ISOLASI DNA DARAH

3 mL darah dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 12 mL. Sembilan mL larutan pelisis sel darah merah ditambahkan ke dalam tabung sentrifugasi tersebut. Tabung sentrifugasi diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Tabung sentrifugasi dibolak-balik sebanyak 3--4 kali selama selang waktu tersebut.

Campuran darah dan larutan pelisis disentrifugasi dengan kecepatan 2.500 rpm selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan dari hasil sentrifugasi dibuang. Empat setengah mL larutan pelisis sel darah merah ditambahkan pada endapan yang tersisa di tabung dan tabung dibolak-balik agar larutan pelisis dan endapan tercampur dengan baik.

Tabung disentrifugasi dengan kecepatan 2.500 rpm selama 10 menit pada suhu ruang, tabung inkubator disiapkan dengan suhu 37 C. Supernatan dibuang sehingga endapan yang tertinggal adalah sel darah putih. Endapan tersebut kemudian divorteks. Satu mL larutan pelisis sel darah putih ditambahkan ke pelet SDP (endapan) dengan menggunakan pipet panjang. Pengadukan dilakukan dengan cepat dengan cara mengeluarkan dan menarik campuran menggunakan pipet panjang (pemipetan dilakukan dengan cepat agar tidak terjadi penggumpalan). Satu setengah μL RNAse A (10 mg/mL) ditambahkan, diaduk dengan cara membolak-balik tabung beberapa kali, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit agar RNA terdegradasi. Lima ratus μL larutan presipitasi protein ditambahkan kemudian tabung divorteks hingga campuran teraduk rata.

Tabung disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit. Empat mL akohol absolut/isopropanol disiapkan pada tabung sentrifugasi bersih. Supernatan hasil dituangkan ke dalam tabung berisi alkohol/isopropanol. Tabung diinvert hingga terbentuk untaian DNA. Tabung kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan tabung dibalik pada selembar tisu. Setengah mL larutan Tris. EDTA ditambahkan ke dalam tabung. Tabung tersebut kemudian disimpan pada suhu 4 C.

asi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Prinsip presipitasi adalah pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang terdapat dalam sel (Kimball 2005: 4; Kent & Carr 2001: 317).

Sentrifugasi merupakan salah satu metode dasar yang Sangat penting dalam studi biologi sel maupun molekular. Sentrifugasi tidak hanya berguna untuk memisahkan sel atau organel subselular, melainkan juga digunakan untuk pemisahan molekular. Teknik sentrifugasi pada pengisolasian DNA berfungsi untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam sel berdasarkan berat molekulnya. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan mengunakan alat yang berupa rotor yang digerakan oleh motor elektrik yang merupakan tempat berpegangnya tabung yang akan disentrifugasi. Pergerakan mesin sentrifugasi berhubungan dengan massa, kerapatan dan usuran dari molekuk yang disentrifugasi, serta massa , kerapatan dan viskositas dari lingkungan larutan (Triwibowo 2005: 33; Wo

Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel. DNA dapat berasal dari hewan, tumbuhan, dan manusia. Pengisolasian DNA manusia dilakukan dengan menggunakan darah. Darah digunakan karena lebih mudah diekstraksi, prosedurnya lebih murah, dan hasil yang didapat lebih banyak. Sel darah yang digunakan untuk isolasi DNA adalah sel darah putih. Hal tersebut disebabkan karena sel darah putih memiliki inti sel. DNA pada manusia terdapat pada inti sel (Fairbank & Andersen 1999: 549).

Pengisolasian DNA dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pengisolasian jaringan. Pengisolasian jaringan darah dilakukan dengan memasukan 3 mL darah ke dalam tabung sentrifugasi (Boyer 1993: 454).

Tahap selanjutnya adalah Ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA dilakukan dengan cara melisiskan sel dan memurnikan DNA dari zat-zat pengotor yang berasal dari sel. Zat-zat yang menjadi pengotor pada umumnya adalah protein, plosakarida pada tumbuhan, senyawa-senyawa (Invitrogen 2003:2).

