Izdelava in karakterizacija hitozanskih nanodelcev za ... · standard ASTM E 2149-01. The results show that an increase in thew/w ratio of chitosan/TPP triggers anincrease in the

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

Metod Kolar

IZDELAVA IN KARAKTERIZACIJA HITOZANSKIH NANODELCEV ZA

MEDICINSKO UPORABO

Diplomska naloga

Maribor, september 2010

Diplomsko delo univerzitetnega študijskega programa

IZDELAVA IN KARAKTERIZACIJA HITOZANSKIH NANODELCEV ZA MEDICINSKO UPORABO

Študent: Metod KOLAR Študijski program: univerzitetni, Kemijska tehnologija Smer: Biokemijska tehnika Predvideni strokovni naslov: univ. dipl. inž. kem. tehnol. Mentor: redni prof. dr. Maja HABULIN Somentorja: doc. dr. Lidija FRAS ZEMLJIČ

redni prof. dr. Stanko SRČIČ

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal sem literaturo iz področja diplomskega dela po naslednjih elementih:

Vir: ScienceDirect, Web of Science

Gesla: chitosan, nanoparticles, ionic gelation, antimicrobial activity

Skupine gesel (unija itd.): chitosan, ionic gelation

Časovno obdobje: Od leta 1995 do leta 2009

Število referenc: 36

Število prebranih izvlečkov: 20

Število prebranih člankov: 55

Število pregledanih knjig: 3

-------------------------- Maribor, september 2010 podpis študenta

Številka:

Datum:

Na osnovi 330. člena Statuta Univerze v Mariboru (Ur. l. RS, št. 1/2010)

izdajam

SKLEP O DIPLOMSKEM DELU

#ImePriimek, študent-ka univerzitetnega študijskega programa #Program, lahko izdela diplomsko delo pri predmetu #Predmet.

Mentor-ica: Mentor

Somentor-ica: Somentor

Naslov diplomskega dela:

Naslov

Naslov diplomskega dela v angleškem jeziku:

Naslov angleški

Diplomsko delo je potrebno izdelati skladno z »Navodili za izdelavo diplomskega dela« in ga oddati v treh izvodih ter en izvod elektronske verzije do #Rok v referatu za študentske zadeve Fakultete za kemijo in kemijsko tehnologijo.

Pravni pouk: Zoper ta sklep je možna pritožba na senat članice v roku 3 delovnih dni.

DEKAN:

#Dekan Obvestiti:

• kandidata -ko, • mentorja, • somentorja, • odložiti v arhiv

Diplomsko delo Stran IV

Diplomsko delo Stran V

We can't solve problems

by using the same kind of thinking

we used when we created them.

(A. Einstein)

ZAHVALA

Za pomoč, potrpežljivost, strokovne nasvete in vodenje pri opravljanju diplomskega dela se iskreno zahvaljujem somentorjema doc. dr. Lidiji Fras Zemljič in red. prof. dr. Stanku Srčiču ter mentorici red. prof. dr. Maji Habulin.

Še posebej bi se rad zahvalil mladi raziskovalki na Fakulteti za farmacijo Biljani Govedarici in mlademu raziskovalcu na Kemijskem inštitutu Urošu Mavru za strokovne nasvete in pomoč pri izvajanju eksperimentalnega dela.

Vsekakor sem hvaležen tudi Mateju Bračiču, kakor tudi celotni ekipi LOPPM za nepogrešljive strokovne nasvete in pomoč pri eksperimentalnem delu.

Posebna zahvala velja staršem, ki so mi omogočili študij, in vsem najbližjim, ki so mi ves čas študija stali ob strani.

Diplomsko delo Stran VI

IZDELAVA IN KARAKTERIZACIJA HITOZANSKIH NANODELCEV ZA MEDICINSKO UPORABO

Povzetek

Namen diplomskega dela je bil izdelati in okarakterizirati nanodelce, ki nastanejo s tehniko

ionotropnega geliranja iz hitozana in natrijevega tripolifosfata (TPP). Nanodelcem smo

določili naboj s polielektrolitsko titracijo, velikosti z metodo dinamičnega sipanja laserske

svetlobe (DLS) in zeta potencial z elektroforetičnim sipanjem svetlobe ter protimikrobni

učinek po standardu ASTM E 2149-01. Preverili smo vpliv različnih masnih razmerij

reaktantov in vpliv dodatka stabilizatorja polietilen glikola (PEG) na lastnosti disperzije

nanodelcev.

Ugotovili smo, da se s povečanjem masnega razmerja hitozan/TPP povečujejo: množina

prostih amino skupin in s tem naboj, hidrodinamski radij ter zeta potencial, kakor tudi

protimikrobni učinek na nekatere testirane mikroorganizme.

Ugotovili smo, da dodatek stabilizatorja polietilen glikola (PEG) k disperziji nanodelcev ne

vpliva izrazito na spremembe hidrodinamskega premera nanodelcev, medtem ko znižuje

heterodisperznost velikosti nanodelcev in zeta potencial, in tako naredi disperzije manj

stabilne. Iz tega sklepamo, da PEG proučevanih molekulskih mas ni najustreznejši

stabilizator za disperzije hitozanskih nanodelcev.

Ugotovili smo, da so nanodelci protimikrobno učinkoviti; presenetljivo celo bolje inhibirajo

rast mikroorganizmov kot sama raztopina hitozana. Nano-formulacija hitozana omogoča

njegovo optimalno in nadzorovano difuzijo v celice patogenih mikroorganizomov in je tako

njihova degradacije še učinkovitejša.

Ključne besede: hitozan, nanodelci, TPP, ionotropno geliranje, ionsko geliranje,

protimikrobna učinkovitost

UDK: 620.3(043.2)

Diplomsko delo Stran VII

PRODUCTION AND CHARACTERIZATION OF CHITOSAN NANOPARTICLES FOR MEDICAL USE

Abstract

In this study, we tried to obtain nanoparticles from chitosan and sodium tripolyphosphate

(TPP) using ionotropic gelation techniques. The obtained nanoparticles were

characterized for positive charge using polyelectrolyte titrations, particle size using

dynamic light scattering (DLS), zeta potential of particles using electrophoretic light

scattering, as well as antibacterial activities of nanoparticles were examined using

standard ASTM E 2149-01.

The results show that an increase in the w/w ratio of chitosan/TPP triggers an increase in

the amount of free amino groups (positive charge), hydrodynamic diameter, zeta potential

and also intensifies the antimicrobial effect of nanoparticles.

The results also show that the addition of stabilizer polyethylene glycol (PEG) does not

have major effect on the hydrodynamic diameter of nanoparticles, however it decreases

heterodispersity of the size as well zeta potential, thus making dispersions less stable.

This leads to the conclusion that PEG is not an appropriate stabilizer for studied

nanoparticles dispersions.

Moreover, the antibacterial activity results suggests that the chitosan in nanoparticulate

form display higher antibacterial activity against all tested microorganisms than the

chitosan in the free form. Nano-formulation of chitosan enables optimal and controlled

diffusion of chitosan into the cells of pathogen microorganisms, thus making their

degradation more efficient.

Key words: chitosan, nanoparticles, TPP, ionotropic gelation, ionic gelation, antimicrobial

activity

UDK: 620.3(043.2)

Diplomsko delo Stran VIII

VSEBINA

VSEBINA VIII

SEZNAM SLIK X

SEZNAM PREGLEDNIC XII

UPORABLJENE KRATICE XIII

UPORABLJENI SIMBOLI XIV

1 UVOD 1

2 TEORETIČNI DEL 32.1 Hitozan 3

2.1.1 Protimikrobno delovanje 4

2.1.2 Uporaba 4

2.2 Nanodelci 52.2.1 Priprava nanodelcev iz naravnih polimerov 6

2.3 Analizne metode za karakterizacijo nanodelcev 102.3.1 Polielektrolitska titracija 10

2.3.2 Dinamično sipanje laserske svetlobe 12

2.3.3 Elektrokinetični pojavi na mejnih površinah 14

2.3.4 Vrstična elektronska mikroskopija 15

3 EKSPERIMENTALNI DEL 173.1 Materiali 173.2 Laboratorijska oprema in aparature 173.3 Metode 18

3.3.1 Priprava raztopin 18

3.3.2 Izdelava nanodelcev iz hitozana in TPP 19

3.3.3 Izdelava nanodelcev iz hitozana, PEG in TPP 19

3.3.4 Določitev prostih amino skupin nanodelcev 20

3.3.5 Merjenje velikosti nanodelcev 20

3.3.6 Merjenje zeta potenciala 20

Diplomsko delo Stran IX

3.3.7 Analiza nanodelcev pod SEM mikroskopom 21

3.3.8 Mikrobiološko testiranje 21

4 REZULTATI IN DISKUSIJA 244.1 Določitev prostih amino skupin nanodelcev s polielektrolitsko titracijo 25

4.1.1 Vpliv masnega razmerja hitozan/TPP na naboj 26

4.1.2 Vpliv stabilizatorja PEG na naboj nanodelcev 27

4.1.3 Vplih pH na naboj nanodelcev 28

4.2 Določitev velikosti nanodelcev 294.2.1 Vpliv stabilizaorja PEG na velikost nanodelcev 32

4.3 Določitev zeta potenciala 344.3.1 Vpliv stabilizatorja PEG na zeta potencial nanodelcev 36

4.4 Analiza nanodelcev pod SEM mikroskopom 374.5 Analiza protimikrobnega testa 39

4.5.1 Vpliv stabilizatorja PEG na protimikrobnost 40

5 SKLEP 42

6 LITERATURA 44

7 PRILOGE 477.1 Priloga A 47

Diplomsko delo Stran X

SEZNAM SLIK

Slika 2 – 1: Kemijska struktura in splošna formula hitozana, kjer je n ß -1,4-N-acetil-

glukozamin in m ß -1,4-D-glukozamin [5].

Slika 2 – 2: Reakcijska shema nastanka nanodelcev iz hitozana, natrijevega tripolifosfata

(TPP) z ali brez uporabe polietilen glikola (PEG) [18], [21].

Slika 2 – 3: Območje nastajanja nanodelcev kot funkcija končne koncentracije hitozana in

TPP-ja v suspenziji [20].

Slika 2 – 4: Shema polielektrolitske titracije kationskega polimera z anionskim

polielektrolitskim titrantom ob prisotnosti kationskega indikatorja [28].

Slika 2 – 5: Konfiguracija aparature Zetasizer serije Nano za merjenje dinamičnega

sipanja laserske svetlobe podjetja Malvern [30].

Slika 2 – 7: Shematska predstavitev zeta potenciala.

Slika 3 – 1: Števna komora namenjeno štetju bakterijskih kolonij [35].

Slika 4 – 1: Polielektrolitska titracijska krivulja hitozana, γH = 1,79 mg/mL.

Slika 4 – 2: Koncentracija površinskega naboja nanodelcev v odvisnosti od z(H/TPP).

Slika 4 – 3: Vpliv molekulske mase PEG na množino dostopnih amino skupin.

Slika 4 – 4: Koncentracija protoniranih amino skupin v odvisnosti od pH, γH = 2,06 mg/ml,

z(H/TPP) = 5.

Slika 4 – 5:Histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja merjen po 12

urah, z(H/TPP) = 5.

Slika 4 – 6: Histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja merjene po 7

dneh, z(H/TPP) = 5.

Slika 4 – 7: Histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja, z(H/TPP) = 4.

Slika 4 – 8: Histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja, z(H/TPP) = 4,

MPEG = 1500 g/mol.

Diplomsko delo Stran XI


MPEG = 4000 g/mol.

Slika 4 – 10: Diagram odvisnosti ζ-potenciala od koncentracije prostih amino skupin.

Slika 4 – 11: Diagram odvisnosti ζ-potenciala od koncentracije prostih amino skupin pri

različnih PEG.

Slika 4 – 12: Kristal hitozana


Slika 4 – 14: Nanodelci pri z(H/TPP) = 3.

Slika 4 – 15:Nanodelci pri z(H/TPP) = 5 z PEG.

Slika 4 – 16: Zamreženje.

Slika 4 – 17: Aglomerat nanodelcev.


Slika A.7 – 1: Titracijske krivulje vseh izdelanih disperzij nanodelcev.

Slika A.7 – 2: Titracijske krivulje raztopin hitozana.

Slika A.7 – 3: Titracijska krivulja za vodo.

Slika A.7 – 4: Titracijske krivulje za TPP.

Diplomsko delo Stran XII

SEZNAM PREGLEDNIC

Preglednica 4 – 1: Končne koncentracije hitozana in TPP v disperziji nanodelcev.

Preglednica 4 – 2: Rezultati polielektrolitskih titracij.

Preglednica 4 – 3: Hidrodinamski premer nanodelcev, merjen po 12 urah nastanka

nanodelcev.

