitik.
3. Pemurnian
Koloni BAL yang memiliki zona jernih dimurnikan pada media MRSA
miring. Isolat kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0C.
20
4. Karakterisasi BAL
Karakterisasi dilakukan untuk membedakan antara isolat BAL yang sudah
terpilih. Ada 4 langkah identifikasi untuk melihat karakter setiap isolat
yaitu:
4.1 Makroskopis
Merupakan pengamatan secara morfologi untuk melihat morfologi
koloni seperti warna, koloni, elevasi, dan bentuk tepian koloni.
4.2 Mikroskopis
Pengamatan mikroskopis dilakukan untuk mengamati morfologi sel
BAL dengan pengecatan Gram dan spora.
4.3 Biokimia
Media MRSB steril dalam tabung reaksi dengan tambahan 1 %
gula-gula antara lain sukrosa, glukosa, galaktosa, laktosa, dan
dilengkapi tabung Durham di dalamnya. Media uji juga dilengkapi
dengan indikator asam berupa phenol red. Isolat BAL sebanyak 1 ose
diinokulasikan ke dalam media uji, kemudian diinkubasi selama 24
jam pada suhu 37 oC. Adanya gelembung gas pada tabung Durham
dan perubahan warna media menjadi kuning menunjukkan aktivitas
fermentasi oleh BAL .
21
4.4 Karakter Fisiologis
a. Penentuan pH Optimum
Media MRS cair steril sebanyak 9 ml disiapkan pada tabung
reaksi dengan variasi pH 2, 3,4, 5, dan 6. Isolat bakteri sebanyak
1 ml diinokulasikan ke dalam masing-masing tabung reaksi,
selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
Perhitungan BAL dilakukan dengan spektrofotometer (Hogg,
2005), sebagai berikut:
1. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Spektrofotometer Media MRS Broth
Tahap pertama yang dilakukan adalah menentukan panjang
gelombang maksimum larutan blanko (MRS Broth) dengan
cara mengukur absorbansi larutan pada berbagai panjang
gelombang. Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi
tersebut, maka diperoleh absorbansi maksimum yaitu pada
panjang gelombang 400 nm dan ini ditetapkan sebagai
panjang gelombang maksimum.
Tabel 3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Panjang Gelombang Absorbansi
400 0.97
450 0.91
500 0.29
550 0.63
600 0.71
22
2. Pembuatan suspensi Standar
Pembuatan suspensi standar berdasarkan standar kekeruhan
Mc. Farland. Standar Mc. Farland 0,5 yang setara dengan
1,5x108 sel/ml. Dalam pembuatan larutan standar Mc. Farland
0,5 digunakan media MRS Broth, karena untuk menyesuaikan
media yang akan digunakan dalam inkubasi bakteri dan
memudahkan dalam melihat tingkat kekeruhannya.
Selanjutnya larutan standar Mc. Farland 0,5 diukur
absorbasinya dan diperoleh angka 0,07.
Kemudian media MRS broth yang ditambah suspensi bakteri
uji, tingkat kekeruhannya disesuaikan dengan larutan standar
Mc. Farland 0,5 sedemikian rupa sehingga absorbansinya
0,07. Kesetaraan ini dilakukan untuk memenuhi standar
jumlah bakteri dalam suatu media. Tahap selanjutnya
dilakukan pengenceran suspensi standar dan diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer sampai angka
menunjukan 0,00.
3. Perhitungan Jumlah Sel BAL
Berdasarkan hasil pengukuran absorbansi suspensi standar
digunakan untuk penentuan jumlah BAL melalui persamaan
regresi dengan rumus
23
Keterangan :
Y = Kepadat
Keterangan:
Y = Kepadatan sel (sel/ml)
X = Absorbansi
Dari hasil perhitungan persamaan regresi diperoleh niai a dan b
yang digunakan untuk menghitung jumlah sel suspensi BAL.
b. Penentuan Suhu Optimum
Media MRS cair steril sebanyak 9 ml disiapkan pada tabung reaksi
kemudian diinokulasikan masing-masing 1 ml biakan isolat BAL
dan diinkubasi selama 24 jam dengan variasi suhu 20, 30,40, 50,
dan 60 oC. Kemudian jumlah BAL dihitung dengan metode
spektrofotometri dan rumus regresi.
c. Uji Motilitas
Media semi padat MRS disiapakan dengan komposisi 50 % agar
pada tabung reaksi kemudian isolat bakteri diinokulasikan dengan
cara menusukkan jarum ose secara tegak lurus hingga setengah
tinggi media. Kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC.
