E N Z İ M L E RE N Z İ M L E R

Prof.Dr.Emel ULAKOĞLU ZENGİN Prof.Dr.Emel ULAKOĞLU ZENGİN Prof.Dr.M.Koray GÜMÜŞTAŞProf.Dr.M.Koray GÜMÜŞTAŞ

İ.Ü.Cerrahpaşa Tıp Fakültesi İ.Ü.Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim DalıBiyokimya Anabilim Dalı

I.TANIM

Enzimler, metabolizma reaksiyonlarını hızlandıran,

biyolojik katalizörlerdir. Protein yapısında maddelerdir. Hücrenin gereksinimine uygun kataliz yaparlar. Hücre içindeki yerleşimleri metabolik olayların özelliğine

göre düzenlenmiştir.

II.ENZİMLERİN TIPTA KULLANIMI

1.Enzim aktivitelerinin ölçümü hastalıkların tanı ve izlenmesinde

kullanılır. Örn:Miyokard İnfarktüsünde: CPK (Kreatin fosfokinaz) SGOT (AST) (Serum glutamat oksaloasetat transaminaz) LDH (Laktat dehidrogenaz)

2.Kalıtsal metabolik hastalıklar bazı enzimlerin incelenmesiyle

ortaya çıkar. Örn:Galaktozemide: Galaktoz-1-fosfat uridil transferaz

3.Tedavi amacıyla bazı enzim preparatlarından yararlanılabilinir. Örn: Streptokinaz,Ürokinaz

III.ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİIII.ENZİMLERİN İSİMLENDİRİLMESİ

Etkiledikleri maddelerin (substratlarının) sonuna -az- takısı eklenerek isimlendirilir. Madde Hidroliz Enzimi Nişasta(Amilon) Amilaz Yağ (Lipos) Lipaz Protein Proteaz Üre Üreaz

Bu kurala uymayanlar: Pepsin, tripsin, pityalin

Katalizledikleri reaksiyon tipine göre: Oksidaz, dekarboksilaz

Günümüzde bu tür karışıklıkları önlemek amacıyla Uluslararası Biyokimya

Birliğinin (IUB) Enzim Komisyonu tarafından Sistematik isimlendirme

önerilmiştir. Bu sistemde her enzim, katalizlediği reaksiyon tipine ve

mekanizmasına göre isimlendirilmektedir.

Günlük kullanımda önerilen kısa isme ilaveten daha detaylı sistematik

ismin kullanılması öngörülmüştür.

SİSTEMATİK İSİMLENDİRMENİN TEMEL ÖZELLİKLERİ

1. Reaksiyonlar ve bu reaksiyonları katalizleyen enzimler, reaksiyon

mekanizmalarına göre 6 sınıfa bölünürler. Bu sınıflarında alt sınıfları

vardır.

2. Her enzimin bir kod numarası vardır (EC). Bu kod, dörtlü sayı grubu

ile gösterilir.

Sistematik İsimlendirme:

ATP + D-Glukoz ADP + D-Glukoz-6-Fosfat

Önerilen kısa isim: Hekzokinaz

Enzim kodu : EC (2.7.1.1)

Sistematik isim : ATP: glukoz fosfotransferaz

EC (2.7.1.1):

İlk sayı: Reaksiyon tipini açıklar (Major sınıf)

Transferaz sınıfı

İkinci sayı: Alt sınıf

Fosfotransferaz

Üçüncü sayı:Alt alt sınıf

Hidroksil grubunun alıcı olduğu fosfotransferaz

Dördüncü sayı:Enzim için spesifiktir. Fosfat grubunun D-glukoza

aktarıldığını açıklar. Enzimin listeye girdiği seri numarasıdır.

Hekzokinaz

IV.ENZİMLERİN ÖZELLİKLERİIV.ENZİMLERİN ÖZELLİKLERİ

1. Enzimler protein yapısında maddelerdir:• Protein yapısına istisna olarak bazı RNA tipleri gösterilebilir. • Bunlar, fosfodiester bağlarının yıkımı ve sentezi esnasında enzim gibi davranabilirler.

Katalitik etkiye sahip RNA’ya Ribozim denir.

2.Enzimler özgül moleküllerdir.Enzimler yalnız belirli reaksiyonları katalizledikleri ve ortamdaki moleküllerden sadece substratları ile etkileştiklerinden dolayı spesifik (özgül) moleküllerdir.

3.Enzimler katalitik etkinliğe sahiptir.Enzimle katalizlenen reaksiyonların çoğu katalizlenmeyen reaksiyonlara göre 103 –108 kere daha hızlı olarak gerçekleşmektedir.Bir enzim molekülü saniyede ortalama 100-1000 substrat molekülünün ürüne dönüşümünü sağlamaktadır.4. Enzimler görev yerlerine göre kompartmanlanmıştır. Her enzim farklı orgenelde görev alabilir.

Enzimin dönüşüm sayısı (Turnover sayısı):

Enzim molekülü tarafından bir saniyede ürüne çevrilen substrat

molekülü sayısıdır.

CO2 + H2O H2CO3

Karbonik anhidraz, 1 saniyede 105 molekül CO2’e, H2O’yu bağlayarak

karbonik asid oluşturur.

4. Substrat-ürün dönüşümleri çift yönlü olabilmektedir.

C

Karbonik anhidraz

C

OH

OHH

CH2OPO3-2

Gliseraldehid-3-fosfat (G3P)

Trioz fosfat izomeraz CH2OH

C

CH2OPO3-2

Dihidroksi aseton fosfat (DHAP)

O

Bu iki madde arasındaki izomerizasyon glikoliz yolunda rastlanır.