Preglednica 4 – 4: Hidrodinamski premer nanodelcev, merjen po enem tednu nastanka

nanodelcev.

Preglednica 4 – 5: Odvisnost hidrodinamskega premera delcev od molekulske mase PEG.

Preglednica 4 – 6: Odvisnost ζ potenciala od razmerja hitozan/TPP.

Preglednica 4 – 7: Vpliv molekulskih mas PEG na ζ potencial.

Preglednica 4 – 8: Rezultati protimikrobnega testiranja hitozanskih nanodelcev.

Preglednica 4 – 9: Rezultati protimikrobnega testiranja hitozanskih nanodelcev z dodanim

PEG dveh različnih molskih mas

Diplomsko delo Stran XIII

UPORABLJENE KRATICE

ASTM - American Society for Testing and Materials

CFU - kolonijska enota (angl. Colony Formung Unit)

DLS - dinamično sipanje laserske svetlobe

DNK - deoksiribonukleinska kislina

H - hitozan

He - helij

HCl klorovodikova kislina

mRNK - informacijska ribonukleinska kislina

NaOH - natrijev hidroksid

Na-PVS - natrijev polivinil sulfonat

Ne - neon

o-Tm - orto-toluidin modro

PCS - fotonska korelacijska spektroskopija

PDADMAC - angl. poly-diallyldimethylammonium chloride

PE - polielektrolitski/a

PEG - polietilen glikol

PhEur - Evropska farmakopeja

SEM - vrstična elektronska mikroskopija

TPP - natrijev tripolifosfat

Diplomsko delo Stran XIV

UPORABLJENI SIMBOLI

OZNAKA VELIČINA ENOTA

A število kolonijskih enot (CFU) po 1 minutnem

stresanju (čas ˝0˝) -

B število kolonijskih enot (CFU) po 1 urnem stresanju -

c množinska koncentracija mol/L

D difuzijska konstanta m2/s

DD stopnja deacetilacije %

dH hidrodinamski premer m

E jakost električnega polja V/m

M molska masa g/mol

m masa kg

PDI polidisperzni indeks -

pKa disociacijska konstanta kisline -

R bakterijska redukcija %

rH hidrodinamski polmer m

RSD relativni standardni odmik %

T temperatura °C

u elektroforetska mobilnost ionov m2/(V s)

V volumen L

v hitrost m/s

VH volumen raztopine hitozana L

VTPP volumen raztopine natrijevega tripolifosfata L

Diplomsko delo Stran XV

w masni delež %

z(H/TPP)1 masno razmerje hitozana in natrijevega tripolifosfata -

Grške črke

γH masna koncentracija hitozana g/l

γTPP masna koncentracija TPP g/L

ζ elektrokinetični (zeta) potencial V

η viskoznost kg/(m s)

λ valovna dolžina nm

1 Namesto grške črke ζ, ki jo uporabljano v tem diplomskem delu za označitev zeta-potenciala smo uporabili latinsko črko z, da ne bi prihajalo do nesporazumov.

Diplomsko delo Stran 1

1 UVOD

Hitozan, deacetilaran derivat hitina, je za celulozo drugi najbolj znan razširjen polisaharid.

Je polikationski, obnovljiv in biorazgradljiv polimer, ki je poznan po široki paleti bioloških

aktivnosti, vključno z antimikrobnim ter antimikotičnim delovanjem in izkazuje dobre

bioadhezivne lastnosti, ki so predvsem posledica tvorbe vodikovih in ionskih vezi med

pozitivno nabitimi amino skupinami polimera ter negativno nabito sialično kislino, prisotno

v glikoproteinih na površini sluznice. Prav tako je poznan kot ojačevalec imunskega

odziva pri ljudeh [1, 2]. Zaradi vseh naštetih lastnosti je izredno iskan dodatek na področju

razvoja farmacevtskih ter kozmetičnih komponent kot tudi na področju razvoja medicinskih

tekstilij za eksterno kot tudi interno uporabo. Še posebej atraktivno področje raziskav je

priprava hitozanskih nanodelcev v razvoju novih dostavnih sistemov zdravilnih učinkovin,

kar pomeni, da je zdravilna učinkovina vgrajena ali pripeta na nosilni del iz biopolimera.

Bioadhezivni sistemi za dostavo učinkovin izboljšajo biološko uporabnost vgrajenih

učinkovin v primerjavi s klasičnimi dostavnimi sistemi, saj podaljšajo čas zadrževanja

učinkovine na mestu adhezije ter omogočajo tesnejši stik farmacevte oblike s sluznico,

skozi katero se učinkovina absorbira. Poleg bioadhezivnih lastnosti se pri načrtovanju

dostavnih sistemov izkorišča tudi sposobnost hitozana, da poveča absorpcijo učinkovin

skozi različne sluznice. Čeprav je bilo opravljenih veliko raziskav uporabe hitozana kot

dostavnega sistema oz. kot nosilca zdravilne učinkovine, je na področju raziskav

hitozanskih nanodelcev kot samostojne protimikrobne učinkovine še velika vrzel, zlasti pri

uporabi novih hitozanskih derivatov (hitozan s kvarternimi amonijevimi solmi, sulfatnimi in

karboksilnimi skupinami, itd.) in tako predstavlja tovrstno raziskovalno delo znanstveni

doprinos.

V kislem mediju amino skupine hitozana protonirajo in imajo kot take sposobnost inhibicije

rasti Gram-pozitivnih in Gram-negativnih bakterij kot tudi nekaterih vrst gliv. Amino

skupine hitozana so gonilna sila protimikrobnega delovanja in meritev njihove vsebnosti je

ključnega pomena za določitev končne učinkovitosti pripravljenih materialov.

Diplomska teza temelji na tem, da je moč sintetizirati stabilne nanodelce hitozana, ki imajo

v kislem mediju pozitivni površinski naboj (posledica prostih protoniranih NH2 skupin) in


delujejo protimikrobno in antifugicidno. Nanodelci hitozana se lahko uporabljajo kot

protimikrobni agens v farmacevtskih in kozmetičnih pripravkih ali kot premaz za tekstilije.

Za naštete aplikacije je bistvenega pomena poznavanje optimalnih pogojev sintetiziranja

nanodelcev, kot tudi podrobna preučitev njihovih fizikalno- kemijskih ter mikrobioloških

karakteristik.

Cilji diplomske naloge so bili:

• sintetizirati nanodelce z postopkom ionotropnega geliranja,

• proučiti pogoje s katerimi lahko fizikalno-kemijske karakteristike nanodelcev

(velikost delcev, naboj, zeta potencial) reguliramo,

• proučiti vpliv možnih stabilizatorjev na stabilnost suspenzije in na proučevane

fizikalno-kemijske karakteristike nanodelcev,

• analizirati morfološke lastnosti nanodelcev, katere so bistvenega pomena za

nadaljnjo praktično uporabo ter

• analizirati protimikrobno delovanje hitozanskih nanodelcev.

V zaključku je podana potencialna uporaba sintetiziranih nanodelcev za različne

segmente na področju zdravja ljudi.


2 TEORETIČNI DEL

2.1 Hitozan

Hitozan je linearen biopolimer sestavljen iz dveh monosaharidnih enot: 2-amino-2-deoksi-

ß-D-glukopiranoze (D-glukozamina) in 2-acetamido-2-deoxy-ß-D-glukopiranoze (N-acetil-

glukozamina). Enote so med seboj povezane z ß-[1 → 4] glikozidno vezjo. Pridobivajo ga

iz hitina z delno N-deacetilacijo. Hitin, ki je za celulozo (analog hitina) drugi najbolj

zastopan polimer v naravi, je sestavni del zunanjega ogrodja rakov in žuželk, zaslediti ga

je možno tudi v celični steni bakterij, gliv in plesni, ki za prehranjevanje potrebujejo dušik

[3]. Slika 2 – 1 prikazuje kemijsko strukturo in splošno formulo hitozana. Polimere, ki so

sestavljeni iz 40% - 95% ß -1,4-D-glukozaminskih monomerov (m), i.e. imajo stopnjo

deacetilacije (DD) v zgoraj navedenem območju, imenujemo hitozani [4]. Večina

komercialno dostopnega hitozana ima stopnjo deacetilacije med 70% in 90% [3].

Slika 2 – 1: Kemijska struktura in splošna formula hitozana, kjer je n ß -1,4-N-acetil-

glukozamin in m ß -1,4-D-glukozamin [5].

Stopnja deacetilacije in molekulska masa polimera sta glavna dejavnika, ki vplivata na

ostale fizikalne in kemijske lastnosti, biorazgradljivost in biokompatibilnost ter

protimikrobni značaj hitozana. Poleg omenjenih lastnosti je hitozan tudi skoraj netoksičen.

Vse to pripomore k široki uporabnosti na področjih kot so: biomedicina, farmacija, čiščenje

odpadnih voda (kelacija kovin), kozmetiki, etc. [6].


Hitozan je hidrofoben naraven polimer, ki je zaradi svoje vrednosti pKa = 6 – 6,5 (odvisno

od stopnje deacetilacije), topen le v kislih medijih. Za raztapljanje hitozana se

najpogosteje uporabljata etanojska in metanojska kislina.

Molekulska masa naravnega hitina je navadno višja od enega milijona, medtem ko imajo

proizvodi iz komercialnega hitozana molekulsko maso med 100 000 in 1 200 000 g/mol.

2.1.1 Protimikrobno delovanje

Čeprav je natančen mehanizem protimikrobnega delovanja hitina, hitozana in njunih

derivatov še neznan je bilo predlaganih nekaj različnih mehanizmov. Pozitivno nabite

molekule hitozana vplivajo na negativno nabite celične membrane mikrobov, tako da te

začnejo prepuščati proteinske molekule in druge celične organele. Možnost hitozana da

selektivno tvori kelate z kovinami naj bi inhibirala nastanek toksinov in rasti mikrobov.

Vezava hitozana z DNK privede do inhibicije sinteze mRNK in posledično proteinov,

poteče kadar hitozan prodre v celice mikroorganizmov oz. v njihova jedra [7]. Hitozan ima

višji protimikrobni učinek proti Gram-pozitivnim bakterijam, kot proti Gram-negativnim

bakterijam [8].

Na protimikrobno aktivnost hitozana vplivajo: molska masa in stopnja deacetilacije

polimera, njegova koncentracija v raztopini in pH raztopine, kakor tudi uporabljeno topilo.

Na primer, rast bakterij E. coli je ob dodatku hitozana z povprečno molsko maso 9300

g/mol inhibirana, ob dodatku polimera z povprečno molsko maso 2200 g/mol pa

pospešena [7]. Protimikrobno aktivnost hitozana je moč opaziti samo v kislem mediju,

zaradi netopnosti polimera nad pH = 6,5. Zaradi tega je nastalo veliko zanimanje za

derivate hitozana, ki so v topni v kislem in bazičnem vodnem mediju, kot sta na primer

karboksimetiliran ali sulfatiran hitozan.

2.1.2 Uporaba

Hitozan je v preteklih 30-ih letih doživel nesluten razvoj in se uspešno uveljavil na

najrazličnejših področjih našega bivanja. Zaradi naravnega izvora, dostopnosti,

biokompatibilnosti in biorazgradljivosti (v organizmu ga razgradijo lizosomalni encimi [9])

ter kemijske strukture, ugodne za nadaljnje modifikacije, je to biopolimer, ki nedvomno

veliko obeta [3].


Hitozan se uporablja na področjih:

• medicine (hitozanske membrane kot umetne membrane ledvic, ustavljanje

krvavitev ob težkih pogojih nestrjevanja krvi, oskrba rane, substrat pri presaditvah

kože, idealen kandidat za izdelavo umetnih leč, enkapsulacija živih celic) [3, 9, 10],

• farmacije (material za ogrodje farmacevtskih oblik, dostavni sistemi za vnos

učinkovin in genov, hitozanski nano in mikrodelci za cepiva, pripravki za znižanje

holesterola in zmanjšanje telesne teže, maskiranje vonja in okusa, varovanje

učinkovin pred vplivi okolja, itd.) [2, 3, 9-13],

• kmetijstva in prehrane (material za embaliranje, zaščita rastlin in pridelkov pred

virusi in bakterijami, stimulacija rasti, konzerviranje) [3, 14, 15],

• čiščenja odpadnih vod in za pripravo pitne vode (koagulacijsko sredstvo in

flokulant, absorpcija maščob, olja, težkih kovin in drugih toksičnih spojin) [3, 9]in

• kozmetične industrije (nega las in kože, ustna higiena) [9, 16].

