J Med Genet-1992-Heitz-794-801

7/29/2019 J Med Genet-1992-Heitz-794-801

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7ed G e n e t 1 9 9 2 ; 2 9 : 7 9 4 - 8 0 1I n h e r i t a n c e o f t h e f r a g i l e X s y n d r o m e : s i z e o ft h e f r a g i l e X p r e m u t a t i o n i s a m a j o r d e t e r m i n a n to f t h e t r a n s i t i o n t o f u l l m u t a t i o nD o m i n i q u e H e i t z , D i d i e r D e v y s , G e o r g e s I m b e r t , C h r i s t i n e K r e t z ,J e a n - L o u i s M a n d e l

A b s t r a c tThe f r a g i l e X mental r e t a r d a t i o n s y n -drome i s c a u s e d by u n s t a b l e e x p a n s i o n o fa CGG r e p e a t . Two m ain t y p e s o f mu ta-t i o n h a v e b e e n c a t e g o r i s e d . C l i n i c a le x p r e s s i o n i s a s s o c i a t e d w i t h t h e p r e s -e n c e o f t h e f u l l m u t a t i o n , w h i l e s u b j e c t swh o c a r r y o n l y a p r e m u t a t i o n do n o th a v e m e n t a l r e t a r d a t i o n . Premutationsh a v e a h i g h r i s k o f t r a n s i t i o n t o f u l l m u -t a t i o n when t r a n s m i t t e d by a f e m a l e . Weh a v e u s e d d i r e c t d e t e c t i o n o f t h e m ut a -t i o n s t o c h a r a c t e r i s e l a r g e f a m i l i e s whoi l l u s t r a t e t h e w i d e v a r i a t i o n i n p e n e -t r a n c e which h a s been o b s e r v e d i n d i f -f e r e n t s i b s h i p s ( a f e a t u r e o f t e n c a l l e d t h eSherman p a r a d o x ) . A f a m i l y o r i g i n a l l yf o u n d t o show t i g h t g e n e t i c l i n k a g eb e t w e e n t h e f a c t o r 9 g e n e an d t h e f r a g i l eX l o c u s wa s r e a n a l y s e d , c o n f i r m i n g t h eo r i g i n a l g e n o t y p e a s s i g n m e n t s and t h eo b s e r v e d l i n k a g e . The s i z e o f premu-t a t i o n s wa s measured b y S o u t h e r n b l o t -t i n g and b y u s i n g a PCR b a s e d t e s t i n 1 0 2c a r r i e r mothers an d t h i s wa s c o r r e l a t e dw i t h t h e t y p e o f mutation f o u n d i n t h e i ro f f s p r i n g . The r i s k o f t r a n s i t i o n t o f u l lm u t a t i o n wa s found t o b e v e r y l o w f o rp r e m u t a t i o n s w i t h a s i z e i n c r e a s e ( A ) o fa b o u t 1 0 0 b p , i n c r e a s i n g up t o 100% whent h e s i z e o f p r e m u t a t i o n wa s l a r g e r t h a na b o u t 2 0 0 b p , even a f t e r t a k i n g i n t o a c -count ( a t l e a s t p a r t i a l l y ) a s c e r t a i n m e n tb i a s . T h e s e r e s u l t s c o n f i r m and e x t e n dt h o s e r e p o r t e d b y Fu e t a l ( 1 9 9 1 ) and Yu c ta ) ( 1 9 9 2 ) and e x p l a i n t h e Sherman p a r a -d o x . The l o w r i s k o f t r a n s i t i o n t o f u l lmutation o f s m a l l p r e m u t a t i o n s l e a d s t ot h e p r e d i c t i o n t h a t c a r r i e r s o f s u c ha l l e l e s m a y be m o r e f r e q u e n t i n t h ep o p u l a t i o n t h a n wa s p r e v i o u s l y e x p e c t e df o r f r a g i l e X c a r r i e r s , and we h a v e i n d e e do b s e r v e d a p r e m u t a t i o n i n a man w i t h n oa p r i o r i r i s k . P o s s i b l e m e cha n i sm s t h a tc o u l d account f o r t h e s e x b i a s e d e x p a n -s i o n o f t h e CGG r e p e a t are d i s c u s s e d i nr e l a t i o n t o t h e a b s e n c e o f s u c h b i a s i ne x p a n s i o n a t t h e m y o t o n i c d y s t r o p h yl o c u s .( J M e d G e n e t 1 9 9 2 ; 2 9 : 7 9 4 - 8 0 1 )The f r a g i l e X s y n d r o m e i s t h e most c o m m o ni n h e r i t e d c a u s e o f m e n t a l r e t a r d a t i o n . ' S e g r e -g a t i o n s t u d i e s h a v e p r e v i o u s l y s h o w n t h eu n i q u e c h a r a c t e r i s t i c s o f i t s mode o f i n h e r i t -a n c e . 2 I t w a s e s t i m a t e d t h a t 20% o f m a l e s

c a r r y i n g t h e m u t a t i o n h a v e n o p h e n o t y p i ce x p r e s s i o n ; t h e s e w e r e c a l l e d n o r m a l t r a n s m i t -t i n g m a l e s . Among c a r r i e r f e m a l e s , 55% w e r ef o u n d t o e x p r e s s t h e f r a g i l e s i t e , a n d o n e t h i r dt o h a v e m e n t a l i m p a i r m e n t i n a d d i t i o n . How-e v e r , d a u g h t e r s o f n o r m a l t r a n s m i t t i n g m a l e sa p p e a r e d t o h a v e l i t t l e o r n o p h e n o t y p i ce x p r e s s i o n . E v e n more c u r i o u s w a s t h e o b s e r -v a t i o n t h a t p e n e t r a n c e w a s l o w ( - 18%) i nb r o t h e r s o f NTM s, a n d h i g h ( > 80%) i nb r o t h e r s o f a f f e c t e d m a l e s , a p h e n o m e n o no f t e n c a l l e d t h e S h e r m a n p a r a d o x . T h i s l e d t oa c l u s t e r i n g o f NTMs i n c e r t a i n s i b s h i p s a n do f a f f e c t e d p a t i e n t s i n o t h e r s , e v e n w i t h i n t h es a m e f a m i l y . I t h a s r e c e n t l y b e e n s h o w n t h a tt h e f r a g i l e X m e n t a l r e t a r d a t i o n s y n d r o m e i sc a u s e d b y e l o n g a t i o n o f a s m a l l t a r g e t DNAf r a g m e n t , c o n t a i n i n g a r e p e a t o f t h e t r i n u c l e o -t i d e CGG - 5 l o c a t e d i n a 5 ' e x o n o f t h e FMR-1g e n e 6 i n X q 2 7 . 3 . We h a v e p r o p o s e d t h a t m u t a -t i o n s c a n b e c l a s s i f i e d a s t w o m a i n t y p e s ,a c c o r d i n g t o t h e s i z e o f t h e e l o n g a t i o n ( A ) , i t ss t a b i l i t y i n s o m a t i c c e l l s , a n d t h e m e t h y l a t i o ns t a t u s o f n e a r b y r e s t r i c t i o n s i t e s . 3 7 P r e m u -t a t i o n s a r e c h a r a c t e r i s e d b y a n e l o n g a t i o n o f 7 0t o a b o u t 5 0 0 b p , s h o w l i t t l e o r n o s o m a t i ch e t e r o g e n e i t y , a n d t h e n e a r b y r e s t r i c t i o n s i t e sa r e n o t m e t h y l a t e d i n m a l e s o r o n t h e a c t i v e Xc h r o m o s o m e s o f f e m a l e s ( b u t a r e m e t h y l a t e do n t h e i n a c t i v e X c h r o m o s o m e ) . P r e m u t a t i o n sd o n o t a p p e a r t o c a u s e m e n t a l r e t a r d a t i o n , a n dt h e i r c a r r i e r s s h o w v e r y l o w o r a b s e n t e x p r e s -s i o n o f t h e f r a g i l e s i t e . 7 T h e y a r e t y p i c a l l yf o u n d i n n o r m a l t r a n s m i t t i n g m a l e s a n d i nt h e i r d a u g h t e r s ( a lt h o u gh some d a u g h t e r s o f ac a r r i e r f e m a l e m ay a l s o h a v e a p r e m u t a t i o n ) .The f u l l f r a g i l e X m u t a t i o n i s c h a r a c t e r i s e d b ya n e l o n g a t i o n ( A ) o f more t h a n 6 0 0 t o 7 0 0 b p ,o f t e n s h o w s i m p o r t a n t s o m a t i c h e t e r o g e n e i t y ,a n d n e a r b y s i t e s a r e m e t h y l a t e d on b o t h a c t i v ea n d i n a c t i v e X c h r o m o s o m e s .I n a s t u d y o f 6 3 f r a g i l e X f a m i l i e s , a l l m a l e sa n d 53% o f f e m a l e s c a r r y i n g a f u l l m u t a t i o nw e r e f o u n d t o h a v e m e n t a l r e t a r d a t i o n . 7 A l -t h o u g h t h e d i s t i n c t i o n b e t w e e n p r e m u t a t i o na n d f u l l m u t a t i o n a p p e a r s c l e a r a t t h e c e l l u l a rl e v e l , we h a v e f o u n d t h a t a b o u t 15% o f s u b -j e c t s wh o h a v e a f u l l m u t a t i o n a r e i n f a c tm o s a i c s a n d a l s o h a v e c e l l s w i t h a p r e m u -t a t i o n . 7 S u c h m o s a i c s u b j e c t s m ay b e morem i l d l y a f f e c t e d t h a n p e r s o n s w i t h a f u l l m u t a -t i o n o n l y . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e f i n d i n g t h a tFMR-1 mRNA i s p r e s e n t i n l e u c o c y t e s o fm o s a i c p a t i e n t s b u t n o t o f p a t i e n t s w i t h f u l l ym e t h y l a t e d m u t a t i o n s . 8The t r a n s i t i o n f r o m p r e m u t a t i o n t o f u l l m u-t a t i o n ( o r t o m o s a i c s t a t u s ) a p p e a r s t o o c c u r

LGME/CNRS,INSERM U 1 8 4 ,I n s t i t u t de ChimieB i o l o g i q u e , 1 1 ru eHum a n n, 6 7 0 8 5S t r a s b o u r g C e d e x ,F r a n c e .D H e i t zD D e v y sG I m b e r tC K r e t zJ - L M a n d e lC o r r e s p o n d e n c e t oDr M a n d e l .R e c e i v e d 8 J u n e 1 9 9 2 .A c c e p t e d 1 7 J u n e 1 9 9 2 .T h i s p a p e r i s d e d i c a t e d t ot h e memory o f I s a b e l l eO b e r l e .