Enzim iki yöne doğru reaksiyon hızını arttırmaktadır.

5.Enzim moleküllerinde aktif bölge ismi verilen özel bir boşluk ya da

cep kısmı bulunur. Aktif bölgedeki aminoasidlerin yan zincirleri, substratın yapısına

uyumlu, üç boyutlu bir yapı oluşturmaktadır.

Aktif bölge

Enzim Substrat Enzim-Substrat kompleksi

Aktif bölgenin substratı bağlamasıyla oluşan enzim-substrat kompleksi (ES), önce enzim-ürün kompleksine, daha sonra ise serbest enzim ve ürüne dönüşmektedir.

E + S ES EÜ E + Ü

Enzim ile substrat biribirlerine hidrojen, elektrostatik ve Van der Waals bağları gibi non kovalent (zayıf) bağlarla bağlanır.

Zayıf bağlar ve bazı kuvvetli bağlar, aktif bölgelerin aminoasidlerini biribirlerine yanaştırmada önemli rol oynarlar.

Birçok enzimin katalitik bölgesinde aşağıdaki aminoasidler yer alır:

Serin, sistein, histidin, tirozin ve lizin

HisHis119

12

Katalitik bölge

S

S

S

S

S

S

S

S

Bağlanma bölgesi

RİBONÜKLEAZ

Aktif Bölge

Bağlanma bölgesi

Katalitik bölge

Başlıca denatürasyona yol açan faktörler: Isı Işınlar (X ışınları, UV ışınları, vs) Çalkalama Dondurup eritme Derişik asid ve baz Alkol, eter, benzen, vs gibi organik çözücüler Üre, guanidin çözeltileri

Enzimler kolaylıkla denatürasyona uğrarlar:

Denatürasyon, proteinlerin doğal yapılarının bozulması sonucunda aktivitelerinin kaybolmasıdır. Enzim denatüre olduğunda aktif bölgesi de denatürasyona uğrayarak substratını bağlayamaz, bundan dolayı da etkili olamaz.

RİBONÜKLEAZ: Bu enzim RNA molekülündeki nukleotidleri hidroliz yapar. Yapısı 4 disülfür bağı ile sağlamlaşmıştır. Katalitik bölgede 2 histidin kalıntısı yer alır.

Histidin 12 ve Histidin 119 His 12, ribozun hidroksil grubu üzerine etki eder. His 119, ise fosforil kısmına etkilidir. Böylece molekülün 2 kısmından kırılma gerçekleşir. Molekülün taranmış kısmı ise 5 aminoasidin yer aldığı bazik bir

bölgedir. Bu bölge RNA‘yı bağlar.

Enzimlerin substrat bağlama yeri olan aktif bölgedeki aminoasidler, substratın ürüne dönüşmesini sağlayan pek çok kimyasal mekanizmayı kullanır.

Bu aminoasidlerden bazıları substratın aktif merkeze bağlanmasını, bazıları ise kataliz olayını sağlamaktadır.

Aktif merkezde yer alan iki bölgeden birincisi bağlanma bölgesi, diğeri ise katalitik bölgeyi oluşturur.

Enzim ile substrat bağlanmasında iki model ileri Enzim ile substrat bağlanmasında iki model ileri sürülmektedir.sürülmektedir.

1.Model: Anahtar-kilit modeli

2.Model: Katalitik bölgenin “uyum oluşturma modeli”

1.MODEL:Kilit anahtara olan benzerliğe dayanılmıştır.Bu modelde enzimin aktif merkezindeki bir bölge ile substrat

yapılarının biribirini tamamlayıcı olmaları gerekmektedir.

+

a b c

Enzim

Substrata

b c

ES kompleksi

Kilit-anahtar modeli

a b c

2. MODEL: Katalitik bölgenin “Uyum-oluşturma” modelidir. Başlangıçta enzim ve substrat biribirlerine uygun değildirler. Ancak substrat enzimin aktif bölgesine yaklaştıkça, enzim buna

uymaktadır. Substrat, enzimde biçimsel değişiklik meydana getirir.

Substrat

Enzim

a b c

a

bc

a b c

ES kompleksi

+

6.Bazı enzimler, enzimatik reaksiyon için gerekli olan bir non-protein kofaktör ile birleşirler. Sıklıkla karşılaşılan kofaktörler arasında metal iyonları (Zn2+,Fe2+,Cu2+, Mn+2 …vs) ve koenzim olarak adlandırılan bir organik molekül, genellikle vitamin türevleri (NAD+, FAD,CoA..gibi) yer alır.

Koenzimlerin pek çoğu genellikle B grubu vitaminlerden türevlenmektedir.

Kofaktörle birleşik durumda olan ve katalitik aktivite gösteren enzim holoenzim olarak bilinmektedir.

Holoenzimin protein kısmına apoenzim adı verilir.

Apoenzim kofaktörün yokluğunda biyolojik aktivite gösteremez.

Protein kısmına sıkıca bağlı olan koenzime prostetik grup denir.

Kofaktörü metal iyonu olan bazı metalloenzimler:

Kofaktör Enzim

Fe2+ Katalaz, peroksidaz

Cu2+ Sitokrom oksidaz, tirozinaz

Mg2+ Fosfohidrolaz, fosfotransferaz

Mn2+ Arginaz

Zn2+ Alkol dehidrogenaz

Mo2+ Ksantin oksidaz

Metal iyonları substrat bağlanmasını ve katalizi kolaylaştırır. Aşağıdaki 4 form da, metal iyonları ile katalizlenen enzimatik

reaksiyonlar için geçerlidir.