Dostavni sistemi in drugi nameni uporabe hitozana v farmaciji in medicini

Hitozan se zaradi dobrih bioadhezivnih lastnosti pogosto uporablja v razvoju novih

dostavnih sistemov za zdravilne učinkovine. Bioadhezivni sistemi za dostavo učinkovin

izboljšajo biološko uporabnost vgrajenih učinkovin v primerjavi s klasičnimi dostavnimi

sistemi, saj podaljšajo čas zadrževanja učinkovine na mestu adhezije ter omogočijo

tesnejši stik farmacevtske oblike s sluznico, skozi katero se učinkovina absorbira. Poleg

bioadhezivnih lastnosti se pri načrtovanju dostavnih sistemov izkorišča tudi sposobnosti

hitozana, da poveča absorpcijo učinkovin skozi različne sluznice.

Hitozan naj bi pospešil tudi celjenje ran. Ob aplikaciji na površinske rane, naj bi se hitozan

vezal na fibroblaste in spodbujal proliferacijo keratinocitov ter s tem obnavljanje

pokožnice. Poleg tega naj bi hitozan aktiviral obrambni sistem gostitelja in s tem preprečil

okužbo rane. Povečal naj bi aktivnost polimorfonuklearnih levkocitov in makrofagov.

Hitozan naj bi zaviral tudi rast in razmnoževanje bakterij. Na Japonskem so že na tržišču

pripravki s hitozanom v obliki hidrogela, praška in zrnc namenjeni celjenju ran [1].

2.2 Nanodelci

Nanodelci so trdni koloidni delci s premerom od 10 do 1000 nm [17]. Ko so jih prvič

pripravili okrog leta 1970, so si jih zamislili kot nosilce za cepiva in zdravila proti raku [18].


Ločimo dva tipa nanodelcev, nanokapsule in nanosfere. Nanokapsule so zgrajene iz

polimerne ovojnice in jedra, medtem ko je gradnik nanosfer polimerni matriks [19].

Najpomembnejše fizikalno-kemijske lastnosti, ki jih lahko pri izdelavi nanodelcev

nadzorujemo so [10]:

• velikost in porazdelitev delcev,

• molekulska masa polimera,

• razmerje med učinkovino in polimerom,

• skupna masa učinkovine in polimera.

Nanodelci imajo v primerjavi z večjimi delci veliko razmerje površina/volumen.

Medpovršinske lastnosti, na katere vplivamo s postopkom priprave in izbiro polimera ter

ostalih sestavin, so zelo pomembne in pogosto napovedujejo učinkovitost nanodelcev

[10].

2.2.1 Priprava nanodelcev iz naravnih polimerov

Za izdelavo biorazgradljivih nanodelcev uporabljamo številne sintezne in naravne

polimere. Najpogosteje uporabljeni so: PLA (polimlečna kislina), PLGA (kopolimer

polimlečne in poliglikolne kisline), PCL (poli-ε-kaprolakton), hitozan, albumin, želatina,

alginat. Za izdelavo nanodelcev obstaja več metod, izbira med njimi je odvisna od

lastnosti polimera in zdravilne učinkovine. Metode izdelave nanodelcev razdelimo v dve

skupini glede na to ali izdelava poteka s polimerizacijo monomerov ali z oblikovanjem že

izdelanih polimerov. Nanodelce iz naravnih polimerov lahko pripravimo brez uporabe

organskih topil in visokih strižnih sil z ionotropnim geliranjem in koacervacijo (enostavno

oz. kompleksno) [19].

Koacervacija

Koacervacija je ena izmed prvotnih tehnik za mikroenkapsulacijo, ki je bila uporabljena za

različne komercialne produkte. Metoda temelji na enostavni separaciji raztopine

hidrofilnega polimera v dve fazi, in sicer v gosto fazo bogato s polimerom in razredčeno

tekočo fazo. Če se pri procesu uporabi samo en polimer imenujemo takšno koacervacijo

enostavna, če pa sta prisotna dva ali več polimerov nasprotnega naboja jo imenujemo

kompleksna koacervacija [16].

Enostavna koacervacija temelji na tem, da povzročimo separacijo faz enega polimera

(npr. želatin, polivinil alkohol, karboksimetil celuloza) z dehidracijo. To lahko dosežemo z

dodatkom topila, ki je v vodi topen, a ne raztaplja polimera (npr. etanol, aceton, dioksan,


isopropanol), z dodatkom anorganskih soli (npr. natrijev sulfat) in s spremembo

temperature [16].

Kompleksna koacervacija temelji na tem, da povzročimo separacijo faz pozitivno nabitega

polimera (npr. hitozan) z dodajanjem nasprotno nabitega polimera (npr. alginat).

Separacijo faze bogate s polimerom dosežemo, kadar nevtraliziramo celoten naboj. Ker

so gonilne sile procesa elektrostatične interakcije dveh ali več polimerov, je pH medija še

kako pomemben [16].

Bungengerg de Jong, Kruyt in Lens so leta 1932 prvi pokazali, da lahko s koacervacijo

ujamemo v koacervatski sistem tudi trdne delce. Pri prehodu faze z enostavno ali

kompleksno koacervacijo se tvorijo majhne kapljice koacervata, ki nato sedimentirajo ali

koalescirajo (se združujejo) v fazo koacervata. Koacervat se lahko tvori okoli trdnih delcev

(npr. zdravilne učinkovine), ki so prisotni v suspenziji. Z mešanjem koacervata,

preprečimo sedimentacijo in združevanje kapljic, z nadaljnjim zamreženjem z dodatki (npr.

glutaralaldehid) ali s toploto pa lahko pridobimo stabilne mikrokapsule oz. nanokapsule

[10].

Ionotropno geliranje

Priprava nanodelcev temelji na sposobnosti polielektrolitskega polimera npr. polikationa

hitozana, da ob dodatku nekega večvalentnega nasprotno nabitega iona npr. polianiona

natrijevega tripolifosfata (TPP) preide iz tekočega stanja v gel. Pri tem pride do ionske

interakcije oz. zamreženja, nastane polielektrolitski kompleks [20]. Shema reakcije je

prikazana na sliki 2 – 2.


Slika 2 – 2: Reakcijska shema nastanka nanodelcev iz hitozana, natrijevega tripolifosfata

(TPP) z ali brez uporabe polietilen glikola (PEG) [18], [21].


Pogoji priprave pri tej reakciji so zelo mili, saj ta poteka pri sobni temperaturi in brez

prisotnih organskih topil [18]. To dejstvo je predvsem pomembno pri pripravi dostavnih

sistemov za zdravilne učinkovine, ki so velikokrat občutljive na različne dejavnike pri

sintezi (temperatura, topila, pH…). Pripravo nanodelcev iz hitozana je prvi opisal Calvo in

sodelavci. Hitozan so raztopili v razredčeni ocetni kislini v prisotnosti ali odsotnosti

stabilizatorja, nato so k temu dodali raztopino polianiona. Ugotovili so, da nanodelci

nastanejo samo v točno določenem koncentracijskem območju reaktantov, kar je razvidno

iz diagrama na sliki 2 – 3.

Slika 2 – 3: Območje nastajanja nanodelcev kot funkcija končne koncentracije hitozana in

TPP-ja v suspenziji [20].

Velikost nanodelcev so spreminjali z variiranjem razmerja med hitozanom, stabilizatorjem

in TPP-jem. Gan in sodelavci so izvedli obsežno raziskavo in ugotovili, da zraven

razmerja hitozan/TPP na velikost, zeta potencial in morfologijo delcev vplivajo fizikalno-

kemijske lastnosti hitozana (molekulska masa, stopnja deacetilacije) in pH medija delovne

suspenzije [22].

Bao in sodelavci so proučevali vpliv kationskega surfaktanta heksadecil-trimetil-

amonijevega bromida na velikost in stabilnost hitozanskih nanodelcev. Ugotovili so, da se

je ob dodatku surfaktanta hidrodinamski radij nanodelcev zmanjšal, sočasno se je zeta

potencial povečal, kar pomeni, da je bila disperzija nanodelcev stabilnejša, še posebej pri

visokih koncentracijah hitozana [23].

Kunjachan in Jose sta prva analizirala postopek ionskega geliranja med hitozanom in

TPP-jem z kvalitativnimi tehnikami. Ugotovila sta, da pri postopku najprej nastane

kompleks dolgih oligomerov z polianionom, ki spominja na biserno ogrlico. Ta proces je

popolnoma slučajen, ampak obdrži enotnost glede na morfologijo površine. Po dodatku


kisline (HCl) suspenziji se na verigi tvorijo mesta za cepljenje. Ko raztopino nato nežno

premešamo, se na šibkih mestih veriga razcepi in posledično nastanejo nanodelci [21].

2.3 Analizne metode za karakterizacijo nanodelcev

Za karakterizacijo nanodelcev v koloidnih disperzijah so bile v okviru raziskovalnega dela

diplomske naloge uporabljene naslednje metode: polielektrolitska titracija za kvantitativno

določitev protoniranih amino skupin hitozanskih nanodelcev, metoda dinamičnega sipanja

laserske svetlobe za določitev velikosti nanodelcev, vrstična elektronska mikroskopija za

določitev in potrditev velikosti delcev in metoda laserske Dopplerjeve elektroforeze za

določitev zeta potenciala.

2.3.1 Polielektrolitska titracija

Polielektrolitska titracija je enostavna metoda za določanje naboja površine proteinov,

polielektrolitov in ostalih biopolimerov [24]. V vodni raztopini elektrolitov se polimeri

električno nabijejo. Površinski naboj je posledica disociacije funkcionalnih skupin polimera

in specifične adsorpcije prisotnih ionov in je odvisen od ionske moči vodne raztopine ter

vrste elektrolita in pH medija [25].

Večina biopolimerov največkrat vsebuje nabite karboksilne in/ali amino skupine.

Karboksilne skupine v raztopini s pH ≥ 7 disociirajo, kjer zaradi deprotonacije postanejo

negativno nabite. Amino skupine so v raztopini s pH ≤ 7 ak ceptorji protonov, pri čemer se

nabijejo pozitivno v NH3+.

Polielektrolitske titracije s prvotnim imenom koloidne titracije temeljijo na stehiometrični

reakciji med nasprotno nabitimi koloidnimi delci, kjer lahko uporabimo različne načine

indikacije ekvivalentne točke (meritve fluorescence, absorbance, prevodnosti, potenciala,

toka, itd.). Je izredno hitra tehnika z zadovoljivo stopnjo ponovljivosti. Pri splošnih

polielektrolitskih titracijah določimo končno točko reakcije vizualno ali spektrofotometrično

z določanjem spremembe barve indikatorja. Indikatorji so naravne ali sintetične spojine,

katerih barva se spreminja glede na pH območje, v katerem se nahajajo [26, 27].

Najpogosteje uporabljan kationski polielektrolitski titrant je PDADMAC (angl. poly-

diallyldimethylammonium chloride). Kot anionski polielektrolitski titrant pa prednjači Na-

PVS (angl. ˝polyvinyl sulphate˝ sodium salt). Kot indikatorja sta najbolj uporabljana orto-

toluidin modro (o-Tm) in kristal vijolično [27].


Princip polielektrolitskih titracij, ki smo jih izvedli v okviru diplomskega dela je prikazan na

sliki 2 – 3, in je sledeč. Titracija analita, pozitivno nabitega polielektrolita (hitozanski

nanodelci), v prisotnosti pozitivno nabitega indikatorja o-Tm poteče ob dodatku negativno

nabitega polielektrolita (titrant Na-PVS). Le-ta se najprej veže na prosta protonirana

kationska mesta hitozana. V stehiometrični točki je hitozan povezan s titrantom v

polielektrolitski kompleks, ki je nevtralno nabit. Molekule indikatorja sedaj lahko začnejo

reagirati s titrantom in tako tvorijo drugače obarvan kompleks. V ekvivalentni točki poteče

preskok barve iz modre v rdeče-vijolično barvo, ki ga okarakteriziramo z merjenjem

absorbance [28]

Slika 2 – 4: Shema polielektrolitske titracije kationskega polimera z anionskim

polielektrolitskim titrantom ob prisotnosti kationskega indikatorja [28].

Uporaba

Polielektrolitske titracije se dandanes uporabljajo za karakterizacijo polielektrolitov v

procesu odpadnih voda ter na biomedicinskem in biotehnološkem področju za

karakterizacijo biopolimerov kationskega ali anionskega značaja. Prav tako se lahko

uporabljajo za spremljanje procesa delignifikacije v papirni industriji, določanje

površinskega in celokupnega naboja vlaken, ugotavljanje kakovosti vlaken ter nenazadnje

za zasledovanje kislinsko – baznih interakcij med trdnimi nosilci in tekočimi adsorbati [27].


