Upload
buikiet
View
234
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ISOLASI DAN PENAPISAN SITOTOKSISITAS KAPANGENDOFIT TANAMAN OBAT DARI KABUPATEN LOMBOK TIMUR
ISOLATION AND SCREENING CYTOTOXICITY OF ENDOPHYTICFUNGI ISOLATED FROM MEDICINAL PLANT ORIGINATED
FROM EAST LOMBOK.
ABSTRAKTelah dilakukan isolasi kapang endofit dari tanaman obat yang diambil
dari kabupaten Lombok Timur, propinsi Nusa Tenggara Barat. Hasil isolasi
menggunakan metode sterilisasi permukaan dan media Corn meal malt extract
agar menghasilkan 75 isolat kapang endofit yang terdiri dari 57 isolat dari
sampel daun dan 18 isolat dari sampel batang yang berasal dari 34 jenis
tanaman obat. Hasil isolasi menunjukkan tingkat kolonisasi kapang pada daun
mencapai 70 % dari total sampel, sedangkan tingkat kolonisasi pada batang
hanya 32 % dari total sampel. Dari 75 isolat kapang yang berhasil diisolasi telah
dilakukan penapisan sitotoksisitas terhadap 36 kapang hasil isolasi dari tanaman
obat di Lombok Timur. Semua isolat dikultivasi dalam media potato dextrose
yeast extract selama 10 hari. Kaldu kultivasi dibagi menjadi tiga, masing-masing
diekstraksi dengan butanol, etil asetat dan dikhlorometana. Ekstrak kasar yang
sudah dipekatkan diuji aktivitas sitotoksisitasnya terhadap Artemia salina dengan
menggunakan metode Brine shrimp lethality test. Penapisan pertama dengan
konsentrasi ekstrak 1000 mg/L mendapatkan 9 ekstrak aktif dari 108 ekstrak
yang diuji. Penapisan lanjutan terhadap 9 ekstrak dengan menghitung LC50
menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat dari isolate ENLT 74.3d.2 adalah ekstrak
yang menunjukkan aktivitas tertinggi dibandingkan ekstrak yang lain dengan
LC50 sebesar 30,21 mg/L. Kapang ENLT 74.3d.2 diisolasi dari tanaman Cibotium
barometz dan secara morfologi sesuai dengan deskripsi fungi Curvularia lunata.
Kata kunci : kapang endofit, tanaman obat, Cibotium barometz, Curvularia
lunata, BSLT, Artemia salina
30
ABSTRACTIsolation of endophytic fungi from medicinal plant originated from East
Lombok, West Nusa Tenggara has been conducted. Seventy five endophytic
fungi have been isolated from 34 medicinal plants that consist of 57 isolate from
leave sample and 18 isolate from stem. The isolation result showed that
colonization endopyhitic fungi in leave (70%) was higher compared to stem
(32%) from total samples. Thirty six isolates from total 75 isolates were screened
for citotoxicity. Isolates were cultivated in potato dextrose yeast extract medium
for 10 days. Fermentation broth was extracted using buthanol, ethyl acetate and
dichloromethane. Crude extracts were assayed citotoxicity activity against
Artemia salina using Brine shrimp lethality test method. First screening using
1000 mg/L concentration of crude extract showed that 9 extracts were active out
of 108 extracts assayed. Further screening for the 9 active extracts using LC50
showed that ethyl acetate extract from fungus ENLT 74.3d.2 was the most active
compared to the others with LC50 of 30,21 mg/L. Fungus ENLT 74.3d.2 was
isolated from Cibotium barometz and morphological descript as Curvularia
lunata.
Key words : endophytic fungi, pharmaceutical plant, Cibotium barometz,
Curvularia lunata, BSLT, Artemia salina
PENDAHULUANTanaman obat telah dikenal sebagai sumber metabolit sekunder yang
bersifat bioaktif. Sejak dari jaman prasejarah hingga era kimia modern sekarang
ini terbukti senyawa yang berbasis metabolit tanaman mempunyai peranan yang
sangat besar dalam bidang pengobatan. Lebih dari 50% dari senyawa kimia
baru yang didaftarkan ke Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat
sebagai senyawa anti kanker, anti migrain, dan anti alergi adalah senyawa
metabolit tanaman dan turunannya. (Cragg et al., 1999). Di Indonesia sendiri
telah ada 283 spesies tanaman yang telah diregistrasi ke Badan POM dan
digunakan dalam pengobatan tradisional (Pramono, 2002).