Enz S M M Enz S

Enz M S Enz

Substrat-köprü kompleksi

Enzim-köprü kompleksi

Metal-köprü kompleksi

M

SSiklik metal-köprü kompleksi

KOENZİMİ VİTAMİN OLAN BAZI ENZİMLER:

Enzim Vitamin Koenzim Katalizlenen reaksiyon

Dekarboksilaz B1 vitamini TPP (Tiamin pirofosfat) ………………...R-CO-COOH

(Tiamin) RCHO + CO 2

(Dekarboksilasyon)

Dehidrogenaz B2 vitamini FMN(Flavin mononukleotid ve…………..Hidrojen (Riboflavin) FAD Flavin adenin dinükleotid) transferi

Transaminaz B6 vitamini Pridoksal fosfat ……………….Amino asidlerden aldığı

(Pridoksal) -NH2 grubunu α-keto asidlere transfer eder.

Karboksilaz Biotin Biotin …………………………α-keto asidlere CO2 ‘i bağlar(Karboksilasyon)

Transformilaz Folik asid THF…………………………… -CHO, -CH2 OH, -CH3

(Tetrahidrofolat) gruplarının transferi

Transmetilaz B12 vitamini Kobamid…………………………-CH3 grubu transferiİzomeraz koenzim

7. Enzimler hücrenin metabolik gereksinimlerine uygun şekilde aktive

veya inhibe edilerek ürün oluşum hızı kontrol edilebilir.

Bu olaya enzim aktivitesinin düzenlenmesi denir.

8. Enzimler enerji türlerini biribirine dönüştürürler. Mitokondrideki küçük moleküller içinde bulunan serbest enerji, ATP

enerjisi şekline dönüşür. Kasta ise ATP enerjisi, kasılma esnasında mekanik enerjiye dönüşür.

9. Enzimler tranzisyon (geçiş) durumunu stabilize ederek reaksiyonları

hızlandırırlar. Moleküllerin reaksiyona girebilmeleri için enerji tüketilmektedir. Substrat ürüne dönüşürken tranzisyon (geçiş) durumundan geçer.

S T* Ü

Tranzisyon durumu, S ve Ü’nün serbest enerjisinden çok daha yüksek

enerjiye sahiptir.

Reaksiyon tranzisyon durumundan itibaren başlar.

Enerji düzeyinin tepe noktasında bulunan yüksek enerjili geçiş ürünleri

daha sonra son ürüne dönüşmektedir.

Enzimlerin yokluğunda, tranzisyon durumuna ulaşabilen çok az sayıda

molekül, ürüne dönüşebilmektedir.

Reaksiyon hızı ise, bu yüksek enerjiye sahip moleküllerin sayısı

tarafından belirlenmektedir.

Ea = Aktivasyon enerjisi

Ea1 = Enzimle katalizlenmemiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi

Ea2 = Enzimle katalizlenmiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi

Ea1

Ea2

Ü

SBaşlangıçdurumu

Bitiş durumu(ürünler)

Ea

∆GOrtama salınan serbest enerji

T*

Ser

bes

t en

erji

Reaksiyon akış yönü

Bir kimyasal reaksiyon ortama enerji salıyor ise, tranzisyon

durumuna geçebilmesi için, önce aktivasyon enerjisinden enerji borç

alır, sonra bu enerjiyi sarfeder. Sarfedilen enerjiden geri kalanı ise ortama serbest enerji şeklinde

salınır.

Ea= Tranzisyon durumu serbest enerjisi – substrat serbest enerjisi

Aktivasyon enerjisi düşük olan reaksiyonların hızı yüksek olmaktadır.

“ Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda, enzimler aktivasyon enerjisini

azaltarak reaksiyonları hızlandırırlar. Böylece enzim ve substratı,

tranzisyon enerjisi daha düşük olan yeni bir reaksiyon yolu oluşturur.”

Spontan reaksiyon Kimyasal katalizör varlığındaki reaksiyon Spesifik enzim

Tranzisyon durumu

Başlangıç durumu

Bitiş durumu

∆G

kalo

ri

Ea

V.ENZİMLERİN KATALİZ HIZINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER

Kataliz Hızı, birim zamanda oluşan ürün ya da kaybolan substratmiktarıdır.

Enzimle katalizlenen reaksiyonların hızını etkileyen faktörler:

1.Enzim Konsantrasyonu

2.Substrat Konsantrasyonu

3.Sıcaklık

4.pH

1.ENZİM KONSANTRASYONU

Enzimle katalizlenen reaksiyonlarda substrat konsantrasyonu yüksek

miktarlarda ise, reaksiyonun başlangıç hızı (Vİ),enzim konsantrasyonu ile

doğru orantılı olarak artmaktadır.

Rea

ksiy

on h

ızı

Vİ

Enzim konsantrasyonu

2.SUBSTRAT KONSANTRASYONUEnzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızı (V), ortamda enzim konsantrasyonunun sabit olması koşuluyla, substrat konsantrasyonu

ile [S] birlikte hızla artar ve maksimal hız (Vmax) değerine varıncaya kadar artış devam eder. Ancak Vmax’ta substrat konsantrasyonu ne kadar artarsa artsın, kataliz hızı artmaz.