2.3.2 Dinamično sipanje laserske svetlobe

Dinamično sipanje laserske svetlobe (DLS) ali fotonska korelacijska spektroskopija (PCS),

je dobro osnovana, tehnika brez poseganja v merjen vzorec. Z njo lahko merimo velikosti

molekul in delcev v submikronskem območju. Z najnovejšo tehnologijo lahko izmerimo

velikosti manjše od 1 nanometra [29]. Na sliki 2 – 2 je prikazana shema delovanja

najnovejše aparature Zetasizer serije Nano podjetja Malvern. Z laserskim žarkom (1)

svetimo na kiveto (2) preko leče (4). V kiveti se nahaja raztopina preiskovanih delcev

dispergiranih v vodi ali kakem drugem topilu (vzorec). Svetloba na vzorcu močno sipa, kar

opazimo kot svetlo črto, ki se razteza od enega do drugega robe kapilare. Sipano svetlobo

detektiramo s fotopomnoževalko (3A) in nato signal prenesemo na računalnik (6) z

vgrajenim korelatorjem (5).

Slika 2 – 5: Konfiguracija aparature Zetasizer serije Nano za merjenje dinamičnega

sipanja laserske svetlobe podjetja Malvern [30].

DLS metoda temelji na razprševanju laserske svetlobe na delcih dispergiranih v tekoči

fazi. Ta fizikalni pojav se imenuje Fraunhof-erjevo sipanje, za katerega velja, da je kot

razpršitve svetlobe odvisen od velikosti delcev. Kadar je vir svetlobe laser in je svetloba

monokromatska, lahko z avtokorelacijsko funkcijo določimo ponavljajoče se vzorce in s

tem sledimo gibanju delcev, kar nas pripelje do difuzijskega koeficienta, iz česar lahko ob

poznavanju lastnosti disperzije sklepamo o velikosti delcev [25].


Če svetloba pada na koloidno disperzijo, v kateri so majhni delci, se ta svetloba na delcih

razprši. Ob robu razpršena svetloba lahko interferira z odbito svetlobo drugih delcev. Ker

se delci gibljejo naključno (Brownovo gibanje), se v interferencah pojavljajo nihanja.

Manjši delci razpršijo svetlobo pod večjim kotom in obratno. Enako veliki delci sipajo

svetlobo pod istim kotom, pri čemer je intenziteta sipane svetlobe premosorazmerna

relativnemu deležu teh delcev. Sipanje samo, kakor tudi intenziteta sipane svetlobe, nista

odvisna od oblike delcev. Uklonsko sliko laserske svetlobe zazna detektor. Aparatura je

sestavljena iz dispergirne enote, merilne enote ter pripadajoče računalniške opreme [25,

30, 31].

Avtokorelacijsko funkcijo intenzitete sipane svetlobe podaja enačba:

(2) ( ) ( ) ( )G I t I tτ τ=< + > , (2.1)

kjer τ predstavlja časovni zamik korelatorja, < > pa označuje povprečje po času.

Za delce, ki so v Brownovem gibanju, avtokorelacijska funkcija kot funkcija časovnega

zamika eksponentno pada:

d(2 / )( ) eG A B τ ττ −= + ⋅ , (2.2)

kjer A in B predstavljata amplitudo statičnega oz. dinamičnega dela, τd pa difuzijski čas. Za

translacijsko Brownovo gibanje delcev je τd podan z enačbo:

2d(1/ ) D qτ = ⋅ , (2.3)

pri čemer pa je sipalni vektor q podan z zvezo:

4 sin( / 2) /q nπ θ λ= , (2.4)

kjer je n lomni količnik vode, v kateri so dispergirani delci, θ sipalni kot in λ valovna dolžina

laserske svetlobe.

Meritve potekajo navadno tako, da sipanje opazujemo pri različnih sipalnih kotih θ, ter

konstruiramo funkcijo med obratno vrednostjo difuzijskega časa τd in kvadratom

valovnega vektorja q2. Zveza je linearna in preko nje dobimo difuzijsko konstatno D.

Difuzijska konstanta za translacijsko gibanje sferičnih sipalcev je podana z Stokes-

Einsteinovo enačbo:

H/ (6 )D kT rπ η= , (2.5)


kjer k predstavlja Boltzmannovo konstanto, T temperaturo raztopine oz. vzorca, rH

hidrodinamski polmer delcev, η pa viskoznost medija. Enačbo (2.5) lahko preoblikujemo

tako, da dobimo:

H / (3 )d kT Dπη= (2.6)

Če poznamo η in T, lahko iz izmerjene difuzijske konstante izračunamo hidrodinamski

premer delcev v raztopini [25, 30, 31].

2.3.3 Elektrokinetični pojavi na mejnih površinah

Elektrokinetični pojavi zajemajo procese, v katerih je prisotno gibanje nabitih delcev

vzdolž nabitih površin. Pod vplivom električnega polja se nabiti delec v mediju (raztopini

elektrolita) giblje, pri čemer se ustvari strižna ploskev med delcem in raztopino elektrolita.

Potencial na strižni ploskvi imenujemo elektrokinetični potencial ali zeta potencial (ζ-

potencial) in je količina, ki jo lahko določimo eksperimentalno. Poznamo štiri

elektrokinetične pojave, in sicer: elektroforeza, elektroosmoza ter strujni in sedimentacijski

potencial [32].

Slika 2 – 6: Shematska predstavitev zeta potenciala.

Pri elektroforezi opazujemo hitrost gibanja nabitih koloidnih delcev v električnem polju.

Predpostavimo, da električno polje ne deformira električnega dvosloja delcev. Za okrogle


delce velja, da je njihova hitrost sorazmerna električni poljski jakosti E, (E = U/l, U je

napetost in l je razdalja med elektrodama) po enačbi:

uEν = , (2.7)

kjer je sorazmernostna konstanta u elektroforetska gibljivost ionov. Z merjenjem hitrosti

gibanja delcev v električnem polju z jakostjo E lahko izmerimo njihovo gibljivost.

Elektroforetska gibljivost je odvisna od naboja delca, zato iz nje lahko izračunamo tudi

potencial ζ s preureditvijo enačbe Smoluchowskega da dobimo:

/uζ ε η= , (2.8)

kjer je ε dielektrična konstanta in η viskoznost vodnega medija. Ob predpostavki, da ima

električna dvoplast zanemarljivo majhno debelino v primerjavi s krivinskim radijem delca

[32].

ζ-potencial se uporablja za določanje relativne stabilnosti koloidnih vodnih raztopin. Kadar

je ζ-potencial > 30 mV ali < -30 mV, delci odbijajo drug drugega, kar poviša stabilnost

disperzije. Kadar pa se ζ-potencial premika proti 0 mV (izoelektrična točka), možnost

agregacije delcev narašča, kar vodi do znižanja stabilnosti [33].

ζ-potencial izmerjen v okviru diplomskega dela je izračunan iz elektroforetske gibljivosti,

izmerjene z metodo laserske Dopplerjeve anemometrije pri elektroforetičnim sipanjem

svetlobe ELS (angl. electrophoretic light scattering).

2.3.4 Vrstična elektronska mikroskopija

Vrstična elektronska mikroskopija SEM (angl. Scanning Electrone Microscopy) daje

informacije o topografiji in morfologiji površine trdnih nehlapnih vzorcev z ločljivostjo

manjšo od 3 nm, z njeno pomočjo pa lahko določimo tudi njihovo kemijsko sestavo [34].

Ločljivost pridobljene slike je odvisna od narave vzorca in tlaka v merilni komori.

Pri SEM uporabljamo za opazovanje strukture vzorca fokusiran snop elektronov. Med

pospešenim koherentnim primarnim snopom elektronov majhnega preseka in atomi

vzorca prihaja do interakcij, zaradi česar pride do emisije sekundarnih in odbitih

elektronov s površine vzorca, le-te pa nato s pomočjo detektorjev zaznamo in prevedemo

v sliko. Ker sta smer in intenziteta nizkoenergijskih sekundarnih elektronov odvisni od

topografije vzorca, vidimo različno orientirane ploskve na zaslonu kontrastno, to pa nam

daje globinsko ostrino in realno sliko površine. Elektronsko slabo prevodne vzorce


moramo pred slikanjem naprašiti oz. napariti s tankim filmom prevodnega materiala

(navadno C - ogljik ali Au - zlato). S tem preprečimo električno nabijanje pri izpostavitvi

vzorca elektronskemu snopu. Če vzorec ni prevoden, se poškoduje (zaradi toplote in

sevanja), kar pripelje do odnašanja materiala z vzorca. Z detekcijo emitiranih Augerjevih

elektronov in rentgenske svetlobe lahko pridobimo tudi informacije o kemijski sestavi

vzorcev [34].


3 EKSPERIMENTALNI DEL

3.1 Materiali

• hitozan (MAHTANI CHITOSAN 124, Batch no.: 201508, India; M ≈ 200 000 g/mol,

DD = 90%)

• natrijev tripolifosfat (TPP), Sigma-Aldrich, Nemčija

• polietilen glikol (PEG), M = 1 500, 4 000 g/mol, Merck, Nemčija

• koncentrirana mlečna kislina (PhEur), Fluka, Španija

• natrijev polivinil sulfonat (Na-PVS), (CAS: 9002-97-5), Sigma-Aldrich, Nemčija

• otro-Toluidin modro (CAS: 92-31-9), Sigma-Aldrich, Nemčija

• Milli-Q voda, Milli-Q Plus, Millipore Corporation, ZDA

3.2 Laboratorijska oprema in aparature

• merilne bučke; 250 mL, 500 mL, 1000 mL

• steklena čaša; 50 mL, 100 mL, 250 mL, 1000 mL, 2000 mL

• plastične posodice; 50 mL

• centrifugirke; 50 mL

• pipete; 1 mL, 10 mL, 20 mL, Eppendorf, Rainin

• precizna tehtnica AE 240, Mettler, ZDA

• magnetno mešalo Rotamix 550 MMH,Tehtnica, Slovenija

• krožni stresalnik, Promax 2020, Heidolph, Nemčija

• pH meter SevenGo, Mettler Toledo, ZDA

• ultrazvočna kopel,

• centrifuga Rotina 380R, Hettich, Nemčija

• titrator DL53, Mettler Toledo, ZDA

• zetasizer Nano ZS, Malvern, Velika Britanija

• elektronski mikroskop, Carl Zeiss SUPRA 35VP, Nemčija


3.3 Metode

3.3.1 Priprava raztopin

Priprava raztopine hitozana γ = 10 mg/mL, pH = 3,6

10,0035 g hitozana v prahu smo suspendirali v 990 mL Milli-Q vode v 2000 mL čaši.

Raztapljanje smo dosegli z dodajanjem nekaj ml koncentrirane mlečne kisline. S

segrevanjem raztopine pri temperaturi T = 40 °C in ob konstantnem mešanju (t = 1 h) smo

pospešili raztapljanje. Nato smo raztopino mešali še 24 ur brez segrevanja. Naslednji dan

smo s koncentrirano mlečno kislino uravnali pH na 3,6 z uporabo pH metra in z vodo

dopolnili do končnega volumna 1000 mL.

Priprava raztopine hitozana γ = 5 mg/mL s PEG γ = 10 mg/mL

S pomočjo pipete smo prenesli 250 mL hitozana s γ = 10 mg/mL v 500 mL merilno bučko

in razredčili do oznake. Delo je potekalo previdno in počasi zaradi viskoznosti prvotne

raztopine hitozana. Nato smo s pomočjo merilnega valja odmerili 150 mL raztopine

hitozana s koncentracijo γ = 5 mg/mL v tri različne 250 mL steklenice. V prvo smo dodali

1,5084 g PEG z molekulsko maso M = 1500 g/mol, v drugo 1,5034g PEG z molekulsko

maso M = 4000 g/mol, v tretjo steklenico nismo dodali ničesar. Steklenici s PEG smo

postavili na magnetno mešalo in mešali približno 30 minut pri 300 obratih/minuto.

Priprava raztopine natrijevega tripolifosfata, γ = 0,7 mg/mL

0,7050 g TPP smo zatehtali v plastični posodi za tehtanje. Nato smo ga kvantitativno

prenesli v 1000 mL merilno bučko in dopolnili do oznake z Milli-Q vodo.

Priprava raztopine Na-PVS, c = 3, 283 mmol/L

371,4 μL raztopine natrijevega polivinil sulfonata (w = 25 %) smo odpipetirali v 250 mL

merilno bučko in dopolnili do oznake z Milli-Q vodo.

Priprava raztopine o-Toluidina modro, c = 0,1 mmol/L

0,0077 g o-Toluidina modro smo zatehtali v ladjici za tehtanje. Nato smo ga kvantitativno

prenesli v 250 mL merilno bučko in dopolnili do oznake z Milli-Q vodo.


3.3.2 Izdelava nanodelcev iz hitozana in TPP

Ker nanodelci nastanejo samo v točno določenem koncentracijskem območju reaktantov

smo kot izhodišče za izdelavo nanodelcev uporabili ugotovitve Calva et. al. Pripravili smo

vzorce z različnimi masnimi razmerji hitozan/TPP. V ta namen smo uporabili en. (3.1), s

katero je moč izračunati potrebne volumne obeh reaktantov.