Penelitian ilmiah juga banyak sudah melaporkan aktivitas tanaman obat
yang selama ini digunakan dalam pengobatan tradisional sebagai bioaktif
antikanker. Mengkudu hutan Morinda elliptica (Jasril et al., 2003); kepel
31
Stelechocarpus burahol (Bl.) Hook (Purwantiningsih et al., 2010), sukun
Artocarpus altilis (Arung et al., 2009) adalah beberapa tanaman obat tradisional
yang sudah dibuktikan secara ilmiah mampu menghambat pertumbuhan sel
kanker.
Pemilihan tanaman sebagai sumber isolat kapang endofit menjadi faktor
yang menentukan untuk mendapatkan mikroba dan senyawa bersifat bioaktif.
Tanaman obat menurut Strobel dan Daisy (2003) adalah salah satu sumber
isolat mikroba endofit yang menjanjikan. Tanaman obat yang mempunyai
sejarah pemakaian lokal oleh penduduk setempat diyakini mempunyai metabolit
sekunder yang spesifik, dan diharapkan menjadi inang bagi kapang endofit yang
juga mampu menghasilkan metabolit yang mempunyai aktifitas spesifik. Atas
dasar pertimbangan tersebut dalam penelitian ini dipilih tanaman obat yang
sudah diketahui sejarah pemakaiannya sebagai sumber isolasi kapang endofit.
Disamping jenis tanaman, lokasi tumbuh tanaman juga mempengaruhi kapang
endofit yang diperoleh. Tanaman yang tumbuh dengan keragaman hayati tinggi
dilaporkan akan mempunyai kemungkinan lebih besar untuk menghasilkan
kapang endofit yang spesifik.
Pada bagian pertama penelitian ini, telah dilakukan eksplorasi kapang
endofit tanaman obat dari beberapa lokasi di Kabupaten Lombok Timur, yang
terletak di lereng Gunung Rinjani. Di daerah ini termasuk dalam kawasan yang
mempunyai keragaman baik flora maupun fauna yang merepresentasikan
daerah di bagian barat garis Wallacea maupun bagian timur (Rhee et al., 2004).
Oleh karena itu, Lombok merupakan area yang menarik untuk dijadikan sebagai
lokasi pengambilan contoh tanaman obat sumber untuk isolasi kapang endofit.
Sampel tanaman obat diambil berdasarkan petunjuk penduduk lokal yang
mengetahui khasiat masing-masing tanaman yang diambil sebagai sampel. Hal
ini dilakukan karena penduduk lokal yang lebih mengetahui pemanfaatan
tanaman tersebut untuk pengobatan secara lokal. Penapisan bioaktivitas
dilakukan terhadap isolat kapang yang berhasil diisolasi. Metode uji biologis
umum yang banyak digunakan untuk penapisan awal sifat sitotoksisitas suatu
senyawa adalah uji kematian larva udang laut atau brine shrimp lethality test
(BSLT). BSLT merupakan metode yang murah dan sederhana dan hasilnya
mempunyai korelasi yang positif dengan aktivitas anti tumor (McLaughlin et al.,
1998; Anderson et al., 1991). Pada bagian ini dilaporkan hasil isolasi dan.,
32
penapisan awal (prescreening) hasil isolasi kapang endofit tanaman obat dari
daerah Lombok Timur Nusa Tenggara Barat.
CARA KERJAPengambilan sampel tanaman dan isolasi kapang
Pengambilan sampel tanaman dan isolasi kapang dilakukan sesuai
dengan metode yang disampaikan dalam bab METODOLOGI PENELITIAN, sub
bab SAMPEL DAN LOKASI bagian penanganan sampel serta CARA KERJA
bagian isolasi kapang endofit.
Kultivasi isolat kapang endofit hasil isolasiKultivasi dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE
PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian kultivasi kultur vegetatif dan
kultivasi kultur produksi. Kultur produksi dilakukan dengan pada media PDY
dengan volume 200 mL di dalam Erlenmeyer 500 mL.