Yüksek substrat konsantrasyonlarında reaksiyon hızının yavaşlaması, enzim üzerindeki substrat bağlama bölgelerinin doygunluğa ulaşmasını

göstermektedir.

VMAX

[S]VO

V

Enzimlerin çoğu Michaelis-Menten Kinetiği gösterirler.

Belli sıcaklıkta ve sabit enzim konsantrasyonunda, bu kinetiğe uyan

enzimler, değişen substrat konsantrasyonu ile başlangıç hızı (VO) arasında hiperbolik bir eğri çizerler (A).

Buna karşılık allosterik enzimlerde, bu eğri sigmoidal özellik taşımaktadır (B).

A

B

VMAX

VO [S]

3.SICAKLIKKimyasal reaksiyonlarda ısının artması moleküllerin hareketini arttırarak reaksiyon hızının da artmasına yol açar.Reaksiyon hızının sıcaklık ile artışı, belli bir enerji düzeyini aşabilecek

molekül sayısı ile ilgilidir.Bu durum, enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar için de geçerlidir.

“Enzimle katalizlenen bir reaksiyonda sıcaklığın yükselmesi reaksiyon hızını arttırmaktadır.”

Ancak enzimler protein yapısında maddeler olduklarından, belirli bir ısı derecesinden itibaren (genelde 45ºC) enzimin denatürasyonu söz konusu olacağından, reaksiyon hızında da bir azalma meydana gelecektir.

Optimum Temperatür:Optimum Temperatür:

Enzimin en iyi etkilediği ısı derecesidir. Bu ısı derecesi, reaksiyon hızını maksimal arttırırken, daha

ilerisinde enzimin denatürasyonuna yol açar.

“Enzim etkinliği düşük ısıda az, tepe noktasında en fazla, sıcaklık

arttığında ise hızla düşer.”

Genellikle, başlangıçta sıcaklığın her 10 ºC artışı, reaksiyon hızının iki

katına çıkmasını sağlamaktadır.

reak

siyo

n h

ızı (

v)

O O

50

100

den

atü

re o

lmam

ışp

rote

in y

üzd

esi

20 30 40 50 60

sıcaklık (ºC)

Enzim aktivitesinde,optimum temperatür 2 faktörle belirlenmektedir (Kırmızı eğri).

Reaksiyon hızı, gerek spontan gerekse katalizör varlığında,

sürekli olarak artar (mavi eğri).

Belirli bir ısı derecesinden sonra, enzim proteini denatüre olur

(siyah eğri).

Termik İnaktivasyon:

Enzim çözeltisi hazırlandıktan sonra enzim aktivitesi ölçülür (Eo). Daha

sonra çözelti termostata konarak her 2-3 dakikada bir ısı derecesi arttırılır

ve çözeltiden bir kısım alınarak aktivite ölçülür (E). Isıtma süresi arttıkça

aktivitede giderek azalma gözlenir. İnaktivasyon, zamanın logaritmik

fonksiyonudur.

30ºC

45ºC

55ºC

60ºC

zaman(dak)

EEo

Log

4.pHEnzimatik reaksiyonlar ortamın H+ iyonu konsantrasyonundan

kolaylıkla etkilenirler.

Enzim etkinliğinin en yüksek olduğu pH , optimum pH’dır. Her enzimin etki ettiği pH farklıdır.

enzi

mat

ik a

kti

vite

pH

a

b

4 5 6 7 8 9 10

Enzimler pH değişikliklerine bağlı olarak başlıca 2 tip aktivite eğrisi

gösterirler:

a) Dar sınırlar içinde etkiyi gösteren çan eğri

b) Geniş sınırlar içinde etkiyi gösteren plato eğri

Çoğunlukla enzimlerin optimum pH’ı 5-8 arasında değişmektedir.

Maksimum aktiviteyi

pH= 2’de gösterir. Nötral

pH’da çalışan enzimler

asidik ortamda denatüre

olurlar.

En

zim

atik

ak

tivi

te

pH

Optimum etki

4 6 8 10 12 TRİPSİN

Alkali ortamda en iyi etkiyi gösterir.

Optimum etki

pH

PEPSİN

2 3 4 5 6 7

pH değişikliklerinin enzimatik aktivite üzerindeki etkileri aşağıdaki

faktörler tarafından belirlenmektedir.

1. Ortamın çok yüksek ve çok düşük pH düzeyleri, enzimin denatürasyonuna

yol açarak, yapısında geri dönüşümsüz değişiklikler yapar.

2. Apoenzim ile koenzim arasındaki bağlar etkilenir.

3. Bir protein olan enzimin yapısındaki amino ve karboksil gruplarının

iyonizasyon durumu, ortamın pH değerine bağlı olarak değişir.

Aktif bölgedeki iyonizasyon değişikleri, enzim-substrat reaksiyonunu ve

buna bağlı olarak katalizi bozar.

Örnek:Katalitik aktivite için ortamdan H+ iyonu kazanılması gerekiyor ise, moleküldeki amino gruplarının protonlaşması gibi:

- NH2 -NH3+

Alkali pH ‘da proton kaybı olacağından, verilen örnekte enzimatikaktivite hızı düşer.

4. Büyük çoğunlukla pH değişikliklerinden substratın da iyonizasyon durumu etkilenir.

H+

VI.ENZİM KİNETİĞİ

Reaksiyon Hızı (v):Enzim etkisiyle birim zamanda kaybolan substrat miktarı veya oluşan ürün miktarı ile ölçülür.