TPPH

H TPP (H/TPP)

z VVz

γγ γ

⋅ ⋅=

+ ⋅, (3.1)

TPP HV V V= − , (3.2)

kjer so: VH – volumen raztopine hitozana, mL,

γTPP – masna koncentracija TPP, mg/mL,

z(H/TPP) – masno razmerje hitozan/TPP,

V – volumen vzorca, mL,

γH – masna koncentracija hitozana, mg/mL in

VTPP – volumen raztopine TPP, mL.

V 50 mL plastične posodice smo najprej dodali preračunane volumne γ = 5 mg/mL

raztopine hitozana. Zatem smo posodice postavili na krožni stresalnik in jih nanj vpeli. Ob

konstantnem stresanju pri 200 obratih/minuto smo vsakemu vzorcu posebej postopoma

dodajali preračunane volumne γ = 0,7 mg/mL raztopine TPP. Disperzije smo stresali še

približno eno uro pri sobni temperaturi (T = 24°C). Masna razmerja hitozan/TPP v

disperziji so bila z(H/TPP) = 3, 4, 5, 6, 7 in 8. Končne disperzije smo pred nadaljnjimi

meritvami centrifugirali 10 min pri 3000 obratih na minuto.

3.3.3 Izdelava nanodelcev iz hitozana, PEG in TPP

Izdelava nanodelcev iz hitozana, PEG in TPP je potekala podobno izdelavi nanodelcev

brez PEG, opisane v prejšnjem podrazdelku 3.3.2, le da smo uporabili namesto raztopine

hitozana samega, raztopino hitozana z dodanim PEG dveh različnih molekulskih mas

posebej M = 1500 g/mol in M = 4000 g/mol. Masna razmerja hitozan/TPP v disperziji so

bila z(H/TPP) = 3, 4 in 5. Končne disperzije smo pred nadaljnjimi meritvami centrifugirali 10

min pri 3000 obratih na minuto.


3.3.4 Določitev prostih amino skupin nanodelcev

Disperzije nanodelcev smo titrirali z uporabo titratorja DL53, Mettler Toledo opremljenega

s Fototrodo DP660. Model DP660 fototroda je fotometrični senzor, z virom svetlobe v

vidnem delu spektru z valovno dolžino λ = 660 nm (rdeča barva). Pri polielektrolitskih

titracijah smo zasledovali potencial vzorca ob dodatku indikatorja orto-toluidin modro v

odvisnosti od dodanega titranta. Dejansko spremljamo absorbanco, vendar programska

oprema titratorja prevede absorbanco v potencial v mV, ta parametra sta obratno-

sorazmerna.

V posodico za titriranje smo odpipetirali 1mL vzorca, temu smo dodali 0,5 mL indikatorja

o-toluidin modrilo ter raztopino razredčili do 40mL z bidestilirano vodo. Tako pripravljene

vzorce smo titririrali z raztopino Natrijevega poli(vinil sulfonata) s koncentracijo c = 3,283

mmol/L.

Vpliv pH na naboj

Vzorcem smo ob konstantnem mešanju na magnetnem mešalu uravnavali pH z raztopino

NaOH c = 1 mol/L, da smo se izognili prevelikem redčenju raztopine. Ko smo pH vzorca

uravnali na želeno vrednost, smo odpipetirali 1 mL vzorca in ga titrirali po postopku v

prejšnjem razdelku.

3.3.5 Merjenje velikosti nanodelcev

Vzorce smo pred merjenjem za 5 min postavili v ultrazvočno kopel. Vzorce smo nato

injicirali v kiveto (DTS10012). Pri tem smo bili pozorni, da je bila kiveta popolnoma čista in

da v vzorcu niso bili prisotni zračni mehurčki.

Pogoji pri katerih smo izvajali meritve:

• Laserska svetloba (He-Ne laser) λ = 633 nm

• T = 25°C

• Čas merjenja = 120 s

• Število ponovitev = 3

• η disperznega medija = 0,89 cP (mPa s)

3.3.6 Merjenje zeta potenciala

Vzorce smo pred merjenjem za 5 min postavili v ultrazvočno kopel. Vzorce smo nato

injicirali v kapilarno celico (DTS1060) za merjenje zeta potenciala, ki smo jo predhodno


dobro sprali s prečiščeno vodo. Pri tem smo bili pozorni, da v vzorcu niso bili prisotni

zračni mehurčki.

Pogoji pri katerih smo izvajali meritve:

• Laserska svetloba (He-Ne laser) λ = 633 nm

• T = 25°C

• Število ponovitev = 3

• η disperznega medija = 0,89 cP (mPa s)

• ε disperznega medija = 79,0

3.3.7 Analiza nanodelcev pod SEM mikroskopom

Raztopine vzorcev smo pred opazovanjem z visokoločljivim vrstičnim elektronskim

mikroskopom Carl Zeiss SUPRA 35VP, opremljenega z energijsko disperzijskim

spektrometrom Inca 400 (Oxford Instruments), nanesli na aluminijaste nosilce. Vzorce

smo nato 1 uro sušili v sušilniku pri 40°C. Zaradi mehke narave in velikosti delcev v

vzorcih smo le te pred slikanjem naprašili s tanko plastjo (cca. 8 nm) mešanice Au/Pd

(zlato/paladij), ki je splošno uporabljena kombinacija za slikanje mehkih materialov z

elektronsko mikroskopijo.

3.3.8 Mikrobiološko testiranje

Mikrobiološko testiranje protimikrobnosti nanodelcev so opravili v Centru za mikrobiologijo

Zavoda za zdravstveno varstvo (ZZV) v Mariboru. Za izvedbo mikrobiološkega testiranja

so uporabili dinamično stresalni test (ASTM E 2149-01). Protimikrobno delovanje so

testirali na tri patogene bakterije: Gram-pozitivni Staphylococcus aureus in Streptococcus

agalactiae, ter Gram-negativno Escherichia coli, ter na dve patogeni glivi: Candida

albicans in Candida glabrata.

Izvedba dinamično stresalnega testa vključuje:

• pripravo bakteriološkega gojišča,

• pripravo pufrne raztopine (pH = 6,8) in cepitev bakterij,

• inkubacijo in

• vrednotenje protimikrobne učinkovitosti.

Priprava bakteriološkega gojišča, pufrne raztopine ter cepitev bakterij

V skladu s standardom ASTM E 2149-01 so pripravili bakteriološko gojišče (agar) v

napravi Agarklav 5/10. Sledila je priprava fosfatnega pufra in cepitev bakterij. Cepitev


poteka tako, da s cepilno iglo prenesejo kolonije bakterij v epruveto s fiziološko raztopino,

kateri nato na denziometru izmerijo optično gostoto v enotah McFarland (MF). MF je

standardizirana enota za merjenje gostote bakterij, na podlagi katere se iz McFarland

skale odčita koncentracija bakterij v raztopini. Tako pripravljeno cepico ustrezno razredčijo

s fosfatnim pufrom, da dobijo ‘delovno raztopino’ z zahtevano koncentracijo bakterij, ki je

1,5 ∙ 105 bakterij [35].

Stresanje

V plastične posodice s 50 mL cepljene ‘delovne raztopine’ so s pipeto dodali 1 mL

vzorca nanodelcev. Prelivanje vzorcev opravijo v neposredni bližini odprtega plamena,

da zagotovijo aseptično delovno okolje. Zatem posodice dobro zaprejo in jih stresajo 1 h

na stresalniku pri temperaturi 37 ºC. Zaradi nadzora rasti bakterij, se stresa tudi samo

‘delavno raztopino’, brez vzorca, ki je predstavljala kontrolo [35].

Inkubacija

Inkubacijo bakterij so izvedli po 1 minutnem ter 1 urnem stresanju vzorcev. V aseptičnih

pogojih so 0,1 mL raztopine razmazali po površini agarja ter petrijevke inkubirali 24 h pri

temperaturi 37 ºC.

Vrednotenje protimikrobne učinkovitosti

Po končani inkubaciji so pod v šrevni komori (slika 3 – 1) prešteli število bakterijskih

kolonij, ki so se razrasle na hranljivem agarju med inkubiranjem, in sicer po 1 minutnem

stresanju (čas ˝0˝) in po 1 urnem stresanju. Število bakterij v času ˝0˝ je predstavljalo

začetno koncentracijo bakterij v ‘delovni raztopini’ [35].

Slika 3 – 1: Števna komora namenjeno štetju bakterijskih kolonij [35].


Učinkovitost protimikrobne apreture se določi z izračunom bakterijske redukcije R po

naslednji enačbi:

100⋅−

=A

BAR (3.3)

kjer so: R – bakterijska redukcija, %,

A – število kolonijskih enot (CFU) po 1 minutnem stresanju (čas ˝0˝) in

B – število kolonijskih enot (CFU) po 1 urnem stresanju.


4 REZULTATI IN DISKUSIJA

Na začetku raziskovalnega dela smo najprej opravili preliminarne poskuse z namenom,

da bi ugotovili, če z uporabo en. (3.1) lahko pripravimo delce v nano območju. Pri

postopku ionotropnega geliranja smo opazovali kaj se je zgodilo, ko smo raztopini

hitozana (H) dodajali natrijev tripolifosfat (TPP). Opazili smo, da pri masnih razmerjih

hitozan/TPP, z(H/TPP) > 10 po nekaj minutah nastane raztopina, pri z(H/TPP) < 3 pa so se v

vzorcu začeli tvoriti agregati. Sklepamo, da se v prvem primeru, ko je masa hitozana v

primerjavi s TPP mnogo večja, nasprotno nabita polielektrolita enostavno ne moreta

dovolj zamrežiti. V drugem primeru, ko je masa hitozana v primerjavi s TPP le malo večja,

sklepamo, da je zaradi prekomernega zamreženja hitozan izgubil ves svoj naboj; z

drugimi besedami vse amino skupine so reagirale s TPP, ki je tokrat v presežku.

Nanodelci sicer lahko nastanejo, vendar se brez naboja med seboj ne morejo več odbijati,

zato koalescirajo v vedno večje skupke, ki se nato ko dosežejo kritično maso zaradi sile

težnosti začnejo posedati na dno posode. Raztopine nanodelcev (ND) katere smo

analizirali so bile opalescentne. Dan po pripravi smo na dnu posodic pri vseh pripravljenih

raztopinah opazili usedline (aglomerate). Zato smo meritve ob predhodnem centrifugiranju

pri 3000 obratih/min, opravili še enkrat. Ugotovili smo, da so bile meritve kljub agregaciji

ponovljive. Masna razmerja z(H/TPP), končne koncentracije hitozana in TPP ter pH disperzij,

katerim smo proučevali lastnosti so zabeležene v preglednici 4 – 1. Vzorce smo označili s

črkama HT in s številom, ki je enako številu masnega razmerja z(H/TPP).

Preglednica 4 – 1: Končne koncentracije hitozana in TPP v disperziji nanodelcev.

Oznaka z(H/TPP) pH γ k,H/(mg/mL) γ k,TPP/(mg/mL)

HT3 3 4,24 1,48 0,49

HT4 4 4,12 1,79 0,45

HT5 5 4,04 2,06 0,41

HT6 6 3,99 2,28 0,38

HT7 7 3,97 2,47 0,35

HT8 8 3,93 2,64 0,33


4.1 Določitev prostih amino skupin nanodelcev s polielektrolitsko titracijo

Na sliki 4 – 1 je prikazan primer diagrama polielektrolitske titracije in sicer za raztopino

hitozana γH = 1,79 mg/mL zaradi dodatka indikatorja orto-toluidin modro vzorcu, dobimo

modro obarvano raztopino. Raztopino titriramo z Na-PVS, ki s hitozanom tvori

polielektrolitski kompleks. Po ekvivalentni točki (nevtralizacija hitozana s Na-PVS),

presežek titranta reagira z indikatorjem in nastane rdeče – vijolično obarvan kompleks Na-

PVS – indikator. Zaradi zmanjšanja koncentracije indikatorja v vzorcu se absorbanca

znižuje (potencial zvišuje). Po nastalem stabilnem kompleksu Na-PVS – indikator, zaradi

efekta redčenja (dodajanje titranta), ki je komaj opazen, potencial v zaključnem delu

krivulje nekoliko narašča (absorbanca pada).

V ekvivalentni točki, opazimo preskok barve indikatorja iz modre v rdeče-vijolično. Na

spodnjem diagramu je to razvidno iz prevoja (naklona) titracijske krivulje. S pomočjo

krivulje prvega odvoda smo izračunali volumen porabe Na-PVS, izbrali smo točko v kateri

je vrednost prvega odvoda najvišja VNa-PVS = 2,9 mL.

Slika 4 – 1: Polielektrolitska titracijska krivulja hitozana, γH = 1,79 mg/mL.