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I n h e r i t a n c e o f t h e f r a g i l e X s y n d r o m eo n l y a f t e r t r a n s m i s s i o n t h r o u g h t h e f e m a l eg e r m l i n e , w h i c h f i t s w i t h t h e p a t t e r n o f i n -h e r i t a n c e o f p h e n o t y p i c t r a i t s . I n p r e v i o u ss t u d i e s 3 7 we f o u n d a n 8 0 % o v e r a l l r i s k o ft r a n s i t i o n . H o w e v e r , t h i s wa s u n c o r r e c t e d f o ra s c e r t a i n m e n t b i a s e s . A more accurate s t u d y o ft h i s r i s k a n d o f t h e parameters a f f e c t i n g i t i s o fi m p o r t a n c e b o t h f o r g e n e t i c c o u n s e l l i n g pur-p o s e s a n d as a t e s t o f t h e main h y p o t h e s e sp r o p o s e d t o a c c o u n t f o r f r a g i l e X i n h e r i t a n c e ,a n d i n p a r t i c u l a r f o r t h e Sherman p a r a d o x .L a i r d 9 p r o p o s e d t h a t t h e f r a g i l e X m u t a t i o nl o c a l l y b l o c k s t h e r e a c t i v a t i o n , b e f o r e oogene-s i s , o f a p r e v i o u s l y i n a c t i v e X , a n d t h e f a i l u r et o era s e t h e i m p r i n t s p e c i f i c t o an i n a c t i v e Xchromosome ( m o s t l i k e l y DNA m e t h y l a t i o n )w o u l d account f o r t h e t r a n s i t i o n f r o m a m u t a -t i o n w i t h no p h e n o t y p i c c o n s e q u e n c e ( s u c h a st h a t f o u n d i n n o r m a l t r a n s m i t t i n g m a l e s or i nt h e i r d a u g h t e r s ) t o a m u t a t i o n c a u s i n g d i s e a s e .L a i r d ' s h y p o t h e s i s p r e d i c t e d t h a t t h e o b s e r v e dp r o b a b i l i t y o f s u c h a t r a n s i t i o n s h o u l d b e o n l y50 % a n d i t was p r o p o s e d t h a t t h e h i g h e r v a l u e ,as w e l l as t h e Sherman p a r a d o x , c o u l d b ea c c o u n t e d f o r b y a s c e r t a i n m e n t b i a s e s , a n d b ya s m a l l number o f o o g o n i a l precursors a t t h et i m e o f X i n a c t i v a t i o n . ' 0 The f i n d i n g o f a b n o r -m a l m e t h y l a t i o n l i n k e d t o t h e m u t a t i o n c a u s -i n g d i s e a s e 3 " ' i 3 a p p e a r e d t o support L a i r d ' sh y p o t h e s i s . When t h e true nature o f t h e m u t a -t i o n was s h o w n , we s u g g e s t e d as an a l t e r n a t i v ep o s s i b i l i t y t h a t t h e s e q u e n c e o f t h e premu-t a t i o n c o u l d d i c t a t e t h e r i s k o f t r a n s i t i o n t o t h ef u l l m u t a t i o n . 3 R e s u l t s were f i r s t p r e s e n t e d b yS u t h e r l a n d e t a l a t t h e 5 t h X L i n k e d M e n t a lR e t a r d a t i o n Workshop ( A u g u s t 1 9 9 1 ) s u g g e s t -i n g a s t r o n g p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h es i z e o f t h e p r e m u t a t i o n i n t h e f e m a l e a n d t h er i s k o f a f u l l m u t a t i o n i n t h e o f f s p r i n g . ' 4 S i m i -l a r r e s u l t s were r e p o r t e d b y Fu er a l ' 5 w h i l et h i s w o r k was i n p r e p a r a t i o n . We present h e r et h e m o l e c u l a r f i n d i n g s i n f a m i l i e s w h i c h i l l u s -t r a t e w e l l t h e Sherman p a r a d o x . Our r e s u l t sc o n f i r m and e x t e n d t h o s e o f Fu e t a l ' 5 a n d Yue t a l , ' 4 as t h e y are b a s e d on a l a r g e r p o p u l a t i o na n d h a v e b e e n , a t l e a s t i n p a r t , c o r r e c t e d f o ra s c e r t a i n m e n t b i a s e s . The f i n d i n g t h a t s m a l lp r e m u t a t i o n s h a v e a l o w r i s k o f t r a n s i t i o n t of u l l m u t a t i o n s u g g e s t s t h a t c a r r i e r s o f premu-t a t i o n s may b e more f r e q u e n t i n t h e p o p u l a t i o nt h a n p r e v i o u s l y e x p e c t e d , a n d we h a v e i n d e e dd e t e c t e d one i n a p erson w i t h no a p r i o r i r i s k .M a t e r i a l a n d methodsThe f a m i l i e s were t h o s e a n a l y s e d p r e v i o u s l y 7w i t h some new f a m i l i e s i n c l u d e d . M u t a t i o n swere a n a l y s e d i n EcoRI + E a g I d i g e s t s 7 or, f o rmore accurate s i z i n g , i n P s t I d i g e s t s 8 s e p a r a t e don 1 - 2 % agarose g e l s a n d h y b r i d i s e d t o p r o b eS t B 1 2 X X . ' 6 The Av a l u e s a re g i v e n b y r e f e r -e n c e t o a b a s e l e v e l c o r r e s p o n d i n g t o t h e m o s tcommon n o r m a l a l l e l e ( 2 9 r e p e a t s ) .PCR across t h e CGG repeats was p e r f o r m e di n a t o t a l v o l u m e o f 5 0 j l w i t h a b o u t 1 0 0 ng o fDNA, i n t h e p r e s e n c e o f 10 m m o l / l T r i s - H C lpH 8 - 3 , 5 0 m m o l / l KC1, 20 m m o l / l MgCl2,1 0 0 g m o l / l dATP, 1 0 0 m m o l / l dCTP,1 0 0 j m o l / l dTTP, 1 0 0 p m o l / l 7 - d e a z a - d G T P ,a n d 2 5 U o f A m p l i - T a q DNA p o l y m e r a s e .

P r i m e r s P F 1 9 9 : 5 ' A T C T T C T C T T C A G C C -C T G C T A G C G 3 ' a n d P E 1 3 8 : 5'GCATG-AATTCGAGCATTTGATTTCCCACGC-CAC3' w e r e a d d e d a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f0 - 5 j m o l / l . T h e s e p r i m e r s a l l o w a m p l i f i c a t i o no f a 6 0 0 b p f r a g m e n t f o r a n o r m a l a l l e l e w i t h 2 9CGG r e p e a t s . The r e a c t i o n s w e r e h e a t e d a t9 6 C f o r f i v e m i n u t e s , f o l l o w e d b y 3 5 c y c l e s o f0 - 5 m i n u t e s d e n a t u r a t i o n a t 9 6 C , o n e m i n u t ea n n e a l i n g a t 6 0 C , f o u r m i n u t e s o f e l o n g a t i o na t 7 2 C w i t h a t w o s e c o n d e x t e n t i o n a t e a c hc y c l e , a n d a f i n a l e l o n g a t i o n o f 1 0 m i n u t e s a t7 2 C . A d d i t i o n o f 2% d e i o n i s e d f o r m a m i d eu s u a l l y h e l p e d t h e a m p l i f i c a t i o n o f DNA t h a tw a s r e f r a c t o r y t o P C R a c r o s s t h i s r e g i o n . A5 g l a l i q u o t o f t h e P C R r e a c t i o n w a s l o a d e d ona 2 % a g a r o s e g e l i n b u f f e r c o n t a i n i n g 5 t o 1 0 n go f t h e 0 9 k b E a g I - P s t I f r a g m e n t c o r r e s p o n d -i n g t o t h e S t B 1 2 . 5 p r o b e , a n d w h i c h s e r v e s a si n t e r n a l m a r k e r f o r a c c u r a t e s i z e d e t e r m i -n a t i o n . A n o t h e r s i z e m a r k e r ( M s p I d i g e s t o fp B R 3 2 2 ) w a s a d d e d s e p a r a t e l y t o e a c h g e l .A f t e r m i g r a t i o n , t h e g e l w a s t r e a t e d f o r 2 0m i n u t e s i n 1 - 5 m o l / l N a C l , 0 - 5 m o l / l NaOH,n e u t r a l i s e d i n 1 - 5 N a C l , 0 - 5 m o l / l T r i s - H C lpH 7 2 , 1 m m o l / l EDTA, a n d b l o t t e d o n t oHybond N + f o r o n e o r t w o h o u r s . The m e m -b r a n e w a s h y b r i d i s e d f o r s i x h o u r s o r m o r e a t4 2 C i n t h e p r e s e n c e o f 50% f o r m a m i d e t op r o b e S t B 1 2 . 5 ( l a b e l l e d b y random p r i m i n g ) ,s h o w i n g t h e P C R p r o d u c t s a n d t h e 0 9kbr e f e r e n c e b a n d . S m a ll p r e m u t a t i o n s w e r e a l s os i z e d o n s e q u e n c i n g g e l s a f t e r P C R i n t h ep r e s e n c e o f 3 2 P - d C T P , a s d e s c r i b e d b y Fu e ta l . ' 5

R e s u l t sTHE CLUSTERING PHENOMENON EXAMINED ATTHE DNA LEVELWe h a v e s y s t e m a t i c a l l y a n a l y s e d f r a g i l e Xf a m i l i e s f o r t h e t y p e o f m u t a t i o n , u s i n g t h es t r a t e g y d e s c r i b e d b y R o u s s e a u e t a l . 7 I ns e v e r a l l a r g e f a m i l i e s , t h e S h e r m a n p a r a d o xw a s w e l l i l l u s t r a t e d b y t h e c l u s t e r i n g o f p r e -m u t a t i o n s i n some s i b s h i p s a n d t h e c l u s t e r i n go f f u l l m u t a t i o n s i n o t h e r s . I n f a m i l y A awoman w i t h a r a t h e r s m a l l p r e m u t a t i o n(A= 1 2 0 b p ) , t h e s i s t e r o f a n a f f e c t e d m a l e( w i t h a f u l l m u t a t i o n ) , h a d s e v e n n o r m a l c h i l -d r e n who i n h e r i t e d t h e p r e m u t a t i o n ( w i t h ar a n g e o f A = 1 3 0 t o 5 5 0 b p ) , a n d n o n e w i t h ac h a r a c t e r i s t i c f u l l m u t a t i o n ( f i g s 1 a n d 2 ) . I tc a n b e s e e n t h a t I I - 7 ( l a n e 5 ) w a s o n e o f t h er a r e c a s e s w h e r e t h e d i a g n o s i s o f p r e m u t a t i o nw a s b a s e d s o l e l y o n m u t a t i o n s i z e ( A = 5 5 0 )a n d n o t o n t h e p r e s e n c e o f a n u n m e t h y l a t e dp r e m u t a t i o n , w h i c h i s i n g e n e r a l s e e n i n E c o R I+ E a g I d i g e s t s . I n t h i s woman, t h e p a t t e r n o fX i n a c t i v a t i o n w a s e x t r e m e l y b i a s e d w i t h v e r yl i t t l e o f t h e 5 - 2 k b b a n d i n d i c a t i v e o f t h e n o r -m a l i n a c t i v e X . T h i s c o u l d w e l l a c c o u n t f o r t h ef a i l u r e t o s e e t h e s m a l l e x p e c t e d a m o u n t o fm u t a t e d f r a g m e n t o n t h e a c t i v e X c h r o m o s o m e( e s p e c i a l l y s i n c e u n m e t h y l a t e d p r e m u t a t i o n si n t h i s r a n g e t e n d t o g i v e f u z z y b a n d s o w i n g t osome d e g r e e o f s o m a t i c i n s t a b i l i t y ) . H o w e v e r ,i t c a n n o t b e e l i m i n a t e d t h a t s h e h a d i n f a c t as m a l l f u l l m u t a t i o n , a s a h o m o g e n e o u s p a t t e r nw i t h p r e f e r e n t i a l i n a c t i v a t i o n o f t h e m u t a t e d X

