João Pedro Castro Silva-Tese de Mestrado-2004.pdf

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João Pedro Martins Soares de Castro e Silva

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Dissertação apresentada à Escola de Ciências

da Universidade do Minho para prestação de

provas de Mestrado em Genética Molecular

2004

Mestrado em Genética Molecular

i

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Assim se faz ciência: de sucessos e fracassos, de momentos de grande alegria e momentos

de desespero. Ao longo do último ano, em que trabalhei no laboratório de Culturas de Células

Animais no âmbito do Mestrado em Genética Molecular, também eu provei essas diferentes

sensações. A meu lado, apoiando-me, sempre as mesmas pessoas…pessoas mais próximas a

quem eu agora agradeço por, de uma forma ou de outra, me terem aturado e ajudado a

alcançar o objectivo de finalizar este trabalho. Agradeço por isso:

Em primeiro lugar, à minha orientadora, a Profª Doutora Olga Coutinho, por ter

acreditado em mim e ter-me proposto o trabalho que agora apresento; pela sua disponibilidade

e por ter partilhado comigo alguma da sua experiência e conhecimentos científicos, guiando-

me por entre os tortuosos caminhos da ciência; e também por, acima de tudo, ter sido uma boa

amiga.

Ao Filipe e à Profª Doutora Fernanda Proença, do Departamento de Química, por terem

sintetizado e me terem fornecido os compostos com que trabalhei; por estarem sempre

disponíveis para me esclarecerem dúvidas sobre a parte “mais química” do trabalho.

A todos os docentes do Departamento de Biologia que partilharam comigo e com os meus

colegas de Mestrado os seus conhecimentos; e a todos os não docentes do mesmo

Departamento, por nunca me terem deixado ficar sem material ou reagentes para trabalhar.

Às pessoas com quem partilhei o laboratório nos últimos tempos: ao Cristóvão, por seres

um bom amigo, por estares sempre disposto a ajudar e pelo teu espírito crítico (às vezes,

exagerado); à Marina, pela amizade e pela enorme boa disposição (só tu para desafiares o meu

mau humor matinal com as tuas melodias nem sempre afinadas); à Sílvia, pela serenidade

inspiradora com que afastaste as minhas frustrações e me fizeste acreditar em mim próprio; ao

Bruno, por teres sempre promovido discussões científicas de grande qualidade e me teres dado

outra visão da ciência; à Fábia e à Patrícia, por terem sido capazes de me aturar (o que é

bastante difícil) e contribuírem para um bom ambiente de trabalho; à Marisa, pela tua

simplicidade e sinceridade; ao pessoal dos 3B’s, pelo vosso contributo para um bom ambiente

de trabalho; ao “Puto”, pela irreverência e optimismo.

Às pessoas do CNC, em Coimbra, nomeadamente à Profª Doutora Cristina Rego, à Profª

Doutora Cláudia Pereira, à Sandra (não, ainda não me esqueci...), à Teresa e à Inês, com quem


ii

tive o enorme prazer de discutir ideias e que, mesmo ao longe, tiveram sempre uma

disponibilidade inigualável para me ajudar quando as coisas não me corriam da melhor

maneira.

Ao Paulo, por continuares a ser o que sempre foste: o melhor amigo que se pode ter,

sincero e sempre disponível para me ajudares e ouvires as minhas frustrações. Ao Conde,

porque apesar de o som não parecer tão audível, continuas sempre lá…em cima...da coluna…a

dançar! À “lindinha” Rita, por estares sempre presente, por me ouvires e por todos aqueles

pequeninos, mas deliciosos pormenores, com que me brindaste diariamente. Ao Raul, acima de

tudo por me compreenderes, e por me fazeres sentir que poderei sempre confiar em ti. À Sofia e

ao Luís, por estarem sempre disponíveis para ouvir os meus desabafos, e por todos os

aprazíveis e incisivos momentos de “cusquice”. À Sandrina, pelas vitórias que me ajudaste a

conquistar, dentro, e essencialmente fora, da mesa de matraquilhos. Ao Artur e ao Huguinho,

por me fazerem acreditar em mim próprio e por todos os momentos de pândega no horário

extra laboral. À Joaninha: apesar de longe, nunca me esquecerei de ti. Ao Manu e ao Louie,

por terem sempre uma palavra de apoio e confiança. À Júlia, por me fazeres acreditar que,

apesar de na vida nada correr como nos filmes, ela pode ser doce como ovos-moles. À

Clarinha, pelo teu modo inocente de ver as coisas. À Patrícia Ramalho, por me teres adoçado

os dias com os teus bolinhos e com a tua maneira de ser. À Andreia, pelos insanos momentos de

boa disposição. À “pequenita” Paty, por teres iluminado as minhas noites com o teu sorriso

etéreo…

Aos meus colegas de Mestrado, por todos os bons momentos que partilhámos.

A todos os outros colegas e amigos a quem não me referi, mas que sempre me

presentearam com um sorriso ou uma palavra amiga e que por isso foram, e continuarão a ser,

importantes para mim.

Aos meus pais, simplesmente por tudo!

Obrigado a todos. Sem vós, nada faria sentido…


iii

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Abreviatura Nome completo

BHT butil-hidroxitolueno

BSA albumina sérica bovina

CI50 concentração necessária para reduzir a resposta inicial em 50%

CP coeficientes de partilha

DMEM “Dulbecco’s Modified Eagle Medium”

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo

Eoxi potenciais de oxidação-redução

H2O2 peróxido de hidrogénio

LDH lactato desidrogenase

MDA malonildialdeído

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NADH nicotinamida-adenina dinucleótido reduzida

NO• óxido nítrico

O2• - anião superóxido

•OH radical hidroxilo

PBS tampão salino de fosfato

PI iodeto de propídio

Rf factor de retardação

ROS espécies reactivas de oxigénio

RNS espécies reactivas azoto

rpm rotações por minuto

RPMI meio de cultura criado no “Roswell Park Memorial Institute”

STS staurosporina

TBA ácido tiobarbitúrico

TBARS substâncias reactivas ao ácido tiobarbitúrico

TCA ácido tricloroacético

TLC cromatografia de camada fina


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As espécies reactivas de oxigénio (ROS), cuja formação ocorre maioritariamente na

mitocôndria, são conhecidas mediadoras de cascatas de sinalização intracelular. A

produção excessiva de ROS pode levar ao stresse oxidativo, à perda de funções

celulares e por fim à morte celular. Actualmente, o stresse oxidativo é considerado

como sendo um dos principais factores responsáveis por inúmeras doenças neuronais e

não neuronais, incluindo aterosclerose, isquémia cerebral, esclerose lateral amiotrófica,

doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Sendo assim, as abordagens que envolvem

o desenvolvimento e utilização de anti-oxidantes, que protejam as células para além das

suas defesas naturais, para a prevenção e terapia destas doenças, adquiriu especial

interesse.

Este trabalho experimental teve como principal objectivo a determinação da

actividade biológica de novos compostos, de síntese orgânica, com potencial anti-

oxidante, com vista ao seu eventual desenvolvimento como moléculas de interesse

farmacológico. Além disso, pretendeu-se também elucidar o seu efeito na reversão de

fenómenos apoptóticos decorrentes de processos de stresse oxidativo. A possibilidade

de modificação da estrutura química dos compostos, em função dos resultados obtidos,

constitui, por seu turno, uma mais valia para o eventual melhoramento do seu potencial

terapêutico.

Os compostos testados apresentaram uma elevada actividade anti-radicalar

intrínseca. A posterior avaliação da sua citotoxicidade (através dos testes de redução do

MTT e da libertação da LDH) demonstrou que nenhum dos compostos é tóxico para as

células.

Os compostos (FMA4, FMA5, FMA7 e FMA8) evidenciaram um perfil protector da

peroxidação lipídica induzida pelo par oxidante ascorbato-ferro, o que se correlaciona

com a sua lipossolubilidade.

Os compostos FMA4 e FMA7 revelaram protecção da morte celular induzida na

presença de um estímulo apoptótico de staurosporina. No entanto, verificou-se ser

necessário um período de pré-incubação de 3 horas para penetrarem na membrana

plasmática e exercerem o seu efeito protector intracelularmente. Essa protecção, que

resultou num significativo decréscimo da actividade da caspase-3, parece derivar de


v

uma protecção tanto da via mediada por receptores membranares (caspase-8) como da

via mitocondrial (caspase-9).

Por último, a ciclização das estruturas dos novos compostos fazia prever compostos

com uma actividade anti-oxidante superior. No entanto, os compostos cíclicos não

evidenciaram qualquer efeito anti-oxidante, como demonstrado pela incapacidade para

reduzir o radical DPPH até uma concentração de 500µM e pelos elevados potenciais de

oxidação-redução, pelo que o seu uso terapêutico potencial como agente pró-oxidantes

continua a ser investigado.


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Reactive oxygen species (ROS), whose formation occurs mainly in mitochondria,

are known mediators of intracellular signalling cascades. The excessive production of

ROS may lead to oxidative stress, loss of cell function, and ultimately to cell death.

Nowadays, oxidative stress is considered as one of the main causes of several neuronal

and non-neuronal diseases, such as atherosclerosis, cerebral ischemia, amyotrophic

lateral sclerosis, Parkinson and Alzheimer’s. Therefore, there has been a great interest in

approaches involving the development and utilization of antioxidants that can act

beyond the cells natural defences, for prevention and therapy of these diseases.

The main goal of the present research was the evaluation of the biological activity of

new compounds, of organic synthesis, with antioxidant potential, outlooking to its

eventual development as molecules of pharmacological interest. Moreover, we also

intended to elucidate their effect on the reversal of apoptotic phenomena derived from

oxidative stress. The possibility of modifying the chemical structure of the compounds,

in function of the results obtained, is also of great worth to the improvement of its

therapeutical potential.

The compounds tested showed a very high intrinsic antiradicalar activity. The

subsequent cytotoxicity evaluation (as assessed by the MTT reduction and LDH release

methods) indicated that none of the compounds was toxic to the cells.

The compounds (FMA4, FMA5, FMA7 and FMA8) revealed a protective profile on

lipid peroxidation induced by the ascorbate-iron oxidative pair, which can be correlated

to their liposolubility.

The compounds FMA4 and FMA7 presented a high cellular death protection in the

presence of a staurosporine apoptotic stimulus. However, a pre-incubation period of

three hours was needed for them to penetrate the plasmic membrane and yield their

protective effect intracellularly. That protection, which resulted in a significant

reduction of caspases-3 activity, seems to result from protection observed in the

membrane receptor pathway (caspase-8) and in the mitochondrial pathway (caspase-9).

Last of all, the cyclization of the new compounds structures was expected to obtain

compounds with higher antioxidant activities. Nevertheless, the cyclic compounds did

not show any antioxidant effect, as demonstrated by their inability to reduce the DPPH


vii

radical for concentrations up to 500µM and by their elevated redox potentials, so its

potential therapeutical use as prooxidant agents is currently under investigation.


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O presente trabalho enquadra-se no Mestrado em Genética Molecular da

Universidade do Minho e centra-se na determinação da actividade biológica de novos

compostos com potencial anti-oxidante, no sentido do seu eventual desenvolvimento

como moléculas de interesse farmacológico em doenças envolvendo stresse oxidativo.

Os novos compostos a testar neste trabalho são compostos azotados, de síntese

orgânica, cuja estrutura química, através da presença de grupos hidroxilo nas posições

C-3 e C-4 do substituinte aromático, revelam uma capacidade de tamponização de

radicais livres, o que dá indicações sobre o seu potencial como “scavengers” de

oxigénio. Além disso, a introdução dessas estruturas numa base de dados criada para o

efeito por um grupo de investigadores russos revelou o seu potencial farmacológico em

doenças que envolvam stresse oxidativo. O acesso directo aos novos compostos com

potencial farmacológico e a possibilidade, no âmbito da investigação em curso, de

eventual modificação das estruturas no sentido de aumentar a actividade anti-oxidante

pretendida, constitui uma mais valia no sentido de conseguir os objectivos propostos e

que a seguir se descrevem.

Como principal objectivo deste trabalho, pretende-se avaliar a real eficácia dos

novos compostos, no que diz respeito à sua capacidade anti-oxidante. Numa fase inicial,

serão efectuados estudos de avaliação da sua citotoxicidade, assim como da sua

lipofilicidade. Posteriormente, proceder-se-á à avaliação da capacidade destes

compostos para exercer protecção quer a nível da oxidação primária (através da

determinação da sua actividade anti-radicalar), quer a nível da oxidação secundária

(através da avaliação da capacidade dos compostos para reverter danos causados em

células expostas a agentes oxidantes, tais como o par ascorbato-ferro).

A produção de ROS desencadeia processos de morte celular programada. Sendo

assim, outro objectivo do trabalho é o de elucidar outras vias bioquímicas em que os

compostos possam ser activos, nomeadamente na reversão de fenómenos de apoptose,

em células expostas a um estímulo apoptótico tradicional, como a staurosporina.

Com a ciclização das estruturas dos novos compostos espera-se obter uma maior

actividade anti-oxidante. Por esse motivo, pretende-se igualmente, numa fase posterior

deste trabalho, comparar a actividade exercida por essas estruturas cíclicas com a

exercida pelos compostos de cadeia linear.

Mestrado em Genética Molecular Introdução

ix

�� Agradecimentos ...................................................................................................... i

Lista de abreviaturas ............................................................................................. iii

Sumário .................................................................................................................. iv

Abstract .................................................................................................................. vi

Enquadramento e objectivos ................................................................................. viii

Índice ...................................................................................................................... ix

1. Introdução geral ................................................................................................ 1

1.1 Biologia da cultura de células animais ................................................................ 1

1.1.1 Linhas celulares ....................................................................................... 1

1.1.2 As condições de cultura ........................................................................... 3

1.2 Stresse Oxidativo ................................................................................................. 5

1.2.1 Formação de espécies reactivas de oxigénio ........................................... 6

1.2.2 Funções fisiológicas das espécies reactivas de oxigénio ......................... 9

1.2.3 As defesas antioxidantes ......................................................................... 12

1.3 Morte celular ........................................................................................................ 15

1.3.1 As principais vias apoptóticas ................................................................. 17

1.4 O estudo de novas moléculas com potencial farmacológico ............................. 20

1.4.1 Avaliação da citotoxicidade ..................................................................... 20

1.4.2 Relação concentração-resposta ................................................................ 21

1.4.3 Coeficientes de partilha ........................................................................... 21

1.4.4 Os novos compostos em estudo .............................................................. 22

1.5 Objectivos do trabalho ................................................................................. 23

2. Material e métodos ............................................................................................................. 24

2.1 Material biológico ............................................................................................... 24

2.1.1 Fibroblastos (linha celular L929) ............................................................ 24

2.1.2 Linha celular PC12 .................................................................................. 25

2.2 Compostos estudados ........................................................................................... 26

2.3 Método de descoloração do DPPH ...................................................................... 26

2.4 Determinação da viabilidade celular .................................................................... 28

2.4.1 Método de redução do MTT ..................................................................... 28

2.4.2 Libertação da lactato desidrogenase ......................................................... 30

2.5 Avaliação da hidrofobicidade dos compostos ...................................................... 31


x

2.6 Determinação da protecção dos compostos na peroxidação lipídica ................... 32

2.6.1 Quantificação da proteína: método de Sedmak ........................................ 34

2.7 Determinação da actividade das caspases ............................................................ 35

2.8 Determinação da morte celular: marcação com Hoechst 33342 e PI ................... 36

2.9 Análise estatística ................................................................................................. 37

2.10 Reagentes químicos .............................................................................................. 38

3. Resultados e Discussão ..................................................................................... 39

3.1 Determinação do CI50 para os compostos de cadeia linear .................................. 39

3.2 Avaliação da citotoxicidade dos compostos ......................................................... 40

3.3 Avaliação do grau de hidrofobicidade dos compostos ......................................... 42

3.4 Protecção dos compostos na peroxidação lipídica ............................................... 44

3.5 Activação da caspase-3 induzida por staurosporina e Apoptose .......................... 49

3.5.1 Efeito protector dos compostos nas vias apoptóticas ............................... 53

3.6 Compostos cíclicos ............................................................................................... 59

3.7 Perspectivas futuras .............................................................................................. 63

4. Conclusões ........................................................................................................ 65

5. Referências bibliográficas ................................................................................ 67


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As culturas de tecidos foram iniciadas no início do século XX, como um método

para estudar o comportamento das células animais sem a interferência de variações

sistémicas que possam surgir no animal, tanto durante a homeostasia normal como sob

o stresse de uma experiência. Tal como o nome indica, a técnica foi elaborada

inicialmente com fragmentos desagregados de tecidos, encontrando-se o crescimento

restrito à migração das células a partir desses fragmentos, com mitoses ocasionais

durante o posterior desenvolvimento. Actualmente, o termo “cultura de tecidos” pode

ser utilizado genericamente para incluir as culturas de órgãos e de células.