Ekstraksi senyawa aktif hasil kultivasi isolat kapang endofitEkstraksi dilakukan sesuai dengan cara kerja pada bab METODE
PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Ekstraksi senyawa aktif. Ekstraksi
dilakukan pada tabung sentrifuse kapasitas 15 ml dengan volume kaldu kultivasi
masing-masing 6 ml. Pelarut organik yang digunakan adalah butanol, etil asetat
dan dikhlorometan.
Penapisan aktivitas biologis ekstrak pelarut organik dari isolat kapangendofitPenapisan aktivitas biologis dilakukan dengan menggunakan metode BSLT
sesuai dengan cara kerja pada bab METODE PENELITIAN sub bab CARA
KERJA bagian Uji aktivitas biologis dengan metode brine shrimp lethality test
(BSLT). Pada penapisan awal, aktivitas dilihat dengan menentukan prosen
kematian larva udang pada konsentrasi ekstrak 100 mgl/L. Apabila jumlah larva
A. salina yang mati lebih besar dari 90% maka ekstrak dapat dianggap aktif dan
mempunyai potensi untuk dilakukan penapisan lebih lanjut. Pada penapisan
lanjutan aktivitas ekstrak dilihat dengan menentukan median konsentrasi lethal
(LC50) dari masing-masing ekstrak aktif hasil penapisan awal. Prosen kematian
33
larva udang dihitung pada 3 konsentrasi yang berbeda, yaitu : 25, 50 dan 100
mg/L. LC50 dihitung dengan membuat grafik log konsentrasi terhadap prosen
kematian larva udang. Persamaan yang diperoleh pada grafik digunakan untuk
menentukan pada konsentrasi berapa ekstrak dapat menyebabkan kematian
larva udang sebanyak 50 %.
Identifikasi morfologi kapang aktifIdentifikasi morfologi kapang endofit dilakukan sesuai dengan cara kerja pada
bab METODE PENELITIAN sub bab CARA KERJA bagian Identifikasi morfologi
kapang
HASIL DAN PEMBAHASANIsolasi kapang endofit dari tanaman obat
Kapang endofit diisolasi dari bagian batang dan daun tanaman obat
sumber isolat. Batang dan daun disterilisasi permukaan untuk menghilangkan
mikroba yang ada pada permukaan tanaman, sehingga diharapkan mikroba
yang tumbuh pada media adalah kapang yang berada dalam jaringan tanaman.
Kapang yang di[ilih untuk dimurnikan ke dalam media PDA adalah kapang yang
tumbuh minimal setelah 2 hari inkubasi pada media CMM. Hal ini dilakukan
untuk meminimalkan kemungkinan mengisolasi kapang yang tumbuh dari
permukaan bagian tanaman.
Hasil isolasi kapang endofit dari 34 sampel tanaman obat disajikan dalam
Tabel 1. Isolasi menghasilkan total 75 kapang endofit yang terdiri dari 57 (76%)
berasal dari sampel daun dan 18 (24 %) berasal dari batang. Kolonisasi kapang
endofit berdasarkan perhitungan menurut Tomita et al., (2003) dan Khan et al.,
(2007) menunjukkan pada daun kolonisasi mencapai 70,58 %, sedangkan
kolonisasi kapang pada batang hanya 32,35 % (Lampiran 1). Radu dan Kqueen
(2002) juga melaporkan hasil bahwa kolonisasi kapang endofit di daun tanaman
obat yang disambil sampelnya dari Malaysia mencapai 90,9 %, jauh lebih besar
dibandingkan dengan tingkat kolonisasi di batangnya. Akan tetapi hasil yang
berbeda diperoleh oleh Tomita (2003) dan Sun et al (2008). Tomita melaporkan
frekuensi kolonisasi kapang endofit pada dahan tanaman obat yang diambil dari
Hokaido mencapai 73 % pada dahan dengan umur kurang dari 1 tahun, dan
mencapai 93.7-100 % pada dahan/batang yang berumur lebih dari 1 tahun.
34
Khan et al., (2007) melaporkan dari sampel daun yang diambil dari sekitar
Universitas Karachi frekuensi kolonisasinya 0%, sedangkan dari sampel batang
frekuensi kolonisasinya 2,5 %. Sun et al., (2008) melaporkan hasil isolasi
kapang endofit tanaman obat dari Kebun Raya Beijing, frekuensi kolonisasi
kapang pada daun berkisar 2-17,5 % sedangkan batang yang berumur 1 tahun
frekuensi kolonisasi berkisar 12-75%, batang berumur 3 tahun frekuensi
kolonisasinya mencapai 86-100%.