7 9 5


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3/9

H e i t z , D e v y s , I m b e r t , K r e t z , M a n d e lF a m i l y A

1 2 3D X : N o r P r e F u l lA ( k b ) : 0 - 1 2

62 t3 L4 LS[I6 ( 7 8P r e P r e P r e P r e P r e P r e Nor0 2 0 013 0 . 1 8 0 - 2 2 0 - 1 2 0 - 5 5

1 1

I I ID X :A ( k b ) : N o r F u l l1 7 N o r

D X : P r eA ( k b ) : 0 - 2 101

D X : F u l lA ( k b ) : 1 - 1 - 2 - 0

0 2 0 3 0 4 5 06 0 7 08P r e P r e P r e P r e P r e P r e P r e0 - 1 7 0 - 2 1 0 - 2 0 0 - 2 4 0 - 1 7 0 - 1 5 0 . 2 3

t2t3 #46WZYL 0F u l l ' M e M o s ' F u l l N o r Nor Nor Nor 'Me Mos' Nor1 - 3 1 . 0 - 2 - 3 0 - 6 - 2 0 1. 0F i g u r e I P e d i g r e e s s h o w i n g c l u s t e r i n g o f p r e m u t a t i o n w i t h i n a s i b s h i p . C a r r i e r s o f a p r e m u t a t i o n a re i n d i c a t e d b y ad o t . H a l f f i l l e d s y m b o l s c o r r e s p o n d t o c y t o g e n e t i c e x p r e s s i o n on t h e r i g h t ( h a t c h e d I t o 3 % f r a g i l e s i t e , f i l l e d >4%),a n d m e n t a l r e t a r d a t i o n on t h e l e f t ( h a t c h e d : m i l d M R, f i l l e d : m o d e r a t e or severe MR). T h e s y m b o l i n I I I 1 4 ( f a m i l yA) c o r r e s p o n d s t o a p r e n a t a l d i a g n o s i s . T h e m o l e c u l a r d i a g n o s i s (DX) i s i n d i c a t e d a s n o r m a l ( N o r ) , p r e m u t a t i o n( P r e ) , f u l l m u t a t i o n ( F u l l ) , or m o s a i c ( M o s or Me M o s , t h e l a t t e r c o r r e s p o n d i n g t o p r e s e n c e o f p a r t i a l l yu n m e t h y l a t e d b a n d s i n t h e A=0 5 t o 1 k b r a n g e ) . T h e s i z e i n c r e a s e o v er t h e n o r m a l s i z e i s r e p r e s e n t e d b y t h e Av a l u e ( i n k b ) .

- 1 --E!1

4567J 89 10 11;.. I-

1 2 3

- F

1 2

5 2 _

do ~ ~ ~-- 8 - _ aF i g u r e 2 A n a ly s i s o f f a m i l y A o n a EcoRI+ E a g I d i g e s t . Normal f r a g m2 8 k b ( u n m e t h y l a t e d on t h e a c t i v e X) and 5 - 2 k b ( m e t h y l a t e d on t h e i n aP r e m u t a t i o n s a re b e s t s e e n o v e r t h e 2 - 8 k b b a n d . T h e c a r r i e r f e m a l e i n l a nf i g 1 A ) d o e s not s h o w t h e f o u r b a n d p a t t e r n t y p i c a l o f p r e m u t a t i o n s , o w i ni n a c t i v a t i o n ( t h e 5 2 k b b a n d i s o n l y f a i n t l y v i s i b l e ) and may r e p r e s e n t ab o r d e r l i n e case b e t w e e n p r e m u t a t i o n and f u l l m u t a t i o n . S u b j e c t s i n l a n e s Iu n r e l a t e d t o f a m i l y A . A p a r t i a l d i g e s t f r a g m e n t i s i n d i c a t e d b y an a s t e r i s

i s not i n f r e q u e n t i n a d u l t c a r r i e r s o f a f u l lm u t a t i o n . 1 7 T h i s woman t w i c e p a s s e d a f u l lr ; m u t a t i o n t o h e r o f f s p r i n g ( a n d no p r e m u -t a t i o n ) . A n o t h e r e x a m p l e o f s u c h c l u s t e r i n gwasthatoffamilyB( f i g 1)withfournormalt r a n s m i t t i n g m a l e s known f r o m p e d i g r e e orDNA a n a l y s i s . A f i f t h b r o t h e r h a d a A o f6 0 b p ( t e s t e d b y t h e more accurate P C R t e s t )

1 3 14 15 ( f i g 3 ) a n d was l a t e r v e r i f i e d t o c o r r e s p o n d t o4 8 r e p e a t s ' 5 a t t h e l i m i t b e t w e e n p r e m u t a t i o na n d n o r m a l . He was t e s t e d f o r t wo m i c r o s a t e l -l i t e m a r k e r s w i t h i n 150kb o f t h e f r a g i l e Xl o c u s (DXS458 a n d FRAXAC2)618 and wasf o u n d t o b e i d e n t i c a l t o h i s NTM b r o t h e r s ,s u g g e s t i n g t h a t h e ha d i n f a c t i n h e r i t e d t h ep r e m u t a t e d a l l e l e f r o m h i s d e a d mother ( u n l e s ss h e was h o m o z y g o u s f o r b o t h p o l y m o r p h i cm a r k e r s ) . E i g h t d a ug h t e r s i n g e n e r a t i o n I I a l lh a d a p r e m u t a t i o n ( i n t h e A= 1 5 0 t o 25 0 b pr a n g e ) ; i n t h e next g e n e r a t i o n , f i v e c h i l d r e nh a d i n h e r i t e d a f u l l m u t a t i o n ( i n t wo c a s e s with

' e n t s a re t h e s m a l l e s t fragment p a r t i a l l y unmethylated)c t i v e X ) . a n d n on e h ad a p r e m u t a t i o n . One c h i l d ( I I I 5 )t e 5 ( I I 1 7 i n w i t h m i l d m e n t a l r e t a r d a t i o n was n o r m a l a t t h eg t o b i a s e d fragileXlocus. The c lu s t ering wasnot a l w a y sand 8 a r e a b s o l u t e , however, a s s h own b y family C ( f i gs k i n l a n e 4 . 4 ) , w h e r e t wo s i b s h i p s showed a m i x t u r e o f

1D X : P r eA ( k b ) : 0 . 1 4

Nr9 r 1 0N o r N o r

L1 2 d3 44

F a m i l y B

D X :A v ( k b ) :

F u l l0 - 8

1 1

I I I

7 9 6


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I n h e r i t a n c e o f t h e f r a g i l e X s y n d r o m e

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3- am_ - 0 9 k b

. - , .4-0*+6kb

F i g u r e 3 P C R b a s e d a s s a y f o r d e t e c t i o n a n d s i z i n g o f p r e m u t a t i o n s . T h e a s s a y w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i nM a t e r i a l a n d m e t h o d s . T h e 0 9 k b b a n d c o r r e s p o n d s t o t h e i n t e r n a l c o n t r o l f r a g m e n t l o a de d w i t h t h e PCR p r o d u c t .T h e 0 - 6 k b f r a g m e n t c o r r e s p o n d s t o t h e a m p l i f i e d p r o d u c t f o r a common a l l e l e w i t h - 3 0 CGG r e p e a t s . L a n e s 1 t o 3c o r r e s p o n d t o a b r a n c h o f a f r a g i l e X f a m i l y w h o h a d n o a p r i o r i r i s k o f h a v i n g a m u t a t i o n . T h e a b n o r m a l b a n d h a sa A o f 8 0 t o 9 0 b p ( 5 4 a n d 5 8 r e p e a t s r e s p e c t i v e l y a s m e a s u r e d o n s e q u e n c i n g g e l s ) . L a n e s 4 t o 7 c o r r e s p o n d t o p a r to f a f a m i l y a l s o s h o w n i n f i g 7 B . L a n e s 9 , 1 7 , 1 9 , a n d 2 3 c o r r e s p o n d t o s u b j e c t s i n f a m i l y B ( f i g 1 ) . I n l a n e 1 7 , t h em a l e I l h a d a - 6 0 b p A ( 4 8 r e p e a t s m e a s u r e d o n s e q u e n c i n g g e l s ) a n d may c o r r e s p o n d t o a h i g h n o r m a l a l l e l e o r as m a l l p r e m u t a t i o n ( s e e t e x t ) . S u b j e c t s i n l a n e s 1 , 5 , a n d 2 0 h a v e o n l y n o r m a l a l l e l e s .F a m i l y C

D X : ( - W + N o r P r e Nr P r eA ( k b ) : 0 - 1 6 0 - 1 1

1 2 * 3 *4 5 6 7 8; 9 10 ( ) 1 1 [12 *13D X : P r e N o r F u l l M os N o r F u l l N o r N o r P r e N o r P r e P r e F u l lA ( k b ) : 0 - 4 2 2 - 5 0 - 2 5 - 3 - 1 1 . 5 0 - 2 0 0 - 2 5 0 . 3 5 1 - 0

D X : N o r F u l l N o rA ( k b ) : 2 - 3F i g u r e 4 A p e d i g r e e s h o w i n g p a r t i a l c l u s t e r i n g o f p r e m u t a t i o n s . Same s y m b o l s a s i n f i g 1 . A f r a g i l e X s i t e h a d b e e no b s e r v e d i n 1 % o f c e l l s i n I 1 0 , w h o w a s l a t e r f o u n d t o b e n o r m a l .