As culturas de tecidos apresentam algumas desvantagens, como a necessidade de as

culturas serem mantidas em condições de assepsia (uma vez que as células animais

crescem mais lentamente do que os contaminantes comuns), e os custos elevados em

material necessário para cultivar e manter as células. No entanto, essas desvantagens são

superadas pela possibilidade de controlar o ambiente físico-químico (pH, temperatura,

pressão osmótica e a tensão de O2 e CO2) e as condições fisiológicas, que podem ser

mantidas relativamente constantes, embora nem sempre possam ser definidas (Freshney,

1994).

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As culturas de células têm sido utilizadas desde há várias décadas com bons

resultados. Inicialmente, as culturas celulares poderiam ser definidas, de um modo

rudimentar, como um método para realizar experiências em populações celulares sem o

embaraço causado pelos organismos inteiros. Este sistema experimental ex vivo torna-se

relevante quando se pretende trabalhar com animais de grandes dimensões, impossíveis

de serem sujeitos a qualquer tipo de manipulação experimental. No entanto, existe

alguma dificuldade em adquirir células para estes estudos ex vivo, que pode ser

ultrapassada através da “imortalização” e multiplicação das células em estudo, o que

pode marcar a passagem de ex vivo para in vitro. O termo “linha celular” tem sido assim

utilizado para descrever as células que proliferam continuamente por indução química


2

e/ou outra. O aparecimento da criopreservação foi outro dos grandes avanços

verificados na tecnologia das culturas celulares, que veio permitir a recuperação das

células armazenadas (Drexler et al., 2000).

A primeira subcultura representa uma transição importante na obtenção deste tipo

de culturas. A necessidade de subcultivar implica que a cultura primária atingiu um

crescimento que levou à ocupação de toda a superfície de adesão disponível. Com cada

subcultura sucessiva, a parte da população com capacidade para proliferar mais depressa

irá predominar gradualmente, enquanto que as células com menor capacidade

proliferativa irão desaparecendo (Freshney, 1994).

Quando uma cultura já se duplicou mais de 150-200 vezes (número de Hayflick),

ou quando cresceu ininterruptamente durante mais de um ano, esta pode ser então

considerada como imortal. Este carácter de imortalização pode ser conseguido por

agentes químicos, irradiação, entre outros factores. Por vezes, podem também ocorrer

alterações nas características do crescimento das células (como independência da

adesão, perda da inibição de crescimento devida ao contacto, e limitação da densidade

de crescimento) que levam frequentemente, mas não necessariamente, ao crescimento

ilimitado. Este processo de transformação pode resultar de um fenómeno de

instabilidade genética que as transforma em células em tudo semelhantes às células

neoplásicas (células geneticamente modificadas) (Drexler et al., 2000; Freshney, 1994).

No entanto, a manutenção do fenótipo inicial é hoje em dia perfeitamente assegurada

pelos dois bancos mundiais, onde as linhas celulares podem ser adquiridas (ATCC, de

“American Type Culture Collection” e ECACC, de “European Collection of Animal

Cell Cultures”).

Os fibroblastos são as células dermais mais utilizadas para o estabelecimento de

linhas celulares “imortalizadas”, nomeadamente em estudos de citotoxicidade de

diversos compostos. O termo “fibroblastos” cobre uma população celular muito

heterogénea, diferindo na sua morfologia, nas macromoléculas que sintetizam, na

capacidade de proliferação, entre outras (Roguet e Schaefer, 1997).

De um modo geral, os fibroblastos são os principais constituintes do tecido

conjuntivo, sendo os mais relevantes produtores de colagénio neste tecido. Além disso,

possuem uma morfologia fusiforme, o seu crescimento é limitado pela densidade, têm

um tempo de vida limitado a cerca de 50 gerações e são diplóides. Contudo, quando a


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cultura se prolonga por um longo período de tempo, estas células têm tendência para se

tornarem aneuplóides, originando assim culturas contínuas.

Devido à sua capacidade de diferenciação em múltiplos tipos celulares, estas

células têm sido consideradas bons modelos para diversas abordagens, incluindo como

modelos neuronais, por terem a mesma origem na ectoderme embrionária (Freshney,

1994).

No entanto, para estudos envolvendo fenómenos de apoptose, as linhas celulares de

fibroblastos mostraram-se resistentes, pelo que foram substituídas por uma linha celular

neuronal, PC12. As células da linha celular PC12 derivam de um feocromocitoma

(tumor da glândula adrenal) de rato e expressam uma grande variedade de receptores e

canais iónicos, assim como continuam a libertar dopamina, norepinefrina e

catecolaminas (Westerink et al., 2002). Além disso, possuem as características

dopaminérgicas intactas, razão pela qual são bastante utilizadas em estudos de

neurobiologia e neuroquímica, ou como modelos neuronais para doenças

neurodegenerativas (Kim et al., 2003; Oliveira et al., 2002).

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A influência do ambiente de cultura é expressa sob quatro formas: a natureza da

superfície de adesão; a constituição da fase gasosa; a constituição (físico-química e

fisiológica) do meio; e a temperatura de incubação.

Na maioria das células é necessária a adesão das mesmas a uma superfície para

ocorrer a divisão celular, de tal modo que quanto mais firme for essa adesão, maior será

a proliferação celular (Paine e Ward, 1999). Quando essa adesão é fraca, ou quando as

células crescem sobrepondo-se umas às outras, a proliferação celular é inibida

(Freshney, 1994).

No caso das células em cultura, apesar de inicialmente o vidro ser o material mais

utilizado como superfície de adesão, hoje em dia o poliestireno, após sofrer um

tratamento que torna a sua superfície carregada negativamente, constitui uma superfície

de adesão mais comum para favorecer a adesão das células em cultura (Freshney, 1994).

Nos últimos anos, vários estudos demonstraram que a adesão de algumas culturas

celulares, como por exemplo as células da linha celular PC12, pode ser melhorada

através do tratamento da superfície de adesão com polímeros carregados positivamente,


4

tais como a poli-D-lisina ou a poli-L-lisina. Por ser uma molécula sintética, a poli-lisina

não estimula qualquer actividade biológica nas células a si aderidas. Além disso não

introduz impurezas muitas vezes presentes nos polímeros naturais. A poli-D-lisina é

geralmente preferida em relação à poli-L-lisina para certos tipos celulares, uma vez que

não é quebrada pelas proteases libertadas pelas células em cultura (McKeehan, 1984).

No que respeita à fase gasosa, os constituintes mais significativos são o oxigénio e

o dióxido de carbono.

As culturas variam na quantidade de oxigénio necessária, sendo uma menor

quantidade preferível para as culturas celulares em relação às culturas de órgãos (que

podem chegar a necessitar de cerca de 95% de oxigénio na fase gasosa).

A tensão atmosférica de CO2 regula directamente a concentração de CO2

dissolvido, em função da temperatura, originando H2CO3, que por sua vez se dissocia,

formando HCO3-. No entanto, o HCO3

- possui uma constante de dissociação baixa e

tende a reassociar-se, provocando a acidificação do meio. Esta diminuição do pH é

neutralizada pelo aumento da concentração de bicarbonato no meio, atingindo-se um

equilíbrio a um pH 7.4. Este valor, ao qual cresce a maioria das linhas celulares pode ser

controlado através do uso de um indicador, sendo o mais comum o vermelho de fenol.

O vermelho de fenol apresenta uma cor vermelha a pH 7.4 e torna-se laranja para um

pH ácido, ou violeta para um pH alcalino (Freshney, 1994).

De um modo geral, os meios definidos contêm diferentes aminoácidos (incluindo

aminoácidos não essenciais e vitaminas), e são frequentemente suplementados com

metabolitos extra (e.g. nucleosídeos, intermediários do ciclo de Krebs e lípidos) e

minerais. Na maior parte dos meios inclui-se ainda glucose como fonte de energia.

Outro constituinte do meio de cultura é o soro, que constitui um suplemento

adicional de vários factores de crescimento e que pode ter diferentes origens, de acordo

com os requisitos específicos de cada tipo celular em cultura. O soro fetal bovino, ou o

soro bovino simplesmente, são os mais frequentemente utilizados, seguidos do soro de

cavalo, geralmente usado para linhas celulares mais exigentes, como é o caso das

células PC12. O soro humano é o adequado para culturas de células humanas

Os tampões de CO2/bicarbonato são base da tamponização contínua do meio de

cultura. Se a actividade metabólica das células em cultura for muito grande, como é

normalmente o caso das linhas celulares imortalizadas há necessidade de tamponização


5

adicional. Neste caso, um dos tampões mais utilizados é o HEPES, que possui uma forte

capacidade de tamponização para uma gama de pH entre 7.2 e 7.6 (Freshney, 1994).

A temperatura de incubação, além de influenciar directamente o crescimento

celular, influencia também o pH do meio, devido ao aumento da solubilidade do CO2 a

baixas temperaturas e, possivelmente, devido a alterações na ionização e no pKa do

tampão. De um modo geral, as células são cultivadas a 37ºC, correspondendo este valor

aproximadamente à temperatura corporal do animal do qual as células foram retiradas.

As células em cultura podem tolerar decréscimos consideráveis de temperatura,

sobrevivendo a 4ºC e podendo ser congeladas a -196ºC. No entanto, não conseguem

resistir a temperaturas mais do que 2ºC acima do normal, morrendo rapidamente a uma

temperatura de 40ºC (Freshney, 1994).

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Com a acumulação de oxigénio na atmosfera terrestre há cerca de 2 biliões de anos

atrás, os organismos anaeróbios existentes tiveram que se adaptar ao novo ambiente que

os envolvia. Ao passo que alguns organismos optaram por viver num micro-ambiente

livre de oxigénio, outros tornaram-se capazes de realizar tanto a respiração como a

fermentação (anaeróbios facultativos). Mais tarde, surgiram novas espécies, que

utilizavam somente a respiração como forma de obter energia: organismos aeróbios

(Behl, 1999). Todos estes organismos aeróbios produzem e degradam espécies reactivas

de oxigénio, originando tanto concentrações fisiológicas (resultantes da realização de

funções celulares normais), como quantidades excessivas que, ao superarem as defesas

anti-oxidantes naturais dão origem a um estado denominado de stresse oxidativo

(Nordberg e Arner, 2001). Resumidamente, o stresse oxidativo pode resultar de dois

factores: da diminuição dos anti-oxidantes, devida a mutações afectando enzimas anti-

oxidantes ou a depleção de anti-oxidantes e outros constituintes essenciais na dieta

humana; ou da produção elevada de espécies reactivas de oxigénio e de azoto, por

exemplo através da exposição a níveis elevados de O2, da presença de toxinas que são

metabolizadas para produzir ROS/RNS, entre outros (Halliwell e Gutteridge, 1999).

Devido aos seus potenciais efeitos indesejáveis, as espécies reactivas de oxigénio e

todos os eventos associados ao stresse oxidativo têm sido relacionados com uma grande


6

variedade de patologias neuronais e não neuronais, incluindo aterosclerose, isquémia

cerebral, esclerose lateral amiotrófica, doença de Parkinson e doença de Alzheimer

(Cardoso et al., 1998; Schroeter et al., 2000).

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Entre as espécies reactivas de oxigénio incluem-se diferentes moléculas. Os radicais

livres intracelulares (moléculas livres de baixo peso molecular, com um electrão

desemparelhado) são considerados como espécies reactivas de oxigénio, e vice-versa,

sendo os dois termos usados muitas vezes como equivalentes (Nordberg e Arner, 2001).��Estudos realizados anteriormente demonstraram que a mitocôndria é a principal

fonte de radicais livres intracelulares (Sharma e Morgan, 2001). Esse facto deve-se à

presença de uma cadeia de transporte de electrões, onde cerca de 95% do oxigénio é

reduzido pela citocromo oxidase, levando o restante à formação de radicais livres. Uma

diminuição da actividade da citocromo oxidase pode assim levar a uma maior libertação

de radicais livres a partir da cadeia respiratória mitocondrial (Curti et al., 1997).

Além da fosforilação oxidativa que ocorre na mitocôndria, existem outros

mecanismos moleculares que podem levar à formação de espécies reactivas de oxigénio,

tais como a conversão enzimática de catecolaminas e indolaminas pela monoamina

oxidase ou a auto-oxidação não enzimática de catecolaminas (Behl, 1999). Podem

também ocorrer alterações no metabolismo da glucose, na oxidação da glutamina e na

homeostasia do cálcio. A activação pelo cálcio da fosfolipase A2 liberta ácido

araquidónico, cuja conversão enzimática a tromboxanos, prostaglandinas e leucotrienos

pelas ciclooxigenases e lipooxigenases leva à formação de espécies reactivas de

oxigénio (Curti et al., 1997; Markesbery, 1997).

O centro activo das lipooxigenases contém iões ferro (Percival, 1991). Na sua forma

inactiva, os iões encontram-se presentes como Fe2+, transformando-se em Fe3+ quando a

enzima é activada. Os iões Fe3+ reagem com os lípidos da membrana, levando à sua

oxidação. Contudo, quando a quantidade de produtos das lipooxigenases aumenta, ou

quando se verifica uma diminuição de oxigénio, as lipooxigenases são desactivadas,

levando assim à libertação dos iões ferro, tendo como consequência também a iniciação

da peroxidação lipídica (Spiteller, 2001).


7

O anião superóxido (O2• -) é uma das mais deletérias espécies reactivas de oxigénio.

