Opazovanje sestavnih delov fotosintetskih membran

bakterij in njihove organizacije in situ z mikroskopom na

atomsko silo (AFM)

Jana Petković17.11.2006

¼ genoma evkariontov in prokariontov vsebuje zapise za membranske proteine

razumevanje membranskih fenomenov zelo omejeno zaradi pomanjkanja strukturnih informacij

poznamo zelo malo struktur membranskih proteinov (rendgensko žarčenje in elektronska kristalografija)

AFM se je razvila v močno orodje raziskovanja membranskih proteinov vzorce lahko opazujemo v nativni obliki v različnih okoljih brez predhodnega označevanja odlična ujemanja topografov AFM proteinskih struktur v

primerjavi z elektronsko mikroskopijo in kristalografijo z X-žarki

možnost nanodisekcije bioloških vzorcev

vzorec skeniramo s tipalom, ki je pritrjeno na ročico

sila med vzorcem in tipalom povzroči deformacijo ročice in se le-ta upogne

upogib ročice najpogosteje merimo z laserskim žarkom, s katerim svetimo na zgornjo površino

ročice, od koder se odbije v fotodetektor

signal iz fotodetektorja sporoči kontrolni enoti za kakšno vrsto upogiba gre

procesna enota (računalnik) iz velikosti premika sestavi sliko na računalniku

AFM - instrumentacija

ročica s piramidalno oblikovano konico (tipalo), ki je v stiku z vzorcem

optično gibalo, sestavljeno iz laserja in fotodetektorja, ki omogoča zaznavanje upogiba ročice

piezoelektrični skener, ki usmerja vzorec glede na tipalo v smereh x, y in z

računalnik, ki poganja mikroskop in shranjuje površinske konture

Več načinov dela:

kontaktni način: tipalo in vzorec se stikata merjenje pri konstantni sili (vzorec premikamo v

vertikalni smeri, tako da je odmik ročice iz ravnovesne lege vedno enak)

merjenje pri konstantni višini (vzorec fiksiramo v vertikalni smeri in merimo spreminjanje sile, torej različne odmike ročice od ravnovesne lege)

nekontaktni način: tipalo niha nad površino vzorca tipalo ne pride v stik z vzorcem in se ne kontaminira možno je snemanje zelo občutljivih vzorcev

oscilirajoči način (“potrkavanje”) ročica niha z resonančno frekvenco z razmeroma veliko

amplitudo in se pri vsakem nihanju le dotakne vzorca, manj poškodujemo vzorec in se izognemo trenju, adheziji in elektrostatičnim silam (prednost pri gledanju mehkih bioloških vzorcev)

Interakcije substrat-vzorec in vzorec-tipalo delo v kontaktnem načinu

povzroča trenje lahko zmanjšamo sile trenj

z oscilirajočim načinom, ki dopušča opazovanje rahlo adsorbiranih vzorcev, čeprav z zmanjšano ločljivostjo

adsorpcija vzorca je odvisna od narave in koncentracije elektrolitov v puferski raztopini za slikanje elektrolite

moramo izbrati tako, da se ustvari ravnotežje med elektrostatsko odbojno in Van der waalsovo privlačno silo

Slikanje-ključni parametri trdnost adsorpcije objekta (membrane, ki niso zadosti trdno

adsorbirane-meglena slika) fizične lastnosti mehanizmov, ki delujejo na površino membran

(npr mobilnost struktur, ki predirajo membrano) geometrija tipala: asimetrično oz dvojno tipalo (geometrija

tipala se oddaljuje od hemisferne oblike)- ovira zanesljivost določanja kontur

radij tipala- vpliv na lateralno ločljivost, kar pride do izraza predvsem v kontaktnem načinu opazovanja

trdnost in mobilnost vzorca biološki vzorci so mehki in mobilni- moramo vdrževati nizke

vrednosti sil, uporabljenih za tipalo, da ne pride do morebitne deformacije vzorca

topografe moramo posneti v kratkem času, da preprečimo zamegljenost slike zaradi premikanja vzorca