Tabel 1 Kapang endofit yang berhasil diisolasi dari bagian tanaman obat
Nama Tanaman Isolasi KapangDaun Batang
Nona Makan Sirih (Clerodendromthomsonae Balf F) 1 -Belimbing Star ( Averrhoa carambola L) - -Dadap ( Erythirna subumbrans (Hask.) Merr) 1 1Jambu Biji (Psidium guajava, Linn.) 2 2Kemangi (Ocimum santumL) - -Kembang Sepatu (Hibiscus rosa-sinensis L) 1 1Tapak Dara (Catharantus roseus (L.) G. Don) - 1Patikan Kerbau (Euphorbia hirta, Linn) - 1Lengkuas (Alpinia galanga, Linn., Willd) - 2Jengger ayam (Celosia cristata ) 4 -Mengkudu (Morinda citrifolia, Linn.) 1 1Pare (Momordica charantia L) 1 1Pegagan (Centella asiatica, (Linn), Urb) 5 -Rumput Mutiara (Hedyotis corymbosa (L.] Lamk) 2 -Bayam Duri (Amaranthus Spinousus, Linn.) 1 -Jarak Pagar (Jatropha curcas) 1 1Bangle (Zingiber purpureum Roxb) - 1Krokot (Portulaca leavis, Wall) - 1Bandotan (Ageratum conyzoides L.) 4 -Pakis (Cibotium barometz) 3 -Jamplung (Calophylum inophylum) - 4Kunyit (Curcuma longa Linn.) 1 -Serai (Cymbopogon nardus (L.) Rendle) 1 1Bunga Pukul Empat (Mirabilisjalapa Linn.) 4 2Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis (L) Vahl) 3 2Katu (Sauropus androgynus (L,) Merr.) 5 -Lemboke/Awar-awar (Ficus septica Burm.L) 2 -Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) 2 -Meniran (Phylanthus urinaria, Linn.) - 1Tembelekan (Lantana camara Linn.) - -Beluntas (Pluchea indica (L.) Less.) 4 2Alpukat (Persea gratissima Gaertn) 3 -Daruju (Acanthus Ilicifolius) 2 1Sangitan (Sambucus javanica Reinw) 1 -
35
Dari laporan beberapa peneliti yang menghitung frekuensi kolonisasi
kapang endofit pada tanaman obat, terlihat bahwa apabila sampel tanaman
berbatang keras (Tomita et al., 2003 dan Sun et al., 2008) maka frekuensi koloni
akan lebih besar pada batang dibandingkan dengan daun. Frekuensi koloni akan
meningkat dengan meningkatnya umur batang yang digunakan sebagai sampel.
Dalam penelitian ini kebanyakan tanaman obat yang digunakan sebagai sampel
adalah tanaman perdu, dan apabila tanaman keras diambil batang yang masih
muda. Hal ini yang dapat menjelaskan mengapa frekuensi koloni pada daun
lebih tinggi dibandingkan koloni pada batang, seperti yang dilaporkan oleh Radu
dan Kqueen (2001).
Penapisan sitotoksisitas awal dengan metode BSLTMetabolit sekunder mikroba adalah salah satu bahan alam penting sebagai
sumber bahan baku obat. Untuk dapat mengidentifikasi senyawa bioaktif yang
dihasilkan oleh mikroba perlu dilakukan penapisan. Menurut Vlietinck dan Apers
(2004) penapisan terdiri dari beberapa tahap yang terdiri dari: pra penapisan,
penapisan, pengawasan dan penapisan sekunder. Pra penapisan dilakukan
untuk mendapatkan kandidat senyawa bioaktif dengan cara cepat. Suatu
methode dapat digunakan untuk prapenapisan apabila metode tersebut dapat
dilakukan secara cepat, mudah, terpercaya, murah, sensitif dan hanya
memerlukan bahan dalam jumlah sedikit (Ghisalberti, 2008).