A formação do anião superóxido ocorre na membrana mitocondrial interna pela adição

de um electrão ao oxigénio molecular induzida pela NADPH oxidase. Pode também ser

produzido endogenamente por flavoenzimas (e.g. xantina oxidase), por lipooxigenases e

ciclooxigenases. Apesar de ser um radical livre, não é muito reactivo, embora possa ser

transformado facilmente pela acção de uma dismutase em espécies muito mais

reactivas, como o peróxido de hidrogénio e o oxigénio molecular. Além disso, este

radical não é capaz de atravessar as membranas lipídicas, limitando-se a sua acção ao

local onde é produzido (Nordberg e Arner, 2001; Spiteller, 2001).

O peróxido de hidrogénio (H2O2), embora não seja considerado um radical livre, é

considerado como sendo uma espécie reactiva de oxigénio, uma vez que pode funcionar

como um intermediário na produção de espécies mais reactivas, como o ácido

hipoclórico (formado pela acção das mieloperoxidases) e o radical hidroxilo. A

produção deste último dá-se na presença de ferro, através da reacção de Fenton (reacção

1) (Nordberg e Arner, 2001; Behl, 1999).

Embora o peróxido de hidrogénio possua uma reactividade limitada, tem a

capacidade de atravessar as membranas biológicas, o que lhe confere uma maior

perigosidade (Multhaup et al., 1997).

Devido à sua reactividade com as biomoléculas, o radical hidroxilo (•OH) é

possivelmente o radical que mais danos causa nos sistemas biológicos. Este radical

forma-se a partir do peróxido de hidrogénio numa reacção catalizada por iões metálicos

(Fe2+ ou Cu+), frequentemente complexados com diferentes proteínas e outras

moléculas. Esta reacção é denominada de reacção de Fenton:

H2O2 + Cu+/ Fe2+ •OH + OH- + Cu2+/Fe3+ (reacção 1)

O superóxido desempenha igualmente um papel importante, em associação com a

reacção 1, levando à reciclagem dos iões metálicos (reacção 2):

Cu2+/Fe3+ + O2• - Cu+/ Fe2+ + O2 (reacção 2)


8

Os metais de transição desempenham assim um papel importante na formação de

radicais hidroxilo. Estes metais podem ser libertados a partir de proteínas, como as

ferritinas e pelos centros [4Fe-4S] de algumas enzimas, através de reacções com o anião

superóxido (Levi et al., 1996; Nordberg e Arner, 2001). A este mecanismo, específico

das células vivas, denomina-se reacção de Haber-Weiss (reacção 3) e corresponde à

soma das reacções 1 e 2 (Nordberg e Arner, 2001).

O2• - + H2O2 Fe/Cu •OH + OH- + O2 (reacção 3)

O ferro e o cobre são iões metálicos essenciais no corpo humano para a síntese de

diversas enzimas e outras proteínas envolvidas na respiração, transporte de O2,

formação de NO• e outras reacções redox. Contudo, estes metais são potencialmente

perigosos devido à sua capacidade para participarem em transferências de electrões, o

que os torna bons catalisadores em reacções de auto-oxidação, conversão de H2O2 em •OH e decomposição de peróxidos lipídicos em radicais peroxilo e alcoxilo (altamente

reactivos). Sendo assim, os organismos necessitam de manter estes iões metálicos em

níveis baixos, diminuindo desse modo a probabilidade de causarem danos celulares

através de reacções com radicais livres (Halliwell e Gutteridge, 1999).

O óxido nítrico (NO•) forma-se na mitocôndria e assemelha-se ao anião superóxido,

na medida em que não reage de uma forma eficaz com a maioria das biomoléculas,

apesar de possuir um electrão desemparelhado. Por outro lado, reage facilmente com

outros radicais livres (e.g. radicais alquilo e peroxilo), originando moléculas menos

reactivas, o que leva assim à remoção de radicais livres.

O óxido nítrico pode reagir com o anião superóxido, levando à formação de

peroxinitrito, um composto altamente citotóxico, que pode, por sua vez, levar à

oxidação de lípidos e proteínas. Além disso, pode ser decomposto para originar catiões

NO2+ ou radicais NO2

•, sendo que ambos são capazes de formar nitrotirosina a partir de

tirosina.

Este radical é sintetizado enzimaticamente pela acção da NO sintetase, a partir da

L-arginina. Em concentrações fisiológicas, o óxido nítrico funciona apenas como um

mensageiro intracelular, estimulando a ciclase do guanilato e algumas cinases, levando

por exemplo ao relaxamento do músculo liso dos vasos sanguíneos (Nordberg e Arner,


9

2001; Spiteller, 2001; Beal, 2002). Além disso, foi também já confirmado o seu efeito

anti-oxidante (Kelley et al., 1999).

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Todas as células produzem quantidades fisiológicas de espécies reactivas de

oxigénio, necessárias para levar a cabo diversas funções.

Uma das funções das espécies reactivas de oxigénio é participar na defesa contra a

infecção. Quando os fagócitos são activados, eles produzem estas espécies em

quantidades suficientes para destruir os microrganismos intrusos.

Além disso, as espécies reactivas de oxigénio podem afectar directamente a

conformação e as actividades de todas as moléculas contendo grupos sulfidrilo, através

da oxidação do grupo tiol. Este tipo de regulação redox afecta muitas proteínas

importantes na transdução de sinal e na carcinogénese, tais como a proteína cinase C, a

Ca2+-ATPase, a colagenase, a tirosina cinase, entre outras enzimas e receptores

membranares. Para muitos factores de transcrição, as espécies reactivas de oxigénio

funcionam como mediadores fisiológicos do controlo da transcrição, uma vez que esses

factores também são sensíveis a uma regulação redox (Nordberg e Arner, 2001; Dalton

et al., 1999).

Apesar disso, as espécies reactivas de oxigénio podem, devido à sua elevada

reactividade, causar danos em diversas macromoléculas, sendo por isso consideradas

como potencialmente tóxicas, mutagénicas e carcinogénicas (Nordberg e Arner, 2001).

Esses danos podem ser também induzidos pelo ferro, embora ainda não se conheça

pormenorizadamente os mecanismos pelos quais este ião, em conjunto com o oxigénio,

amplifica os danos em alvos celulares oxidáveis, tais como: a) ácidos nucleicos; b)

proteínas; c) lípidos (Eaton e Qian, 2002), conforme a seguir se sumaria.

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Tanto o DNA como o RNA são susceptíveis a modificações por oxidação, dando

origem a produtos hidroxilados das suas bases. O RNA citoplasmático e o DNA

mitocondrial são dois dos alvos mais sensíveis (Miranda et al., 2000).


10

Diversas alterações (e.g. clivagem do DNA, ligações DNA-proteínas, oxidação das

purinas, etc.) podem ser causadas por espécies reactivas de oxigénio, em especial pelo

radical hidroxilo. Se o DNA danificado não for imediatamente reparado, pode ocorrer

uma mutação devido ao emparelhamento errado das bases durante a replicação. Este

mecanismo pode ser, em parte, responsável pela elevada incidência de cancro em

indivíduos sujeitos a stresse oxidativo (Nordberg e Arner, 2001).

As mitocôndrias não são apenas uma fonte de radicais livres, mas são também o

alvo imediato dos danos mediados por esses radicais. O DNA mitocondrial é o primeiro

alvo de ataques oxidativos, devido à sua proximidade com a fonte de produção de

radicais livres e devido a não possuir mecanismos de reparação do DNA (Sharma e

Morgan, 2001). Por sua vez, estudos recentes demonstraram ainda que os danos

causados no DNA mitocondrial são amplificados pela presença de ferro no interior da

célula, podendo este efeito ser evitado pela adição de agentes complexantes do ferro

(Eaton e Qian, 2002).

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A oxidação de proteínas aumenta dramaticamente no último terço de vida, de tal

modo que, em média, uma em cada três proteínas é afectada (Beal, 2002).

Os danos oxidativos causados em proteínas resultam na fragmentação das cadeias

polipeptídicas, formação de ligações proteína-proteína e modificações dos aminoácidos

das cadeias laterais em derivados de hidroxilos ou carbonilos (Fagan et al., 1999). Entre

estes aminoácidos encontram-se a prolina, a arginina, a histidina e a treonina (Dalle-

Donne et al., 2003).

Os grupos carbonilo podem formar-se igualmente através de reacções dos resíduos

de cisteína, histidina e lisina tanto com aldeídos produzidos durante a peroxidação

lipídica (4-hidroxi-2-nonenal, malonildialdeído) como com os derivados reactivos dos

carbonilos (cetoaminas, cetoaldeídos, desoxiosonas) formados como uma consequência

da reacção dos açúcares redutores, ou os seus produtos de oxidação, com os resíduos de

lisina das proteínas (Dalle-Donne et al., 2003; Berlett e Stadtman, 1997).

Como consequências destas reacções de oxidação, podem ocorrer alterações

funcionais nas proteínas (através da modificação directa de aminoácidos catalíticos,


11

resíduos críticos em locais de ligação ou de regulação; e através da alteração da

susceptibilidade proteolítica, estados de agregação, etc.) (Choi et al., 2003).

Hoje em dia, a quantificação de grupos carbonilo nas proteínas é um dos

indicadores da oxidação proteica mais utilizados e a sua acumulação nas proteínas foi já

relacionada com o envelhecimento, o stresse oxidativo e algumas doenças, tais como a

doença de Alzheimer e a diabetes (Dalle-Donne et al., 2003; Berlett e Stadtman, 1997).

A acumulação de proteínas oxidadas não reflecte apenas a taxa de oxidação

proteica, mas também a velocidade com que ocorre a degradação dessas proteínas

oxidadas, que por sua vez depende de diversas variáveis, incluindo a concentração de

proteases que degradam preferencialmente proteínas oxidadas e inúmeros factores (iões

metálicos, inibidores, activadores e proteínas regulatórias) que afectam a sua actividade

proteolítica (Berlett e Stadtman, 1997).

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A peroxidação lipídica é provavelmente a área de investigação mais explorada

quando se fala de espécies reactivas de oxigénio. Isto deve-se ao facto de os ácidos

gordos poli-insaturados serem alvos excelentes para ataque por parte dos radicais livres,

devido a possuírem múltiplas ligações duplas (Nordberg e Arner, 2001).

Podem distinguir-se três passos na peroxidação lipídica: iniciação, propagação e

terminação. A peroxidação pode ser induzida por radicais suficientemente reactivos

para remover um átomo de hidrogénio aos ácidos gordos poli-insaturados. Este é o

ponto de partida para um ciclo de propagação que leva ao aumento da produção de

radicais livres e ao aumento de hidroperóxidos lipídicos formados pela oxidação de

inúmeras moléculas lipídicas. Este ciclo de propagação é quebrado quando dois radicais

se juntam, formando não-radicais. Estas últimas reacções designam-se de reacções de

terminação (Lehuédé et al., 1999).

Os principais ácidos gordos poli-insaturados presentes nas membranas celulares dos

mamíferos são os ácidos araquidónico e linoleico. Ambos são vulneráveis à peroxidação

lipídica, tanto enzimática como não enzimática. No entanto, uma vez que o ácido

linoleico é muito mais abundante do que o ácido araquidónico, a maioria dos produtos

da peroxidação lipídica derivam do ácido linoleico (Spiteller, 2001).


12

Os diversos produtos originados pela peroxidação lipídica permitem a sua

quantificação (Meagher e Fitzgerald, 2000). Os produtos obtidos pela redução dos

hidroperóxidos do ácido linoleico (ácidos 9-hidroxi-10,12-octadecadienóico e 13-

hidroxi-9,11-octadecadienóico), por exemplo, são susceptíveis de ser detectados em

grandes quantidades (Spiteller e Spiteller, 1997). Os aldeídos são os produtos

produzidos em maior quantidade, especialmente o 4-hidroxinonenal (4-HNE), que

deriva do ácido araquidónico e é altamente reactivo, sendo responsável pela maioria dos

efeitos citotóxicos verificados em situação de stresse oxidativo (Markesbery, 1997;

Pereira et al., 1999). No entanto, a medição do malonildialdeído é o método mais

utilizado para quantificar a peroxidação lipídica.

A acroleína, um produto da oxidação dos ácidos gordos poli-insaturados, leva à

inactivação da redutase responsável pela redução dos radicais da vitamina E e, em

conjunto com a depleção de glutationa, leva ao aumento da peroxidação lipídica. Sendo

assim, pode ser igualmente utilizada como marcador da peroxidação lipídica (Lovell et

al., 2000).

A peroxidação lipídica pode ser ainda quantificada recorrendo à medição de dienos

conjugados, gases de etano e pentano, isoprostanos, ou até recorrendo à inserção do

ácido cis-parinárico (ácido gordo fluorescente) em vesículas e posterior integração na

estrutura da membrana (Meagher e Fitzgerald, 2000; Steenbergen et al., 1997).

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Com a hipótese da associação do stresse oxidativo a diversas doenças

desenvolveram-se inúmeras abordagens para uma protecção anti-oxidante eficaz (Behl,

1999). Apesar de bastante utilizado, existe alguma dificuldade em definir o termo “anti-

oxidante”. De um modo geral, o termo anti-oxidante pode ser utilizado para descrever

qualquer composto que seja capaz de complexar espécies reactivas de oxigénio, sem no

entanto se converter num radical destrutivo (Noctor e Foyer, 1998). Quando as espécies

reactivas de oxigénio ou de azoto se formam in vivo, muitos anti-oxidantes entram em

acção. A sua importância relativa depende de diferentes factores, tais como o tipo de

ROS/RNS que é formado, o modo como é formado, onde se forma e a que nível

provoca danos. Os sistemas anti-oxidantes das próprias células podem ser divididos em

dois tipos: enzimáticos e não enzimáticos (Nordberg e Arner, 2001).


13

No que diz respeito aos sistemas anti-oxidantes enzimáticos, a superóxido

dismutase (SOD) foi a primeira enzima a ser descoberta que era capaz de metabolizar as

espécies reactivas de oxigénio. Esta enzima metaboliza o anião superóxido em peróxido

de hidrogénio e oxigénio (Nordberg e Arner, 2001).

O peróxido de hidrogénio, por sua vez, é convertido pela catalase (que se encontra

presente nos peroxissomas) em água e oxigénio molecular. No entanto, a sua afinidade

pelo peróxido de hidrogénio é relativamente baixa e consequentemente algum H2O2

pode permanecer na célula. Isto pode tornar-se problemático, uma vez que o H2O2 pode

reagir com o anião superóxido formado no metabolismo oxidativo e originar o radical

hidroxilo que é altamente reactivo (Arrigoni e De Tullio, 2002).

A glutationa peroxidase (GPx) apresenta uma elevada afinidade para o peróxido de

hidrogénio, sendo capaz de remover quantidades muito pequenas desta molécula. Esta

enzima cataliza a redução do peróxido de hidrogénio utilizando a glutationa como

substrato.

Além destes sistemas enzimáticos, existem ainda outros que participam na remoção

do excesso de espécies reactivas de oxigénio, tais como as superóxido redutases, as

peroxirredoxinas e o sistema associado à tiorredoxina (composto por duas

oxidorredutases anti-oxidantes) (Nordberg e Arner, 2001).