Ločljivost: dosežemo atomsko ločljivost na trdnih kristalnih strukturah kot so

sljuda ali grafit (te uporabimo za imobilizacijo) pri lipidnem dvosloju, ki vsebuje membranske proteine, je

ločljivost v puferski raztopini omejena zaradi gibljivosti proteinov na sobni temperaturi (lateralna ločljivost <1 nm, vertikalna ločljivost 0,1 nm )

Fotosintetski aparat škrlatnih bakterij za absorpcijo svetlobe in njeno

pretvorbo v kemijsko energijo so potrebni 4 transmembranski kompleksi pigmentov, lokalizirani v intracitoplazemskih membranah: periferni kompleks, ki zbira svetlobo LH2 centralni kompleks, ki zbira svetlobo LH1 fotokemijski reakcijski center RC citokromski kompleks cyt bc1 za

translokacijo protonov

Reakcijski center: Heterotrimer, vsebuje proteinske podenote L, M in H.

LH antene: Heterodimer sestavljen iz 2 majhnih polipeptidov α in β, oba predirata membrano enkrat kot transmembranski heliks. Z njihovo agregacijo v obroč dobimo tercijarno strukturo kompleksa, ki izgleda kot votel cililnder.

LH1-RC centralni kompleks: Ni znana struktura na atomskem nivoju.

Cytbc1: Razvozlane so strukture homologov iz mitohondrij in cianobakterij, je dimer pravokoten na mebransko ravnino.

Priprava intracitoplazemske bakterijske membrane (ITC)

bakterijske celice razbijemo z večkratno pasažo s francosko prešo

lizat damo na saharozni gradient in centrifugiramo

pred analizo z AFM dializiramo lizate v pufru brez saharoze

če so prečiščene ITC premajhne, induciramo fuzijo membran s cikli zmrzovanja in odtajevanja.

Slike (AFM)

Rubrivivax gelatinosus – LH2

Rhodospirillum rubrum – LH1-RC

PSU- photosynthetic unit (AFM)

Blastochloris viridis Rhodospirillum photometricum

Rhodobacter blasticus

Trenutni pogledi…

gosto pakiranje PSU predstavlja problem za vse procese v membrani, za katere potrebujemo prosto difuzijo skozi membrano (prenos kinon-kinol med RC in cyt c1)

kako je možno vzpostaviti stike protein–protein, za katere je potrebna funkcionalnost PSU v membrani in hkrati omogočiti učinkovito difuzijo Q/QH2 v membrani?

rezultat dobljen z AFM: odsotnsot cyt odsotnsot cyt bc1bc1 kompleksakompleksa v membrani nekaterih bakterij (Blastochloris viridis), z analizo SDS-PAGE pa je prisotnost bila potrjenamožna razlaga: v celicah je cyt bc1 lociran blizu membrane ali na koncih

intracitoplazemskih invaginacij, ploska struktura teh invaginacij slikanih z AFM vsebuje veliko proteinov PSU, cyt bc1 pa zelo malo ali nič

PSU membran se pri AFM adsorbirajo preferenčno na podporo

Zaključki

Lahko preučujemo molekularno organizacijo fotosintetskih kompleksov pri visoki ločljivosti v nativnih membranah brez predhodnega topljenja, čiščenja ali kristalizacije.

Lahko spremljamo konformacijske spremembe bioloških struktur.

Škrlatne fotosintetske bakterije predstavljajo edinstven sistem za zbiranje in povezovanje strukturnih ter funkcijskih informacij.

Podatki kažejo, da bo AFM postala ključna tehnika za raziskovanje fotosintetskih aparatur v nativnih membranah (od bakterij do rastlin).

Literatura

Scheuring S., Lévy D., Rigaud J-L. 2005. Watching the components of photosynthetic bacterial membranes and their in situ organisation by atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes, 1712: 109-127

Engel A., Lyubchenko Y., Müller D. 1999. Atomic force microscopy: a powerful tool to observe biomolecules at work. Trends in cell biology, 9: 77-80

Müller D., Anderson K. 2002. Biomolecular imaging using atomic force microscope. Trends in biotechnology, 20: S45-S49