Isolasi Dna

7/17/2019 Isolasi Dna

http://slidepdf.com/reader/full/isolasi-dna-568d5929039c6 1/6

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti

amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk

memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi

DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis, ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa

dan protein, serta pemurnian DNA (!orkill dan "apley, #$$%& Dolphin, #$$%. Menurut 'urycki (#$$$,

ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA

tanpa adanya kontaminan seperti protein dan "NA& metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk

semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA& dan

metodenya harus sederhana dan cepat.

Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama

namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. )ahkan beberapa teknik menjadi

lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang

digunakan untuk isolasi DNA pada tumbuhan seperti *it Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA

pada he+an digunakan ene-//M enomic DNA Purification *it. Namun tahapan0tahapan isolasi DNA

dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan

teknik isolasi DNA dengan kit dan manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode kon1ensional

memiliki kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya

membutuhkan +aktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis sampel.

/ahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding

sel. Pemecahan sel (lisis merupakan tahapan dari a+al isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan

isi sel (2olme dan 2ael, 344%. /ahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni

dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair

atau dengan menggunakan metode freeing0tha+ing dan iradiasi (iacomai et al., #$$5. !ara lain

yakni dengan menggunakan kimia+i maupun enimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimia+i

seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi

membran sel ('urycki, #$$$. 'ementara cara enimatik seperti menggunakan proteinase * seperti

untuk melisiskan membran pada sel darah (*hosra1inia et al., #$$6 serta mendegradasi protein globular

maupun rantai polipeptida dalam komponen sel ()ro+n, #$3$& 'urycki (#$$$.

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium dodecyl sulphate ('D'

sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi akti1itas enim nuklease yang merupakan enim pendegradasi

DNA ('+iter, 3444. 'elain digunakan 'D', detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide

(!/A) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA tumbuhan ()ettelheim dan

7andesberg, #$$6. Parameter keberhasilan dalam penggunaan !/A) bergantung pada beberapa hal.

Pertama, *onsentrasi Na!l harus di atas 3.$ M untuk mencegah terbentuknya kompleks !/A)0DNA.

*arena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan !/A) sebagai pemecah larutan

harus dengan Na!l dengan konsentrasi minimal 3.8 M. *edua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung

!/A) harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks !/A)0DNA bersifatinsolublepada suhu di ba+ah

359!. *etiga, penggunaan !/A) dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang

didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. 'etelah ditambahkan !/A), sampel



diinkubasikan pada suhu kamar. /ujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah pengendapan !/A) karena

!/A) akan mengendap pada suhu 359!. *arena efekti1itasnya dalam menghilangkan polisakarida, !/A)

banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat

pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan "hiobium

('urycki, #$$$.

Dalam penggunaan buffer !/A) seringkali ditambahkan reagen0reagen lain seperti Na!l, D/A, /ris02!l,

dan #0mercaptoethanol. Na!l berfungsi untuk menghilangkan polisakarida sementara #0mercaptoethanol

befungsi untuk menghilangkan kandungan senya+a polifenol dalam sel tumbuhan ("anjan et al., #$3$. #0

mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara membentuk ikatan

hidrogen dengan senya+a polifenol yang kemudian akan terpisah dengan DNA (7odhi et al., 3448.

'enya+a polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., #$$%. Polifenol

juga dapat menghambat reaksi dari enim /a: polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu

polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al.,

3446. Penggunaan #0mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang

mengkontaminasi DNA (;alker dan "apley, #$$%.

*onsentrasi dan p2 dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang p2 5 sampai 3#. 7arutan

buffer dengan p2 rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase

fenol selama proses deproteinisasi. 'edangkan p2 larutan yang tinggi di atas 3# akan mengakibatkan

pemisahan untai ganda DNA. <ungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses

penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan "NA serta

mencegah akti1itas enim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. =ntuk

mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, p2, kekuatan ion, dan penambahan

inhibitor DNAase dan detergen ('urycki #$$$.

Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic

acid (D/A yang berperan menginakti1asi enim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi,

D/A menginakti1asi enim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan

sebagai kofaktor enim DNAse (!orkill dan "apley, #$$%. DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel

selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan

protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. <enol seringkali digunakan sebagai

pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangankelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi

(*arp, #$$%. )ettelheim dan 7andesberg (#$$6 menyebutkan bah+a setelah sentrifugasi akan terbentuk

# fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan ba+ah dan fase a:uoeus (air pada lapisan atas

sedangkan DNA dan "NA akan berada pada fase a:uoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang

terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organik (ambar 3. 'elain

fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil

alkohol untuk mendenaturasi protein. kstrak DNA yang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh "NA

sehingga "NA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian "NAse ()irren, et al., 3446&

!lark, #$3$.



ambar 3. Asam nukleat berada pada lapisan air setelah disentrifugasi

pada tahapan ekstraksi (!lark, #$3$. klik gambar untuk memperbesar.

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein juga

mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. )erdasarkan sifat

ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. )iasanya pelarutorganik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 8> isoamil alkohol. Penggunaan

kloroform isoamil alkohol (!IA berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. *loroform tidak dapat

bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai

polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform ? air.

*onsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami

presipitasi. 'edangkan lipid dan senya+a organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (!lark, #$3$.

Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform0air. Proses ini dapat

dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. 2al ini hanya dapat dilakukan dengan

penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamilalkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan

emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform0air yang mana protein akan mengalami presipitasi.

Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni,

namun dengan ukuran yang terbatas (#$.$$$?5$.$$$ bp. <ungsi lain dari penambahan !IA ini adalah

untuk menghilangkan kompleks !/A) dan meninggalkan DNA pada fase a:uoeus. DNA kemudian diikat

dari fasea:uoeus dengan presipitasi etanol ('urycki, #$$$.

'etelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi.Pada umumnya

digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan presipitasi. *edua senya+a tersebut akan

mempresipitasi DNA pada fase a:uoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan

terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi ('+iter, 3444.2oelel (344# juga menambahkan bah+a

presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu0residu kloroform yang berasal dari tahapan

ekstraksi.

Menurut 'urycki (#$$$, prinsip0prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan kelarutan asam

nukleat dalam air. 2al ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan a:uoeus.

Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi

ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar

dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat

sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat& kedua, penambahan isopropanol



akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi& ketiga,

penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan akti1itas molekul air sehingga memudahkan presipitasi

DNA.

Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu0residu "NA dan protein

yang masih tersisa. "esidu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan

berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet

dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.Proses

presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan

derajat kemurnian DNA yang diisolasi ()ettelheim dan 7andesberg, #$$6. *eller dan Mark (34%4

menerangkan bah+a pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan

etanol bertujuan untuk menghilangkan residu0residu garam yang masih tersisa. aram0garam yang

terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi

bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan

isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., #$$@.

'etelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian

dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari

pelet DNA. Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara e1aporasi karena etanol mudah menguap

('urycki, #$$$. Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang

bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti dN/P dan oligosakarida

yang terikat pada asam nukleat ('ambrook et al., #$$3.

'etelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer / ke dalam tabung

yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freeer dengan suhu sekitar 0#$!. Berkuil et al. (#$$%

menyatakan bah+a buffer / dan penyimpanan suhu pada 0#$! bertujuan agar sampel DNA yang telah

diekstraksi dapat disimpan hingga +aktu berminggu0minggu. *eller dan Mark (34%4 juga menjelaskan

bah+a pelarutan kembali dengan buffer / juga dapat memisahkan antara "NA yang mempunyai berat

molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh "NA

dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu 0#$!.



ambar #. Proses pufrifikasi DNA dengan menggunakan metode silika dan kolom kromatografi (a proses

pengikatan DNA ke silika dengan bantuan perubahan konsentrasi garam, (b DNA dielusi untuk

memperoleh DNA ()ro+n, #$3$. *lik gambar untuk memperbesar.

Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah diproduksi oleh beberapa

perusahan untuk mempermudah dan mempercepat proses isolasi DNA. *it isolasi juga disesuaikan

dengan kebutuhan oleh konsumen dan jenis sel yang akan digunakan. )erikut adalah bagan contoh

isolasi DNA tanaman dengan menggunakan *it Nucleon Phytopure yang disajikan pada ambar @.



ambar @. )agan isolasi DNA dengan menggunakan kit phytopure.*lik gambar untuk memperbesar.

Documents

Isolasi Dna