Conjuntamente com os mecanismos enzimáticos, existem alguns compostos anti-

oxidantes celulares que, ao participarem em reacções redox, contribuem com um

electrão para neutralizar os radicais livres. Estes são designados de anti-oxidantes

directos, uma vez que interagem quimicamente com os radicais livres formados. No

entanto, um anti-oxidante biológico eficaz deve fazer mais do que simplesmente reagir

com os radicais livres: deve estar presente em concentrações adequadas na célula, deve

poder reagir com uma grande variedade de radicais livres e a sua regeneração deve ser

possível. Esta combinação é típica do ácido ascórbico e do �-tocoferol, que são por isso

considerados bons anti-oxidantes (Arrigoni e De Tullio, 2002; Behl e Moosmann,

2002).

O ácido ascórbico (também conhecido como vitamina C) é um anti-oxidante

hidrossolúvel que participa em diversas reacções do metabolismo celular. Devido a

possuir um grande potencial de redução é capaz de reagir com as diferentes espécies

reactivas de oxigénio. Destas reacções forma-se o radical ascorbilo, que pode ser

posteriormente oxidado a desidroascorbato (Shapiro e Saliou, 2001; Chepda et al.,


14

2001). Em estudos recentes, demonstrou-se que o ascorbato podia induzir a apoptose

das células. Esse efeito deve-se à acção do principal produto da sua oxidação, o radical

ascorbilo, que actua maioritariamente como um oxidante. Desse modo, o ascorbato pode

actuar tanto como um anti-oxidante como um pró-oxidante (via radical ascorbilo)

(Lopez-Lluch et al., 1998; Sakagami et al., 1997).

A vitamina E engloba oito formas de anti-oxidantes lipossolúveis, de ocorrência

natural, presentes no plasma, em membranas e nos tecidos. Dessas formas, o �-tocoferol

é a forma mais abundante. Pode actuar como anti-oxidante, na medida em que é capaz

de complexar rapidamente os radicais lípido-peroxilo, antes que estes reajam com

outros lípidos e impedindo assim a propagação da peroxidação lipídica nas membranas

(Shapiro e Saliou, 2001). No entanto, através do seu mecanismo de auto-reciclagem, o

�-tocoferol pode provocar uma diminuição de outros anti-oxidantes, actuando assim

como um pró-oxidante (Fuchs, 1998).

Além destes anti-oxidantes directos, existem ainda outros dois tipos: anti-oxidantes

indirectos, que actuam impedindo a formação de radicais livres, e dos quais são

exemplo os antagonistas de cálcio, os quelantes iónicos ou os inibidores da sintetase do

óxido nítrico); e os anti-oxidantes metabólicos, que limitam os danos causados às

células através da redução dos níveis elevados de radicais livres resultantes do

metabolismo secundário (Behl e Moosmann, 2002).

A procura de novos anti-oxidantes que possam colmatar as defesas das células

quando sujeitas a situações de stresse oxidativo, impedindo desse modo o desencadear

de reacções conducentes a degenerações várias, continua a ser objecto de investigação.

Os novos anti-oxidantes devem possuir propriedades melhoradas quando

comparados com as vitaminas E e C, tal como uma maior lipofilicidade e uma maior

capacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica no caso de se pretender que

actuem a nível do sistema nervoso central (Behl, 1999). Recentemente, têm-se testado

alguns anti-oxidantes naturais, tais como o estrogénio (Bonnefont et al., 1998), ácidos

fenólicos e polifenóis presentes no vinho tinto (German e Walzem, 2000), flavonóides

presentes em alguns frutos (du Toit et al., 2001; Schroeter et al., 2000) e extractos

naturais de Ginkgo biloba ou de outras plantas medicinais (Bastianetto e Quirion, 2002),

Alguns destes têm sido, devido às suas propriedades, incluídos como conservantes

alimentares. No entanto, e ainda no que diz respeito aos extractos naturais, o facto de

constituírem misturas de composição indefinida dificulta o exacto conhecimento do


15

modo como actuam, logo o seu desenvolvimento como compostos de interesse

farmacológico.

As defesas anti-oxidantes procuram apenas controlar os níveis de espécies reactivas

de oxigénio, em vez de proceder à sua eliminação por completo. Uma possibilidade para

a ocorrência deste fenómeno relaciona-se com os gastos energéticos necessários para

manter um excesso de defesas anti-oxidantes: pode tornar-se energeticamente menos

dispendioso reparar (no caso do DNA) ou destruir (no caso das proteínas e dos lípidos)

biomoléculas danificadas. Outra possibilidade é a das espécies reactivas de oxigénio se

tornarem fisiologicamente úteis, desde que em quantidades controladas, de modo a que

a sua não eliminação tenha sido privilegiada a nível evolutivo pelos sistemas vivos

(Halliwell e Gutteridge, 1999).

Na figura 1 apresenta-se de uma forma esquemática e resumida alguns dos sistemas

responsáveis pela ocorrência de danos nas biomoléculas, assim como alguns dos

sistemas anti-oxidantes presentes a nível celular com a função de evitar esses danos.

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A desregulação das vias fisiológicas para a indução da morte celular encontra-se

relacionada com o aparecimento de diversas patologias, incluindo doenças

Figura 1 – Esquema simplificado dos sistemas oxidantes e anti-oxidantes que actuam

na célula. O superóxido é produzido intracelularmente, tanto no citosol como na

mitocôndria. Duas moléculas de superóxido são rapidamente dismutadas, quer

espontaneamente quer por via de superóxido dismutases, sendo que estas permitem o

posterior fluxo de ROS entre compartimentos celulares. O peróxido de hidrogénio

resultante da dismutação do superóxido pode depois ser enzimaticamente metabolizado

em dioxigénio e água, ou convertido no radical hidroxilo através de reacções

catalizadas por iões metálicos. Segundo (Nordberg e Arner, 2001).


16

neurodegenerativas (tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de

Huntington), doenças cardiovasculares, doenças imunológicas, SIDA e cancro em geral,

e é muitas vezes desencadeada por stresse oxidativo (Reed, 2001).

Os danos celulares podem resultar de um estímulo químico ou físico, quer pelo seu

excesso quer pela sua carência, que temporária ou permanentemente provoca alterações

na homeostasia da célula. A resposta a estes danos pode ser reversível: a célula entra

num estado de latência que pode ou não ser prolongado, e que não leva à morte celular.

As respostas reversíveis podem ser transitórias ou podem reflectir eventos precoces de

resposta a um insulto que eventualmente leva a danos irreversíveis. Por vezes, estas

respostas reversíveis são prolongadas, designando-se de adaptações celulares, que

incluem fenómenos como a indução de defesas anti-oxidantes, proteínas de choque

térmico ou dos citocromos P450 (em resposta a xenobióticos) (Halliwell e Gutteridge,

1999).

A morte celular pode ocorrer por duas vias distintas, apoptose ou necrose, embora

possa ocorrer morte por mecanismos com características de ambas as vias. Tanto a

necrose como a apoptose podem resultar da exposição a stresse oxidativo. A necrose é o

processo resultante de uma disfunção celular aguda em resposta a condições de stresse

ou após exposição das células a agentes tóxicos. É um processo passivo associado a

uma rápida depleção de ATP celular. Morfologicamente, a necrose caracteriza-se pelo

aumento do volume celular e ruptura da membrana plasmática, seguida da consequente

libertação dos conteúdos celulares para o meio intercelular. Esta libertação do conteúdo

celular das células mortas pode provocar danos nas células vizinhas, assim como

resultar no desenvolvimento de uma resposta inflamatória (Chandra et al., 2000).

A apoptose é um processo activo de morte celular programada que desempenha um

papel crucial no desenvolvimento e homeostasia dos organismos multicelulares. Este

processo permite a remoção das células (danificadas ou indesejadas) que de outra forma

poderiam prejudicar o bom funcionamento das células circundantes através do contacto

com os seus conteúdos citoplasmáticos (Leist e Jaattela, 2001). Durante a apoptose

ocorre a diminuição do tamanho celular, condensação da cromatina e formação de

corpos apoptóticos (vesículas de pequenas dimensões que contêm no seu interior

componentes celulares que são posteriormente fagocitados por células adjacentes).

Além disso, verifica-se igualmente a clivagem do DNA em regiões

internucleossómicas, resultando no aparecimento de fragmentos de DNA que formam

um padrão característico (“DNA ladder”) após electroforese em gel de agarose. Na


17

figura 2 pode observar-se um esquema comparativo das alterações morfológicas

ocorrentes durante os fenómenos de necrose e apoptose.

Outro processo característico da apoptose é a activação de caspases (proteases

cisteínicas específicas para o ácido aspártico), que existem como zimogéneos no

citoplasma, espaço intermembranar e matriz nuclear, e que são responsáveis pela

clivagem e activação de diversas proteínas intracelulares. É possível também observar a

externalização de fosfatidilserina, que pode contribuir para o reconhecimento da célula

apoptótica pelas células vizinhas ou por macrófagos, facilitando a sua fagocitose. Estas

células apoptóticas são rapidamente fagocitadas, anteriormente à libertação dos

conteúdos celulares, minimizando a resposta inflamatória e possibilitando assim a

sobrevivência das restantes células (Chandra et al., 2000; Hutchins e Barger, 1998;

Zimmermann et al., 2001).

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Todas as células dos organismos superiores expressam a maquinaria necessária para

o processo apoptótico. Este pode ser dividido em quatro fases distintas: fase de

iniciação, durante a qual a célula recebe sinais que podem resultar na activação da

Figura 2 – Esquema ilustrativo das alterações morfológicas e bioquímicas que

ocorrem durante os fenómenos de apoptose e necrose (segundo Darzynkiewicz et al.,

1997).


18

apoptose; fase de compromisso, em que a apoptose se torna irreversível (pode dever-se

a alterações mitocondriais); fase de amplificação, durante a qual ocorre a activação das

caspases; e fase de execução, onde as estruturas celulares são degradadas, quer por

acção das caspases quer por activação de outras enzimas (Slee et al., 1999).

Existem duas vias pelas quais a apoptose pode ser induzida: a via apoptótica

mitocondrial e a via apoptótica mediada por receptores membranares, designados de

“death receptors” (Ferri e Kroemer, 2001).

A via apoptótica mitocondrial pode ser desencadeada por vários estímulos, como

por exemplo algumas substâncias citotóxicas, radiação, choque térmico e pela privação

de factores de crescimento indispensáveis à sobrevivência da célula (Slee et al., 1999).

Esta via apoptótica pode ser iniciada pela translocação de alguns dos membros pró-

apoptóticos da família da Bcl-2 (como por exemplo a Bax, a Bid ou a Bad) para a

mitocôndria, onde vão levar à libertação de determinadas proteínas presentes no espaço

intermembranar, incluindo uma proteína chave, o citocromo c. Além do citocromo c

podem ser igualmente libertados o Factor Indutor da Apoptose (AIF, do inglês

“Apoptosis Inducing Factor”), a Smac (do inglês “Second mitochondria-derived

activator of caspases), também designada por DIABLO (do inglês “Direct IAP Binding

Protein With Low pI”) e a Omi/HtrA2 (do inglês “High Temperature Requirement

A2”). Após a sua libertação, o citocromo c liga-se ao factor Apaf-1 (do inglês

“Apoptotic Protease Activating Factor-1”), formando o apoptossoma. Ao mesmo

tempo, a Smac/DIABLO promove também a activação das caspases pela ligação ao

apoptossoma e pela inibição dos inibidores das proteínas apoptóticas (IAPs, do inglês

“Inhibitors of Apoptosis Proteins”) (Cain et al., 2002; Cande et al., 2002; Zimmermann

et al., 2001).

No que diz respeito aos receptores apoptóticos membranares, aqueles cuja função

se encontra mais bem estudada são os pertencentes à família do TNF (do inglês “Tumor

Necrosis Factor”), como por exemplo o TNFR1 (do inglês “Tumor Necrosis Factor

Receptor-1”), e o Fas (também conhecido como Apo-1 ou CD95, do inglês “Cell Death

95”) (Leist e Jaattela, 2001). Estes receptores possuem um motivo comum nas suas

porções citoplasmáticas, designado de domínio apoptótico (“death domain”). Após a

activação destes receptores apoptóticos pelos respectivos ligandos, os seus domínios

vão recrutar moléculas adaptadoras, tais como a FADD (do inglês “Fas-associated

Death Domain”). Posteriormente, a interacção entre as moléculas adaptadoras e os pró-

domínios das caspases 2, 8 ou 10 leva à formação do complexo DISC (do inglês


19

“Death-Inducing Signaling Complex”) e à subsequente activação das caspases. Uma vez

activadas, estas podem amplificar o sinal apoptótico através da activação de outras

caspases (como por exemplo as caspases 3, 6 e 7) (Krammer, 2000; Wajant, 2002).

As duas vias apoptóticas (via mitocondrial e via mediada por receptores

membranares) encontram-se interligadas. Essa ligação é efectuada pela proteína pró-

apoptótica Bid (pertencente à família da Bcl-2). Esta proteína, que geralmente se

encontra no citoplasma, pode ser clivada pela caspase-8. Após essa clivagem, a porção

do terminal carboxílico da Bid é translocada para a mitocôndria onde promove, directa

ou indirectamente (através da interacção com a proteína pró-apoptótica Bax), a

libertação de citocromo c (Tang et al., 2000).

Verifica-se assim que todos os processos apoptóticos conduzem à activação de

caspases, as quais amplificam o sinal apoptótico, levando à activação de outras caspases

que são necessárias para a fase de execução celular. Durante esta fase, são degradadas

ou clivadas diversas proteínas celulares por acção das caspases. As duas vias

apoptóticas encontram-se esquematizadas na figura 3.

Figura 3 – As duas principais vias apoptóticas nas células animais: no lado esquerdo, a

via mediada por receptores de membrana; no lado direito, a via mitocondria (adaptado de

Hengartner, 2000).


20

Recentemente, foi demonstrado que o retículo endoplasmático (RE) pode também

participar na iniciação da apoptose. Por um lado, as suas membranas possuem alguns

membros pró e anti-apoptóticos da família da bcl-2, e por outro lado, foi já evidenciado

que o cálcio (presente em concentrações elevadas no RE) pode funcionar como um

segundo mensageiro pró-apoptótico, encontrando-se envolvido na iniciação da apoptose

e na regulação de enzimas responsáveis pela morte celular. Uma dessas enzimas é a

caspase-12, que se encontra especificamente associada a fenómenos de apoptose

resultantes do stresse observado ao nível do RE.

!"2" ��)� �� %��

��

A descoberta, desenvolvimento e introdução clínica de novos fármacos é um

processo que envolve uma cooperação próxima entre investigadores, a indústria

farmacêutica, classe médica e os organismos reguladores da entrada de novos fármacos

no mercado (e.g. “Food and Drug Administration”, nos E.U.A., ou o INFARMED em

Portugal). O processo de desenvolvimento de um novo fármaco inicia-se com a síntese,

ou isolamento, de um novo composto com actividade biológica e com potencial para

uso terapêutico. Posteriormente, este composto tem que ser sujeito a diversos testes,

antes de se tornar disponível no mercado como um fármaco eficaz e terapeuticamente

seguro, nomeadamente estudos bioquímicos in vitro, testes de farmacocinética e

farmacodinâmica, comummente designados por testes pré-clínicos, seguidos finalmente

dos ensaios clínicos em humanos (Brody et al., 1998).