s u b j e c t s w i t h a p r e m u t a t i o n o r a f u l l m u t a -t i o n ( o r a m o s a i c p a t t e r n ) . I t c a n b e n o t e d i nt h i s f a m i l y t h a t t h e wom a n who h a d t h r e ec h i l d r e n w i t h a p r e m u t a t i o n a n d o n e w i t h a f u l lm u t a t i o n h a d a s m a l l (A= 1 1 0 b p ) p r e m u -t a t i o n . I I 1 0 , who w a s o r i g i n a l l y f o u n d t o h a v e1 % o f f r a g i l e X s i t e , h a d i n h e r i t e d a n o r m a lh a p l o t y p e f o r f l a n k i n g RFLPs, a n d w a s l a t e rc o n f i r m e d t o h a v e n o f r a g i l e X m u t a t i o n .F i n a l l y t h e f a m i l y wh o h a d o r i g i n a l l y s h o w nc o m p l e t e l i n k a g e b e t w e e n a n R F L P a t t h ec o a g u l a t i o n f a c t o r 9 l o c u s a n d t h e f r a g i l e Xl o c u s ' 9 w a s a l s o r e a n a l y s e d ( f i g 5 ) . A ll t h e s e v e nd a u g h t e r s o f a n o r m a l t r a n s m i t t i n g m a l e( A = 2 3 0 b p ) h a d i n h e r i t e d p r e m u t a t i o n s i n t h eA = 2 3 0 t o 3 1 0 b p r a n g e ( f i g 5 B ) , w h i l e i n t h en e x t g e n e r a t i o n d i r e c t DNA a n a l y s i s c o n -f i r m e d t h e f o r m e r g e n o t y p e a s s i g n m e n t s , t h a ti s , a l l t h e p h e n o t y p i c a l l y n o r m a l c h i l d r e n h a dn o m u t a t i o n a n d a l l t h e 1 0 a f f e c t e d c h i l d r e n ,who h a d i n h e r i t e d t h e g r a n d p a t e r n a l F9 a l l e l e ,h a d a f u l l m u t a t i o n o r w e r e m o s a i c s . No DNAw a s a v a i l a b l e f o r d i r e c t m u t a t i o n a n a l y s i s f o rf i v e c h o r i o n i c v i l l i s a m p l e s , b u t t h e i r s t a t u sw a s d e d u c e d e i t h e r f r o m c y t o g e n e t i c r e s u l t s( I I I - 1 8 a n d I I I 2 2 ) o r f r o m t h e F9-DXS52( S t l 4 ) h a p l o t y p e a s t h e y d i d n o t s h o w r e c o m -b i n a t i o n b e t w e e n t h e s e m a r k e r s t h a t f l a n k t h ef r a g i l e X l o c u s . I t i s o f i n t e r e s t t o n o t e t h a t i nt h i s f a m i l y t h e r e a r e no r e c o m b i n a n t s b e t w e e nF9 a n d FraX i n 2 1 m e i o t i c e v e n t s ( o r 1 8 i f o n e

t a k e s o n l y t h o s e wh o h a v e a s t a t u s e s t a b l i s h e db y d i r e c t DNA a n a l y s i s o r b y c y t o g e n e t i c s ) . Att h e t i m e o f t h e o r i g i n a l d e s c r i p t i o n t h e r e w e r eo n l y 1 5 n o n - r e c o m b i n a n t s . T h i s c o n f i r m s t h es t r i k i n g t i g h t l i n k a g e , c o n t r a s t i n g w i t h t h e-20% r e c o m b i n a t i o n f o u n d b e t w e e n t h e t w ol o c i i n o t h e r f a m i l i e s ' 2 2 0 ; t h e p r o b a b i l i t y o fo b s e r v i n g t h i s b y c h a n c e i s 0 . 8 2 1 , a b o u t 1 i n1 0 0 . I n f a c t t h i s f a m i l y w a s o n e o f t h e t h r e ew h i c h a c c o u n t e d f o r m o s t o f t h e h e t e r o g e n e i t yo f r e c o m b i n a t i o n r e p o r t e d b y Brown e t a l . 2 'A P C R BASED TEST FO R THE A NA L YSIS O FPR EMUTATIONSI n o r d e r t o c h a r a c t e r i s e q u i c k l y a n d a c c u r a t e l yt h e s i z e o f p r e m u t a t i o n s , we h a v e d e v e l o p e d aP C R b a s e d t e s t . P r i m e r s w e r e c h o s e n t h a ts h o u l d a m p l i f y a 6 0 0 b p n o r m a l f r a g m e n t ( f o rs u b j e c t s w i t h t h e m o s t f r e q u e n t a l l e l e c o n t a i n -i n g 2 9 r e p e a t s ) . The e x t r e m e GC r i c h n e s s o ft h e r e g i o n (100% f o r t h e CGG r e p e a t )p r o m p t e d u s t o u s e 7 - d e a z a - d G T P i n s t e a d o fd G T P f o r t h e P C R r e a c t i o n . ' 6 H o w e v e r , u n d e rs u c h c o n d i t i o n s , i t i s n o t p o s s i b l e t o d e t e c t t h eDNA s y n t h e s i s e d b y f l u o r e s c e n c e i n t h e p r e s -e n c e o f e t h i d i u m b r o m i d e . The r e a c t i o n p r o -d u c t s w e r e t h u s a n a l y s e d o n a g a r o s e g e l , b l o t -t e d , a n d h y b r i d i s e d t o a 9 0 0 b p p r o b e( S t B 1 2 . 5 ) t h a t i n c l u de s t h e a m p l i f i e d s e g m e n ta n d c o n t a i n s 2 0 CGG r e p e a t s . 3 An a l i q u o t o f

__ b_1 -40adoI m g pip_ m _wio0

7 9 7

F .


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H e i t z , D e v y s , I m b e r t , K r e t z , M a n d e lAF a m i l y D

I I

1 1F I X :D x :i A ( k b ) :

I I I d

F I X :D x :A ( k b ) :

1 2 2 2 1 2N o r F u l l F u l l F u l l2 - 0 1 - 5 0 - 9 - 2 - 2 1 2Mos0 * 3 - 3 *

2 1 1 2 2 1 1 1 1 2 1 1 2 1 2 2 2 2 2 1 1 2Mos N o r F u l l Mos N o r N o r F u l l ( - ) ( + ) N o r F u l l + ( ) F u l l N o r -0 . 5 - 3 - 0 2 - 3 0 . 2 - 3 . 1 0 - 9 - 2 - 6 1 - 5 - 3 - 3 1 - 6 - 2 - 80

-c

L~~~F i g u r e 5 ( A ) S e g r e g a t i o n o f t h e m u t a t i o n i n a f a m i l y s h o w i n g c o m p l e t e l i n k a g e b e t w e e n t h e f r a g i l e X a n d t h e c o a g ul a t i on f a c t o r IX g e n e . T h ep e d i g r e e o f f a m i l y D i s p r e s e n t e d i n t h e upper p a n e l . S y m b o l s a re a s i n f i g 1 . 1 I 1 8 h a d 5 % f r a g i l e X s i t e . T h e a l l e l e s at t h e T a q I RFLP i n t h ec o a g u l a t i o n f a c t o r IX g e n e a re i n d i c a t e d . ' 9 F i v e p r e n a t a l d i a g n o s e s h a d b e e n p e r f o r m e d i n I I 1 4 , 1 5 , 1 8 , 1 9 , a n d 2 2 u s i n g f l a n k i n g p r o b e s i n a l lc a s e s , a n d c y t o g e n e t i c a n a l y s i s f o r I I 1 1 8 a n d 2 2 . No r e c o m b i n a t i o n was d e t e c t e d b e t w e e n F9 a n d DXS52 i n t h e s e f i v e c a s e s ( w h i c h were f u l l yi n f o r m a t i v e f o r t h e m a r k e r s ) . A s p o n t a n e o u s a b o r t i o n o c c u r r e d i n I I 1 4 , w h i l e pregnancy was t e r m i n a t e d i n I I 1 5 , 1 8 , a n d 1 9 b e c a u s e ana f f e c t e d F9-DXS52 h a p l o t y p e was f o u n d . I I I - 2 2 w h o h a d t h e n o r m a l h a p l o t y p e was c o n f i r m e d t o b e f r a g i l e X n e g a t i v e a f t e r b i r t h . + or -c o r r e s p o n d s t o p r e s e n c e or a b s e n c e o f f r a g i l e s i t e , ( + ) or ( -) c o r r e s p o n d s t o t h e genotype d e d u c e d f r o m t h e F9-DXS52 h a p l o t y p e . ( B ) A n a l y s i so f p r e m u t a t i o n s in g e n e r a t i o n s I a n d I I . Th e p r e m u t a t i o n s were a n a l y s e d i n a P s t I d i g e s t h y b r i d i s e d t o p r o b e StB12XX.'6 T h i s p r o b e d e t e c t s t h ep o l y m o r p h i c CGG c o n t a i n i n g f r a g m e n t 1060+ 7 0 b p ( 6 t o 5 4 r e p e a t s ) i n n o r m a l s u b j e c t s ( r a n g e i n d i c a t e d b y t h e b r a c k e t ) a n d a constant b a n d a t1 0 7 5 b p .

t h e S t B 1 2 . 5 i n s e r t was i n c l u d e d i n t h e l o a d i n gb u f f e r t o p r o v i d e an i n t e r n a l c o n t r o l b a n d . Theb l o t t i n g , h y b r i d i s a t i o n , a n d exposure s t e p sc o u l d b e c o n s i d e r a b l y s h o r t e n e d c o m p a r e d t os t a n d a r d g e n o m i c b l o t t i n g a n d r e s u l t s wereo b t a i n e d i n l e s s t h a n t wo d a y s from t h e s t a r t o ft h e PCR r e a c t i o n ( s e e M a t e r i a l and m e t h o d s ) .W h i l e t h i s work was c o m p l e t e d , t wo o t h e rPCR b a s e d t e s t s were r e p o r t e d . A d i r e c t P C Rt e s t d e v e l o p e d b y Fu e t a l l 5 a l l o w s e v e n moreaccurate s i z i n g o f p r e m u t a t i o n s on s e q u e n c i n gg e l s . A h y b r i d method s i m i l a r t o ours, b u tu s i n g t h e CGG r e p e a t i t s e l f as p r o b e , wasr e p o r t e d b y P e r g o l i z z i e t a P 2 w h i c h a l s o a l l o w sd e t e c t i o n , i n m o s t c a s e s , o f f u l l m u t a t i o n s . 2 3Our p r o c e d u r e a l l o w s accurate s i z i n g w i t han e s t i m a t e d p r e c i s i o n o f 2 0 b p , t h a t i s , s e v e nCGG r e p e a t s ( f i g 3 ) . T h i s was e s p e c i a l l y ap-p l i e d t o t h e s t u d y o f s m a l l p r e m u t a t i o n s ora m b i g u o u s cases. We c o u l d t h u s c o n f i r m t h a tan a b n o r m a l f r a g m e n t f i r s t o b s e r v e d i n EcoRI+ E a g I d i g e s t s i n a man w i t h no a p r i o r i r i s ka n d i n h i s d a u g h t e r ha d a s i z e t y p i c a l o f a s m a l lp r e m u t a t i o n ( A =8 0 a n d A =9 0 b p , f i g 3 , l a n e s2 a n d 3 c o r r e s p o n d i n g t o 5 4 and 5 8 r e p e a t swhen m e a s u r e d as d e s c r i b e d b y Fu e t a l l 5 ) . I t i sa l s o o b v i o u s w i t h t h i s assay t h a t l a r g e p r e m u-t a t i o n s ( A > 2 0 0 b p ) a re a l r e a d y s om a t i c a ll yu n s t a b l e w i t h a s p a n o f -50 b p ( f i g 3 , l a n e s