Na enak način smo določili volumne porabe titranta disperzijam nanodelcev iz preglednice

4 – 1, slepima probama obeh polielektrolitov in vodi. Vsak vzorec smo titrirali v treh

paralelkah.

Zaradi boljše preglednosti smo združili vse titracijske krivulje nanodelcev ene paralelke pri

različnih masnih razmerij H/TPP v en diagram, prikazan v Prilogi A (slika A.7 – 1) in

posebej diagrame za raztopine hitozana (slika A.7 – 2), vodo (slika A.7 – 3), ter TPP (slika

A.7 – 4). SH označuje slepo probo hitozana, STPP slepo probo TPP-ja in H2O vode.

-50

50

150

250

350

450

550

880

900

920

940

960

980

1000

1020

1040

1060

0 1 2 3 4 5 6

Prvi

odv

od (m

V/m

L)

E/m

V

V (Na-PVS)/mL

Titracijska krivuljaKrivulja prvega odvoda


Množino prostih amino skupin oz. pozitivnega površinskega naboja smo lahko izračunali

iz izmerjenih volumnov porabe Na-PVS, ker smo poznali koncentracijo titranta in volumen

titriranega vzorca ob predpostavki 100 % stehiometrične reakcije.

4.1.1 Vpliv masnega razmerja hitozan/TPP na naboj

V preglednici 4 – 2 so podani rezultati polielektrolitskih titracij kot preračunane vrednosti

množin amino skupin in sicer v enotah: mmol/g ND za nanodelce, oz. mmol/g H za slepe

probe hitozana.

Preglednica 4 – 2: Rezultati polielektrolitskih titracij.

Oznaka pH n(NH2)/m(H)/ (mmol/g ND)

RSD/%

HT3 4,24 1,998 0,00

HT4 4,12 2,585 3,27

HT5 4,04 3,056 7,53

HT6 3,99 3,287 2,17

HT7 3,97 3,405 1,97

HT8 3,93 3,498 1,82

SH3 3,82 5,177 2,35

SH4 3,78 5,182 2,04

SH5 3,75 5,156 3,57

STPP 9,8 0 0

H2O 7,00 0 0

Opazili smo, da je pozitivni naboj hitozana/g hitozana stalen in znaša ca. 5 mmol/g. Naboj

nanodelcev na maso nanodelcev se je povečeval skladno s povečanjem masnega

razmerja hitozan/TPP. S povišanjem masnega razmerja smo povečevali koncentracijo

hitozana in zmanjševali koncentracijo TPP, kar je razvidno iz preglednice 4 – 1. Glede na

to, je s porastom z(H/TPP) pri formulaciji nanodelcev moč pričakovati manjše blokiranje oz.

senčenje prostih dostopnih amino skupin (NH3+) hitozana. Z zmanjševanjem koncentracije

TPP je očitno dostopnost amino skupin večja, saj so ionske interakcije oz. zamreženje

med obema polimeroma manj intenzivne. Izmed vseh proučevanih masnih razmerij je

glede na količino prostih amino skupin, ki so odgovorne za protimikrobni značaj, najbolj

idealno masno razmerje z(H/TPP) = 8. Opazimo lahko tudi, da sta vsebnosti prostih amino


skupin slepe probe TPP in vode enaki nič, kar je v skladu z pričakovanji in potrjujejo

relevantnost polielektrolitske titracije.

Slika 4 – 2 prikazuje diagram površinskega naboj nanodelcev v odvisnosti od masnega

razmerja hitozan/TPP. Iz diagrama lahko opazimo lahko, da je koncentracija površinskega

naboja pri hitozanskih nanodelcih manjša kot v raztopini hitozana. Iz tega lahko sklepamo,

da je pri nanodelcih prišlo do reakcije med hitozanom in TPP-jem in posledično

zmanjšanja vsebnosti prostih amino skupin. Razlika v vsebnosti amino skupin med

hitozanom in formuliranimi nanodelci pri isti koncentraciji hitozana (masna razmerja 3, 4,

5) je cca. 3,8 mmol/L NH2 skupin. Predpostavljamo, da je tolikšna množina hitozana

zreagirala s TPP tekom ionskega geliranja. Očitno je v povprečju več kot 50% amino

skupin hitozana blokiranih tekom postopka priprave nanodelcev z uporabo ionotropnega

geliranja. S povišanjem z(H/TPP) od 3 do 5 se dostopnost amino skupin zvišuje, saj se v

istem zaporedju blokiranost skupin zmanjšuje v območju od 50% do 30% (slika 4 – 2). O

nastalih vzrokih za te rezultate smo že diskutirali v prejšnjem odstavku.

Slika 4 – 2: Koncentracija površinskega naboja nanodelcev v odvisnosti od z(H/TPP).

4.1.2 Vpliv stabilizatorja PEG na naboj nanodelcev

Ugotavljali smo vpliv PEG na naboj nanodelcev. Med seboj smo primerjali nanodelce brez

dodanega PEG in nanodelce z dodanim PEG z M = 1500 g/mol oz. z M = 4000 g/mol. Iz

diagrama na sliki 4 – 3 lahko vidimo da PEG z nižje molekulsko maso ne vpliva na naboj,

medtem ko bi PEG višje molekulske mase lahko imel minimalen vpliv pri razmerju z(H/TPP)

= 4.

0

2

4

6

8

10

12

2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

c(N

H 2)/

(mm

ol/L

)

z(H/TPP)

hitozan

nanodelci


Slika 4 – 3: Vpliv molekulske mase PEG na množino dostopnih amino skupin.

Sklepamo, da je zaznana minimalna razlika v območju standardnega odstopanja meritev.

4.1.3 Vplih pH na naboj nanodelcev

Opazili smo da je naboj hitozanskih nanodelcev v precejšni meri odvisen od pH medija,

kar je pričakovano glede na vrednost disociacijske konstante hitozana, ki znaša pKa = 6,3

[36]. Proučili smo tudi vpliv PEG (M = 1500 g/mol) na naboj v odvisnosti od pH.

Iz diagrama na sliki 4 – 4 je tako razviden plato krivulje hitozana kot tudi nanodelcev pri

100% protonaciji amino skupin, to je v območju pH vrednosti od 3 do 4. Vsebnost amino

skupin hitozana, nanodelcev in nanodelcev s PEG s povišanjem pH pada zaradi

deprotonacija le-teh vse do pH = 7, kjer je stopnja deprotonacije enaka 100% (oz. stopnja

protonacije je 0).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

2,5 3 3,5 4 4,5 5

n(N

H 2)/

m(N

D) /

(mm

ol/g

ND)

z(H/TPP)

brez

PEG 1500

PEG 4000


Slika 4 – 4: Koncentracija protoniranih amino skupin v odvisnosti od pH, γH = 2,06 mg/ml,

z(H/TPP) = 5.

Razlike v višini krivulj na sliki 4 – 4 so zaradi vsebnosti amino skupin, ki so seveda najbolj

dostopne v raztopini hitozana, nato v nanodelcih in nazadnje v nanodelcih z dodatkom

stabilizatorja PEG. Kot smo že razpravljali TPP (elektrostatske interakcije) in še

intenzivnejše PEG (vodikove vezi) zablokirata in/ali zasenčita proste amino skupine

hitozana tekom ionskega geliranja.

4.2 Določitev velikosti nanodelcev

Programska oprema aparature Zetasizer Nano ZS podjetja Malvern nam je kot rezultat

meritev podala izračunano Z povprečje meritev hidrodinamskega premera dh v nm in

polidisperzni indeks PDI na podlagi standarda ISO 13321:1996 E. Rezultati meritev

pripravljenih nanodelcev so prikazani v preglednici 4 – 3. Ugotovili smo, da se je

hidrodinamski premer nanodelcev povečeval skladno s povečevanjem masnega razmerja

hitozan/TPP od 3 do 7.

0

2

4

6

8

10

12

2 3 4 5 6 7 8

c(N

H 2))/

mm

ol/L

)

pH

hitozan

nanodelci

nanodelci z PEG


Preglednica 4 – 3: Hidrodinamski premer nanodelcev, merjen po 12 urah nastanka

nanodelcev.

Oznaka z(H/TPP) dh /nm RSD/% PDI

HT3 3 260,8 0,15 0,371±0,044

HT4 4 556 4,98 0,555±0,064

HT5 5 706,5 0,69 0,650±0,198

HT6 6 882,7 0,00 0,540±0

HT7 7 1000 3,33 0,546±0,059

SH5 0 4167 0,92 0,500±0,063

STPP 0 3745 5,89 0,451±0,039

Opazili smo trend povečanja velikosti s povišanjem razmerja hitozan/TPP. Opazili smo

tudi visok indeks polidisperznosti nanodelcev, kar nam pove, da je v disperziji prisotna

širša populacija različno velikih nanodelcev.

Nanodelcem smo izmerili velikosti tudi po enem tednu priprave le-teh. Rezultati so

prikazani v preglednici 4 – 4.

Preglednica 4 – 4: Hidrodinamski premer nanodelcev, merjen po enem tednu nastanka

nanodelcev.

Oznaka z(H/TPP) dh /nm RSD/% PDI

HT3 3 314 1,84 0,740±0,044

HT4 4 451,8 1,99 0,851±0,090

HT5 5 732,8 2,33 0,862±0,103

HT6 6 976,3 8,91 0,839±0,135

HT7 7 1296 5,87 1±00

SH5 0 5255 13,36 0,426±0,095

STPP 0 3745 5,89 0,451±0,039

Če primerjamo preglednici 4 – 3 in 4 – 4 lahko opazimo, da je velikost nanodelcev v

disperziji, izmerjeni po enem tednu, znatno višja v primerjavi s sveže pripravljenimi (12 h)

disperzijami nanodelcev, kar nakazuje na aglomeracijo nanodelcev.


Prav tako smo opazili, da so vrednosti PDI iz preglednice 4 – 3 mnogo manjše, v

primerjavi z vrednostmi iz preglednice 4 – 4. Razpršenost oz. raznolikost velikosti

nanodelcev po 7 dneh priprave je tako širša, kar potrjuje aglomeracijo nanodelcev s

časom.

Slika 4 – 5 prikazuje histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja

merjen po 12 urah, medtem ko slika 4 – 6 prikazuje histogram porazdelitve nanodelcev

glede na intenziteto sipanja merjen po 7 dneh. V obeh primerih je bil testiran vzorec z

z(H/TPP) = 5.

Slika 4 – 5:Histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja merjen po 12

urah, z(H/TPP) = 5.

Slika 4 – 6: Histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja merjene po 7

dneh, z(H/TPP) = 5.

0

2

4

6

8

10

1 10 100 1000 10000

Inte

nsity

(%)

Size (d.nm)

Size Distribution by Intensity

Record 11: 5 3

0

2

4

6

8

10

1 10 100 1000 10000

Inte

nsity

(%)

Size (d.nm)


Record 51: HT5 3


Iz slike 4-6 je razvidno, da se intenziteta porazdelitve velikosti nanodelcev s časom

pomakne v smeri nastajanja večjih nanodelcev in da ni več prisotne populacije

nanodelcev s premerom ≈ 100 nm.

Oboje potrjuje aglomeracijo nanodelcev po enem tednu shranjevanja le-teh. Prav tako je

zaradi aglomeracije in posledično povečanja velikosti nanodelcev na diagramu 4 – 6 moč

opaziti večjo površino vrhov, kar je v skladu s teorijo, saj večji delci intenzivnejše sipajo

svetlobo v primerjavi z manjšimi delci.

4.2.1 Vpliv stabilizaorja PEG na velikost nanodelcev

Iz preglednice 4 – 5 sklepamo, da dodatek PEG različno vpliva na velikosti nanodelcev.

Pri razmerju z(H/TPP) = 3 se na primer hidrodinamski radij vzorca z dodanim PEG M = 1500

g/mol poveča iz dh = 417 nm brez PEG, na dh = 438,8 nm z PEG, in še dodatnih 2,2% ko

smo vzorcu dodali PEG M = 4000 g/mol, in sicer na dh = 448,7 nm. Calvo in sodelavci so

prišli do podobnih rezultatov [20]. Pri drugih dveh razmerjih hitozan/TPP smo opazili trend

zmanjšanja velikosti delcev po dodatku PEG. S spreminjanem molekulske mase PEG

smo ugotovili, da so se hidrodinamski premeri nanodelcev zmanjšali skladno s

povečanjem molekulske mase PEG, razen v primeru nanodelcev s z(H/TPP) = 5.

Nanodelcem s tem razmerjem se premer povečal ob povečanju molske mase PEG iz

1500 na 4000 g/mol, vendar je kljub temu manjši od premera nanodelcev brez dodatka

PEG.

Preglednica 4 – 5: Odvisnost hidrodinamskega premera delcev od molekulske mase PEG.

