Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov

• Km

• kcat

• kcat/Km

Encimi, ki delujejo po Michaelis-Mentenovih zakonitostih:- Sestavljeni so iz ene polipeptidne verige.- Aktivni center je bodisi en sam, če jih je več, so neodvisni.

(Če imajo encimi več polipeptidnih verig ali več med seboj odvisnih aktivnihcentrov, delujejo kot alosterični encimi).

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, Km

• Vmax , Km eksperimentalno določimo

• Km - odraža afiniteto encima do substrata- odraža fiziološke razmere - za mnoge encime velja: Km ≈ [S]fiziol.

≈ = Kd

≈

VELJA: - velika Km majhna afiniteta encima do substrata

- majhna Km velika afiniteta encima do substrata

-Pomen Km je odvisen od reakcijskega mehanizma, kot npr. število stopenj reakcije in njihove reltivne hitrosti

-Če je v dvostopenjski reakciji ,potem je Km merilo za afiniteto encima do substrata

-V primeru, da je k2 >> k−1, potem je Km = k2/k1.

- Če sta hitrosti obeh stopenj primerljivi k2 ~ k−1, potem je Km kompleksna funkcija treh hitrostnih konstant

Tudi za ta primer velja Michaelis Mentenova kinetika, vendar Km ne moremo opredeliti le kot merilo za afiniteto encima do substrata.

Pri večstopenjskih reakcijah je Km še kompleksnejša funkcija, sestavljena iz številnih hitrostnih konstant.

Splošni pomen Km

Vrednosti Km nekaterih encimov in substratov

-Če gre za dvostopenjski Michaelis-Mentenov mehanizem, kjer k2 določa hitrost reakcije: Vmax = k2[Et]

-Število reakcijskih stopenj se med encimi razlikuje:

-Če gre za tristopenjski mehanizem, kjer k3 določa hitrost reakcije: Vmax = k3[Et].

Splošni pomen Vmax

-Bolj splošna hitrostna konstanta, ki opisuje limitirajočo hitrost katerekoli reakcije (ne glede na mehanizem), pri saturacijskih pogojih (vse molekule encima so zasedene)

- Če ima reakcija več stopenj in le ena stopnaj odloča o hitrosti, je kcat enaka hitrostni konstanti najpočasnejše stopnje:

- Če več reakcijskih stopenj delno odloča o hitrosti reakcije, je kcat kompleksna funkcija hitrostnih konstant teh stopenj.

-Iz the Michaelis-Mentenenove enačbe: kcat = Vmax/[Et]

-Kcat je hitrostna konstanta reakcije prvega reda – ponazarja pretvorbeno število(turnover number) – število molekul substrata, ki jih predela ena molekula encima, ob saturacijskih pogojih, v časovni enoti.

Splošni pomen Kcat

kcat = k2

kcat = k3

Pomen Km v fiziologiji primer: občutljivost Azijcev na alkohol

• Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci

• Reakcije razgradnje alkoholaCH3CH2OH + NAD+ → CH3CHO + H+ + NADH

encim: alkoholna dehidrogenaza• CH3CHO + NAD+ → CH3COOH + H+ + NADH

encim: aldehidna dehidrogenaza

• Azijci imajo aldehidno dehidrogenazo z višjim Km → (aldehid v krvi dolgo kroži po telesu); izoencim!

• Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti encimov: različna encimska aktivnost (kkat in Km), različna molekulska masa (Mr). Genski zapis je drugačen, zato druga sekvenca!

Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, kkat

• kkat = hitrostna konstanta najpočasnejše stopnje (v smeri, ki daje produkt!)

• kkat - pretvorbeno število: št. molekul substrata, ki se pretvori v produkt na eni molekuli encima v enoti časa (encim je nasičen s substratom)

Vmax = k2.[E]t

Vmax = kkat.[E]t ESkv kat0

-kcat in Km sta uporabna za primerjavo različnih encimov z različnimi reakcijskimi mehanizmov.

-kcat in Km ponazarjata okolje v celici in vivo, kjer pri določeni koncentraciji substrata poteka encimska kataliza.

-kcat in Km vsak posamezno nista dovolj, da bi opredelila kinetično učinkovitost encima.

-Npr. 2 encima imata lahko enak Kcat, vendar je hitrost nekatalizirane reakcije pri obeh drugačna, zato vsak drugače vplivata na pospešitev katalizirane reakcije.

-Km je pogosto podobna koncentraciji substrata v celici. Če je koncentracija substrata zelo majhna, bo imel tak encim majhen Km v primerjavi z encimom, ki katalizira reakcijo substrata, ki je prisoten v veliki koncentraciji.