1 0 - 1 2 , 1 9 , 2 3 ) . T h i s c a n a l s o b e d e t e c t e d asf u z z y b a n d s i n S o u t h e r n b l o t s u s i n g P s t I orE c o R I + E a g I d i g e s t s .RELATIONSHIP BETWEEN S I Z E O F PREMUTATIONIN T H E MOTHER AND RISK O F T R A NS ITION TOFU LL MUTATIONA c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s i z e o f a m p l i f i c a t i o ni n a m o t h e r a n d t h e r i s k o f i n h e r i t a n c e o f al a r g e a n d s o m a t i c a l l y u n s t a b l e m u t a t i o n i n t h eo f f s p r i n g h a s r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d b y Yu e ta l ' 4 a n d Fu e t a l l 5 w h i l e our l a r g e d a t a s e t wasb e i n g a n a l y s e d . We m e a s u r e d s i z e o f p r e m u -t a t i o n s i n m o t h e r s u s i n g t h e EcoRI + E a g I d i -g e s t d e s c r i b e d b y R o u s s e a u e t a l 7 ( f i g 2 ) and i nm o s t c a s e s a ls o i n P s t I d i g e s t s 5 1 4 ( f i g 5 B ) . Them a j o r i t y o f t h e s e m o t h e r s were a l s o a n a l y s e d i na PCR a s s a y , which i s more accurate f o r mea-s u r i n g s m a l l p r e m u t a t i o n s as t h e normal f r a g -m e n t i s o n l y 6 0 0 b p ( c o m p a r e d t o 2 - 8 kb i n t h eEcoRI + E a g I d i g e s t , and 1 kb i n t h e P s t I d i -g e s t ( f i g 3 ) ) . I n f a c t , e x c e p t f o r t h e s m a l l e s tp r e m u t a t i o n s , we f o u n d t h a t m e a s u r e m e n t i nt h e EcoRI + E a g I d i g e s t gav e v a l u e s i n veryg o o d agreement w i t h t h o s e o b t a i n e d w i t h t h eo t h e r a s s a y s ( a s n o t e d p r e v i o u s l y , 2 4 a A v a l u e o f2 0 0 b p c o r r e s p o n d s t o a d i f f e r e n t i a l m i g r a t i o no f - 5mmi n an EcoRI + E a g I d i g e s t a n d

F I X : 1D x : N o rA ( k b ) :B

1 1

7 9 8

" --( .I... - 1

- 1,- .. .4 -


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I n h e r i t a n c e o f t h e f r a g i l e X s y n d r o m eO f f s p r i n g o f m o th e r s w i t h p r e m u t a t i o n s . M o t h e r s h a v e b e e n g r o u p e d i n t o c l a s s e sa c c o r d i n g t o t h e s i z e o f t h e i r p r e m u t a t i o n . T h e n u m b e r o f c h i l d r e n w i t h a p r e m u t a t i o n ,f u l l m u t a t i o n , o r w h o i n h e r i t e d t h e n o r m a l a l l e l e ( a s c o n t r o l l e d b y d i r e c t DNAa n a l y s i s ) i s i n d i c a t e d . U n t e s t e d c h i l d r e n a r e c l a s s i f i e d a s n o r m a l o r m e n t a l l y r e t a r d e d .I n t h e F M - p r o b a n d c o l u m n , o n e a f f e c t e d p r o b a n d w a s r e m o v e d i n e a c h f a m i l y .

T e s t e d o f f s p r i n g U n t e s t e d o f f s p r i n gA b pi n m o t h e r s PM FM F M - p r o b a n d N N MR7 5 - 1 2 5 1 8 4 2 6 3 01 2 5 - 1 7 5 7 1 5 9 2 2 1 1 51 7 5 - 2 2 5 5 6 4 4 5 3 4 1 6 42 2 5 - 2 7 5 0 3 3 2 4 1 5 2 22 7 5 - 3 2 5 0 1 8 1 5 1 5 1 03 2 5 - 3 7 5 0 2 1 1 1 03 7 5 - 4 2 5 0 1 1 2 0 04 2 5 - 4 7 5 0 5 3 0 1 04 7 5 - 5 2 5 0 3 1 4 0 0

T o t a l 3 0 1 4 5 1 0 1 9 9 3 5 1 1

9 mm i n a P s t d i g e s t ) . O n t h e b a s i s o f b o t hs i z e a n d m e t h y l a t i o n a n a l y s i s , we d i v i d e d o f f -s p r i n g i n t o t w o c l a s s e s : t h o s e w i t h p r e m u t a t i o na n d t h o s e w i t h f u l l m u t a t i o n ( t a b l e ) . A l l 3 0c h i l d r e n w i t h p r e m u t a t i o n s h a d m o t h e r s w i t ha p r e m u t a t i o n o f A < 2 2 5 , a n d f o r 1 8 o f t h e s e ,t h e m o t h e r ' s A w a s < 1 2 5 ( i n o n l y t w o o f t h e s e3 0 c a s e s d i d t h e s i z e o f t h e p r e m u t a t i o n d e -c r e a s e ) . I n c o n t r a s t , i n m o t h e r s w i t h aA > 2 2 5 b p , t h e t r a n s i t i o n t o f u l l m u t a t i o n ( o rm o s a i c ) o c c u r r e d i n a l l 6 2 c h i l d r e n a n a l y s e d .H o w e v e r , i t w a s e v i d e n t t h a t o u r d a t a s u f f e r e df r o m a s c e r t a i n m e n t b i a s i n f a v o u r o f c h i l d r e nw i t h a f u l l m u t a t i o n , a s i n d i c a t e d b y t h e f a c tt h a t i n t h e s i b s h i p s a n a l y s e d 1 7 5 c h i l d r e n h a di n h e r i t e d a m u t a t e d c h r o m o s o m e a n d o n l y 9 9i n h e r i t e d t h e n o r m a l o n e ( r a t i o 1 - 7 7 t o 1 ) . Tot r y t o c o r r e c t f o r t h i s b i a s we s u b t r a c t e d f r o me a c h f a m i l y a s i n g l e a f f e c t e d p r o b a n d ( a s s u m -i n g s i n g l e a s c e r t a i n m e n t ) . Under t h e s e c o n -d i t i o n s , t h e m u t a t e d t o n o r m a l r a t i o d e c r e a s e dt o 1 - 3 2 a n d t h e r a t i o o f p r e m u t a t e d t o f u l lm u t a t e d w a s 0 - 3 . T h i s a p p a r e n t l y i n c o m p l e t ec o r r e c t i o n r e f l e c t s i n p a r t t h e f a c t t h a t 4 6 s i b sc o u l d n o t b e s t u d i e d ( o f whom o n l y 1 1 w e r em e n t a l l y r e t a r d e d ) . A s s u m i n g t h a t t h e p r o p o r -t i o n o f p r e m u t a t i o n s i n t h e u n t e s t e d n o r m a ls i b s i s t h e s a m e a s i n t h e t e s t e d o n e s , t h em u t a t e d t o n o r m a l r a t i o w o u l d b e 1 1 9 . Thed i f f e r e n c e f r o m t h e e x p e c t e d r a t i o o f 1 i s m o s tp r o b a b l y t h e r e s u l t o f m u lt i p le a s c e r t a i n m e n t

5 0*P r e m u t a t i o nE H F u l l m u t a t i o n0

3 0

2 0

1 0

075-125 175-225 275-325 5375-425 475-525125-175 225-275 5 3 2 5 - 3 7 5 5 4 2 5 - 4 7 5( 8 ) ( 1 9 ) ( 3 6 ) ( 2 2 ) ( 1 1 ) ( 1 ) ( 1 ) ( 2 ) ( 2 )S i z e o f p r e m u t a t i o n i n b p (number o f mothers i n each s i z e c l a s s )F i g u r e 6 R i s k o f t r a n s i t i o n t o f u l l m u t a t i o n a s a f u n c t i o n o f t h e s i z e o f p r e m u t a t i o ni n t h e m o t h e r , a f t e r c o r r e c t i o n f o r a s c e r t a i n m e n t b i a s . O f f s p r i n g w i t h t h e abnormala l l e l e were c h a r a c t e r i s e d a s h a v i n g t h e p r e m u t a t i o n or f u l l m u t a t i o n ( t h e l a t t e r c l a s si n c l u d e s m o s a i c s ) . One a f f e c t e d p r o b a n d pe r f a m i l y was r e m o v e d ( s e e t e x t ) .

f o r s o m e f a m i l i e s . The e f f e c t o f s i z e o f t h ep r e m u t a t i o n o n t h e t y p e o f m u t a t i o n i n h e r i t e db y t h e o f f s p r i n g ( a f t e r t h i s s t i l l p a r t i a l c o r r e c -t i o n f o r a s c e r t a i n m e n t b i a s ) i s p r e s e n t e d i n f i g6 . I t s h o w s t h a t f o r A s o f 7 5 t o 1 2 5 b p , a b o u t90% o f c h i l d r e n i n h e r i t a p r e m u t a t i o n . R a r ee x a m p l e s o f s m a l l p r e m u t a t i o n s l e a d i n g t o f u l lm u t a t i o n i n t h e o f f s p r i n g a r e shown i n f i g 7 .The s m a l l e s t o f t h e s e ( l a n e 1 , l e f t p a n e l ) h a s6 0 r e p e a t s a s m e a s u r e d o n a s e q u e n c i n g g e la f t e r PCR. An a b o u t e v e n r i s k was f o u n d f o rA s o f 1 2 5 t o 1 7 5 b p w h i l e , a s s t a t e d a b o v e ,p r e m u t a t i o n s l a r g e r t h a n 2 2 5 b p a l w a y s le d t o af u l l m u t a t i o n . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t v e r y f e wp r e m u t a t i o n s w e r e f o u n d a b o v e 3 2 5 b p , w h i c hi s p r o b a b l y b e c a u s e , p a s t 1 7 5 b p , a p r e m u -t a t i o n i s more l i k e l y t o p a s s t o a f u l l m u t a t i o nt h a n t o h a v e a m o d e r a t e i n c r e a s e i n s i z e w i t h i nt h e r a n g e o f p r e m u t a t i o n .