Oznaka dh /nm RSD/% PDI

HT3 417,8 1,42 0,561±0,023

HT4 777,8 0,38 0,605±0,005

HT5 1074 8,80 0,615±0,013

HT3P1500 438,4 2,37 0,548±0,045

HT4P1500 776,6 5,10 0,580±0,017

HT5P1500 999,6 10,54 0,788±0,166

HT3P4000 448,7 2,17 0,494±0,004

HT4P4000 721,5 2,21 0,573±0,019

HT5P4000 1035 1,10 0,569±0,052


V splošnem preglednica 4 – 5 kaže, da dodatek stabilizatorja ne vpliva izrazito na

spremembe hidrodinamskega premera nanodelcev.

Polidisperzni indeks se ob dodatku PEG v vseh primerih z(H/TPP), razen pri z(H/TPP) = 5, M =

1500 g/mol, zmanjša. Dodatek stabilizatorja znižuje heterodisperznost velikosti

nanodelcev in tako povečuje termodinamsko stabilnost suspenzije nanodelcev. Za

primerjavo histogramov porazdelitve velikosti vzemimo nanodelce z z(H/TPP) = 4, brez

dodatka PEG in z dodanim PEG obeh molekulskih mas. Histogrami so prikazani na slikah

4 – 7, 4 – 8, 4 – 9, v zaporedju z(H/TPP) = 4: i) brez dodanega PEG,ii) z dodanim PEG M =

1500 g/mol in iii) PEG M = 4000 g/mol. Na sliki 4 – 7 lahko opazimo dva vrhova; prvi je pri

približno pri dh ≈ 300 nm, drugi pa pri dh ≈ 1150 nm. Če nanodelcem dodamo PEG M = 1500

g/mol (slika 4 – 8) opazimo da se je porazdelitev velikosti pomaknila v smeri nastajanja

manjših delcev in hkrati se je intenziteta prvega vrha (površina pika) znižala. Enak, a še

bolj intenziven trend pomika velikosti je moč opaziti v primeru dodanega PEG M = 4000

g/mol (slika 4 – 9).

Slika 4 – 7: Histogram porazdelitve nanodelcev glede na intenziteto sipanja, z(H/TPP) = 4.

0

2

4

6

8

1 10 100 1000 10000

Inte

nsity

(%)

Size (d.nm)


Record 39: HT4 3



MPEG = 1500 g/mol.


MPEG = 4000 g/mol.

4.3 Določitev zeta potenciala

Zanimalo nas je kako se ζ-potencial spreminja v odvisnosti od masnega razmerja

hitozan/TPP. Rezultati so prikazani v preglednici 4 – 6. Ugotovili smo, da se je pozitivni

zeta potencial povečeval skladno s povečevanjem masnega razmerja z(H/TPP). Rezultati so

v skladu z rezultati polielektrolitskih (PE) titracij, ki s povišanjem razmerja z(H/TPP) kažejo na

višjo dostopnost prostih amino skupin oz. večjo vsebnost pozitivnega naboja disperzij

nanodelcev.

0

2

4

6

8

1 10 100 1000 10000

Inte

nsity

(%)

Size (d.nm)


Record 36: HT4P1500 3

0

2

4

6

8

10

1 10 100 1000 10000

Inte

nsity

(%)

Size (d.nm)


Record 45: HT4P4000 3


Preglednica 4 – 6: Odvisnost ζ potenciala od razmerja hitozan/TPP.

Oznaka z(H/TPP) ζ /mV RSD/%

HT3 3 55,9 6,62

HT4 4 62,6 2,78

HT5 5 70,6 2,83

HT6 6 74,8 2,34

HT7 7 79,3 2,96

HT8 8 80,6 1,94

SH4 0 74,6 11,84

SH5 0 68,9 7,65

STPP 0 -9,46 -6,70

Iz zgornje preglednice je prav tako razvidno, da je vrednost zeta potenciala nanodelcev z

z z(H/TPP) = 4 in 5, v primerjavi z slepim vzorcem hitozana enake končne koncentracije,

manjša. Slednjo ugotovitev smo že potrdili z PE titracijami. Ugotovili smo namreč, da

tekom nastanka nanodelcev zaradi elektrostatskih kot tudi hidrofobnih interakcij blokiramo

pozitivni naboj hitozana, kar vodi k znižanju pozitivnega zeta potenciala suspenzij

nanodelcev. Diagram prikazan na sliki 4 – 10 podaja primerjavo med obema metodama.

Slika 4 – 10: Diagram odvisnosti ζ-potenciala od koncentracije prostih amino skupin.

50

55

60

65

70

75

80

85

3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 11,5

ζ-po

tenc

ial/

mV

c(NH2)/(mmol/L)

ND (HT3-HT8)

SH4,SH5


Primerjava kaže, da zeta potencial narašča skorajda linearno s povišano vsebnostjo

amino skupin.

Pri vseh disperzijah nanodelcev, kot tudi hitozana samega lahko opazimo da je zeta

potencial > 30 mV, kar pomeni da so nanodelci v disperziji fizikalno stabilni.

4.3.1 Vpliv stabilizatorja PEG na zeta potencial nanodelcev

Ugotavljali smo kakšen vpliv ima PEG oz. njegova molekulska masa na zeta potencial. Iz

preglednice 4 – 7 je razvidno, da se zeta potencial nanodelcev pri konstantnih razmerjih

hitozan/TPP z ob dodatku PEG zmanjša. Kot smo že ugotovili iz rezultatov PE titracij (glej

diagram na sliki 4 – 11) PEG še dodatno zasenči oz. blokira pozitivni naboj hitozanskih

nanodelcev, kar vodi do znižanja ζ-potenciala.

Preglednica 4 – 7: Vpliv molekulskih mas PEG na ζ potencial.

Oznaka ζ /mV RSD/%

HT3 55,2 1,42

HT4 62,3 0,38

HT5 66,3 8,80

HT3P1500 53,8 2,37

HT4P1500 61,6 5,10

HT5P1500 64,1 10,54

HT3P4000 50,8 2,17

HT4P4000 60,8 2,21

HT5P4000 62,4 1,10

Slika 4 – 11 prikazuje diagram odvisnosti ζ-potenciala od koncentracije prostih amino

skupin pri različnih PEG.


Slika 4 – 11: Diagram odvisnosti ζ-potenciala od koncentracije prostih amino skupin pri

različnih PEG.

ζ-potencial se zmanjšuje z višanjem molekulske mase oz. dolžine molekul PEG. To je

moč razložiti s tem, da s povišano molekulsko maso PEG intenzivnejše zasenčimo naboj

hitozana; in/ali hkrati povečujemo električni dvosloj okoli nanodelcev. Posledica slednjega

je zmanjšana elektroforetska gibljivost in s tem proporcionalno tudi ζ-potencial.

Vse izmerjene vrednosti ζ potenciala so prav tako mnogo večje od 30 mV, kar je merilo za

stabilnost disperzij.

4.4 Analiza nanodelcev pod SEM mikroskopom

S vrstičnim elektronskim mikroskopom smo hoteli preveriti in posredno pokazati, da so

nastali delci pri reakciji ionotropnega geliranja dejansko v območju nanoskale. Slike 4 –

12-18 predstavljajo slike, katere smo naredili z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Na

slikah 4 – 12 in 13 je prikazana mikrostruktura kristala hitozana. Na slikah 4 – 14 in 15 so

prikazani nanodelci, ki so nastali pri reakciji ionotropnega geliranja. Slika 4 – 16 potrjuje

nastanek premrežene strukture na nanoskali. Na sliki 4 – 17 in 18 lahko vidimo manjše

oz. večje aglomerate, ki nastanejo po določenem času po pripravi. Število in velikost

aglomeratov narašča s časom podobno kot pri analizi velikosti delcev. S pomočjo SEM

analize smo med drugim ugotovili, da zmeraj ne nastanejo delci sferičnih oblik. Velikokrat

pride zaradi mehke narave materiala do deformacij, tako da sama oblika končnih delcev

40

45

50

55

60

65

70

1,5 1,7 1,9 2,1 2,3 2,5 2,7 2,9 3,1 3,3

ζ-p

oten

cial

/mV

n(NH2)/m(ND) / (mmol/g ND)

ND

ND z PEG1500

ND z PEG4000


variira. K temu prispeva tudi dejstvo, da so vidni delci pretežno sestavljeni iz manjših

skupkov primarnih hitozanskih nanodelcev velikosti cca. 200 nm. Slika 4 – 18 pa

predstavlja več takšnih delcev skupaj, kar je posledica aglomeracije.



Slika 4 – 14: Nanodelci pri z(H/TPP) = 3.

Slika 4 – 15:Nanodelci pri z(H/TPP) = 5 z PEG.

Slika 4 – 16: Zamreženje.




4.5 Analiza protimikrobnega testa

Protimikrobno učinkovitost disperzij nanodelcev smo testirali na tri patogene bakterije:

Gram-pozitivni Staphylococcus aureus in Streptococcus agalactiae, ter Gram-negativno

Escherichia coli, ter na dve patogeni glivi: Candida albicans in Candida glabrata. Rezultati

protimikrobnih testiranj disperzij hitozanskih nanodelcev so podani z bakterijsko redukcijo

(R) v % in so zbrani v preglednici 4 – 6. O učinkovitosti protimikrobnih agentov lahko

govorimo v primeru R > 75 %. Iz preglednice lahko vidimo, da je hitozan deloval

protimikrobno na bakterije kot tudi na glive, kar je že znano iz virov preteklih raziskav [7].

Preglednica 4 – 8: Rezultati protimikrobnega testiranja hitozanskih nanodelcev.

Oznaka vzorca

S. aureus R/%

S. agalactiae R/%

E. coli R/%

C. albicans R/%

C. glabata R/%

HT3 88 98 99 95 84 HT4 92 100 99 98 82 HT5 96 100 99 100 95 HT6 95 100 99 98 89 HT7 94 100 99 94 86 HT8 93 100 100 91 52 SH4 94 99 99 82 64 SH5 93 100 100 85 74

STTP5 -6 -7 14 -22 -2 kontrola 7 0 0 -7 7


Disperzije nanodelcev (HT4, HT5) izkazujejo v povprečju boljšo celokupno redukcijo

patogenov kot sama raztopina hitozana z enako koncentracijo hitozana (SH4, SH5).

Glede na vsebnost amino skupin je bilo pričakovati višje rezultate R/% za raztopine

hitozana v primerjavi s disperzijami nanodelcev.

Nanodelci očitno vsebujejo že zadostno kritično koncentracijo amino skupin za učinkovito

inhibicijo patogenov in je tako nemogoče oceniti vpliv povišanja vsebnosti amino skupin

na redukcijo patogenov.

Dejstvo je da so poleg vsebnosti amino skupin za inhibicijo patogenov pomembni še tudi

drugi fizikalno-kemijski dejavniki substanc kot na primer: hidrofilnost, hidrofobnost,

razmerje med površino in volumnom, struktura in velikost delcev, etc.

Nano-formulacija hitozana omogoča njegovo optimalno in nadzorovano difuzijo v celice

patogenih mkroorganizomov in je tako njihova degradacije še učinkovitejša. ND hitozana

z večjo gostoto pozitivnega površinskega naboja lažje reagirajo z negativno nabitimi

površinami mikrobov v primerjavi z hitozanom samim. ND imajo višjo afiniteto do

bakterijskih celic zaradi efekta kvantne velikosti. Zaradi večje površine hitozanskih ND v

primerjavi s hitozanom samim se na bakterijske celice močneje adsorbirajo [8]. Slednje je

potrjeno pri inhibiciji gliv, saj večina nanodelcev hitozana inhibira obe patogeni glivi

C.albicans C. glabrata bolje kot raztopina hitozana.

Glede na to, da TPP sam po sebi stimulira rast patogenov (glej Preglednico 4 – 8), pa

protimikrobni rezultati nanodelcev formuliranih iz TPP-ja in hitozana kažejo na odličen

sinergizem obeh.

4.5.1 Vpliv stabilizatorja PEG na protimikrobnost

V preglednici 4 – 7 so zbrani rezultati protimikrobnih testiranj hitozana in hitozanskih

nanodelcev z dodanim PEG dveh različnih molekulskih mas pri različnih z(H/TPP). Ugotovili

smo, da se je v posameznih primerih protimikroben učinek nanodelcev malo zmanjševal s

povečanjem molekulske mase PEG. Ena izmed možnih razlag, zakaj PEG negativno

vpliva na protimikroben učinek nanodelcev je, da oslabi bioadhezivnost le-teh [8], ali pa v

zadostni meri zasenči pozitivni naboj hitozana potreben za uspešno redukcijo patogenov,

saj so molekule PEG z večjo molekulsko maso daljše in tako bolj učinkovito sterično

ovirajo dostop topila do površine nanodelcev hitozana.