Primerjava katalitičnih mehanizmov in učinkovitosti encimov

yeastgenomics.ca/structure

-kcat/Km – konstanta specifičnosti (specificity constant)

-Ponazarja hitrost pretvorbe E + S E + P.

-Če je [S] << Km,

kcat/Km- najboljši način za primerjavo katalitičnih učinkovitosti encimov

: www.miracleoftheenzyme.com/3.htm

-Reakcija drugega reda, saj je V0 odvisen od koncentracije [Et] in [S];

- Zgornja omejitev za kcat/Km je hitrost, s katero se E in S srečata (difuzija)

- Z difuzijo-uravnavana omejitev znaša is 10 to 10 M−1s−1, zato imajo mnogi encimi kcat/Km blizu te številke.

-Take encimi imajo “perfektno katalizo” (catalytic perfection).

8 9

Kinetična učinkovitost encimov

Slabost izražanja encimske učinkovitosti s Km ali kkat: ni upoštevananeencimska reakcija, ni informacije za koliko encim pospeši reakcijo

Najboljši način za izražanje encimske aktivnosti: kkat/Km

Michaelis-Mentenova kinetika velja tudi za bi (več) substratne reakcije(velikanska večina reakcij v organizmu je takih!)

S1 + S2 ↔ P1 + P2

Primer: prenos funkcionalne skupine (fosforilne, amino...) z enega substrata na drug substrat (encimi: transferaze)

ATP + D-glukoza ↔ ADP + D-glukoza-6-fosfat

ATP + D-fruktoza ↔ ADP + D-fruktoza-6-fosfat

ak1 + ketokislina2 ↔ ak2 + ketokoslina1

Mehanizem encimsko kataliziranih bisubstratnih reakcij je kompleksen

- Mehanizem, ki vključuje ternarni kompleks

- Mehanizem brez ternarnega kompleksa (ping-pong mehanizem)

ATP + glucose → ADP + glucose 6-phosphate

Primer bisubstratne reakcije: Transaminacija: encim transaminaza(koencim piridoksalfosfat )

Glutamat/piruvattransaminaza (GPT)

Glutamat/oksaloacetattransaminaza (GOT)

-R = -CH3-R , -CH2-COOH

Koencim:piridoksal-fosfat

Transaminacije: Prenos –NH2 skupine z enega na drug substrat

Encimi

• Splošne lastnosti - osnove delovanja, specifičnost, energijski vidik nekatalizirane in encimsko katalizirane reakcije

• Kofaktorji, koencimi in prostetične skupine

• Mehanizmi encimske katalize

• Klasifikacija encimov

• Encimska kinetika

• Encimska inhibicija

• Uravnavanje encimske aktivnosti (biokemijskih reakcij)

• Encimi v medicinski diagnostiki in biotehnologiji

Modulatorji encimske aktivnosti

• Aktivatorji – encimska aktivnost ↑

• Inhibitorji – ecimska aktivnost ↓

Vrste inhibicije:

- reverzibilna inhibicija - kompetitivna- akompetitivna- mešana (npr. nekompetitivna)

- ireverzibilna inhibicija

Encimska inhibicija - uporaba

• Inhibitorji encimov – najpomembnejše farmacevtske učinkovine (npr. aspirin inhibira sintezo prostaglandinov)

• Uporaba inhibitorjev pri študiju mehanizma encimskih reakcij• Uporaba inhibitorjev pri študiju metaboličnih poti• Inhibitorji so lahko strupi! Kako postopati pri zastrupitvah? Pri reverzibilnih

(kompetitivnih) inhibitorjih uvesti substrat v visoki koncentraciji Pri ireverzibilnih inhibitorjih uvesti sredstvo, ki veže inhibitor z večjo afiniteto kot encim,

Kompetitivna inhibicija

Akompetitivna inhibicija

Mešana inhibicija

Vrste reverzibilne inhibicije

Kompetitivna inhibicija

S in I sta si podobna in se vežeta na isto mesto, a nikoli sočasno!

Kompetitivni inhibitor vpliva na afiniteto encima do substrata ne pa na maksimalno hitrost.