Ekstraksi DNA darah dilakukan dengan menambahkan larutan pelisis sel darah merah dan diinvert. Larutan tersebut berfungsi untuk menghancurkan sel-sel darah merah. Invert adalah pengocokan pada tabung dengan pola angka delapan dengan tujuan agar larutan terdistribusi merata dan mempercepat tumbukan antar sel darah sehingga cepat lisis (Boyer 1993: 454). Komposisi dari larutan pelisis sel darah merah adalah EDTA, NH4Cl, KHCO3, dan KOH. EDTA berfungsi untuk mencegah terjadinya kerusakan pada DNA karena di dalam sel dan lingkungan sekitar sel terdapat banyak enzim yang dapat merusak DNA . Penambahan larutan EDTA juga dilakukan pada ekstraksi DNA khamir (Boyer 1993: 455). Ekstraksi DNA tumbuhan dilakukan dengan menambah larutan buffer ekstraksi sebanyak 5 mL yang telah dipanaskan. Penambahan larutan buffer bertujuan untuk melisiskan dinding sel pada tanaman (Invitrogen 2003: 3). Tabung selanjutnya diinkubasi selama 10 menit. Inkubasi bertujuan menjaga suhu tetap optimal (Cell Biology Research 2004: 1).

Tabung yang telah diinkubasi selanjutnya disentrifugasi. Prinsip kerja sentrifugasi berhubungan dengan massa, kerapatan, dan bagian struktur atau molekul yang disentrifugasi serta berhubungan dengan massa, kerapatan dan kekentalan larutan. Berdasar berat molekulnya, maka akan dihasilkan dua bagian yang mudah untuk dipisahkan. Dua bagian tersebut terdiri dari supernatan dan pelet. Supernatan adalah bagian yang berat molekulnya ringan dan terdapat pada bagian atas tabung sedangkan pelet adalah bagian yang berat molekulnya lebih berat dan terdapat pada bagian dasar tabung. Sebelum disentrifugasi, tabung ditutup terlebih dahulu menggunakan parafilm. Hal tersebut dilakukan untuk mencegah tumpahnya isi tabung saat disentrifugasi (Boyer 1993 191--196).

Supernatan yang dihasilkan pada proses sentrifugasi darah adalah sel darah merah yang telah lisis. Pelet yang dihasilkan dari proses sentrifugasi darah adalah sel darah putih yang mengendap. Supernatan yang dihasilkan pada proses sentrifugasi DNA tumbuhan adalah dinding sel yang lisis. Pelet yang dihasilkan adalah inti sel yang mengandung DNA.

Tabung yang telah disentrifugasi pada isolasi DNA darah, supernatannya dibuang kemudian peletnya divorteks. Vorteks adalah proses membolak-balikan tabung. Fungsi dari vorteks adalah menghomogensikan larutan agar sel darah putih tidak menggumpal pada dasar tabung (Boyer 1993: 456). Tahap selanjutnya, pada pelet ditambahkan larutan pelisis sel darah putih dan campuran

dikeluarkan dengan menggunakan pipet. Tujuan dari penambahan larutan pelisis sel darah putih adalah melisiskan membran sel darah putih sehingga pori-pori sel akan membesar menyebabkan sel darah putih pecah dan DNA akan keluar. Komposisi dari larutan pelisis sel darah putih adalah Tris-HCl, SDS, EDTA. Tris-HCl berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfit dari protein sehingga protein akan terpisah dari sel darah putih. SDS berfungsi untuk melarutkan protein pada membran sel darah putih dan larutan EDTA berfungsi melindungi DNA dari aktivitas DNAse sehingga DNA tidak rusak (Sinex 2004: 2). Pemipetan dalam mengeluarkan perlu dilakukan dengan cepat agar tidak terjadi penggumpalan (Purves & Rybicki 2003: 2).

Tahapan selanjutnya setelah sentrifugasi pada isolasi DNA adalah purifikasi atau pemurnian. Tahapan tersebut pada isolasi DNA darah bertujuan membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya. Tabung yang diberi larutan pelisis sel darah putih dan dikeluarkan campurannya didiberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Tahapan purifikasi pada isolasi DNA tanaman dilakukan dengan pemberian etanol absolut dingin dan RNAse. Fungsi pemberian etanol absolut dingin adalah agar DNA terpisah dari zat lainnya dan tidak menghancurkan DNA (Harley 2005: 409—410). RNAse berfungsi untuk mendegradasi RNA, sehingga hanya DNA yang terlihat (Boyer 1993: 455).

Tahap selanjutnya pada isolasi DNA darah yaitu tahap presipitasi yang dilakukan dengan cara meneteskan 50 larutan presipitasi protein dan kemudian divorteks. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung diinvert. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah terakhir adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley 2005: 409--410).