!"2"!" ��

De entre os estudos bioquímicos necessários ao desenvolvimento de novos

fármacos, os testes de citotoxicidade são de importância primordial. Hoje em dia, a

utilização de culturas celulares em placas multipoços é uma prática corrente para a

avaliação de novos compostos com potencialidade farmacológica, uma vez que permite

a manipulação de várias amostras simultaneamente, além de ser um procedimento

económico e que permite uma certa automatização (Freshney, 1994). Recentemente, os

ensaios de citotoxicidade têm sido dominados pelo uso de técnicas colorimétricas, como


21

a da redução do MTT ou a da quantificação da enzima lactato desidrogenase (LDH)

libertada, para determinar o número de células viáveis no final do ensaio, realizado com

linhas celulares adequadas crescidas em placas multipoços.

!"2"'" 3��0��

Existe mais do que um modo de medir a resposta farmacológica produzida por um

composto. De um modo geral, a citotoxicidade de um composto aumenta de acordo com

o aumento da sua concentração até um determinado valor. É a resposta denominada

“gradual”. Uma vez obtidos os valores das respostas para cada concentração de

composto estes são representados num gráfico semi-logarítmico, em função da

concentração de fármaco utilizada. Na maior parte das vezes, obtém-se uma curva

sigmoidal. A partir dessa curva é então possível determinar o valor da concentração de

composto necessária para reduzir a resposta inicial em 50%, denominada CI50 (Brody et

al., 1998).

!"2"/" 4��&��

Outro dos parâmetros que normalmente se procura determinar quando se pretende

desenvolver uma determinada molécula com potencial farmacológico é o coeficiente de

partilha, uma vez que a interacção das nossas moléculas com as membranas biológicas

tem importantes implicações no tipo, magnitude e duração dos efeitos biológicos

induzidos, tornando-se assim importante para compreender melhor a sua acção e

toxicologia (Zeng et al., 1999). Além disso, o conhecimento da lipofilicidade relativa de

um composto permite formular estratégias que facilitem a absorção ou penetração nos

tecidos, que por sua vez levará à libertação do composto no local de acção (Scott e

Cleymer, 2002; Leonard et al., 1989). Ao longo dos últimos anos têm-se realizado

diversas tentativas para correlacionar a eficácia farmacológica de compostos insolúveis

em água com a sua solubilidade em solventes orgânicos, solventes estes que em muitos

casos podem ser considerados como bons mimetizadores das propriedades físico-

químicas do interior da membrana (Leonard et al., 1989). A medição dos coeficientes de

partilha tem sido um método bastante utilizado para obter tanto a lipofilicidade como a

hidrofilicidade relativa de um determinado composto. No entanto, para espécies


22

ionizáveis o coeficiente de distribuição é um parâmetro mais relevante, embora exista

uma maior dificuldade na sua obtenção (Scott e Cleymer, 2002).

!"2"2" )��

Os novos compostos a utilizar neste trabalho são compostos azotados de síntese

orgânica, que diferem na sua estrutura química, nomeadamente na presença de grupos

hidroxilo localizados nas posições C-3 e C-4 do substituinte aromático (figura 4). A sua

estrutura química, especialmente através desses grupos hidroxilo, revela a sua

capacidade de tamponização de radicais livres, sendo assim indicativa do seu potencial

como “scavengers” de oxigénio. A introdução dessa estrutura numa base de dados

criada para o efeito por um grupo de investigadores russos (informação cedida pela

Prof. Fernanda Proença), revelou o seu potencial farmacológico em doenças que

envolvam stresse oxidativo.

OH

H

NCN

CNHN

H N

OCH3

HOOH

H

NCN

CNHN

H N

OCH2

HO

H

NCN

CNHN

H N

OCH2

HOOH

H

NCN

CNHN

H N

OCH3

FMA4 FMA5 FMA7 FMA8

HON

CN

N

H

N N OHNNC C

H

NC NH2

FMA523 FMA676

a)

b)

HON

CN

CN

HC

N OCH2

NHO

N

CN

CN

HC

N OCH3

N

HON

CN

CN

H

N

FMA698 FMA699 FMA705

Figura 4 – Representação das estruturas químicas dos novos compostos em estudo: a) estruturas de

cadeia linear (FMA4, FMA5, FMA7 e FMA8); b) estruturas de cadeia cíclica (FMA523, FMA676,

FMA698, FMA699 e FMA705).


23

!"5" )��&��

O principal objectivo do presente trabalho é o de determinar a actividade

antioxidante destes novos compostos no sentido do seu eventual desenvolvimento como

moléculas de interesse farmacológico.

Um segundo objectivo é o de elucidar outras vias bioquímicas em que os

compostos possam ser activos, nomeadamente na reversão de fenómenos de apoptose.

Finalmente, a possibilidade de modificação da estrutura química dos compostos, em

função dos resultados obtidos, constituirá uma mais valia para o eventual melhoramento

do seu potencial terapêutico.

Mestrado em Genética Molecular Material e Métodos

24

'"'"'"'" 1��1%��1��1%��1��1%��1��1%��

'"!" 1��

No presente trabalho foram utilizadas duas linhas celulares distintas: uma linha

celular de fibroblastos (L929), constituída por células não neuronais, indiferenciadas e

pluripotentes; e uma linha celular neuronal (PC12), bastante utilizada como modelo de

estudo de diferentes processos que podem ser correlacionados com o que ocorre em

determinadas doenças neurodegenerativas.

'"!"!" *��6��&��7'7+��

Os fibroblastos utilizados na realização deste trabalho pertenciam à linha celular

L929, obtida a partir da “European Collection of Animal Cell Cultures” (ECACC). Esta

linha celular é um subclone da linha parental L, uma das primeiras a ser estabelecida em

culturas contínuas, que deriva do tecido subcutâneo normal de ratos adultos (Freshney,

1994).

Esta linha celular foi mantida em meio DMEM (“Dulbecco’s Modified Eagle

Medium”) ao qual se adicionou 10% (v/v) de soro fetal bovino e 1% (v/v) de

antibiótico, numa estufa a 37ºC com atmosfera humidificada e 5% de CO2. As células

em estado de confluência foram tripsinizadas, utilizando-se para tal 0.25%

tripsina/EDTA, e colocadas a crescer nos recipientes adequados, à densidade desejada.

Resumidamente, o processo de tripsinização consistiu na remoção do meio de

cultura e adição de uma solução 0.25% tripsina/EDTA (1ml por cada frasco de cultura

de 25cm2 e 2ml por cada frasco de 75cm2). Após incubação numa estufa, a 37ºC e 5%

CO2, durante cerca de 3 minutos, a tripsina foi removida (para evitar possíveis danos

celulares) e as células colocadas de novo na estufa, durante aproximadamente 5

minutos, nas mesmas condições. As células foram de seguida ressuspensas em meio de

cultura, através de pipetagens sucessivas sobre a camada de células ainda aderidas ao

frasco (operação efectuada com cuidado para evitar a formação de espuma, que pode ter

efeito de detergente e danificar irremediavelmente a cultura), levando à sua total

desagregação. Procedeu-se então à contagem celular num hemocitómetro, com azul


25

tripano, efectuando-se de seguida o plaqueamento das células à densidade desejada ou a

transferência para novos frascos de cultura.

O azul tripano é um corante cuja reactividade se baseia no facto de o cromóforo ser

carregado negativamente e não interagir com as células, a não ser que a membrana se

encontre danificada. Sendo assim, todas as células que incluírem o corante consideram-

se como não viáveis. Para a determinação da densidade celular, este corante foi

misturado com a suspensão celular, numa proporção 1:1, e de seguida relacionou-se o

número de células não coradas com o número de células totais e as diluições efectuadas,

expressando-se os resultados em termos de percentagem de viabilidade celular.

'"!"'" ��&��-4!'��

A linha celular PC12 foi estabelecida pela primeira vez por Greene e Tischler

(Greene e Tischler, 1976) a partir de um feocromocitoma transplantável da glândula

adrenal de rato e consiste numa população homogénea de células capazes de sintetizar,

armazenar e libertar dopamina dum modo semelhante a células neuronais. A

suplementação destas células com NGF (do inglês “Nerve Growth Factor”) pode levar à

indução do fenótipo neuronal, sendo esta resposta reversível.

Esta linha celular (gentilmente cedida pelo Centro de Neurociências e Biologia

Celular de Coimbra) foi cultivada em suspensão em frascos de cultura de 75cm2, em

meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v/v) de soro de cavalo, 5% (v/v) de soro

fetal bovino e 1% (v/v) de antibiótico.

As células foram mantidas numa estufa a 37ºC, com atmosfera humidificada e 5%

de CO2 e, devido à sua elevada tendência para formar aglomerados, passadas duas vezes

por semana. A primeira passagem consistiu apenas numa diluição das células, em que

primeiro se procedeu à desagregação mecânica dos aglomerados formados (altamente

desaconselhados por poderem resultar na morte celular) com uma pipeta serológica de

5ml, seguida da transferência de 10ml da suspensão celular para um novo frasco de

cultura, perfazendo-se de seguida o volume de ambos os frascos até 20ml. A segunda

passagem consistiu na transferência do meio de cultura com as células (após

desagregação dos aglomerados com uma pipeta serológica de 5ml) para um Falcon, à

qual se seguiu uma centrifugação das células a 1000rpm e posterior nova desagregação

mecânica dos aglomerados, primeiro com a ajuda de uma pipeta serológica de 5ml e


26

depois por passagem das células por seringa e agulha estéreis. As células foram então

contadas num hemocitómetro, com azul tripano, procedendo-se de seguida ao seu

plaqueamento ou à transferência para novos frascos.

As células PC12 foram plaqueadas à densidade de 50.000 células/cm2 para ensaios

de viabilidade celular e à densidade de 180.000 células/cm2 para outros estudos. Devido

à sua fraca adesão ao poliestireno, foi necessário proceder-se ao tratamento prévio das

placas de cultura com poli-D-lisina (preparada à concentração de 0.1mg/ml em tampão

borato 150mM, pH 8.4).

'"'" 4� ��

Os compostos em estudo foram sintetizados pelo grupo de Síntese Orgânica do

Departamento de Química da Universidade do Minho. As suas estruturas químicas

encontram-se representadas na figura 4.

Estes compostos são, conforme evidenciado, compostos azotados com uma estrutura

semelhante a compostos naturais com anéis de imidazole. A sua fórmula de estrutura

revela capacidade de tamponização de radicais livres, essencialmente através dos grupos

hidroxilo situados no anel de imidazole, o que faz prever a sua actividade como anti-

oxidantes. Por outro lado, de acordo com os resultados da introdução das suas estruturas

numa base de dados, criada para o efeito por um grupo de investigadores russos

(informação cedida pela Prof. Fernanda Proença), apresentam potencial farmacológico

em doenças que envolvam stresse oxidativo.

Os compostos estudados foram separados de acordo com a sua estrutura,

nomeadamente os que apresentavam cadeia linear e os que apresentavam uma estrutura

cíclica (figura 4a e 4b, respectivamente). Com a ciclização dos novos compostos

pretendia-se obter um aumento da actividade anti-oxidante.

'"/" 1%��8--9��

De entre os diversos métodos descritos que permitem determinar a remoção de

radicais livres (Parejo et al., 2000; Arnao, 2002) foi utilizado no presente trabalho o

método de descoloração do 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), de acordo com o


27

descrito por Mathiesen (Mathiesen et al., 1997). Com esta abordagem pretendeu-se

determinar o CI50 para cada composto.

O DPPH é um radical livre estável que contém um electrão não emparelhado na sua

estrutura (Jin e Chen, 1998), o que permite a observação de um pico de absorção a

517nm (Lehuédé et al., 1999). A captação de um átomo de hidrogénio a partir de um

dador por parte do radical DPPH leva à formação do radical difenilpicrilhidrazina

(DPPH-H) e de um radical fenoxilo (reacção 4). Esta reacção envolve a mudança de cor

da solução de violeta para amarelo (Lebeau et al., 2000).

DPPH + AH DPPH-H + A (reacção 4)

(cor violeta) (cor amarela)

Uma vez que a descoloração resultante possui uma relação estequiométrica com o

número de electrões captados, o decréscimo na absorvância que resulta desta reacção é

assim representativo da capacidade de um determinado composto remover radicais

livres independentemente de qualquer actividade enzimática (Lehuédé et al., 1999).

Para proceder à execução deste teste, foram inicialmente preparadas soluções em

etanol, dos compostos, a diferentes concentrações, nomeadamente entre 1 e 200µM para

os compostos de cadeia linear e entre 1 e 500µM para os compostos cíclicos.

Colocaram-se então 20µl de cada uma destas soluções numa placa de 96 poços, aos

quais se adicionaram 180µl de uma solução etanólica de DPPH 0.002%.

Os valores de absorvância foram registados num leitor de microplacas Spectra Max

340PC, a 517nm, imediatamente após a adição do DPPH e passados 5, 10, 20, 30, 40,

50 e 60 minutos da mesma. Simultaneamente, procedeu-se à leitura da absorvância de

um controlo positivo contendo apenas DPPH em etanol (com o intuito de se observar a

descoloração do DPPH ao longo do tempo), assim como de controlos negativos

contendo apenas os compostos na ausência de DPPH, de modo a verificar se os

compostos sofreriam alguma descoloração ao longo do tempo.

Com os dados obtidos foi construído um gráfico de modo a ser possível determinar

o tempo de estabilização da descoloração do DPPH para cada composto. Nestes ensaios,

foram adicionalmente utilizados o �-tocoferol (vitamina E) e o Trolox, um análogo da

vitamina E solúvel em água, como bases de comparação para os compostos.


28

Obtido o tempo de estabilização do DPPH, utilizaram-se os valores das absorvâncias

para esse tempo para calcular as percentagens de descoloração para cada concentração

de composto em relação ao controlo positivo e, a partir da curva gerada, determinou-se

a concentração de composto necessária para diminuir a concentração inicial de DPPH

em 50% (CI50).

'"2" 8��

Para a determinação da viabilidade celular foram utilizados dois métodos distintos

mas complementares. Este parâmetro foi assim determinado através da capacidade das

células para reduzir o MTT e através da libertação da enzima lactato desidrogenase para

o meio extracelular.

'"2"!" 1%��1::��

Um dos métodos mais utilizados na avaliação da citotoxicidade de diferentes

compostos é o teste da redução do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazólio (MTT), devido à sua rapidez, versatilidade e alta reprodutibilidade

(Supino, 1995). Este teste colorimétrico baseia-se na capacidade das células viáveis

converterem um sal de tetrazólio solúvel (MTT) num precipitado de formazan insolúvel,

de acordo com a reacção indicada na figura 5. Os sais de tetrazólio atravessam a

membrana celular e entram para a célula onde aceitam electrões a partir de substratos

oxidados, ou de determinadas enzimas, sendo particularmente reduzidos como resultado

da actividade da enzima mitocondrial succinato desidrogenase (Supino, 1995). Esta

reacção converte os sais de MTT de cor amarela em cristais de formazan de cor violeta

que se acumulam em endossomas e são posteriormente transportados para a superfície

celular através de um processo de exocitose (Supino, 1995; Liu, 1999). Os referidos

cristais de formazan podem ser posteriormente dissolvidos num solvente orgânico, que

permita a sua quantificação por espectrofotometria (Supino, 1995; Freshney, 1994).