Enzim Moleküler Aktivitesi: Optimum reaksiyon şartlarında, 1 molekül enzim tarafından 1 dakikada ürüne dönüşen substrat miktarıdır.

Spesifik Enzim Aktivitesi:mg protein başına düşen enzim ünite sayısıdır.

Enzim Ünitesi: Optimal şartlarda, 1 dakikada 1 mikromol (μmol) substratı ürüne dönüştüren enzim miktarıdır.

Enzimlerin katalizledikleri reaksiyonlarda genel kimyasal reaksiyon

kinetikleri geçerlidir.

Michaelis ve Menten isimli araştırmacılar, enzimlerle gerçekleşen reaksiyonlar için basit bir tanımlama yapmışlardır.

Enzim kinetiklerinin kantitatif analizleri için geliştirilen bu model, tek

substratlı reaksiyonlar için geçerlidir.

E + S ES E + Ü

k1, k2 ve k3 : reaksiyonların hız sabitleri

k1

k2

k3

Tersinir olarak sabit bir hızla (k1) substratla [S] birleşen enzim [E], önce enzim-substrat [ES] kompleksini oluşturur. [ES] kompleksi daha sonra başlıca 2 akıbete uğrayabilir:

1. Sabit bir hızla (k2) yeniden E ve S’a dönüşür.

2. Yahut k3 sabit hızıyla ürün [Ü] oluşurken enzim de serbestleşerek ilk yapısını kazanır.

ES oluşum hızı = k1[E] [S]

ES yıkılım hızı = (k2 +k3) [ES]

Reaksiyon hızı ile substrat konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayanMichaelis-Menten denklemi kurulurken aşağıdaki varsayımlar gözönünealınmıştır:

1. Substrat konsantrasyonu [S], enzim konsantrasyonun [E]’dan çok daha fazladır. Böylece belirli bir zamanda enzime bağlı olan substrat miktarı ihmal edilebilir.

2. Reaksiyonun denge durumunda ES kompleksinin oluşum ve yıkılım hızları biribirine eşittir.

Reaksiyonun denge durumunda :

k1 [E] [S] = [k2 + k3] [ES] (1)

[ES] = (2)

[E] [S]

k2 + k3 k1

k2 + k3

k1

Km

Michaelis-Menten denklemi hiperbolik bir eğrinin denklemidir.

Km

[S] (mol/L)

V

VMAX

2

VMAX

0

Rea

ksiy

on

hız

ı

VMAX :

• Katalizin ulaşabileceği en yüksek hız değeridir.

• Enzim bölgeleri substrat ile tam doygunluğa geçince VMAX’a

ulaşılır.

Km : (Michaelis-Menten Sabiti)

• En yüksek hız (VMAX) değerinin yarısına ulaşmak için gerekli substrat

miktarıdır.

• Ortamda bulunan tüm enzim moleküllerinin aktif bölgelerinin yarısını

dolduran substrat miktarıdır.

• Km değerini tam olarak bulabilmek için farklı konsantrasyonlarda

substrat kullanılmalıdır.

• Km , bir enzime ve substratına özgüldür.

• Enzimin substratına ilgisini (affinitesi) ni yansıtır.

• Km , enzim-substrat ilişkisinde bir ölçüdür.

• Km’i düşük olan bir enzim, substratına yüksek ilgi (affinite) gösterir.

• Enzim, aşağı substrat konsantrasyonunda doyar.

• Tersine büyük KM , enzimin substratına düşük ilgisini tanımlamaktadır.

• Km = mol/L olarak ifade edilir.

• Bir çok enzim için bu değer 10-3 – 10-5 mol/L arasında değişir.

Km =

k2 + k3

k1(mol/L)

Enzim a’nın küçük Km ‘i, enzimin substrata ilgisinin yüksek olduğunu yansıtır.

Enzim b’nin büyük Km’i, enzimin substrata olan ilgisinin az olduğunu yansıtır.

[S]

V

a

b

Kma Kmb

VMAX

2

VMAX

Rea

ksiy

on h

ızı

Vmax

2

vmax

Km

[S]

Yüksek substrat konsantrasyonlarında

[S] > Km reaksiyon hızı sıfırıncı basamaktır-yani,

substrat konsantrasyonundan bağımsız ve sabittir.

Düşük substrat konsantrasyonunda

[S] < Km, , reaksiyon hızı

birinci basmaktır-yani, substrat

konsantrasyonuylaorantılıdır.

o

[S]= Km : Substrat Kmdeğerine eşitse, başlangıç hızı,maksimal hızın yarısına eşittir. Vi = Vmax

2

Belirli bir andaki kataliz hızı:

Vo = Michaelis-Menten Eşitliği

Michaelis-Menten denklemi hiperbolik bir eğrinin denklemidir.

Bu denklem tersine çevrildiğinde düz eğri elde edilir.

Düz eğrinin (doğru) çizilmesi ile Km ve VMAX değerlerinin duyarlı bir biçimde belirlenmesi kolaylaşmaktadır.

Bu doğru ayrıca enzim inhibitörlerinin etki mekanizmalarının saptanmasında da kullanılır.

VMAX [S]

[S] + Km

1

Vo

Km + [S]

VMAX [S]

1Vo

Km

VMAX [S] +

[S]

VMAX [S]

1

Vo

Km

VMAX

X1

[S]+

1

VMAX

1

[S]1

Vo

arasında bir grafik çizilirse, doğrunun y eksenini ile1

VMAX

,

x eksenini ise - 1Km

değerinde kestiği görülür.