Jika koloni tumbuh menyebar, maka bakteri tersebut bersifat motil
Y = a + bX
24
dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis
saja, maka bakteri tersebut bersifat nonmotil (Candra, 2006).
d. Uji Katalase
Secara aseptis isolat bakteri diambil menggunakan jarum ose dan
dipindahkan pada gelas objek. Preparat tersebut ditetesi dengan
larutan 3 % H2O2. Jika terbentuk gelembung gas menunjukkan
adanya enzim katalase.
5. Penentuan Proteolitik BAL Kefir Susu Sapi dan Kefir Susu Kedelai
Isolat bakteri ditumbuhkan pada media MRS Agar + susu skim 1 %.
Aktivitas proteolitik ditunjukan dengan terlihatnya zona jernih yang
muncul di sekitar koloni (Putri, 2012). Indeks proteolitik dihitung
dengan cara mengukur luas areal jernih dan luas koloni bakteri. Indeks
proteolitik ditetapkan dengan rumus:
Rumus indeks proteolitik:
Keterangan:
a = diameter zona jernih
b = diameter koloni (Setyaningsih et al., 2013).
25
Gambar 1. Penentuan Indeks Proteolitik Secara Kualitatif
26
F. Diagram Alir
Berikut merupakan diagram alir penelitian:
Gambar 2. Diagram Alir Penelitian
Pembuatan Kefir Susu Sapi dan
Susu Kedelai
Isolasi BAL dari Kefir Susu Sapi dan
Susu Kedelai
Pemurnian Isolat
Karakterisasi BAL dari Kefir Susu
Sapi dan Susu Kedelai
BiokimiaFisiologisMakroskopis Mikroskopis
Uji Kualitatif Kemampuan BAL
Proteolitik
Pengamatan Zona Jernih
1
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Diperoleh 4 isolat BAL dari kefir susu sapi dan 3 isolat dari kefir susu
kedelai yang menghasilkan enzim protease.
2. Isolat dari kefir susu sapi dan susu kedelai tidak memiliki banyak
perbedaan karakter baik morfologi, biokimia maupun fisiologi.
3. Isolat BAL dari kefir susu sapi dan kefir susu kedelai tidak memiliki
perbedaan indeks proteolitik yang signifikan, keduanya menunjukan
aktivitas protease sedang dengan nilai IP pada kisaran 1 < IP < 3.
B. SARAN
Disarankan untuk dilakukan pengujian lanjutan dengan uji kuantitatif
proteolitik sehingga diperoleh kemampuan proteolitik yang lebih tepat selain
itu perlu mengidentifikasi lebih lanjut spesies bakteri dari hasil penelitian,
sehingga penelitian kedepannya dapat menentukan spesies atau bahkan strain
dari bakteri tersebut.
40
DAFTAR PUSTAKA
Abraham, A.G., G. Antoni, dan A.C. Anon. 1993. Proteolytic Activity ofLactobacillus bulgaricus Grown in Milk. Journal of Diary Science. LaPlata. Argentina. 76:1498-1505.
Adesokan, I.A., B.B. Odetoyinbo, Y.A. Ekanola, R.E. Avanrenren, danS. Fakorede. 2011. Roduction of Nigerian nono using lactic startercultures. Pakistan J. Nutrit. 10(3):203-207.
Afriani. 2010. Pengaruh penggunaan starter bakteri asam laktat Lactobacillusplantarum dan Lactobacillus fermentum terhadap total bakteri asamlaktat, kadar asam dan nilai pH dadih susu sapi. JIIP. 13(6):279-285.
Aisyah, A., E. Kusdiyantini, dan A. Suprihadi. 2014. Isolasi, Karakterisasi BakteriAsam Laktat, dan Analisis Proksimat dari Pangan Fermentasi“Tempoyak”. Jurnal Biologi. 3(2):31-39.
Akmal, A.H. dan A. Romita. 1996. Isolasi Mikroba Tanah Penghasil Antibiotikadan Sampel Tanah pada Lokasi Penumpukan Sampah. Cermin DuniaKedokteran. 108:199645.
Aman dan Harjo. 1973. Perbaikan Mutu Susu Kedelai di dalam Botol.Departemen Perindustrian Bogor. Bandung.
Astuti, S. 1995. Bahan Ajar Pengetahuan Bahan Ikan, Susu, dan Telur.Universitas Lampung. Bandar Lampung.
Axelsson, L.T. 1998. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. MarcelDekker Inc. New York.
Axelsson, L. 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. LacticAcid Bacteria. Microbiological and Functional Aspects Third edition,Revised and Expanded. Marcel Dekker Inc. New York.
Bamfort, C.W. 2005. Food, Fermentation and Micro-organisms. BlackwellScience Ltd. Iowa. University of California.
41
Candra, J.I. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari ProdukBekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Skripsi. Institut PertanianBogor.
Emmanuelle, A. 2013. Integrated Process Production and Extraction of theFibrinolytic Protease from Bacillus sp. UFPEDA 485. BiochemBiotechnol (2013). 170:1676–1688.