Estudos mais recentes demonstraram que a mitocôndria não tem um papel exclusivo

na redução do MTT, uma vez que outras fracções subcelulares importantes (incluindo a

nuclear, a microssomal e a citosólica) podem igualmente reduzir o MTT, funcionando o


29

NADH ou o NADPH citoplasmáticos eventualmente como melhores substratos para a

redução do MTT do que o próprio succinato (Liu, 1999).

Sendo assim, deve ter-se em consideração que a redução do MTT poderá não

exprimir necessariamente actividade metabólica a nível mitocondrial. Para além disso a

toxicidade intrínseca do MTT pode de algum modo contribuir para a morte celular

eventualmente verificada (Liu, 1999; Freshney, 1994). Não obstante, a redução do MTT

continua a ser um método expedito de determinação da viabilidade celular, tendo em

consideração as limitações mencionadas.

O método utilizado neste trabalho foi adaptado a partir do descrito por Mosmann

(1983). Sendo assim, colocaram-se 500µl de uma suspensão de fibroblastos com uma

densidade de 5x105 células/ml em placas de 24 poços, tendo as células sido deixadas a

incubar durante 5 horas, a 37ºC, sob atmosfera humidificada com 5% CO2. Após esse

período de incubação (necessário para a adesão dos fibroblastos à superfície dos poços)

adicionaram-se os compostos previamente diluídos em etanol. Foi utilizado um

controlo, contendo apenas células, às quais foi adicionado etanol, no volume máximo de

composto utilizado, o que equivale a uma percentagem de etanol que não excede 1% do

volume total.

As células com os compostos foram deixadas a incubar “overnight”. No dia

seguinte, aspirou-se o meio e lavaram-se os poços com meio de Krebs, tendo-se

adicionado de seguida 500µl de uma solução de MTT diluído em meio de Krebs, à

concentração de 0.5mg de MTT/ml. A placa foi então coberta com papel de alumínio e

deixada a incubar na estufa de CO2, a 37ºC, durante 2 horas. Após esse período,

adicionaram-se a cada poço 500µl de uma solução de isopropanol-ácido e as placas,

protegidas da luz, foram colocadas num agitador orbital durante 2 horas, de modo a

Figura 5 – Estruturas químicas do MTT e do MTT formazan.

Adaptado de Liu (1999).


30

Figura 6 – Redução do piruvato a lactato, catalisada pela lactato desidrogenase,

utilizando NADH como poder redutor. Adaptado de Stryer (1998).

permitir a melhor dissolução dos cristais. Finalizado esse período de tempo, raspou-se o

fundo dos poços com a ajuda de pipetas de Pasteur de plástico, transferindo-se 100µl de

cada poço, em duplicado, para uma placa de 96 poços, destinada a posterior leitura da

absorvância, a um comprimento de onda de 570nm, num leitor de microplacas Spectra

Max 340PC.

A percentagem de viabilidade celular foi então determinada relacionando os valores

das absorvâncias obtidos para cada amostra com o controlo contendo as células expostas

apenas a 1% etanol.

'"2"'" ��6�89+��

A viabilidade celular foi igualmente determinada através do teste da libertação da

enzima lactato desidrogenase (LDH, do inglês “Lactate dehydrogenase”). Esta enzima é

responsável pela redução de piruvato a lactato, na presença de NADH (figura 6) (Stryer,

1998). Uma vez que esta enzima é de origem citoplasmática, a sua presença no meio

extracelular fornece indicações sobre a integridade da membrana plasmática.

As células foram incubadas em placas de 12 poços à concentração de 5x105

células/ml, durante o tempo necessário para ocorrer a adesão celular à placa. Após esse

período de incubação, o meio de cultura foi removido e substituído por meio novo, com

o objectivo de remover possíveis células mortas. Os compostos a testar foram então

adicionados e deixados a incubar na presença das células durante o tempo pretendido.

Após a incubação, recolheu-se um pequeno volume de meio para eppendorfs, com

vista à determinação da LDH extracelular. O restante volume foi então removido,

lavaram-se os poços uma vez com PBS e recolheram-se as células com 1ml de Tris

15mM. Estas foram posteriormente sujeitas a pulsos de poucos segundos num


31

sonicador, de modo a provocar a lise celular e a consequente libertação da LDH

intracelular.

Tanto as amostras para quantificação da LDH extracelular como da intracelular

foram sujeitas a uma centrifugação a 13000rpm, durante 1 minuto, numa centrífuga

(Eppendorf Centrifuge 5415C) para eliminar quaisquer fragmentos celulares que se

encontrassem em suspensão.

As amostras foram colocadas numa placa de 96 poços e as reacções foram iniciadas

pela adição de 10µl de piruvato (concentração final de 0.32mM), na presença de 250µl

de NADH (concentração final de 0.28mM). Ambas as soluções foram preparadas em

tampão fosfato 0.05M, a pH 7.4. A velocidade de conversão da forma reduzida da

nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) na forma oxidada (NAD+) foi então

determinada espectrofotometricamente num leitor de microplacas Spectra Max 340PC,

a 340nm, ao longo de 3 minutos, a 30ºC. A percentagem de LDH libertada foi

posteriormente expressa como percentagem da actividade total, de acordo com a

fórmula:

% LDH libertada = LDH extracelular / (LDH extracelular + LDH intracelular) x 100

'"5" ��&��

O grau de hidrofobicidade dos diferentes compostos foi determinado através da

medição dos coeficientes de partilha (PC, do inglês “Partition Coefficients”) e dos

factores de retardação (Rf, do inglês “Retardation factors”).

Os coeficientes de partilha foram medidos num sistema n-octanol/HEPES. Os

compostos azotados foram dissolvidos em n-octanol a uma concentração de 20µM.

Misturou-se 1ml de cada solução com 20ml HEPES (20mM, pH 7.4), por inversões

várias do conteúdo de cada tubo, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. As duas

fases formadas foram de seguida separadas por centrifugação (Heraeus Sepatech

Megafuge 1.0) à temperatura ambiente e a 2000rpm. Os valores dos coeficientes de

partilha foram calculados através da fórmula: CP = log (CO / CH), onde CO e CH

correspondem às concentrações dos compostos em n-octanol e HEPES,

respectivamente, determinados através dos valores de absorvância lidos a 400nm (para

os compostos FMA4 e FMA7) e 410nm (para os compostos FMA5 e FMA8) de acordo


32

com os picos de absorção previamente determinados. Os valores de CH foram

determinados indirectamente calculando a diferença entre o valor da concentração

inicial e o valor final de composto presente no n-octanol.

Uma segunda avaliação da hidrofobicidade dos compostos foi feita pela

determinação dos factores de retardação, através de cromatografia em camada fina

(TLC, do inglês “Thin Layer Chromatography”), em placas de gel de sílica G60

(Merck) (Areias et al., 2001). Para o efeito, utilizou-se um sistema de eluição

ascendente, constituído por clorofórmio:acetato de etilo:ácido acético numa proporção

de 16:8:1. As placas foram previamente sujeitas a uma corrida com o eluente e deixadas

a secar antes da aplicação da amostra. Colocaram-se 2µl de cada composto e, após

eluição das amostras, observaram-se as bandas dos compostos com o auxílio de um

visor iluminado com radiação ultravioleta.

'";" 8��

��.��

Os peróxidos lipídicos são compostos instáveis que tendem a degradar-se

rapidamente, originando diversos produtos, tais como alcanos de cadeia curta e

aldeídos. Alguns exemplos de intermediários ou produtos da peroxidação lipídica que

podem ser aplicados em estudos clínicos incluem a medição de dienos conjugados, de

substâncias reactivas com o ácido tiobarbitúrico, da exalação dos gases pentano e etano,

e de aldeídos citotóxicos (Meagher e Fitzgerald, 2000).

No presente trabalho experimental procedeu-se à medição do malonildialdeído

(MDA) pelo método do doseamento das espécies reactivas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS), um método desde há muito utilizado (Ohkawa et al., 1979), ao qual foram

introduzidas algumas alterações.

Para a realização deste teste, indicativo da peroxidação lipídica, colocaram-se 4ml

de uma suspensão celular por cada poço numa placa de 6 poços, tendo-se deixado essa

placa a incubar durante 2 dias, a 37ºC numa estufa de CO2, de modo a conseguir obter-

se uma densidade celular de cerca de 1.8x106 células/ml. Este período de incubação foi

necessário, uma vez que a densidade celular obtida por cada passagem/tripsinização era

inferior à densidade final desejada (4.32x107 células para 24ml). Tendo em

consideração que o tempo de duplicação das células é de cerca de 24 horas, com os dois

dias de incubação conseguia-se obter a densidade celular desejada.


33

Após esse período de tempo, os poços foram lavados uma vez com meio de Krebs,

adicionando-se de seguida 2ml do par oxidante, na presença e na ausência dos

compostos a testar, diluídos em meio de Krebs. Para cada condição foram utilizadas

duas réplicas. A peroxidação lipídica foi induzida através da adição do par ascorbato-

ferro, ascorbato 2mM e ferro(II) 400µM, no caso dos fibroblastos, ou ascorbato 2mM e

ferro(II) 100µM no caso das PC12. O ferro utilizado encontrava-se sob a forma de

sulfato de ferro. O efeito protector de cada composto foi estudado pela adição de cada

um deles na presença do par oxidante ascorbato/ferro(II) na concentração anteriormente

determinada. O ascorbato funciona neste caso como um pró-oxidante, reciclando o Fe2+

a partir de Fe3+, que por sua vez leva à formação de radicais livres, como o radical

hidroxilo (Shapiro e Saliou, 2001), razão pela qual a sua concentração poderá ser crítica

no sentido de assegurar a oxidação continuada do ferro presente. Como controlo

negativo foi verificada a eventual peroxidação residual em células, na ausência de

qualquer par oxidante. Mais uma vez foi utilizado o �-tocoferol e o seu análogo Trolox,

como anti-oxidantes tradicionais, de modo a poder comparar o seu efeito com o dos

compostos em estudo.

A placa com os reagentes adicionados ficou então a incubar durante 60 minutos, a

37ºC e 5% CO2. O meio foi posteriormente removido por aspiração e a placa colocada

em gelo. Adicionaram-se 1560µl de Tris 15mM (pH 7.4) a cada poço, de modo a

induzir o rebentamento das células. O conteúdo dos poços foi então removido, com o

auxílio de raspadores, para tubos cónicos de vidro (volume total de 3120µl), fazendo-se

um “pool” de dois poços com células sujeitas às mesmas condições. De cada tubo,

foram retirados 100µl para eppendorfs, para posterior quantificação da proteína total

pelo método de Sedmak. Esta quantificação visa a normalização dos resultados para a

mesma quantidade de proteína total.

Aos tubos cónicos de vidro adicionaram-se 6ml de uma solução contendo 0.38%

TBA (p/v), 37.5% TCA (v/v) e 0.015% BHT (p/v). Os tubos, tapados com esferas de

vidro, foram colocados num banho de água a ferver durante cerca de 15 minutos. Este

tempo de fervura das células com a solução TBA/TCA/BHT destina-se a detectar o

processo de peroxidação lipídica induzido pelo par oxidante. As espécies reactivas ao

ácido tiobarbitúrico originaram o aparecimento de um cromogéneo cor de rosa,

susceptível de absorver a 530nm (Minotti e Aust, 1987; Tang et al., 2000b).


34

Após os 15 minutos de fervura, os tubos foram deixados arrefecer e centrifugados

durante 10 minutos a 3000rpm numa centrífuga preparativa de baixa velocidade

Heraeus-Christ Labofuge. De cada tubo foram retirados 3ml do sobrenadante obtido

para cuvetes e lida a absorvância a 530nm num espectrofotómetro Perkin-Elmer

Lambda 2 UV/VIS. A concentração de TBARS foi calculada utilizando a seguinte

fórmula:

lproteínademgODV

C nm

×××

=ε

530..,

em que V corresponde ao factor de diluição, l corresponde à espessura da cuvete (1cm).

O coeficiente de extinção molar (εεεε) utilizado foi de 1,56x105 M-1.cm-1. Os resultados

foram normalizados para a concentração de proteína em cada caso e por isso expressos

em nmol de MDA/mg de proteína.

'";"!" <��.�=� %�� >��

A determinação da proteína total foi realizada através do método de Sedmak

(Sedmak e Grossberg, 1977) que, devido ao facto de apresentar uma grande facilidade

de execução e uma alta sensibilidade, é um método vulgarmente utilizado para

determinação de baixas gamas de proteína. Este método baseia-se na ligação do corante

(Coomassie Blue) à proteína, que resulta num complexo corante-proteína que absorve a

um comprimento de onda entre 595 e 620nm. Esta ligação do corante à proteína é

mediada pela interacção de grupos amina protonados presentes na proteína. Estes

grupos amina, nomeadamente os resíduos de lisina e arginina, formam um par iónico

com os grupos de ácido sulfónico do corante, resultando na passagem do corante de

castanho para azul (Sapan et al., 1999).

A curva padrão foi obtida a partir de seis soluções contendo quantidades crescentes

de albumina sérica bovina (BSA) 0.1%, 20µl de tampão Tris 15mM, 2ml de reagente de

Sedmak (Coomassie Brilliant Blue G250 0.06%, em ácido perclórico 3% (p/v),

previamente filtrado através de filtros de papel Whatman nº1) diluído em ácido

perclórico 3% numa proporção de 3 para 7, completando o volume de 3ml com água

ultra-pura. Para quantificação da proteína nas amostras, colocaram-se nos tubos 50µl de

cada uma delas, 2ml de reagente de Sedmak diluído e perfez-se o volume até 3ml com


35

água ultra-pura. O conteúdo de cada tubo foi misturado num vortex, após o que se

esperaram cerca de 10 minutos à temperatura ambiente. A absorvância foi lida num

leitor de microplacas Spectra Max 340PC, a um comprimento de onda de 620nm.

'"?" 8�� 4��

As caspases são uma componente fundamental da maquinaria apoptótica,

participando numa cascata enzimática que resulta na morte celular. Estas proteases

clivam os seus substratos em ligações Asp-Xxx, ou seja, a seguir a um resíduo de

aspartato. A especificidade de uma caspase por um substrato é determinada pelos três a

quatro resíduos anteriores a esse aspartato (Hengartner, 2000).

A actividade das caspases 3, 8 e 9 foi determinada através da utilização de

substratos contendo o cromóforo p-nitroanilida (pNA). Após a indução de apoptose nas

células, a actividade proteolítica das caspases aumenta, proporcionando a clivagem dos

seus substratos e a libertação do cromóforo, que por sua vez pode ser detectado

espectrofotometricamente. Desta forma, comparando as absorvâncias obtidas para as

amostras controlo com as restantes amostras, é possível determinar o nível de actividade

proteolítica para cada uma delas, após indução de apoptose.

O método utilizado foi adaptado do procedimento descrito por Cregan (Cregan et

al., 1999). As células foram incubadas em placas de 12 poços tratadas com poli-lisina a

uma densidade de 1.8x105 células/cm2. Após a adesão das células, o meio de cultura foi

removido e substituído por meio contendo apenas 4% de soro. A ausência de soro no

meio contribui para a indução de apoptose (Oliveira et al., 2002). Foi adicionada

staurosporina (STS), um alcalóide isolado a partir da bactéria Streptomyces

staurospores que, por parecer activar mecanismos de morte celular comuns a todas as

células, é utilizado de uma forma generalizada como indutor da apoptose (Kruman et

al., 1998). Os compostos a testar, na presença de STS, foram então adicionados a este

novo meio.