McLaughin et al., (1998) melaporkan bahwa metode pengujian ekstrak
terhadap larva udang yang disebut dengan brine shrimp lethality test (BSLT)
adalah metode pra penapisan untuk aktivitas antikanker. Larva Artemia salina
dianggap mewakili organism zoologis untuk uji lethalitas secara in vivo. Hasil uji
yang mereka lakukan untuk membandingkan uji letalitas terhadap A. salina dan
uji hambatan proliferasi terhadap karsinoma nasofaring menunjukkan adanya
korelasi positif dari sifat toksisitas senyawa uji terhadap kedua jenis uji.
Cash (1994) di dalam Kanwar (2007) melaporkan hasil uji komparasi
aktivitas enzim yang terdapat di dalam A. salina dan jaringan hati tikus yang
secara spesifik memecah dinukleosida tetrafosfat. Semua substrat enzim yang
berasal dari purin maupun pirimidin dinukleosida tetrafosfat ternyata
menunjukkan Vmaks dan Km yang sama, baik untuk enzim yang berasal dari A.
salina maupun hati tikus. Inhibisi oleh nukleotida terhadap enzim yang berasal
36
dari keduanya juga menunjukkan hasil yang sama. Hasil uji tersebut mendukung
hasil uji yang dilakukan oleh McLaughlin et al., (1998) untuk dapat
menggunakan A. salina sebagai uji pra screening untuk senyawa antikanker.
Tabel 2 Orientasi konsentrasi penapisan sitotoksisitas dengan metode BSLT
Kode isolat PelarutOrganik
Uji BSLT (% kematian A. salina)
1000
mg/L
100 mg/L 10 mg/LENLT 35. 3d. 2 Butanol 93.33 93.33 6.67
Etil asetat 93.33 93.33 3.33Diklorometan 93.33 13.33 13.33
ENLT 41. 5d Butanol 86.67 73.33 20.00Etil asetat 86.67 90.00 13.33Diklorometan 90.00 46.67 13.33
ENLT 35. 3d. 1 Butanol 100.00 100.00 3.33Etil asetat 100.00 100.00 20.00Diklorometan - 3.33 -
Meyer et al. (1982) melaporkan bahwa suatu ekstrak tanaman dianggap
sebagai bioaktif apabila ekstrak tersebut memiliki nilai LC50 lebih kecil atau sama
dengan 1000 mg/L, pendekatan yang sama juga dilakukan oleh Amara et al.
(2008) untuk penapisan ektrak kasar dari tanaman obat. Berdasarkan hasil yang
dilaporkan oleh Meyer et al. (1982) dan Amara et al. (2008) maka dilakukan
orientasi konsentrasi pengujian untuk ekstrak bahan aktif dari kapang endofit
dengan melihat angka mortalitas larva udang yang dikenai perlakuan ekstrak
bahan aktif kapang endofit.
Hasil orientasi konsentrasi pada Tabel 2 menunjukkan hasil yang berbeda
dengan laporan Meyer et al. (1982) dan Amara et al. (2008). Hasil uji pada
konsentrasi 1000 mg/L ternyata semua ekstrak menunjukkan tingkat kematian
larva diatas 90 %. Hasil pengujian menunjukkan bahwa pemakaian konsentrasi
ekstrak kasar pada konsentrasi 1000 mg/L tidak selektif digunakan untuk
menapis ekstrak bahan aktif dari kapang endofit. Dari hasil ini dapat ditarik
asumsi bahwa bahan aktif dari ekstrak kasar tanaman konsentrasinya lebih kecil
dibandingkan bahan aktif dalam ekstrak kasar fungi. Berdasarkan hasil tersebut
penapisan awal bioaktifitas ekstrak kapang dengan metode BSLT dilakukan
pada konsentrasi 100 mg/L.