D i s c u s s i o nOur r e s u l t s c o n f i r m t h a t t h e s i z e o f t h e p r e m u -t a t i o n i s a m a j o r ( a n d p e r h a p s t h e o n l y ) d e t e r -m i n a n t o f t h e r i s k o f t r a n s i t i o n f r o m p r e m u -t a t i o n t o f u l l m u t a t i o n . ' 4 1 5 We h a v e a n a l y s e d1 0 2 s i b s h i p s f r o m f r a g i l e X f a m i l i e s w h o s em o t h e r s h a d a p r e m u t a t i o n , a s a m p l e s i z el a r g e r t h a n t h a t o f Fu e t a l l 5 ( 3 0 s i b s h i p s ) o r Yue t a l ' 4 ( 6 0 s i b s h i p s ) . We h a v e t r i e d t o c o r r e c tf o r a s c e r t a i n m e n t b i a s , w h i c h f a v o u r s a f f e c t e dc h i l d r e n a n d w h i c h w a s n o t t a k e n i n t o a c c o u n ti n t h e p r e v i o u s r e p o r t s . A l t h o u g h o u r c o r r e c -t i o n a p p e a r s s t i l l i n c o m p l e t e , i t s h o u l d r e s u l t i na more a c c u r a t e e s t i m a t i o n o f t h e r i s k o f t r a n s i -t i o n f r o m p r e m u t a t i o n t o f u l l m u t a t i o n . T h i sr i s k w o u l d b e a b o u t 10% f o r p r e m u t a t i o n s

1 2 3 4

Q

5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2

52-_e _ _-28-.-

F i g u r e 7 S m a l l p r e m u t a t i o n s t h a t h a d d i r e c t l y o ri n d i r e c t l y l e d t o a f u l l m u t a t i o n a s v i s u a l i s e d i n a nE c o R I + E a g I d i g e s t . I n t h e f a m i l y o n t h e l e f t , t h em o t h e r ( l a n e 1 ) h a d a p r e m u t a t i o n ( m e a s u r e d i n P s t Id i g e s t s ) w i t h a A o f 9 0 b p ( 6 0 r e p e a t s w e r e m e a s u r e d i nt h e d i r e c t P CR a s s a y o f F u e t a l ' 5 ) w h i l e t h e d a u g h t e r si n l a n e s 2 a n d 3 h a d l a r g e r p r e m u t a t i o n s ( A = 2 0 0 t o3 0 0 b p ; i n l a n e 3 , t h e a b n o r m a l a l l e l e i s m o s t l y o n t h ei n a c t i v e X ) , a n d t h e t h i r d d a u g h t e r h a d a h e t e r o g e n e o u sf u l l m u t a t i o n . I n t h e r i g h t p a n e l , l a n e s 7 , 1 1 , 8 a n d 6c o r r e s p o n d t o l a n e s 4 , 5 , 6 , a n d 7 r e s p e c t i v e l y i n f i g 5 .T h e p r e m u t a t i o n a p p e a r s s m a l l e r i n l a n e 6 b e c a u s e m o s to f i t i s o n t h e i n a c t i v e X ( s l i g h t l y a b o v e t h e 5 - 2 k bn o r m a l b a n d ) , w h i c h d o e s n o t a l lo w a c c ur a t e s i z i n g , a n db e c a u s e t h i s woman i n h e r i t e d f r o m h e r f a t h e r a h i g h' n o r m a l ' a l l e l e ( s e e f i g 5 , l a n e 7 ) . P r e m u t a t i o n s h a v e aA o f 1 20 , 1 15 , 1 25 , a n d 2 0 0 b p i n l a n e s 6 , 7 , 8 , a n d 1 0r e s p e c t i v e l y .

0 )a._C o( 0~ 0' a )C u )

7 9 9group.bmj.comon January 25, 2013 - Published byjmg.bmj.comDownloaded from

7/29/2019 J Med Genet-1992-Heitz-794-801

7/9

H e i t z , D e v y s , I m b e r t , K r e t z , M a n d e lw i t h a m p l i f i c a t i o n ( A s ) o f 7 5 t o 1 2 5 b p ( c o r r e s -p o n d i n g t o 5 5 t o 7 0 r e p e a t s ) , a b o u t 50 %b e t w e e n 1 2 5 a n d 1 7 5 b p ( 7 0 t o 9 0 r e p e a t s ) , a n d>9 8 % a b o v e 2 2 5 b p ( 1 0 5 r e p e a t s ) w h i c h f i t sr e m a r k a b l y w e l l w i t h t h e d a t a o f Fu e t a l l 5 a n dYu e t a l . 1 4 A l t h o u g h t h i s h a s i m p o r t a n t c o n s e -q u e n c e s i n g e n e t i c c o u n s e l l i n g , s i n c e t h e r i s ko f h a v i n g a f f e c t e d c h i l d r e n c a n v a r y c o n s i d e r a -b l y d e p e n d i n g o n p r e m u t a t i o n s i z e , f o r a s i t u a -t i o n w i t h a l o w b u t m e a s u r a b l e r i s k i t w i l lp r o b a b ly b e n e c e s s a r y t o c o n s i d e r p r e n a t a lDNA d i a g n o s i s . I t r e m a i n s t o b e s e e n ,h o w e v e r , w h e t h e r d i f f e r e n t p a t t e r n s o fi n t e r s p e r s e d AGG u n i t s e x i s t w i t h i n t h e CGGr e p e a t , 3 5 6 w h i c h m i g h t i n f l u e n c e t h e r i s k o ft r a n s i t i o n t o f u l l m u t a t i o n . I t h a s b e e n s h o w nf o r ( C A ) n m i c r o s a t e l l i t e s t h a t i m p e r f e c t t a n -d e m r e p e a t s a r e l e s s p o l y m o r p h i c ( t h a t i s , m o r es t a b l e ) t h a n p e r f e c t o n e s . 2 5A s a l r e a d y d i s c u s s e d b y Fu e t a l , " 5 t h e s ef i n d i n g s a c c o u n t v e r y w e l l f o r t h e S h e r m a np a r a d o x a n d t h e c l u s t e r i n g w i t h i n s i b s h i p s o fe i t h e r n o r m a l t r a n s m i t t i n g m a l e s ( o r u n a f f e c -t e d c a r r i e r s ) o r o f m a l e s o r f e m a l e s w i t h p h e n o -t y p i c e x p r e s s i o n . A f t e r c o r r e c t i o n f o r a s c e r -t a i n m e n t b i a s we f o u n d a 77% o v e r a l l r i s k f o rt r a n s i t i o n t o f u l l m u t a t i o n , w h i c h f i t s w e l l w i t ht h e 8 0% p e n e t r a n c e v a l u e f o u n d b y S h e r m a ne t a P i n f r a g i l e X f a m i l i e s . The f a c t t h a t a b o u t15% o f c a r r i e r s w i t h p r e m u t a t i o n s ( o r a b o u t10% o f a l l c a r r i e r s ) i n f r a g i l e X f a m i l i e s h a v e as m a l l a m p l i f i c a t i o n a s s o c i a t e d w i t h a l o w r i s ko f h a v i n g a f f e c t e d c h i l d r e n s t r o n g l y s u g g e s t st h a t t h e i r f r e q u e n c y i n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o nm i g h t b e a b o u t a s h i g h a s t h a t o f c a r r i e r s w i t h aA o f 1 5 0 t o 3 0 0 , who m a k e u p t h e m a j o r i t y o fp r e m u t a t i o n c a r r i e r s i n f r a g i l e X f a m i l i e s .A s s u m i n g t h a t o n e m a l e i n 1 50 0 h a s c l i n i c a le x p r e s s i o n o f t h e f r a g i l e X s y n d r o m e , t h ef r e q u e n c y o f c a r r i e r f e m a l e s w o u l d b e a b o u t 1i n 6 0 0 , a s s u m i n g a n 8 0% a v e r a g e r i s k o f t r a n s i -t i o n t o f u l l m u t a t i o n , b u t t h a t f i g u r e may b ec o n s i d e r a b l y i n c r e a s e d , t o p e r h a p s 1 i n 4 0 0 o rm o r e , i f o n e t a k e s i n t o a c c o u n t women w i t h as m a l l r i s k who d o n o t b e l o n g ( y e t ) t o f r a g i l e Xf a m i l i e s . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n so f a b n o r m a l f r a g m e n t s o f p r e m u t a t i o n s i z e i ns p o u s e s 2 6 ( f i g 3 , l a n e s 1 , 2 , 3 ) a n d i n o n e C E P Hf a m i l y , ' 5 a n d r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y o f s y s t e m -a t i c s c r e e n i n g f o r s u c h m u t a t i o n s i n women o fc h i l d b e a r i n g a g e i n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n .The 100% r i s k o f t r a n s i t i o n o f p r e m u t a t i o n sw i t h > 1 0 0 r e p e a t s t o a d i s e a s e c a u s i n g f u l lm u t a t i o n d u r i n g f e m a l e t r a n s m i s s i o n i s v e r yd i f f i c u l t t o r e c o n c i l e w i t h L a i r d ' s h y p o t h e s i s o fa c o r r e l a t i o n w i t h t h e X i n a c t i v a t i o n s t a t u s , a st h e l a t t e r w o u l d p r e d i c t a m a ximum r i s k o f5 0 / 0 . 9 1 L a i r d ' s h y p o t h e s i s w o u l d s t i l l b e t e n -a b l e , h o w e v e r , i f i n o o g o n i a l p r e c u r s o r s as e l e c t i o n was o c c u r r i n g w h i c h w o u l d r e s u l t i np r e f e r e n t i a l s u r v i v a l o f c e l l s w i t h t h e p r e m u -t a t i o n on t h e i n a c t i v e X . We h a v e o b s e r v e ds u c h a s e l e c t i o n ( a l b e i t w i t h an e x t e n d e dc o u r s e o f t i m e ) i n l e u c o c y t e s o f f e m a l e c a r r i e r so f a f u l l m u t a t i o n , b u t n o t i n c a r r i e r s o f ap r e m u t a t i o n . ' 7 H o w e v e r , i t i s f o r m a l l y p o s s i b l et h a t o o g o n i a l p r e c u r s o r s w o u l d b e c r i t i c a l l yd e p e n d e n t on FMR-1 f u n c t i o n a n d t h a te x p a n s i o n o f a b o u t 1 0 0 r e p e a t s c o u l d i m p a i rf u n c t i o n o f t h e F M R- 1 g e n e , e i t h e r t h r o u g h