Após a incubação com os compostos na presença de STS, o meio foi removido e as

células lavadas duas vezes com PBS (pH 7.4). De seguida, recolheram-se as células com

um tampão de lise (Na-EDTA 1mM, Na-EGTA 1mM, MgCl2.6H2O 2mM, HEPES

25mM, pH 7.5, contendo fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 100µM e DTT 2mM).

As amostras foram sujeitas a uma sonicação de 10 segundos num sonicador “High


36

Intensity Ultrasonic Processor” a fim de assegurar o processo de lise, seguida de uma

centrifugação a 14000rpm (centrífuga Sigma 2K15) durante 10 minutos, a 4ºC, para

eliminar os fragmentos celulares. Os sobrenadantes foram transferidos para novos

eppendorfs e guardados a -80ºC até serem utilizadas, quer para determinação da

actividade das caspases quer para determinação da proteína total pelo método de

Sedmak já descrito.

Para determinar a actividade das caspases 3, 8 e 9, alíquotas de extractos celulares

contendo 50µg de proteína foram adicionadas a um tampão de reacção (sacarose 10%,

hidróxido de N,N-dimetil-N-(3-sulfopropil)-3-[[3�,5�,7�,12�)-3,7,12-trihidroxi-24-

oxocolan-24-il]-amino]-1-propanamónio (CHAPS) 0.1%, HEPES 25mM, pH 7.4,

contendo DTT 10mM). As reacções (volume final de 500µl) foram iniciadas pela

adição, ao abrigo da luz, dos seguintes substratos colorimétricos: acetil-Asp-Glu-Val-

Asp-p-nitroanilida (Ac-DEVD-pNA) 100µM, para determinação da actividade das

enzimas semelhantes à caspase-3; acetil-Ile-Glu-Thr-Asp-p-nitroanilida (Ac-IETD-

pNA) 100µM, para determinação da actividade das enzimas semelhantes à caspase-8;

ou acetil-Leu-Glu-His-Asp-p-nitroanilida (Ac-LEHD-pNA) 100µM, para determinação

da actividade das enzimas semelhantes à caspase-9. Ao fim de 2 horas de incubação ao

abrigo da luz e a 37ºC, foram transferidos 200µl de cada reacção para placas de 96

poços, sendo a clivagem dos substratos colorimétricos medida a 405nm. A actividade

das diferentes caspases, expressa em nmol de substrato / mg de proteína, foi

posteriormente expressa como o aumento dos valores de absorvância relativamente ao

controlo (células incubadas na ausência do indutor apoptótico).

'"@" 8�� 1��4��A� �� 9��&��///2'��.��

O colapso nuclear característico que ocorre durante a apoptose engloba a

fragmentação da cromatina, degradação do envelope nuclear e o “blebbing” nuclear,

resultando na formação de micronúcleos. Por conseguinte, os marcadores de ácidos

nucleicos tornam-se ferramentas úteis na identificação de células apoptóticas, no meio

de uma população celular.

Neste trabalho, as células apoptóticas foram distinguidas das necróticas através da

utilização em simultâneo de dois marcadores fluorescentes: o Hoechst 33342 e o iodeto

de propídio (PI, do inglês “Propidium Iodide”). O marcador Hoechst penetra livremente


37

nas células, marcando dessa forma os núcleos (com uma cor azul fluorescente) tanto das

células viáveis como das células em apoptose ou necrose. As células apoptóticas podem

de seguida ser distinguidas das outras com base na condensação e fragmentação nuclear.

O iodeto de propídio entra apenas em células cujas membranas se encontrem

danificadas, ou seja, a partir de fases mais avançadas da apoptose, em que ocorre um

aumento da permeabilidade da membrana. Logo, as células PI-negativas são

consideradas viáveis, enquanto que as células PI-positivas consideram-se como

necróticas (Liu et al., 2003).

Para a realização deste procedimento, as células foram incubadas à densidade de

5x105 células/ml em lamelas de vidro previamente esterilizadas com etanol a 70% e

colocadas em placas de 6 poços. Para a adesão das células PC12, as lamelas foram

tratadas com poli-lisina, de acordo com o procedimento descrito anteriormente (secção

2.1.2.).

Após adesão celular, o meio de cultura foi removido e as células aderidas às lamelas

foram lavadas duas vezes com PBS. Foram adicionados 100µl/lamela de iodeto de

propídio 4µg/ml (em PBS) e aguardados 5 minutos. De seguida, as células foram

novamente lavadas com PBS (duas vezes), adicionaram-se 400µl/lamela de

paraformaldeído 4% e aguardaram-se mais 10 minutos, para promover a fixação. O

paraformaldeído foi então removido e as células novamente lavadas duas vezes com

PBS. Adicionaram-se 400µl/lamela de Hoechst 5µg/ml (em PBS). Após 10 minutos

nessas condições, procedeu-se a novas lavagens das células com PBS.

Depois de deixar secar bem as lamelas, estas foram montadas em lâminas com uma

gota de água, e observadas por microscopia de fluorescência (Leitz Laborlux S). Os

núcleos foram identificados pela reacção fluorescente azul ou vermelha e distinguidos

pela respectiva morfologia.

'"7" ��.��

Todos os resultados foram expressos como a média ± erro padrão, para pelo menos

três experiências independentes, executadas em duplicado. A significância estatística foi

determinada pelo teste de t-Student (“unpaired, two-tailed”). Valores de p < 0.05 foram

considerados como sendo estatisticamente significativos.


38

'"!B" 3��. ��

O soro fetal bovino (FBS) foi adquirido à Biochrom KG (Berlim, Alemanha).

O soro de cavalo foi adquirido à Gibco (Paisley, UK).

O 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) e o 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-

ácido carboxílico 97% (Trolox) foram adquiridos à Sigma-Aldrich Chemie (Berlim,

Alemanha).

O Coomassie Blue foi adquirido à Fluka (Suíça).

Todos os outros reagentes, incluindo o meio de cultura DMEM (Dulbecco’s

Modified Eagle Medium), o meio de cultura RPMI-1640, o HEPES, o antibiótico, a

0.25% tripsina/EDTA, o azul de metileno, o azul tripano, o 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-

2,5-difeniltetrazólio (MTT), a forma reduzida da �-nicotinamida adenina dinucleótido

(�-NADH), o dimetilsulfóxido (DMSO), o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), o ácido

tricloroacético (TCA), o hidroxitolueno butilado (BHT), a albumina sérica bovina

(BSA), o ácido L-ascórbico, o ácido bórico, a poli-D-lisina, o Hoechst 33342, o iodeto

de propídio, o hidróxido de N,N-dimetil-N-(3-sulfopropil)-3-[[(3�,5�,7�,12�)-3,7,12-

trihidroxi-24-oxocolan-24-il]-amino]-1-propanamónio (CHAPS), a staurosporina, o

acetil-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilida (Ac-DEVD-pNA), o acetil-Ile-Glu-Thr-Asp-p-

nitroanilida (Ac-IETD-pNA), o acetil-Leu-Glu-His-Asp-p-nitroanilida (Ac-LEHD-

pNA), o fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), o ditiotreitol (DTT), o ácido Na-

etilenodiaminatetraacético (EDTA) e o ácido Na-etilenoglicol-bi-(�-aminoetiléter)-N,N-

tetraacético (EGTA) foram adquiridos à Sigma Chemical Company (St Louis, EUA)

Mestrado em Genética Molecular Resultados e Discussão

39

/"/"/"/" 3��8��3��8��3��8��3��8��

O stresse oxidativo é uma das principais causas de danos celulares, resultando em

diversas disfunções do metabolismo e por conseguinte em morte celular. A procura de

novos compostos que possam actuar para além das defesas celulares naturais, em

situações em que as células se encontrem danificadas, tem vindo a aumentar

drasticamente nos últimos anos, uma vez que estes podem contribuir para uma melhoria

significativa de patologias envolvendo stresse oxidativo. Alguns compostos, de origem

natural, tais como alguns flavonóides, provaram já ser bons anti-oxidantes (Areias et al.,

2001). No entanto, estes flavonóides encontram-se maioritariamente em extractos de

plantas ou outros componentes naturais, fazendo parte de misturas que, devido à sua

complexidade, impossibilitam a sua utilização directa como fármacos. Por outro lado, o

seu isolamento dessas misturas é um processo complexo, nem sempre reprodutível, e

por isso pouco viável para a sua obtenção em larga escala.

No presente estudo foram utilizados compostos sintetizados de novo, com uma

estrutura química bem definida, podendo o seu potencial anti-oxidante ser directamente

correlacionado com as suas características estruturais.

�

/"! 8�� 4#5B� ��

De acordo com Beckman e Ames (1998), a actividade anti-oxidante de um

composto depende da sua capacidade como “scavenger” de radicais livres. Neste

trabalho, utilizou-se o método de descoloração do radical DPPH para verificar essa

capacidade nos novos compostos. Nesta primeira fase, foram testados apenas os

compostos de cadeia linear.

De acordo com estudos realizados anteriormente em flavonóides, a presença de dois

grupos hidroxilo nas posições C-3 e C-4 da sua estrutura química é responsável por um

aumento da capacidade de redução do DPPH (Okawa et al., 2001; Yokozawa et al.,

1998). Sendo assim, seria de prever uma maior actividade anti-radicalar por parte dos

compostos FMA5 e FMA8. De facto, e tal como demonstram os resultados da tabela I,

esses compostos apresentam valores de CI50 bastante baixos (2.5 e 3.9µM), logo uma


40

actividade anti-radicalar elevada, sendo inclusivamente superior às duas formas da

vitamina E testadas: a forma lipossolúvel (�-tocoferol) e o análogo hidrossolúvel

(Trolox). Por sua vez, os compostos FMA4 e FMA7 apresentaram valores de CI50 mais

elevados, logo menor actividade anti-radicalar, o que também seria de prever pela

presença de apenas um grupo hidroxilo na posição C-3 da sua estrutura química.

Tabela I – Valores de CI50 obtidos através do método de descoloração do DPPH, para os diferentes

compostos testados e sua comparação com dois anti-oxidantes tradicionais.

Adicionaram-se diferentes concentrações de cada composto a uma solução etanólica de DPPH cuja

descoloração foi lida espectrofotometricamente a 517nm, após 40 minutos. Os resultados foram expressos

como a percentagem de descoloração em relação a um controlo positivo contendo apenas uma solução

etanólica de DPPH. Todos os compostos apresentam valores de CI50 da ordem µM, indicativos de elevada

actividade anti-radicalar. Esta actividade é maior para os compostos FMA5 e FMA8.

/"' ��

Os valores de CI50 acima determinados foram tomados em consideração na

avaliação da citotoxicidade dos novos compostos. Tendo em consideração a eventual

metabolização dos compostos in vivo, escolheu-se testar os mesmos para uma

concentração por excesso (cinco vezes o CI50). A viabilidade celular foi determinada em

fibroblastos pertencentes à linha L929. Foram utilizados dois métodos distintos: o teste

de redução do MTT, que reflecte a capacidade redutora das células, e o teste de

libertação da LDH, relacionado com a integridade da membrana plasmática.

Os resultados representados na figura 7 permitem observar que nenhum dos

compostos provocou uma diminuição significativa da actividade redutora das células,

Composto CI50 (µµµµM)

FMA4 19,75

FMA5 2,5

FMA7 20,4

FMA8 3,9

Trolox 9

�-tocoferol 9,6


41

indicando que a maquinaria enzimática responsável pelos processos metabólicos de oxi-

redução não foi afectada. De igual modo, nenhum dos compostos conduziu ao aumento

da enzima lactato desidrogenase no meio extracelular, revelando assim as boas

condições da membrana plasmática a nível da sua integridade (figura 8).

0

20

40

60

80

100

120Controlo

FMA4

FMA5

FMA7

FMA8

% R

eduç

ão d

e M

TT

Figura 7 – Viabilidade celular determinada pelo teste de redução do MTT. Os fibroblastos, à

densidade de 5x105 células/ml, foram incubados com os compostos (a uma concentração 5xCI50)

“overnight”, após o que se adicionou o MTT. A percentagem de viabilidade celular foi calculada

relacionando os valores de absorvância obtidos a 570nm para cada amostra, com um controlo

contendo apenas as células expostas a 1% de etanol. Cada coluna representa a média ± erro padrão,

considerando os resultados obtidos para pelo menos 3 experiências independentes.

0

5

10

15

20

25Controlo

FMA4

FMA5

FMA7

FMA8

% L

DH

libe

rtad

a

Figura 8 – Avaliação da integridade membranar através da medição da LDH libertada para

o meio extracelular. As condições de incubação, assim como as concentrações dos

compostos testadas, foram as mesmas que foram utilizadas para a realização do teste de

redução do MTT. A percentagem de LDH libertada foi determinada após leitura das

amostras a 340nm durante 3 minutos, a 30ºC. Esses valores foram depois relacionados com

um controlo contendo apenas fibroblastos expostos a 1% de etanol. Para cada barra

representa-se a média ± erro padrão de pelo menos 3 experiências distintas.


42

Conjuntamente, estes dados revelam que nenhum dos compostos é citotóxico,

mesmo para uma concentração cinco vezes superior ao CI50 previamente determinado.

/"/ ��&��

A actividade anti-oxidante de um composto encontra-se relacionada, entre outros

factores, com a sua capacidade para interagir e penetrar nas membranas lipídicas. Por

sua vez, a incorporação de um composto nas membranas celulares é afectada por

inúmeros factores, nomeadamente pelas interacções electrostáticas, pela formação de

pontes de hidrogénio com os grupos polares dos fosfolípidos, pelas interacções

hidrofóbicas com as cadeias de ácidos gordos e igualmente pela geometria molecular

dos fosfolípidos e dos compostos (Saija et al., 1995). No sentido de poder vir a

relacionar os efeitos dos compostos com estas características, foram utilizados dois

métodos complementares para avaliar o grau de hidrofobicidade dos novos compostos

em estudo: determinação dos coeficientes de partilha no sistema n-octanol/HEPES e

cromatografia de camada fina em placas de sílica.

Previamente à determinação dos coeficientes de partilha dos compostos, foi

necessário determinar os comprimentos de onda aos quais a sua absorvância é máxima.

Para isso, foi varrido o espectro entre 300 e 450nm (resultados não apresentados). Os

novos compostos evidenciaram dois picos de absorvância, um situado entre os 300 e os

350nm e outro entre os 400 e os 420nm. Dado que a leitura da absorvância no primeiro

pico se torna incompatível com a utilização do método, devido ao facto de o n-octanol

também possuir um pico de absorvância nessa gama, levando à interferência com os

resultados, procurou-se utilizar o segundo pico. Os espectros obtidos indicaram assim a

presença do segundo pico por volta dos 400nm para os compostos FMA4 e FMA7 e por

volta dos 410nm para os compostos FMA5 e FMA8. As leituras de absorvância

efectuadas posteriormente foram realizadas considerando os comprimentos de onda

determinados deste modo.