37
Tabel 3 Hasil penapisan toksisitas metabolit sekunder kapang endofit padakonsentrasi 100 mg/L
Kode isolat Uji BSLT(% kematian )
Butanol Etil asetat DiklorometanENLT 1.3d 53.33 100.00 10.00ENLT 6.6d.1 70.00 100.00 13.33ENLT 8. 2d 13.33 100.00 43.33ENLT 6.6d.2 - 80.00 90.00ENLT 11. 4d 86.67 90.00 -ENLT 11. 5d 76.67 90.00 86.67ENLT 12. 2d. 1 3.33 26.67 33.33ENLT 12. 3d. 1 13.33 93.33 16.67ENLT 7.2d.1 13.33 100.00 13.33ENLT 12. 3d. 2 26.67 80.00 3.33ENLT 18.4d. 1 23.33 66.67 36.67ENLT 18. 4d. 2 43.34 73.34 6.67ENLT 18. 5d. 2 - 6.67 - 3.33 6.67ENLT 18. 5d. 1 73.33 66.67 63.33ENLT 23. 5d 66.67 86.67 3.33ENLT 24. 3d 76.67 86.67 13.33ENLT 35. 3d. 2 93.33 93.33 13.33ENLT 41. 5d 73.33 90.00 46.67ENLT 20.2d 53.33 73.33 16.67ENLT 35. 3d. 1 100.00 100.00 3.33ENLT 39.3d.2 90.00 20.00 3.33ENLT 40.5d 33.33 26.67 6.67ENLT 42.8d 23.33 36.67 23.33ENLT 26. 4d 66.67 96.66 6.67ENLT 47. 3d 60.00 96.67 16.67ENLT 47 5d. 1 46.67 93.33 6.67ENLT 47. 5d. 2 86.67 63.33 13.33ENLT 49. 3d. 1 30.00 80.00 0.00ENLT 74. 3d.2 10.00 100.00 13.33ENLT 101.3d 40.00 100.00 10.00ENLT 90.4d.2 40.00 26.67 6.67ENLT 62.4d 60.00 36.67 66.67ENLT 108.4d.2 60.00 100.00 0.00ENLT 107.4d -3.33 36.67 76.67ENLT 79.2d.1 -3.33 53.33 66.67ENLT 67.4d.2 10.00 50.00 73.33
Tabel 3 menunjukkan hasil penapisan bioaktivitas awal kapang endofit
pada konsentrasi 100 mg/L. Hasil penapisan menunjukkan 9 ekstrak mampu
38
menyebabkan kematian larva lebih besar dari 90% pada konsentrasi 100 mg/L.
Sembilan ekstrak yang menunjukkan bioaktivitas terdiri dari 8 ekstrak yang disari
dengan etil asetat dan 1 ekstrak yang disari dengan butanol. Hasil penapisan ini
menunjukkan bahwa sebagian besar ekstrak bioaktif adalah ekstrak yang disari
dengan etil asetat. Beberapa penelitian sebelumnya melaporkan ekstrak butanol
(Kumala, et al., 2006) dan ekstrak etil asetat (Teles, et al., 2005; Guimaraes et
al., 2010; Qin et al., 2009) dari kapang endofit bersifat bioaktif antikanker. Dari
laporan yang sudah dipublikasikan sebelumnya lebih banyak ekstrak etil asetat
yang bersifat bioaktif dibandingkan dengan ekstrak butanol.
Aktivitas biologis suatu senyawa terjadi karena adanya interaksi molekul
senyawa aktif dengan gugus fungsional dari reseptor. Interaksi antara kedua
molekul tersebut dapat berlangsung karena adanya ikatan kimia tertentu didalam
molekul senyawa aktif (Purwanto dan Susilowati, 2000). Senyawa aktif yang
tersari oleh pelarut butanol adalah senyawa-senyawa yang bersifat polar.
Senyawa polar pada umumnya mengandung ikatan ionik atau kovalen. Albert
(1985) melaporkan bahwa senyawa dengan tingkat ionisasi yang tinggi pada
umumnya mempunyai sifat bakteriostatik sehingga bersifat antibiotik.
Sedangkan Raguse et al (2002) dan Powers dan Hancock (2003) juga
melaporkan aktivitas antibakteri dari peptida-peptida yang bersifat kationik.
Penapisan sitotoksisitas ekstrak dengan penetapan LC50 menggunakanmetode BSLT
Analisis median konsentrasi letal (LC50) adalah parameter yang lebih teliti
untuk penapisan bahan alam dengan metode BSLT. Dalam analisis tersebut
akan ditetapkan konsentrasi dari masing-masing ekstrak yang mampu
menyebabkan kematian 50% larva udang yang diuji. Sembilan ekstrak yang
diperoleh dari penapisan awal, dilakukan penapisan lanjutan dengan
menetapkan LC50 dari masing-masing ekstrak.