Doğru denklemi y = ax +b

Lineweaver-Burk eğrisidenklemi

(Çift-resiprok eğrisi)

Lineweaver-Burk çift-resiprok Eğrisi

1V0

1VMAX

1 Km

1[S]

Km

VMAX

Eğim

..

Km Değerinin Bilinmesinin Önemi

Enzimlerin Saflaştırılması Dokularda enzim aktivitesinin saptanması İlaç imalatında Enzim inhibitörlerinin belirlenmesi

VII.ENZİM AKTİVİTESİNİN İNHİBİSYONU Enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hızını azaltan ya da

engelleyen maddeye inhibitör adı verilir.

İnhibitör, bir molekül yada iyon olabilir. Enzim katalizinin engellenmesi olayına ise inhibisyon denir.

Enzim Katalizinin İnhibisyonu (engellenmesi)

1. Enzimlerin yapısal özelliklerinin ve katalitik aktivitelerinin

incelenmesinde önemli rol oynar.

2. Hücre içindeki metabolik yolların belirlenmesinde yol gösterir.

3. Biyolojik sistemlerin temel kontrol mekanizmasını oluşturur.

4. Pek çok ilaç ve zehirli bileşik tarafından ortaya çıkabilir.

Enzimlerin inhibisyonu; reversibl (tersinir, geriye dönüşümlü) veya irreversibl (tersinmez, geriye dönüşümsüz) olarak iki grupta incelenir.

1-Geriye dönüşümlü (reversibl) inhibisyonlar:

Bu tip inhibisyonlarda substrat konsantrasyonunun ya da inhibitöre oranla enzim konsantrasyonunun arttırılması ile enzim inhibitör ilişkisi tersine çevrilebilmektedir.

a)Yarışmalı (kompetitif) inhibisyon:

b)Yarışmasız (nonkompetitif) İnhibisyon:

c)Yarışmasız (unkompetitif) inhibisyon:

a)Yarışmalı (kompetitif) inhibisyon:

İnhibitör (İ) enzimin aktif bölgesine substratla (S) yarışarak bağlanmaktadır.

İnhibitör molekülünün yapısı substratınkine benzediğinden dolayı enzim ile inhibitör kolaylıkla bağlanırlar, ancak ürün oluşamamaktadır. Bu tip inhibitörler, enzime asıl substratın bağlanmasını engelleyen maddelerdir.

Bu tür inhibisyonda Vmax’a ulaşmak için daha fazla substrat gereklidir.

Ortamda substrat moleküllerinin arttırılmasıyla enzimin inhibitöre olan ilgisi azalmakta ve inhibisyon ortadan kalkmaktadır.

Kompetitif İnhibisyon (Vmax değişmez, Km artar).

Km Km

Yarışmalı İnhibitör ile

İnhibitörsüz

VMAX

2

VMAX

[S]

Yarışmalı inhibitör ile

1Km

inhibitörsüz

1[S]

1Vo

1Km

1VMAX

Rea

ksi

yon

hız

ı (V

o)

İnhibitör varlığında VMAX değişmez, buna karşılık Km

değişir. İnhibitör varlığında Km değeri büyür, enzimin substrata olan ilgisi

azalmıştır.

Km büyümüştür. Çünkü 1 küçülmüştür ve Km (eğrinin

VMAX

eğimi) büyümüştür.

Km

Bir molekülün, belirli bir enzimin inhibitörü olup olmadığı,yahutinhibisyonun tipi, kinetik analizlerle ortaya konulur!

• Metanol zehirlenmesinin tedavisinde yarışmalı inhibisyondan faydalanılır.

• Metanol, alkol dehidrogenaz etkisiyle FORMALDEHİD’e dönüşür.

• Formaldehid körlüğe ve müdahale edilmez ise ölüme yol açar.

• Metanol zehirlenmesinde damar-içi etanol uygulanır.

• Etanol, alkol dehidrogenaza bağlanmada metanol ile yarışır.Enzim Etanolü daha çok toksik olmayan asetaldehide dönüştürür.

Böylece toksik formaldehid oluşumu yarışmalı olarak engellenir.

b)Yarışmasız (nonkompetitif) İnhibisyon: Substratla yapısal benzerliği olmayan inhibitör, substratla aynı

bölgeye bağlanmaz. Yarışmasız inhibitör, ya serbest enzime ya da ES kompleksine

bağlanarak reaksiyonu yavaşlatır. Substrat konsantrasyonu arttırılarak inhibisyon ortadan

kaldırılamaz.

E +S ES E +Ü VMAX

Km DEĞİŞMEZ

Eİ + S EİS Ü

+İ

+İ

Non kompetitif İnhibisyon (Vmax azalır,Km değişmez)

Km

Yarışmasız İnhibitör

İnhibitörsüz

VMAX

2

VMAX

[S]

Yarışmasız inhibitör

inhibitörsüz

1[S]

1Vo

1Km

1VMAX

VMAX

2

1VMAX

c)Yarışmasız (unkompetitif) inhibisyon: İnhibitör, ES kompleksine bağlanır. İnhibitör bağlandığında ürün oluşumu sonlanır.

E +S ES E + Ü

+

İ

EİS Ü

VMAX

Km

Unkompetitif İnhibisyon (Vmax ve Km Azalır)

KmKm

Unkompetitif inhibitör VMAX

2

VMAX

[S]

1Km

1[S]

1Vo

1Km

1VMAX

İ

1VMAX

½ VMAX

2- Geriye dönüşümsüz (tersinmez, irreversibl inhibisyon):

Bu tip inhibisyonlarda aktif bölgeye kovalent olarak bağlanan inhibitör, enzim yapısını bozduğu için geriye dönüş olmamaktadır.