Ernawati. 1997. Fermentasi Susu Menggunakan Ragi Tape dan Biji Kefir Kering.Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Gramedia Pustaka Utama Jakarta.
Fardiaz, S. 1993. Analisis Mirobiologi Pangan. Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Fuller, R. 1992. Probiotics: The Scientific Basis. Chapman and Hall. London.
Ganjar, I. 2003. Tapai from Cassava and Sereals. First International Symposiumand Workshop on Insight into the World of Indigenous Fermented Foodsfor Technology Development and Food Safety. Bangkok.
Guessas, B. dan M. Kihal. 2004. Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolatedfrom Algerian Arid Zone Raw Goats’ Milk. African Journal ofBiotechnology. 3(6):339-342.
Hardiningsih, R., R.N.R. Napitupulu, dan T. Yulinery. 2006. Isolasi dan UjiResistensi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas.7(1):15-17.
Haryadi, Nurliana, dan Sugito. 2013. Nilai pH dan Jumlah Bakteri Asam LaktatKefir Susu Kambing Setelah Difermentasi Dengan Penambahan GulaDengan Lama Inkubasi Yang Berbeda. Jurnal Medika Veterinaria.7(1), ISSN : 0853-1943. Program Studi Pendidikan Dokter HewanFakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala. Banda Aceh
Hill, M. J. 1995. Role of Gut Bacteria in Human Toxicology and Pharmacology.Taylor and Francis. New York.
Hogg, S. 2005. Essential Microbiology. John Wiley & Sons Ltd. England.
Hutkins, R.W. 2006. Microbiology and Technology of Fermented Foods. Lowa:IFT Press. Blackwell Publishing Ltd.
42
Jay, J.M. 1992. Modern Food Microbiology. 4th Ed. Chapman and Hall. NewYork
Jay, J.M. 2000. Modern Food Microbiology. Ed ke-6. Aspen Pub. Maryland.
Karina, A.N., D.R. Hussain, E. Johannes, dan N.H. Nawir. 2016. Isolasi danKarakterisasi Bakteri Proteolitik Dari Saluran Pembuangan LimbahIndustri Tahu. Jurnal Biologi. Universitas Hasanudin. Makassar.
Kwok, J., W.M. De Vos.1994. The Proteolytic System of Lactic Acid Bacteria.In :Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Ed Gasson abdDe Vos. 1994. Balckie Academic & Profesional. Glasgow.
Lehninger, A.L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.
Ng-Kwai-Hang. K.F. 2003. Milk proteins-heterogeneity, fractionation andisolation. In: Roginski H, Fuquay JW, Fox PF, editors, Encyclopedia ofDairy Sciences. Academic Press. London. pp. 1881-1894.
Melliawati, R., A.C. Djohan, dan Yopi. 2015. Seleksi Bakteri Asam Laktatsebagai Penghasil Enzim Protease. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon.1(2):184-188.
Murti, T.W. dan T. Hidayat. 2009. Pengaruh Pemakaian Kultur Tiga MacamBakteri Asam Laktat dan Pemeraman Terhadap Komposisi Kimia danFlavour Keju. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture.
Palmer, T. 1995. Understanding Enzymes 4thedition. Prentice Hall. London.
Pakpahan, R. 2009. Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Bakteri Protease TermofilikDari Sumber Air Panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara.Thesis. Universitas Sumatera Utara.
Park, Y.W., M. Ramos, dan G.F.W. Haenlein. 2007. Physicochemicalcharacteristics of goat and sheep milk. Small Rumin Re. 68:88-113.
Poernomo, A. T. dan D.A. Purwanto. 2003. Uji Aktifitas Crude EnzimProteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 Hasil Fermentasi Curah. MajalahFarmasi Airlangga. 3:103–107.
Poliana, J. dan Mac C.A.P. 2007. Industrial enzymes: structure, function, andapplications. Dordrecht Springer.
43
Pratiwi, S.T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Yogyakarta.
Putranto, W.S. 2006. Purifikasi dan karakterisasi protease yang dihasilkanLactobacillus acidophilus dalam fermentasi susu sapi perah. SeminarNasional Bioteknologi “Capturing opportunities through biotechnology”.15-16. Pusat Penelitian Bioteknologi. Cibinong.
Putranto, W.S. 2007. Aktivitas Proteolitik Lactobacillus Acidophilus DalamFermentasi Susu Sapi. Jurnal Ilmu Ternak. 7(1):69-72. FakultasPeternakan Universitas Padjadjaran Bandung.
Putri, W.D.R., Haryadi, D.W. Marseno, dan M.N. Cahyanto. 2012. Isolasi DanKarakterisasi Bakteri Asam Laktat Amilolitik Selama Fermentasi Growol,Makanan Tradisional Indonesia. Jurnal Teknologi Pertanian.13(1):52-60.