m o d i f i c a t i o n o f t h e p r o t e i n ( i f t h e r e p e a t i st r a n s l a t e d ) o r b y d e c r e a s i n g s t a b i l i t y o f t h emRNA.T h i s o b l i g a t o r y a n d s e x b i a s e d e x p a n s i o n ,w i t h c a t a s t r o p h i c c o n s e q u e n c e s , a p p e a r s t os h o w a m a j o r d i f f e r e n c e f r o m m y o t o n i c d y s -t r o p h y , w h e r e e x p a n s i o n s o f s i m i l a r s i z e c a no c c u r i n b o t h s e x e s . " 7 2 9 A s t h e f u l l m u t a t i o n i nf r a g i l e X i s c o r r e l a t e d w i t h a b n o r m a l m e t h y l a -t i o n o f n e a r b y s i t e s , a n d t h e CGG r e p e a t i t s e l fi s a b l e t o b e m e t h y l a t e d ( a l t h o u g h i t h a s n o tb e e n e x p e r i m e n t a l l y s h o w n t h a t i t i s i n d e e dm e t h y l a t e d i n a f u l l m u t a t i o n ) , w h i l e t h e CTGr e p e a t i s u n a b l e t o b e m e t h y l a t e d , i t i s t e m p t -i n g t o p r o p o s e t h a t m e t h y l a t i o n c o u l d b e t h eb a s i s f o r t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o d i s -e a s e s , i f i t w e r e a c a u s e r a t h e r t h a n a c o n s e -q u e n c e o f t h e l a r g e e x p a n s i o n . We h a v e p r o -p o s e d e a r l i e r 3 t h a t m e t h y l a t i o n c o u l d m o d i f yt h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e CGG r e p e a t ,i n t e r f e r e w i t h r e p l i c a t i o n p r o c e s s e s , a n d i n -d u c e a g r e a t e r i n s t a b i l i t y . A s e c o n d u n s o l v e dq u e s t i o n i s w h e t h e r l a r g e e x p a n s i o n r e a l l y o c -c u r s d u r i n g f e m a l e m e i o s i s o r v e r y e a r l y i ne m b r y o g e n e s i s . I n t h e l a t t e r c a s e , o n e w o u l dh a v e t o s u p p o s e a s e x i m p r i n t ( n o t n e c e s s a r i l yl i n k e d t o f e m a l e X i n a c t i v a t i o n ) i n t h e FMR-1r e g i o n w h i c h w o u l d d i s t i n g u i s h b e t w e e n ap r e m u t a t i o n on a p a t e r n a l l y o r m a t e r n a l l y d e -r i v e d X . T h i s q u e s t i o n i s r a i s e d b y t h e p u z -z l i n g c a s e o f ' m o s a i c s ' who h a v e c e l l s w i t he i t h e r a f u l l o r p r e m u t a t i o n . " 8 I n t h e f i r s ta l t e r n a t i v e ( m e i o t i c e x p a n s i o n ) s o m e p o s t c o n -c e p t i o n p r o c e s s e s ( s i s t e r c h r o m a t i d e x c h a n g ef o r i n s t a n c e ) c o u l d l e a d b o t h t o s h o r t e n i n g o ft h e r e p e a t a n d l o s s o f m e t h y l a t i o n . H o w e v e r ,t h i s i s i n a p p a r e n t c o n t r a d i c t i o n t o t h e v e r yr a r e o c c u r r e n c e o f e x t e n s i v e s h o r t e n i n g i n o f f -s p r i n g f r o m f e m a l e s w i t h a f u l l m u t a t i o n 7 ( a n di n t h e r a r e e v e n t r e c o r d e d , o n e c a n n o t e x c l u d et h a t t h e m o t h e r w a s a ' m o s a i c ' a n d t h e o f f -s p r i n g w i t h a p r e m u t a t i o n h a d i n h e r i t e d a n Xc h r o m o s o m e t h a t o r i g i n a l l y c a r r i e d a p r e m u -t a t i o n ) . Thus i t s e e m s t h a t t h e s e c o n d a l t e r n a t -i v e ( e x p a n s i o n b e i n g m o s t l y a p o s t c o n c e p t i o n a le v e n t ) i s a t l e a s t a s a t t r a c t i v e , e s p e c i a l l y a sh e t e r o g e n e i t y o f t h e f u l l m u t a t i o n ( b y s o m a t i cm u t a t i o n ) i s a l r e a d y p r e s e n t e a r l y i n f e t a l l i f ea n d f u r t h e r m u t a t i o n ma y b e much r e d u c e dp o s t n a t a l l y . - 0 We s u g g e s t a s o n e p o s s i b i l i t yt h a t a b n o r m a l m e t h y l a t i o n c o u l d o c c u r v e r ye a r l y i n e m b r y o g e n e s i s o n t h e m a t e r n a l l y d e -r i v e d c h r o m o s o m e c a r r y i n g a p r e m u t a t i o n ,w i t h a f r e q u e n c y w h i c h d e p e n d s o n t h e s i z e o ft h e p r e m u t a t i o n ( t h a t i s , o f t h e m e t h y l a b l et a r g e t ) . T h i s w o u l d l e a d t o e x p a n s i o n t o f u l lm u t a t i o n a n d s t a b i l i s a t i o n o f t h e m e t h y l a t i o n .T h a t a b n o r m a l m e t h y l a t i o n ( o f t h e f u l l m u t a -t i o n ) o c c u r s v e r y e a r l y i s s u g g e s t e d b y t h ef i n d i n g t h a t i n c h o r i o n i c v i l l i t h e f u l l m u t a t i o ni s i n g e n e r a l ( b u t n o t a l w a y s ) m e t h y l a t e d ,w h e r e a s t h e n o r m a l i n a c t i v e X i s i n g e n e r a lu n m e t h y l a t e d a t t h e F MR- 1 C pG i s l a n d . ' 0U n d e r m e t h y l a t i o n o f C pG i s l a n d s o n t h e i n a c -t i v e X i n c h o r i o n i c v i l l i i s w e l l k n o w n , a n d i sa t t r i b u t e d t o t h e l a t e r t i m i n g o f t h e m e t h y l a -t i o n p r o c e s s w i t h r e s p e c t t o t h e e a r l i e r d i f f e r -e n t i a t i o n o f t r o p h o b l a s t s . " 3 2 M e t h y l a t i o n p a t -t e r n s m a y , h o w e v e r , b e o b s c u r e d b y e x i s t e n c ei n e a r l y e m b r y o g e n e s i s o f b o t h m e t h y l a t i o n

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I n h e r i t a n c e o f t h e f r a g i l e X s y n d r o m eand d e m e t h y l a t i o n a c t i v i t y . 3 " 3 I t i s o b v i o u st h a t t h e s e q u e s t i o n s w i l l b e d i f f i c u l t to a n a l y s ed i r e c t l y i n h u m a n s , a n d s o l u t i o n s may comefrom c o m p a r i s o n w i t h m o l e c u l a r p atternso b s e r v e d a t o t h e r X l i n k e d or a u t o s o m a l f r a g i l es i t e s , or at l o c i s u c h a s t h a t f o r m y o t o n i cd y s t r o p h y , and by t r y i n g to f i n d or e s t a b l i s ha n i m a l ( m u r i n e ) m o d e l s w h i c h m i m i c t h ev a r i o u s f e a t u r e s o f u n s t a b le e x p a n s i o n o f s u c hr ep e a t s .

We t h a n k our c l i n i c a l c o l l e a g e s f o r r e f e r r i n gf r a g i l e X f a m i l i e s , V B i a n c a l a n a f o r p r o v i d i n gb l o t s o f t h e f a mi li e s, F R o u s s e a u f o r p a r t i c i p a -t i o n i n t h e i n i t i a l s t age o f t h i s w o r k , A S t a u band F R u f f e n a c h f o r o l i g o n u c l e o t i d e s y n t h e s i s ,and J M L a f o n t a i n e and A L a n d m a n f o r pho-t o g r a p h y . T h i s work was s u p p o r t e d byINSERM/CNAMTS, t h e CHRU o f S t r a s -b o u r g , t h e M i n i s t e r e d e l a R e c h e r c h e e t d e l aT e c h n o l o g i e ( M R T ) ( t o JLM), a n d t h eA s s o c i a t i o n F r a n g a i s e co ntr e l e s Myopathies( A F M ) .

S h er m a n S. R e c o g n i t i o n o f t h e f r a g i l e X or M a r t i n - B e l lsyndrome. I n : Hag er man R J , S i lv e r m a n AC , e d s . F r a g i l eX syndrome: d i a g n o s i s , t r e a t m e n t an d r e s e a r c h . B a l t i m o r e :Th e Johns Hopkins U n i v e r s i t y P r e s s , 1 9 9 1 : 6 9 - 9 7 .2 S h er m a n SL , J a c o b s P A, Morton NE , et a l . F u r t h e r segre-g a t i o n a n al ys i s o f t h e f r a g i l e X syndrome w i t h s p e c i a lr e f e r e n c e t o t r a n s m i t t i n g m a l e s . Hum G e n e t 1985;69:289-9 9 .3 O b e r l e I, Rousseau F , Heitz D, et a l . I n s t a b i l i t y o f a 55 0 b pDNA segment a n d abnormal m e t h y l a t i o n i n f r a g i l e Xsyndrome. S c i e n c e 1 9 9 1 ; 2 5 2 : 1 0 9 7 - 1 0 2 .4 Yu S , P r i t c h a r d M , Kremer E , e t a l . F r a g i l e X genotypec h a r a c t e r i z e d b y an u n s t a b l e r e g i o n o f DNA. S c i e n c e1 9 9 1 ; 2 5 2 : 1 1 7 9 - 8 1 .

5 Kre m e r EJ , P r i t c h a r d M, L y n c h M, et a l . M a ppi n g o f DNAi n s t a b i l i t y at t h e f r a g i l e X t o a t r i n u c l e o t i d e r e p e a t se-quence p ( C G G ) n . S c i e n c e 1 9 9 1 ; 2 5 2 : 1 7 1 1 - 4 .6 Verkerk AJ , P i e r e t t i M , Fu YH , e t a l . I d e n t i f i c a t i o n o f agene (FMR-1) c o n t a i n i n g a CGG repeat c o i n c i d e n t w i t h abreakpoint c l u s t e r r e g i o n e x hi b i t i n g l e n g t h v a r i a t i o n i nf r a g i l e X s y n drome. C e l l 1 9 9 1 ; 6 5 : 9 0 5 - 1 4 .7 Rous s e au F, Heitz D, Biancalana V, et a l . E f f i c i e n t a n dr e l i a b l e d i r e c t d i a g n o s i s of t h e f r a g i l e X mental r e t a r d -a t i o n syndrome. N Engl Med 1 9 9 1 ; 3 2 5 : 1 6 7 3 - 8 1 .8 P i e r e t t i M, Zhang F , F u Y H, et a l . Absence o f e x p r e s s i o n o fth e FMR-1 gene i n f r a g i l e X syndrome. C e l l 1991;66:817-2 2 .