Sinir gazlarından DIPF (diizopropil fosfofluoridat) asetilkolin isimli nörotransmittörü parçalayan asetilkolin esteraz’ ın tersinmez inhibitörüdür.

Asetilkolin bir sinir hücresindeki uyarıyı diğer bir hücreye aktaran maddedir.

Bu etkisi sona erdikten sonra, asetilkolin esteraz tarafından hidrolize uğrar.

Asetilkolin esteraz’ın aktif bölgesinin DIPF tarafından tersinmez inhibe edilmesi hidroliz olayını engeller ve bunun sonucunda felç meydana gelir.

Tarımda kullanılan insektisidler (böcek öldürücüler) de asetilkolin esterazın tersinmez engelleyicisidir.

Birçok insektisidin bileşiminde bulunan fosforlu organik yapı aktif bölgesinde serin amino asidini içeren enzimlerle geriye dönüşümsüz inhibisyon yapar.

Kurşun zehirlenmesi

Kurşun, proteinlerin yapısında yer alan sistein isimli aminoasidin sülfhidril grubuyla (-SH) kovalent bağlar oluşurur.

Hemoglobin sentezinde, protoporfirin isimli maddeye Fe+2 girişini katalizleyen ferrokelataz ve yine bu sentezde yer alan δ-aminolevülinat dehidraz isimli enzimler kurşunun geri dönüşümsüz inhibisyonuna duyarlı enzimlerdir.

3-Bazı ilaçlar da enzim inhibitörü olarak etki ederler.

Penisilin ve amoxicillin gibi yaygın olarak kullanılan antibiotikler,bakteri duvarı sentezine ait enzimleri inhibe ederek etki gösterirler.

ACE (angiotensin-konverting enzim) inhibitörleri (captopril, enapril gibi) kan basıncını düşüren ilaçlardır.

Bu etkilerini, angiotensin I’i vazokonstriktör (damar büzücü) etkili

angiotensin II’ye çeviren ACE’yi bloke ederek gösterirler.

Angiotensin I Angiotensin IIACE

(Damar büzücü etkili)

captopril, enapril(inhibitör etki gösteren ilaçlar)

VIII. ENZİM AKTİVİTESİNİ DÜZENLENMESİ

Bir metabolik yolun belli bir hızda ve yönde ilerleyebilmesi için

kontrol altında tutulması gerekir, bu da enzimlerin sayesinde olur.

Enzim aktivitesi 2 şekilde kontrol edilebilir:

1-Enzimin mutlak (absolü) miktarının değişimi

2-Enzimin katalitik etkinliğinin değişimi

1-ENZİMİN MUTLAK MİKTARININ DEĞİŞİMİ

Organizma varolan enzim miktarını, enzim sentez hızlarını değiştirerek düzenleyebilir.

Enzim proteinin sentezi ihtiyaca göre artabilir (indüklenme)

ya da azalabilir (represyon, baskılanma). İndüksiyon ile enzim sentezi artar, represyon ile enzim sentezi azalır. Derepresyon ile enzim sentezi baskıdan kurtulup tekrardan artar.

Enzim sentezi indükleyici bir maddeye cevap olarak tetiklenebilir.

E. coli isimli mikroorganizma glukozun bulunduğu ortamda glukozu kullanır.

Ancak bir disakkarid olan laktozu, β-galaktozidaz isimli enzimi bulunmadığından dolayı galaktoz ve glukoza hidrolizleyemez.

Ortamdan glukoz çıkarılıp yerine laktoz ilave edildiğinde, mikroorganizma laktozu kullanır hale gelir.

Laktoz (indüktör) protein yapısında olan β-galaktozidazın sentezlenmesini indüklemiştir.

İndükleyici maddelerin çoğu, enzimlerin substratlarıdır.Ancak substrata yapısal bakımdan benzeyen bileşikler de indükleyicimadde olabilirler fakat substrat olamazlar!

Salmonella isimli mikroorganizma histidin bulunan ortamda, kendisi

histidin sentezleyemez ( represyon, baskı altına alma).

Histidin korepresör’dür, yani kendi sentezi ile ilgili enzimlerin sentezini engellemektedir.

Histidin represyon etkisini bir proteine bağlanarak yapar.

Bu proteine aporepresör denir.

Aporepresör-korepresör, enzim sentezini kontrol altına alır.

Ortamdan histidin çıkarılması yahut bu maddenin tükenmesi, enzim biosentezinin tekrardan başlamasını sağlar (derepresyon, baskının ortadan kaldırılışı).

2-ENZİMİN KATALİTİK ETKİNLİĞİNİN DEĞİŞİMİ

1. Enzim molekülünün aktivasyon-inhibisyonu (Allosterik enzimler)

2. Kovalent Modifikasyon

3. Zimojen Aktivasyonu1.ALLOSTERİK ENZİMLER Allosterik “başka yere ait” anlamına gelir.

Aktif bölgeleri dışında bir yere nonkovalent olarak bağlanan efektör (modülatör) isimli moleküller tarafından düzenlenirler. Allosterik efektörün enzime bağlanması sonucunda, enzimin substratına olan ilgisi değişir. Efektör, enzim aktivitesini inhibe ettiğinde negatif efektör, aktiviteyi arttırdığında pozitif efektör denir.