Tabel 4 menunjukkan hasil penapisan berdasarkan LC50 dari 9 ekstrak
hasil penapisan awal. Hasil penapisan lanjutan tersebut menunjukkan bahwa
ekstrak menggunakan etil asetat dari kapang ENLT 74.3d.2 merupakan ekstrak
yang mempunyai nilai LC50 terkecil. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak
dari hasil penyarian menggunakan etil asetat dari kapang ENLT 74.3d.2
merupakan ekstrak yang paling aktif dan prospektif untuk dilakukan pemurnian
39
dan penapisan lebih lanjut. Isolat aktif ENLT 74.3d.2 didepositkan di koleksi
kultur Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT dan diberi kode BioMCC-FE00283.
Tabel 4 Hasil penapisan berdasarkan penetapan LC50
Kode isolat Pelarut LC50 (mg/L)
ENLT 6.6d.1 Etil asetat 58,74
ENLT 7.26.1 Etil asetat 66,07
ENLT 8.2d Etil asetat 110,59
ENLT 9.3d.1 Etil asetat 57,54
ENLT 35.3d.1 Butanol 77,62
ENLT 35.3d.1 Etil asetat 79,57
ENLT 74.3d.2 Etil Asetat 30,21
ENLT 101.3d Etil asetat 44,60
ENLT 108.4d.2 Etil asetat 46,47
Isolat aktif BioMCC-FE00283 adalah isolat yang diisolasi dari tanaman
pakis-pakisan (Cibotium barometz). Sampai saat ini belum ditemukan publikasi
tentang aktivitas kapang endofit yang diisolasi dari tanaman pakis. Tanaman
pakis secara tradisional digunakan untuk pengobatan reumatik dan paralisis.
Yang et al., (2007) melaporkan bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak umbi pakis
dengan etanol mengandung sterol, sedangkan Yuan et al., (2004) melaporkan
berhasil mengindetifikasi 12 jenis senyawa dari tanaman pakis. Kedua belas
jenis senyawa tersebut adalah asam palmitat, metil ester palmitat, asam linoleat,
asam oleat, metil ester stearat, etil ester stearat, 4′-Hidroksiasetanilid, Sukrose,C
asam lemak jenuh dengan jumlah C 27, protosatekhualdehid, β-sitosterol,
Vanillin, dan 3,4′,5,7-tetrahidroksflavon. Meskipun berhasil menidentifikasi
senyawa yang terdapat dalam C. barometz, akan tetapi mereka belum
melaporkan bioaktivitas dari masing-masing senyawa tersebut.
Identifikasi kapang aktifPengamatan dibawah mikroskop terhadap kapang BioMCC FE-00283
menunjukkan bahwa kapang tersebut mempunyai konidiofor yang tegak,
berwarna coklat, tidak bercabang dan lurus dengan panjang lebih dari 30 µm.
Sedangkan konidia berbentuk subelipsoidal yang terdiri dari 4 sekat, dimana
40
sekat kedua merupakan sekat yang paling lebar dengan dimensi 4-5 µm x 10-12
µm. Ciri-ciri morfologi kapang BioMCC FE-00283, terutama bentuk konidia yang
bersekat 4 adalah ciri spesifik dari genus Curvularia.
a b
c d
e f
g hGambar 11 Morfologi kapang BioMCC FE-00283 dibawah mikroskop dengan
perbesaran 1000 kali (a, b) dan morfologi Curvularia affininis (c), C.brachyspora (d), C. clavata (e), C. lunata (f), C pallescen (g) danC. prasadji (g) (Watanabe, 2002)
41
Perbandingan bentuk dan ukuran konidiofor dan konidia dengan spesies-
spesies genus Curvularia dan kapang BioMCC FE-00283 disajikan pada
Gambar 10. Apbila dibandingkan bentuk dan ukuran konidiofor maupun konidia,
morfologi kapang BioMCC FE-00283 paling mendekati dengan spesies C. lunata
dan C palescense, dilihat dari bentuk konidiofor yang berbeda dengan spesies
lain. Pembeda spesifik antar kedua spesies adalah panjang konidiofor, dimana C
lunata mempunyai panjang konidiofor adalah 160-300 µm sedangkan panjang
konidiofor dari C. palescense adalah berkisar 46 µm (Watanabe, 2002). Dari
hasil pengamatan dimensi morfologi, panjang konidiofor dari kapang BioMCC
FE-00283 yang terukur pada pengamatan mikroskop rata-rata lebih dari 60 µm.