9 Laird CD. Proposed m e c h a n i s m o f i n h e r i t a n c e a n d expres-s i o n of th e human f r a g i l e - X s y n d r o m e o f m en t a l retard-a t i o n . G e n e t i c s 1 9 8 7 ; 1 1 7 : 5 8 7 - 9 9 .10 Laird C D, Lamb MM, Thorne J L . Two p r o g e n i t o r c e l l sf o r h u m a n oogonia i n f e r r e d from p e d i g r e e d a t a an d t h e X -inactivation imprinting m o d e l of th e f r a g i l e X s y n d r o m e .Am Hum G e n e t 1 9 9 0 ; 4 6 : 6 9 6 - 7 1 9 .

1 1 Vin cen t A, Heitz D, P e t i t C , Kr e t z C, Oberle I , M a n d e l JL .A b n o r m a l pattern detected i n f r a gi le X p a t i e n t s b y pu l s edf i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s . Nature 1 9 9 1 ; 3 4 9 : 6 2 4 - 6 .12 B e l l MV, Hirst MC, Na ka hori Y, e t al . Physical mappingacross th e f r a g i l e X : h y p erm e t h y l a t i on a n d c l i n i c a le x p r e s s i o n o f t h e f r a g i l e X syndrome. C e l l 1 9 9 1 ; 6 4 : 8 6 1 - 6 .

1 3 H e i t z D , R o u s s e a u F , D e v y s D , e t a l . I s o l a t i o n o f s e q u e n c e st h a t s p a n t h e f r a g i l e X a n d i d e n t i f i c a t i o n o f a f r a g i l e X -r e l a t e d CpG i s l a n d . S c i e n c e 1 9 9 1 ; 2 5 1 : 1 2 3 6 - 9 .1 4 Yu S , M u l l e y J , L o e s c h D , e t a l . F r a g i l e X s y n d r o m e :u n i q u e g e n e t i c s o f t h e h e r i t a b l e u n s t a b l e e l e m e n t . Am J 7Hu m G e n e t 1 9 9 2 ; 5 0 : 9 6 8 - 8 0 .1 5 Fu YH, K u h l DPA, P i z z u t i A , e t a l . V a r i a t i o n o f t h e CGGr e p e a t a t t h e f r a g i l e X s i t e r e s u l t s i n g e n e t i c i n s t a b i l i t y :r e s o l u t i o n o f t h e S h e r m a n p a r a d o x . C e l l 1 9 9 1 ; 6 7 : 1 0 4 7 - 5 8 .1 6 M c C o n l o g u e L , B r o w M A D , I n n i s MA. S t r u c t u r e - i n d e -p e n d e n t DNA a m p l i f i c a t i o n b y P C R u s i n g 7 - d e a z a - 2 ' -d e o x y g u a n o s i n e . N u c l e i c A c i d s R e s 1 9 8 8 ; 1 6 : 9 8 6 9 .1 7 R o u s s e a u F , H e i t z D , O b e r l e I , M a n d e l J L . S e l e c t i o n i nb l o o d c e l l s f r o m f e m a l e c a r r i e r s o f t h e f r a g i l e X s y n d r o m e :i n v e r s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n a g e a n d p r o po r t i o n o f a c t i v eX c h r o m o s o m e s c a r r y i n g t h e f u l l m u t a t i o n . J M e d G e n e t1 9 9 1 ; 2 8 : 8 3 0 - 6 .1 8 R i c h a r d s R I , Holman K , Kozman H , e t a l . F r a g i l e Xs y n d r o m e : g e n e t i c l o c a l i s a t i o n b y l i n k a g e m a p p i n g o f t w om i c r o s a t e l l i t e r e p e a t s FRAXACI a n d F R A X A C 2 w h i c hi m m e d i a t e l y f l a n k t h e f r a g i l e s i t e . J M e d G e n e t1 9 9 1 ; 2 8 : 8 1 8 - 2 3 .1 9 C a m e r i n o G , M a t t e i M G , M a t t e i J F, J a y e M, M a n d e l J L .C l o s e l i n k a g e o f f r a g i l e X - m e n t a l r e t a r d a t i o n s y n d r o m e t oh a e m o p h i l i a B a n d t r a n s m i s s i o n t h r o u g h a n o r m a l m a l e .N a t u r e 1 9 8 3 ; 3 0 6 : 7 0 1 - 4 .2 0 A r v e i l e r B , O b e r l e I , V i n c e n t A , H o f k e r M H, P e a r s o n P L ,M a n d e l J L . G e n e t i c m a p p i n g o f t h e X q 2 7 - q 2 8 r e g i o n :new RFLP m a r k e r s u s e f u l f o r d i a g n o s t i c a p p l i c a t i o n s i nf r a g i l e X a n d h e m o p h i l i a B f a m i l i e s . Am 7 Hu m G e n e t1 9 8 8 ; 4 2 : 3 8 0 - 9 .2 1 B r o w n WT, G r o s s A , C h a n C , e t a l . M u l t i - l o c u s a n a l y s i s o ft h e f r a g i l e X s y n d r o m e . Hum G e n e t 1 9 8 8 ; 7 8 : 2 0 1 - 5 .2 2 P e r g o l i z z i RG , E r s t e r S H , G o o n e w a r d e n a P , B r o w n T .D e t e c t i o n o f f u l l f r a g i l e X m u t a t i o n . L a n c e t 1 9 9 2 ;3 3 9 : 2 7 1 - 2 .2 3 E r s t e r S H , Brown WT, G o o n e w a r d e n a P , D o b k i n C S ,J e n k i n s E C , P e r g o l i z z i RG . P C R a n a l y s i s o f f r a g i l e Xm u t a t i o n s . Hum G e n e t ( i n p r e s s ) .2 4 R o u s s e a u F , H e i t z D , B i a n c a l a n a V , O b e r l e I , M a n d e l J L .O n s o m e t e c h n i c a l a s p e c t s o f d i r e c t DNA d i a g n o s i s o f t h ef r a g i l e X s y n d r o m e . AmJ M e d G e n e t 1 9 9 2 ; 4 3 : 1 9 7 - 2 0 7 .2 5 Weber J L . I n f o r m a t i v e n e s s o f human ( d C - d A ) n . ( d G - d t ) np o l y m o r p h i s m s . G e n o m i c s 1 9 9 0 ; 7 : 5 2 4 - 3 0 .2 6 M a c p h e r s o n J , H a r v e y J , C u r t i s G , e t a l . A r e i n v e s t i g a t i o no f t h i r t y t h r e e f r a g i l e ( X ) f a m i l i e s u s i n g p r o b e S t B 1 2 . 3 .Am J M e d G e n e t 1 9 9 2 ; 4 3 : 9 0 5 - 1 2 .2 7 F u YH, P i z z u t i A , F e n w i c k RG , e t a l . An u n s t a b l e t r i p l e tr e p e a t i n a g e n e r e l a t e d t o m y o t o n i c m u s c u l a r d y s t r o p h y .S c i e n c e 1 9 9 2 ; 2 5 5 : 1 2 5 6 - 8 .2 8 M a h a d e v a n M, T s i l f i d i s C , S a b o u r i n L , e t a l . M y o t o n i cd y s t r o p h y m u t a t i o n : a n u n s t a b l e CTG r e p e a t i n t h e 3 'u n t r a n s l a t e d r e g i o n o f t h e g e n e . S c i e n c e 1 9 9 2 ; 2 5 5 : 1 2 5 3 - 5 .2 9 B r o o k J D, M c C u r r a c h ME, H a r l e y HG, e t a l . M o l e c u l a rb a s i s o f m y o t o n i c d y s t r o p h y : e x p a n s i o n o f a t r i n u c l e o t i d e(CTG) r e p e a t a t t h e 3 ' e n d o f a t r a n s c r i p t e n c o d i n g ap r o t e i n k i na s e f a mi ly m e m b e r . C e l l 1 9 9 2 ; 6 8 : 7 9 9 - 8 0 8 .3 0 D e v y s D , B i a n c a l a n a V , R o u s s e a u F , B o u e J , M a n d e l J L ,O b e r l e I . A n a ly si s o f f u l l f r a g i l e X m u t a t i o n s i n f e t a lt i s s u e s a n d m o n o z yg o t i c t w i n s i n d i c a t e t h a t a b n o r m a lm e t h y l a t i o n a n d s o m a ti c h e t e ro g en e i t y a r e e s t a b l i s h e de a r l y i n d e v e l o p m e n t . An n J M e d G e n e t 1 9 9 2 ; 4 3 : 2 0 8 - 1 6 .3 1 M i g e o n B R , W o l f S F , A x e l m a n H , K a s lo w DC , S c h m i d tM. I n c o m p l e t e X c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n i nc h o r i o n i c v i l l i o f human p l a c e n t a . P r o c N a t l A c a d S c iUSA 1 9 8 5 ; 8 2 : 3 3 9 0 - 4 .3 2 M i g e o n B R . I n s i g h t s i n t o X c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n f r o ms t u d i e s o f s p e c i e s v a r i a t i o n , DNA m e t h y l a t i o n a n d r e p l i -c a t i o n , a n d v i c e v e r s a . G e n e t R e s 1 9 9 0 ; 5 6 : 9 1 - 8 .3 3 M i g e o n B R , H o l l a n d MM, D r i s c o l l D J , R o b i n s o n J C .P r o g r a m m e d d e m e t h y l a t i o n i n C pG i s l a n d s d u r i n ghuman f e t a l d e v e l o p m e n t . S o m a t i c C e l l Mol G e n e t1 9 9 1 ; 1 7 : 1 5 9 - 6 8 .3 4 F r a n k D , K e s h e t I , S h a n i M , L e v i n e A , R a z i n A , C e d a r H .D e m e t h y l a t i o n o f C pG i s l a n d s i n e m b r y o n i c c e l l s . N a t u r e1 9 9 1 ; 3 5 1 : 2 3 9 - 4 1 .

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7/29/2019 J Med Genet-1992-Heitz-794-801

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doi: 10.1136/jmg.29.11.7941992 29: 794-801J Med Genet

D Heitz, D Devys, G Imbert, et al.mutation.determinant of the transition to fullof the fragile X premutation is a majorInheritance of the fragile X syndrome: size

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J Med Genet-1992-Heitz-794-801