HIZ DÜZENLEYİCİ ENZİMLERİN ÇOĞU ALLOSTERİK ENZİMLERDİR.

Birden fazla alt üniteden meydana gelmişlerdir (oligomerik enzimler). Çoğunlukla metabolik yolun ilk basamağına etki ederler. Enzim moleküllerinin üzerinde bir katalitik, bir de düzenleyici bölge bulunur. Düzenleyici bölgeye efektör, nonkovalent olarak bağlanır.

SUBSTRAT

KATALİTİK BÖLGE

II.

I.İNHİBİTÖR(negatif efektör)

DÜZENLEYİCİ BÖLGE

AKTİVATÖR(pozitif efektör)

İki alt birimli bir enzimin 1. alt ünitesine efektörün bağlanması sonucunda, 2. alt birimin substrat bağlanması etkilenmektedir.

Efektör, 2. alt birime substrat bağlanmasını hızlandırabilir ya da yavaşlatabilir.

Bu olaya kooperativite adı verilir. Ortamda bulunan allosterik aktivatör enzimin etkinliğini arttırır,

allosterik inhibitör ise enzimin etkinliğini azaltır. Allosterik enzimlerde, substrat ile hız arasındaki hiperbolik eğri,

sigmoidal karakter kazanır. Bu grafik lineer olarak çizildiğinde ise kırık şekil alır. Böyle bir grafik enzimin 2 veya daha fazla alt üniteden meydana

geldiğini gösterir.

V

Sigmoidal eğri

S

kırık eğri

1/V

1/S

Substratın kendisi aktivatör ya da inhibitör olarak davrandığında

homotropik etki denir.

Bu olaya 4 altüniteden meydana gelmiş enzimlerde rastlanır.

Bir allosterik enzim kendi substratından başka bir efektör

tarafından aktive ya da inhibe edilmekte ise heterotropik etkiden

bahsedilir.

Bir ara ürün veya son ürün de enzim etkinliğinin düzenlenmesinde

görev yapabilir. Bu ürün kullanılmıyor birikiyor ise, bu yolda görevli 1. veya 2. enzimi

“negatif feed back” başa tepki şeklinde inhibisyona uğratır.

A B C D

D’nin konsantrasyonu, sentezlendiği kadar tüketilmediğinden dolayı

artacak olursa, metabolik yoldaki ilk enzim inhibe olur.

Düzenleyici enzimler sayesinde son ürünün birikimi engellenmiş olur!

E1 E2 E3

Hız düzenleyici enzim

Feed back İnhibisyon

2. KOVALENT MODİFİKASYONA UĞRAYAN SİSTEMLER

Bazı enzimlerin katalitik etkileri kovalent modifikasyonlarla

değişebilir.

Aktivitelerinde kovalent modifikasyona uğrayan enzimler biribirine

dönüşebilen enzimlerdir.

Bu enzimler iki aktivite halinde bulunurlar:

Yüksek ve düşük aktivite

En sık rastlanan modifikasyon şekli, enzim molekülünün yapısındaki

belirli serin, treonin veya tirozin isimli aminoasidlere bir fosfat

grubunun eklenmesi veya bir fosfat grubunun çıkarılmasıdır.

Bazı enzimlerde fosfoenzim, bazılarında ise defosfo enzim şekil

daha aktif olabilmektedir.

Metabolik yolun gereksinimine uygun olarak, fosfor grubunun enzime ilavesi ya da enzimden ayrılması sonucunda, enzim iki faklı şekilde çalışmaktadır.

Organizmanın glukoza gereksinimi olduğu esnada, glikojen sentataz fosforillenerek aktivitesini kaybeder. Aynı esnada glikojen fosforilaz bir fosfat grubu bağlayarak aktif şekle dönüşür. Bu sayede depo maddesi glikojenden glukoz sağlanmış olur.

Fosforilasyon ve defosforilasyon sırası ile protein kinaz ve protein fosfataz ismi verilen enzimler tarafından gerçekleştirilmektedir. Buenzimler ise hormonal ve sinirsel kontrol altında tutulmaktadır.

Enzim

serinOH

Enzim

serin O-P-O-

O

O-

Fosforilasyon

Defosforilasyon

Kinaz ve Fosfataz isimli enzimler kovalent modifikasyonun reversibl

(geri dönüşebilir) oluşunu sağlayan enzimlerdir.

Enzim-Serin Enzim-Serin O-PO3-2

Kinaz

Fosfataz

ATPMg+2

ADP

H2OPi

Mg+2

ENZİMİN KOVALENT MODİFİKASYONU

3.ZİMOJEN AKTİVASYONU

Hücre dışında görev yapan bazı enzimler, bulundukları yere zarar vermemeleri için aktif olamayan öncül moleküller şeklinde sentez edilirler. Bu moleküllere proenzim veya zimojen adı verilmektedir.

Zimojen aktivasyonu bir veya birkaç peptid bağının koparılması (yarılması, kırılması) ile olur.

Pankreasta sentezlenen tripsinojen (inaktif) etki gösterdiği barsaklara salgılandığında peptid bağları kırılır ve aktif şekle dönüşür.

Tripsinojen Tripsin

(İnaktif) (Aktif)

Kimotripsinojen Kimotripsin

(İnaktif) (Aktif)

Kan plazmasında:

Fibrinojen Fibrin

(İnaktif) (Aktif)

Enterokinaz

Tripsin Proteinlerdeki aromatik aminoasidleri ayırır.(Tirozin,fenilalanin,triptofan)

Trombin