Hasil ini menunjukkan bahwa morofologi kapang BioMCC FE-00283 paling
mendekati dengan deskripsi dari kapang Curvularia lunata.
Kapang endofit C. lunata pernah dilaporkan berhasil diisolasi oleh
beberapa peneliti lain. Kharwar et al., (2008), melaporkan berhasil mengisolasi
C. lunata dari tanaman Catharanthus roseus (L) G.Don sedangkan Verma dan
Kharwar (2006) mengisolasinya dari daun nimba.
Dalam kaldu kultivasi senyawa aktif yang dihasilkan oleh kapang
biasanya berada dalam konsentrasi yang kecil dalam suatu cairan yang
mengandung sel kapang, medium maupun produk metabolit lainnya. Untuk
meningkatkan konsentrasi dari senyawa aktif, maka perlu dilakukan pemisahan
senyawa tersebut dari pengotornya. Pemisahan yang dimaksudkan untuk
pemurnian senyawa aktif pada dasarnya dilakukan untuk mengetahui senyawa
mana sebenarnya yang menunjukkan aktivitas dan untuk mengetahui karakter
biologis maupun kimia dari senyawa tersebut (Spainhour, 2005). Ekstrak yang
disari menggunakan etil esetat dari kapang endofit C. lunata BioMCC FE 00283
menunjukkan aktivitas terbesar terhadap larva A. salina (Tabel 4), akan tetapi
belum diketahui senyawa apa yang berperan dalam aktivitas tersebut. Untuk
dapat menentukan senyawa yang berperan dalam aktivitas tersebut perlu
dilakukan pemurnian lebih lanjut terhadap ekstrak etil asetat dari kapang C.
lunata BioMCC FE 00283. Pemurnian dilakukan dengan panduan uji
sitotoksisitas agar dapat diperoleh fraksi maupun senyawa murni yang
mempunyai aktivitas sitotoksik. Pada bagian kedua dari penelitian ini akan
dilakukan pemurnian senyawa aktif dari kapang endofit C. lunata BioMCC FE
00283 dengan panduan uji BSLT dan uji sitotoksitas terhadap sel MCF-7 untuk
42
senyawa murninya. Disamping itu akan dilakukan identifikasi struktur senyawa
aktif yang dihasilkan oleh kapang endofit C. lunata BioMCC FE 00283 yang
bersifat sitotoksik terhadap sel kanker MCF-7.
SIMPULANIsolasi kapang endofit tanaman obat dari Lombok Timur, Nusa Tenggara
Barat dilakukan dengan metode strerilisasi permukaan. Dari 34 jenis sampel
tanaman diperoleh 75 kapang endofit yang terdiri dari 57 dari sampel daun dan
18 dari sampel batang. Tingkat kolonisasi kapang pada daun mencapai 70% dari
total sampel, sedangkan tingkat kolonisasi pada batang hanya 32% dari total
sampel.
Metabolit sekunder dari 36 kapang endofit yang berhasil diisolasi diuji
bioaktivitasnya terhadap larva Artemia salina. Konsentrasi selektif untuk
penapisan ekstrak metabolit sekunder kapang endofit tanaman obat adalah
1000 mg/L. Penapisan awal terhadap 108 ekstrak metabolit sekunder kapang
menghasilkan 9 ekstrak yang dapat menyebabkan mortalitas 100 % terhadap
larva A. salina .
Penapisan lanjutan terhadap ekstrak aktif pada penapisan awal
dilakukan dengan menghitung LC50 ekstrak pada pengujian terhadap A. salina.
Penapisan lanjutan menghasilkan ekstrak hasil penyarian menggunakan etil
asetat dari kapang endofit ENLT 74.3d.2 dengan LC50 sebesar 30,21 g/L.
Kapang endofit ENLT 74.3d.2 diidentifikasi secara morfologi dibawah
mikroskop. Ciri-ciri morfologi kapang ENLT 74.3d.2 paling sesuai dengan
deskripsi morfologi kapang Curvularia lunata. Kapang aktif C. lunata disimpan
dalam koleksi kultur dan mendapatkan kode BioMCC FE-00283.