Putri, Y.S. 2012. Skrining Dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri Dari LimbahRumah Pemotongan Hewan . Skripsi. Universitas Airlangga.
Rahayu, E.S. 2003. Lactid Acis Bacteria In Fermented Foods Of IndonesianOrigin. Agritech. 23(2):75-84.
Rahmat, R. 1997. Kacang Hijau dan Budi Daya Pasca Panen. Kanisius.Yogyakarta.
Rao, M.B., A.M. Tanksale, M.S. Ghatge, dan V.V. Deshpande. 1998. Molecularand Biotechnologi Aspect of Microbial Proteases. Microbiol. Mol. Biol.Rev. 63(3):597−635.
Said, I.M. dan E.M. Ningrum. 2009. Karakterisasi dan purifikasi protease bakteriBacillus sp. dan jamur Aspergillus sp. serta aplikasinya sebagai soakingagent pada proses penyamakan kulit kambing (Abstrak). Hibah PenelitianKerjasama (Hibah Pekerti). LP2M, UNHAS. Makasar.
Salminen, S., A.V. Wright, dan A. Ouwehand. 2004. Lactic Acid BacteriaMicrobiological and functional Aspects. Marcel Dekker. Inc. New York.
Sastono,U. dan Sutardi. 2008. Opimasi Pemecahan Emulsi Kanil Dengan CaraPendinginan Dan Pengadukan Pada Virgin Coconut Oil (VCO): (Abstrak)Prosiding Seminar . Institut Pertanian Bogor .
Schlegel, H.G. 1994. Mikrobiologi Umum. Penterjemah Tedjo Baskoro. Edisikeenam. Gajah Mada University Press. Yogyakarta.
44
Setyaningsih, I., T.Nurhayati, dan U. Aremhas. 2013. Pengaruh Media KultivasiChaetoceros gracilis Terhadap Kandungan Kimiawi dan Potensi InhibitorProtease. J.Teknol. dan Industri Pangan. 24(2) . Institut Pertanian Bogor.Bogor.
Suardana, W. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari CairanRumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif. Journal of Veterinery.8(4):155-159.
Sujaya, I.N., K.A. Nociantri, dan K. Asano. 2010. Diversity Of Bacterial Flora OfIndonesian Ragi Tape And Their Dynamics Duringthe TapeFermentationas Determined by PCR-DGGE. International food researchjournal. 17:239-245.
Sunarlim, R dan H. Setiyanto. 2008. Pengaruh kombinasi Lactobacillusacidophilus dengan starter yoghurt (Lactobacillus bulgaricus danStreptococcus thermophilus) terhadap mutu susu fermentasi. SeminarNasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor.
Sunaryanto, R. dan B. Marwoto. 2013. Isolasi, Identifikasi, Dan KarakterisasiBakteri Asam Laktat dari Dadih Susu Kerbau. Jurnal Sains dan TeknologiIndonesia. 14(3):228-233.
Suri,W.L., Syukur, S., Jamsari. 2013. Optimization of protease activity from lacticacid bacteria (LAB) Pediococcus pentosaceus isolated from soursopfermentation (Annona muricata L.). J Kimia Unand. 2(1).
Surono, I.S. 2004. Probiotik, Susu Fermentasi dan Kesehatan. Tri Cipta Karya.Jakarta.
Susanti, E. 2003. Penentuan Aktivitas dan Jenis Protease Dari Bacillus sp.BAC4¹.Sainmat. 1:56-57.
Susilorini, T.E., M.E. Sawitri, dan Muharlien. 2009. Budidaya 22 TernakPotensial. Penebar Swadaya. Jakarta.
Susilowati, S. 2016. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat (BAL) dariFermentasi Air Cucian Beras. Skripsi. UIN Syarifhidayatullah. Jakarta.
Toruan, P. 2008. Performance nutrition. Prima Diet Cathering. Jakarta.
45
Usmiati, S. 2007. Kefir, susu fermentasi dengan rasa menyegarkan. WartaPenelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. 29(2):12-17.
Widodo, W. 2002. Bioteknologi Fermentasi Susu. Pusat PengembanganBioteknologi Universitas Muhammadiyah Malang. Jawa Timur.
Wikandari, P.R. Suparmo, Y. Marsono,E.S Rahayu. 2012. Karakterisasi BakteriAsam Laktat Proteolitik pada Bekasam. Jurnal Natur Indonesia.14(2):120-125.
Winarno, F.G. 1989. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama.Jakarta.
Yusmarini, R., T. Indrati., Utami, dan Y. Marsono. 2009. Isolasi dan IdentifikasiBakteri Asam Laktat Proteolitik dari Susu Kedelai yang TerfermentasiSpontan. Jurnal Natur Indonesia. 12(1):28-33.