Kompetitivna inhibicija

brez inhibitorja z inhibitorjem

Vmax se ne spremeni

Km se poveča (zmanjša se afiniteta za S)

Kompetitivna inhibicija (spremenjena Km)

dvojni recipročni diagram

-1/Km

Mehanizem akompetitivne inhibicije

www.biologypictures.net/.../

Akompetitivna inhibicija (spremenjena Km in Vmax)

dvojni recipročni diagram

,

Mešana inhibicija (spremenjena Km in Vmax)

dvojni recipročni diagram

Ki = Ki’

= ’X

X

Poseben primer mešane inhibicije: nekompetitivna inhibicija

www.biologypictures.net/.../

Nekompetitivna inhibicija - spremenjena Vmax, Km pa ne!

dvojni recipročni diagram

Ki = Ki’

Kompetitivna inhibicija Nekompetitivna inhibicija

Akompetitivna inhibicija Mešana inhibicija

Diagnostični diagrami za različne vrste inhibicij

Akompetitivna in mešana inhibicija – za encime z več substrati!

Kinetični parametri reverzibilnih inhibicij

Ireverzibilna inhibicija – inhibitor se ireverzibilno veže v aktivnem mestu encima

Primer: reakcija kimotripsina ali acetilholin-esteraze (v aktivnem mestu je Ser) z diizopropilfluorofosfatom (DIFP)

Encim je trajno okvarjen!

acetiholin + voda → ocetna kislina + holin, encim = AChE

živčni bojni strup

pesticid

Spojine, kot so nekateri pesticidi, se ireverzibilno vežejo na encim acetilholin-esterazo (AChE), ki hidrolizira nevrotransmitor acetilholin

Samomorilski inhibitorji

-Nereaktivni, dokler se ne vežejo v aktivni center encima. Nekaj encimskih ciklov reakcije se tudi ob samomorilskem inhibitorju lahko odvrti normalno, toda namesto običajnega produkta nastaja izredno reaktivna snov, ki se ireverzibilno veže na encim.

-Samomorilska inaktivacija je z mehanizmom reakcije pogojena inaktivacija.

-Pomen v farmacevtski industriji: racionalno načrtovanje zdravil

- Dobra učinkovina je tista, ki je specifična za en encim in je neaktivna, dokler se ne veže na aktivno mesto . S tem je zdravilo zelo učinkovito, z malo stranskimi učinki.

www.biochem.arizona.edu/.../

Terapija raka – 5-fluoro uracil, samomorilski inhibitor dihidrifioat reduktaze

Na encimsko aktivnost vplivajo zunanje razmere

• Vmax , Km – eksperimentalno določimo, karakteristični za encim, odivsni od zunanjih razmer.

- pH- temperatura- ionska moč

Pepsin ima največjo aktivnost pri nižjem pH kot večina ostalih encimov.

Vpliv pH na encimsko aktivnost (v0)

employees.csbsju.edu/...

Encimi imajo pH optimum pri tazličnih vrednostih pH. So tudi encimi, ki imajo enako aktivnost v širokem pH območju.

Kimotripsin ima pH optimum pri pH 8

Vpliv temperature na encimsko aktivnost (V)

www.bbc.co.uk/.../

Sprva z naraščanjem temperature narašča hitrost reakcije večja kinetična enerigija molekul, več uspešnih trkov.

Z naraščajočo temperaturo pa se povečuje tudi verjetnost za denaturacijo encima –rušijo se šibke vezi, ki vzdržujejo terciarno strukturo. Ko se ves encim denaturira, s povečevanjem temperature encimska aktivnost strmo pade.

Encimi v organizmu delujejo POD svojim temperaturnim optimumom – aktivnost je sicer manjša, a je tudi verjetnost za denaturacijo encima manjša.

Km in Vmax imata pri različnih encimih različen pomen.

kkat opisuje hitrost določujočo stopnjo encimsko katalizirane reakcije pri saturacijskih pogojih – pretvorbeno število (turnover number).

Razmerje kkat/Km je dobro merilo katalitične učinkovitosti encima.

Michaelisova kinetika (enačba) velja tudi za nekatere bisubstratne reakcije (npr. reakcije z mehanizmom ping-pong)

Reverzibilna inhibicija je lahko kompetitivna, akompetitivna ali mešana. Nekompetitivna inhibicija je poseben primer mešane inhibicije.

Pri kompetitivni inhibiciji substrat in inhibitor tekmujeta za isto vezavno mesto.

Pri akompetitivni inhibiciji se inhibitor lahko veže le na kompleks ES, na drugo mesto kot S.

Pri mešani inhibiciji se inhibitor lahko veže na encim in na ES, na drugo mesto kot S.

Pri ireverzibilni inhibiciji se inhibitor za stalno veže na encim. Samomorilski inhibitorji so substrati, ki z delovanjem encima tvorijo produkte, le-ti pa se ireverzibilno vežejo na encim.

Večina encimov ima optimum pH (ali območje optimalnega pH) in optimum temperature, kjer je encim najbolj aktiven.

Encimska kinetika - povezetek