Preglednica 4 – 9: Rezultati protimikrobnega testiranja hitozanskih nanodelcev z dodanim

PEG dveh različnih molskih mas

Oznaka vzorca

S. aureus R/%

S. agalactiae R/%

E. coli R/%

C.albicans R/%

C. glabata R/%

HT3P1500 47 87 85 64 86 HT4P1500 64 96 98 95 75 HT5P1500 80 96 98 100 62 SH5P1500 76 99 99 99,7 58 HT3P4000 36 64 84 52 48 HT4P4000 49 96 96 92 87 HT5P4000 95 100 88 99 84 SH5P4000 67 96 99 100 33 PEG1500 4 21 -39 -1,5 59 PEG4000 10 4 -45 -9,5 38

MK 28 23 6 -3 19

Kakorkoli, dodatek stabilizatorja PEG bistveno ne zniža redukcije R/% patogenih

organizmov kot so: Gram-negativna S. agalactiae, ter Gram-negativno E. coli, ter obeh

gliv, medtem ko v povprečju slabše vpliva na redukcijo Gram-pozitivne S. aureus. Izmed

vseh suspenzij nanodelcev ima najslabše protimikrobne lastnosti vzorec HT3P4000

(z(H/TPP) = 3, PEG M = 4000), ter najboljše HT5P4000 (z(H/TPP) = 5, PEG M = 4000).


5 SKLEP

Danes med veliko količino dostopnih polimerov prednjači uporaba naravnih polimerov,

predvsem polisaharidov oz. njihovih derivatov, katerih glavne prednosti v primerjavi s

sinteznimi polimeri so biorazgradljivost, netoksičnost, širša dostopnost in posledično tudi

nižja cena. Hitozan, derivat biopolimera hitina, spada v omenjeno skupino. Zaradi

njegovih lastnosti, kot so sposobnost geliranja in posledično tvorbe nanodelcev,

bioadhezivnosti ter netoksičnosti, ga vedno pogosteje uporabljajo kot sisteme za dostavo

aktivnih učinkovin. V obliki nanodelcev pa je zelo atraktiven tudi kot samostojen

protimikrobni agens.

S spreminjanjem različnih parametrov smo uspešno sintetizirali nanodelce iz

polielektrolitov hitozana in natrijevega tripolifosfata. Ugotovili smo da na njihov nastanek

vplivajo koncentraciji obeh polielektrolitov in njuno masno razmerje v disperziji. S

povečanjem masnega razmerja hitozan/TPP se povečujejo: množina prostih amino skupin

in s tem naboj, hidrodinamski radij ter zeta potencial kakor tudi protimikrobni učinek na

nekatere testirane mikroorganizme.

Ugotovili smo, da dodatek stabilizatorja polietilen glikola (PEG) k disperziji nanodelcev, ne

vpliva izrazito na spremembe hidrodinamskega premera nanodelcev, medtem ko znižuje

heterodisperznost velikosti nanodelcev in tako povečuje termodinamsko stabilnost

suspenzije nanodelcev. S povišanjem koncentracije in/ali molekulske mase PEG v

disperziji, se ζ-potencial disperzije zmanjša in tako naredi disperzije manj stabilne. Iz tega

sklepamo, da PEG proučevanih molekulskih mas ni najustreznejši stabilizator za

disperzije hitozanskih nanodelcev. Potrebne bi bile še dodatne raziskave, ki bi vključevale

še zraven optimizacije molekulskih mas in koncentracij PEG tudi druge potencialne

stabilizatorje.

Eden izmed glavnih ciljev je bil oceniti protimikrobno učinkovitost pripravljenih nanodelcev.

Ugotovili smo da nanodelci pripravljeni s postopkom ionotropnega geliranja bolje inhibirajo

rast mikroorganizmov v primerjavi z raztopinami hitozana samega. Nano-formulacija

hitozana omogoča njegovo optimalno in nadzorovano difuzijo v celice patogenih

mikroorganizomov in je tako njihova degradacije še učinkovitejša.


Zaključimo lahko, da bi pripravljeni nanodelci lahko bili aplicirani na številna področja

uporabe, kot recimo:

• Protibakterijski agens v farmacevtski industriji in kozmetiki.

• Protiglivični geli, kreme, zlasti tisti brez dodatka PEG.

• Premazi za tekstilije: medicinski materiali, gaze, sanitetni materiali (tamponi,

vložki, robčki).


6 LITERATURA

1. Kerec Kos, M., Uporaba hitosana v farmaciji. Farmacevtski vestnik, 2006; 57(5): 287-291.

2. Singla, A.K. in Chawla, M., Chitosan: some pharmaceutical and biological aspects - an update. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2001; 53(8): 1047-1067.

3. Strnad, S., Šauperl, O., Fras Zemljič, L., et al., Hitozan - vsestransko uporaben biopolimer. Tekstilec, 2007; 50(10/12): str. 243-261.

4. Balázs, N. in Sipos, P., Limitations of pH-potentiometric titration for the determination of the degree of deacetylation of chitosan. Carbohydrate Research, 2007; 342(1): 124-130.

5. Ajun, W., Yan, S., Li, G., et al., Preparation of aspirin and probucol in combination loaded chitosan nanoparticles and in vitro release study. Carbohydrate Polymers, 2009; 75(4): 566-574.

6. Bodnar, M., Hartmann, J.F., in Borbely, J., Preparation and characterization of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules, 2005; 6(5): 2521-7.

7. Rabea, E.I., Badawy, M.E.T., Stevens, C.V., et al., Chitosan as Antimicrobial Agent: Applications and Mode of Action. Biomacromolecules, 2003; 4(6): 1457-1465.

8. Qi, L., Xu, Z., Jiang, X., et al., Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticles. Carbohydrate Research, 2004; 339(16): 2693-2700.

9. Ravi Kumar, M.N.V., A review of chitin and chitosan applications. Reactive and Functional Polymers, 2000; 46(1): 1-27.

10. Burgess, D.J. in Hickey, A.J., Microsphere Technology and Applications. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology: Third Edition, 2006: 2328 - 2338.

11. Gref, R., Domb, A., Quellec, P., et al., The controlled intravenous delivery of drugs using PEG-coated sterically stabilized nanospheres. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995; 16(2-3): 215-233.

12. Wang, S.L., Yao, H.H., Guo, L.L., et al., Selection of optimal sites for TGFB1 gene silencing by chitosan-TPP nanoparticle-mediated delivery of shRNA. Cancer Genet Cytogenet, 2009; 190(1): 8-14.

13. Gan, Q. in Wang, T., Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier—Systematic examination of fabrication conditions for efficient loading and release. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2007; 59(1): 24-34.

14. Bordenave, N., Grelier, S., in Coma, V., Hydrophobization and antimicrobial activity of chitosan and paper-based packaging material. Biomacromolecules, 2010; 11(1): 88-96.

15. Gil, G., del Monaco, S., Cerrutti, P., et al., Selective antimicrobial activity of chitosan on beer spoilage bacteria and brewing yeasts. Biotechnol Lett, 2004; 26(7): 569-74.

16. Park, K. in Yeo, Y., Microencapsulation Technology. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology: Third Edition, 2006: 2315 - 2327.

17. Yih, T. in Al-Fandi, M., Engineered nanoparticles as precise drug delivery systems. Journal of Cellular Biochemistry, 2006; 97(6): 1184-1190.


18. Ravi Kumar, M.N., Nano and microparticles as controlled drug delivery devices. J Pharm Pharm Sci, 2000; 3(2): 234-58.

19. Nabergoj, M., Izdelava hidrofilnih nanodelcev z metodo polielektrolitskega kompleksiranja - diplomsko delo. Ljubljana: Univerza v ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2008.

20. Calvo, P., Remuñán-López, C., Vila-Jato, J.L., et al., Novel hydrophilic chitosan-polyethylene oxide nanoparticles as protein carriers. Journal of Applied Polymer Science, 1997; 63(1): 125-132.

21. Kunjachan, S. in Jose, S., Understanding the mechanism of ionic gelation for synthesis of chitosan nanoparticles using qualitative techniques. Asian J Pharm [serial online], 2010; 4(2): 148-153.

22. Gan, Q., Wang, T., Cochrane, C., et al., Modulation of surface charge, particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery. Colloids Surf B Biointerfaces, 2005; 44(2-3): 65-73.

23. Bao, H., Li, L., in Zhang, H., Influence of cetyltrimethylammonium bromide on physicochemical properties and microstructures of chitosan-TPP nanoparticles in aqueous solutions. Journal of Colloid and Interface Science, 2008; 328(2): 270-277.

24. Horn, D. in Heuck, C.C., Charge determination of proteins with polyelectrolyte titration. Journal of Biological Chemistry, 1983; 258(3): 1665-1670.

25. Veronovski, N., Študij TiO2 nanoprevlek regeneriranih celuloznih vlaken za doseganje samočistilnega učinka - doktorska disertacija. Maribor: Univerza v Mariboru, 2009.

26. Tanaka, H. in Sakamoto, Y., Polyelectrolyte titration using fluorescent indicator. I. Direct titration of anionic and cationic polyelectrolytes with 10−4N standard solutions. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 1993; 31(11): 2687-2691.

27. Tanaka, H. in Sakamoto, Y., Polyelectrolyte titration using fluorescent indicator. II. Analysis of cationic starches and flocculants. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 1993; 31(11): 2693-2696.

28. Kam, S.-k. in Gregory, J., Charge determination of synthetic cationic polyelectrolytes by colloid titration. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 1999; 159(1): 165-179.

29. Dynamic Light Scattering - Malvern.com (dostopano: 9.9.2010). http://www.malvern.com/LabEng/technology/dynamic_light_scattering/dynamic_light_scattering.htm

30. FAQ - What is the hydrodynamic radius.pdf, Frequently Asked Questions, Malvern Instruments (dostopano: 9.9.2010). www.malvern.com.

31. Gabrič, T. DOLOČANJE VELIKOSTI SUBMIKRONSKIH DELCEV S FOTONSKO KORELACIJSKO SPEKTROSKOPIJO (dostopano 9.9.2010). http://optlab.ijs.si/idrevensek/DLS.pdf.

32. Kogej, K., Površinska in koloidna kemija. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2010, 185.

33. Zeta Potential Using Laser Doppler Eelectrophoresis - Malvern.com.htm (dostopano: 9.9.2010). http://www.malvern.com/LabEng/technology/zeta_potential/zeta_potential_LDE.htm.

34. Goldstein, J., Newbury, D.E., Echlin, P., et al., Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. New York: Plenum Press, 1984, 479-483.

35. Ristič, T., Polisaharidi za razvoj medicinskih tekstilij - diplomsko delo. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za strojništvo, 2009.

http://www.malvern.com/LabEng/technology/dynamic_light_scattering/dynamic_light_scattering.htm�

http://www.malvern.com/LabEng/technology/dynamic_light_scattering/dynamic_light_scattering.htm�

http://www.malvern.com/�

http://optlab.ijs.si/idrevensek/DLS.pdf�

http://www.malvern.com/LabEng/technology/zeta_potential/zeta_potential_LDE.htm�

http://www.malvern.com/LabEng/technology/zeta_potential/zeta_potential_LDE.htm�


36. An, J.-H. in Dultz, S., Adsorption of tannic acid on chitosan-montmorillonite as a function of pH and surface charge properties. Applied Clay Science, 2007; 36(4): 256-264.


7 PRILOGE

7.1 Priloga A

Slika A.7 – 1: Titracijske krivulje vseh izdelanih disperzij nanodelcev.

Slika A.7 – 2: Titracijske krivulje raztopin hitozana.

860

880

900

920

940

960

980

1000

1020

1040

0 1 2 3 4 5 6

E/m

V

V (Na-PVS)/mL

z(H/T)=3

z(H/T)=4

z(H/T)=5

z(H/T)=6

z(H/T)=7

z(H/T)=8

880

900

920

940

960

980

1000

1020

1040

1060

0 1 2 3 4 5 6

E/m

V

V (Na-PVS)/mL

SH3

SH4

SH5


Slika A.7 – 3: Titracijska krivulja za vodo.

Slika A.7 – 4: Titracijske krivulje za TPP.

-50

150

350

550

750

950

1150

1350

1550

900

920

940

960

980

1000

1020

1040

1060

1080

0 0,5 1 1,5 2

Prvi

odv

od (m

V/m

L)

E/m

V

V (Na-PVS)/mL

Titracijska krivulja

Krivulja prvega odvoda

-50

150

350

550

750

950

1150

920

940

960

980

1000

1020

1040

1060

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6Pr

vi o

dvod

(mV/

mL)

E/m

V

V (Na-PVS)/mL

Titracijska krivulja

Krivulja prvega odvoda

Documents

Izdelava in karakterizacija hitozanskih nanodelcev za ... · standard ASTM E 2149-01. The results show that an increase in thew/w ratio of chitosan/TPP triggers anincrease in the