A razão de escolha do sistema n-octanol/água para determinação dos coeficientes de

partilha relaciona-se com o facto de se encontrar publicada uma grande quantidade de

estudos sobre a relação entre o n-octanol e a partição de compostos, costumando existir

uma boa correlação de tais coeficientes de partilha com a resposta biológica (Bhat et al.,


43

2002; Rogachev et al., 2003). Neste trabalho, utilizou-se HEPES, em vez de apenas

água, somente com o objectivo de estabilizar o pH, uma vez que as variações de pH

podem afectar a hidrofobicidade (Areias et al., 2001). Para além da informação

fornecida pelos coeficientes de partilha, foi também utilizada a cromatografia em

camada fina como um processo de avaliar a interacção dos compostos com as

membranas biológicas. De facto, no sistema n-octanol/HEPES, os factores

preponderantes são as interacções hidrofóbicas, ou forças de “van der Waals”, entre a

longa cadeia hidrofóbica do n-octanol e os compostos, enquanto na cromatografia de

camada fina em placas de sílica, os factores dominantes são as pontes de hidrogénio

formadas entre a sílica e os compostos. Assim, comparando os dois diferentes sistemas

químicos, provavelmente a avaliação da permeabilidade destes compostos nas

membranas celulares será a mais realista. Os resultados obtidos para os dois sistemas

encontram-se representados na tabela II.

Tabela II – Valores dos coeficientes de partilha e dos factores de retardação para os novos compostos.

Os coeficientes de partilha foram determinados num sistema n-octanol/HEPES e os factores de

retardação foram determinados através de cromatografia de camada fina, em placas de sílica, utilizando

um sistema de eluição composto por clorofórmio: acetato de etilo: ácido acético (16:8:1). Os compostos

foram testados a uma concentração de 20µM. Os compostos FMA4 e FMA7 apresentam maior

lipofilicidade que o FMA5 e o FMA8. Os resultados dos coeficientes de partilha correspondem à média ±

erro padrão de duplicados de pelo menos 3 experiências distintas.

Como se pode observar, a capacidade dos compostos testados para penetrarem as

membranas biológicas varia de acordo com a mesma ordem, independentemente do

sistema usado para avaliação da sua lipofilicidade. Deste modo, o FMA4 é aquele que

possui uma maior afinidade para formar interacções hidrofóbicas com o n-octanol

(maior coeficiente de partilha). Por outro lado, apresenta uma menor afinidade para

Composto Coeficientes de partilha Factores de Retardação

FMA4 1,65 ± 0,13 0,67

FMA5 1,31 ± 0,13 0,40

FMA7 1,42 ± 0,03 0,58

FMA8 0,68 ± 0,03 0,36


44

formar pontes de hidrogénio com a sílica (factor de retardação mais elevado). Estes

valores, em conjunto, indicam que este composto terá uma maior facilidade em

atravessar as membranas lipídicas. A lipossolubilidade dos compostos varia assim, por

ordem decrescente: FMA4 > FMA7 > FMA5 > FMA8. Os compostos apresentam

valores de coeficientes de partilha e factores de retardação semelhantes a alguns

flavonóides utilizados tradicionalmente como anti-oxidantes, tais como o eriodictiol ou

a quercetina (Areias et al., 2001) para os quais foram encontrados valores na ordem dos

1.65 ± 0.05 e 2.04 ± 0.04, respectivamente.

Observando as estruturas químicas dos compostos (figura 4), a maior

lipossolubilidade de FMA4 e FMA7 parece estar associada à presença de apenas um

grupo hidroxilo na posição C-3, enquanto que os outros dois compostos (FMA5 e

FMA8) possuem dois grupos hidroxilo, nas posições C-3 e C-4. Sendo assim, estes

resultados indicam que a presença destes grupos hidroxilo, apesar de conferirem uma

maior actividade anti-radicalar aos compostos, têm a desvantagem de dificultar o seu

acesso ao interior da célula, levando desse modo a uma eventual diminuição da sua

eficácia como anti-oxidantes a nível intracelular. Esta aparente discrepância pode vir a

ser elucidada nos estudos subsequentes.

/"2" -�� .��

Os estudos do efeito protector dos compostos na peroxidação lipídica permitem

analisar a sua actividade anti-oxidante secundária, uma vez que se vai observar a

capacidade do composto para complexar o ião metálico utilizado para induzir

peroxidação (neste caso, o ferro), impedindo dessa forma que esse ião vá peroxidar a

membrana.

De modo a induzir a oxidação dos lípidos membranares foi utilizado o par

ascorbato-ferro(II), que é frequentemente utilizado para este tipo de estudos (Katayama

et al., 1989; Rego et al., 1998). O ascorbato comporta-se como um pró-oxidante, uma

vez que a sua função é a de reduzir o ferro, numa reacção permitida pelos seus

potenciais de redução, de acordo com a reacção 5:

Fe3+ + ascorbato � Fe2+ + ascorbato• (reacção 5)


45

O Fe2+ resultante desta reacção é depois canalizado para a reacção de Fenton,

levando à formação de radicais hidroxilo (Shapiro e Saliou, 2001; Halliwell e

Gutteridge, 1999). A mistura ascorbato-ferro estimula os danos causados por radicais

livres no DNA, lípidos e proteínas in vitro. Por vezes surge a questão sobre se o efeito

pró-oxidante do ascorbato será fisiologicamente relevante in vivo, de modo a determinar

o conteúdo adequado de ascorbato na dieta humana e a necessidade ou não de existir

uma suplementação. Até ao momento não existem indícios que revelem toxicidade para

doses elevadas de ascorbato em pessoas saudáveis, mas essas doses não são

aconselháveis (Halliwell e Gutteridge, 1999).

Os resultados da figura 9 mostram que o par ascorbato 2mM / Fe2+ 400µM induz

níveis de peroxidação lipídica superiores aos obtidos para outros pares oxidantes

testados (parte A). Ao mesmo tempo, não compromete significativamente a viabilidade

celular avaliada pela redução do MTT (parte B), sendo o decréscimo na viabilidade

celular de apenas 19.85%. Por estas razões, esta combinação foi a escolhida para os

estudos subsequentes.

Os resultados obtidos com os compostos na protecção da peroxidação induzida pelo

par ascorbato-ferro estão representados na figura 10 e demonstram que existe uma

Controlo

Asc 2mM / Fe2+ 400µMAsc 2mM / Fe2+ 600µM

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

Nív

eis

de T

BA

RS

(nm

ol /

mg

prot

eína

)

0

25

50

75

100

125

% R

eduç

ão d

o M

TT

Asc 5mM / Fe2+ 400µM

A B

Figura 9 – Escolha do melhor par oxidante para induzir peroxidação lipídica. A: Os fibroblastos

foram incubados na presença de diferentes concentrações de ascorbato e ferro. A produção de

MDA foi determinada pelo método de TBARS com correcção para a quantidade de proteína

utilizada em cada caso; B: Alterações da viabilidade celular induzidas pelo par ascorbato 2mM /

Fe2+ 400µM. Para cada coluna encontra-se representada a média ± erro padrão de pelo menos 3

experiências independentes.


46

protecção elevada exercida pelos novos compostos, sendo esta maior para o FMA4 e

FMA7. Em nenhum dos casos se verificou diferenças significativas entre as duas

concentrações testadas, CI50 e 5xCI50, tal como evidenciado para o caso do Trolox e do

FMA4. O FMA4 foi no entanto o único composto a apresentar diferenças

estatisticamente significativas em relação ao Trolox. A razão deste perfil de protecção

verificado pode ser explicado pelo relativamente baixo nível de oxidação verificado

(2.19 vezes em relação ao controlo, figura 9A) com o par oxidante.

Na verdade, os fibroblastos são células que, pela sua natureza indiferenciada, são

difíceis de oxidar. As células PC12, por seu turno, têm sido bons modelos para estudos

deste tipo (Kruman et al., 1998; Pereira et al., 1999). Os resultados na figura 11

mostram inequivocamente níveis superiores de peroxidação lipídica (aumento de 7.43

vezes em relação ao controlo), o que facilita a observação de uma possível protecção

por parte dos compostos em estudo.

0

20

40

60

80

100

120

CI50 5xCI50

Tro lox FMA4 FMA5 FMA8FMA7

* *

CI50 5xCI505xCI505xCI505xCI50

% P

rote

cção

na

pero

xida

ção

lipíd

ica

Figura 10 – Protecção dos novos compostos na peroxidação lipídica. Os compostos (às

concentrações do CI50 e 5xCI50, foram adicionados simultaneamente com o par oxidante

ascorbato 2mM/ Fe2+ 400µM, a fibroblastos incubados à densidade de 1.8x106 células/ml.

A produção de MDA foi determinada pelo método de TBARS e corrigida para a

quantidade de proteína em cada caso. Para cada coluna representa-se a média ± erro

padrão para pelo menos 3 experiências distintas. * p < 0.05 (comparativamente à

respectiva concentração de Trolox).


47

Assim, a capacidade dos compostos para reverter a peroxidação lipídica induzida

pelo par oxidante ascorbato 2mM / Fe2+ 100µM, avaliada em células PC12 (figura 12),

mostra que a incubação com os compostos FMA4 e FMA7 numa concentração igual ao

CI50 conduz a uma protecção de 46.96 ± 9.05%, no caso do FMA4, e 41.67 ± 4.72%

para o FMA7. Com a incubação dos compostos numa concentração duas vezes superior

ao CI50 não se verificaram diferenças estatisticamente significativas dos níveis de

protecção (50.05 ± 6.26% para o FMA4 e 53.31 ± 0.93% para o FMA7) em relação ao

CI50. Em qualquer dos casos, pode afirmar-se que os novos compostos possuem uma

capacidade bastante elevada para reverter os danos observados nos lípidos membranares

induzidos pelo par oxidante.

Como meio de comparação com os compostos, foram utilizados o �-tocoferol e o

seu análogo hidrossolúvel Trolox. O �-tocoferol corresponde à forma da vitamina E

mais eficaz em animais. Sabe-se que os tocoferóis inibem a peroxidação lipídica em

grande parte por impedirem que os radicais peroxilo lipídicos (LO2•) reajam com as

cadeias dos ácidos gordos ou com as proteínas membranares (Halliwell e Gutteridge,

1999). Em termos comparativos, e analisando a figura 12, verifica-se que os novos

0

1

2

3

4Controlo

L929 PC12

***

Par Oxidante

Nív

eis

de T

BA

RS

(nm

ol /

mg

prot

eína

)

Figura 11 – Diferenças entre os níveis de peroxidação lipídica em células L929 e em células

PC12. O par oxidante que apresentou melhores resultados na oxidação dos lípidos

membranares nas células L929 foi o ascorbato 2mM/ Fe2+ 400µM, enquanto que para as PC12

o par ascorbato 2mM/ Fe2+ 100µM revelou melhores resultados. Para cada coluna representa-

se a média ± erro padrão de pelo menos 6 experiências distintas. A análise estatística consistiu

na realização do teste de t-student. *** p < 0.001.


48

compostos possuem um efeito protector superior ao do Trolox (39.99 ± 4.65% para o

CI50 e 42.76 ± 5.80% para 2xCI50), mas inferior ao observado para o �-tocoferol (57.86

± 3.39% para o CI50 e 68.30 ± 4.73% para 2xCI50).

Uma vez que a peroxidação lipídica ocorre maioritariamente devido aos radicais

livres formados intracelularmente (Spiteller, 2001b), quanto maior for a facilidade dos

compostos para penetrar a membrana lipídica, maior será a sua capacidade para impedir

que esses radicais conduzam à peroxidação dos lípidos membranares. De facto, os

resultados obtidos através do método de TBARS parecem correlacionar-se com a

lipossolubilidade dos compostos testados.

Analisando os resultados das figuras 10 e 12 verifica-se que os compostos FMA4 e

FMA7 apresentaram uma protecção elevada na peroxidação lipídica, apesar de não

terem sido aqueles que demonstraram uma maior actividade anti-radicalar (tabela I).

Esta aparente discrepância de resultados pode ser explicada pela maior lipofilicidade

dos compostos FMA4 e FMA7 em relação ao FMA5 e ao FMA8, evidenciada pelos

seus coeficientes de partilha (tabela II), e que indica a sua maior capacidade para

0

25

50

75 Trolox 9µM

Trolox 18µM

Tocoferol 9.6µM

Tocoferol 19.2µM

FMA4 19.75µM

FMA4 39.5µM

FMA7 20.4µM

FMA7 40.8µM

% P

rote

cção

na

pero

xida

ção

lipíd

ica

Figura 12 – Protecção dos compostos na peroxidação lipídica em células PC12 expostas ao par

oxidante ascorbato 2mM/Fe2+ 100µM. Os compostos foram adicionados a uma concentração igual

ou duas vezes superior ao CI50, 3 horas antes da incubação com o par oxidante. A produção de

MDA foi determinada pelo método de TBARS e normalizada para a quantidade de proteína em

cada caso. Para cada coluna está representada a média ± erro padrão para pelo menos 3

experiências independentes, realizadas em duplicado.


49

atravessar a membrana lipídica e desse modo impedir a formação de radicais

intracelulares.

Nenadis et al. (2003), utilizando um sistema octanol/água, indicaram os valores de

0.49 ± 0.02 e 6.76 ± 0.39 como coeficientes de partilha para o Trolox e o �-tocoferol,

respectivamente. Sendo assim, verifica-se que o composto com menor capacidade para

atravessar a membrana lipídica (Trolox) é aquele que apresenta menor protecção a nível

da peroxidação lipídica. Por outro lado, o �-tocoferol, que possui uma maior facilidade

em penetrar a membrana lipídica, foi o composto com maior protecção na peroxidação

lipídica. Os compostos FMA4 e FMA7, que possuem uma lipossolubilidade intermédia

entre os dois anti-oxidantes naturais testados, apresentam de facto uma protecção

intermédia.

/"5" �� 0/� ��

Os resultados já apresentados e outros previamente obtidos (Silva et al., 2003)

revelaram que os novos compostos não são tóxicos e poderão ser bons protectores de

fenómenos de peroxidação lipídica. Com este trabalho pretendeu-se também determinar

a sua capacidade para actuarem intracelularmente e desse modo exercerem protecção a

nível dos fenómenos apoptóticos.

A caspase-3 é uma caspase que desempenha um papel fundamental na execução do

programa apoptótico, uma vez que participa na clivagem ou degradação de inúmeros

substratos importantes e eventualmente na activação de outras caspases, contribuindo

dessa forma para o aparecimento do fenótipo apoptótico (Boulares et al., 1999;

Zimmermann et al., 2001). De acordo com estudos anteriores, a activação desta caspase

possui implicações em diversas patologias, tais como doença de Alzheimer (Jang et al.,

2004), doença de Parkinson (Viswanath et al., 2001), isquémia cerebral (Chen et al.,

1998), entre outras. Por seu turno, a staurosporina (STS) é um alcalóide isolado a partir

da bactéria Streptomyces staurospores que, por parecer activar mecanismos de morte

celular comuns a todas as células, é utilizado de uma forma generalizada como indutor

da apoptose (Kruman et al., 1998). As vias através das quais realiza essa indução não

foram ainda completamente esclarecidas (Belmokhtar et al., 2001). No entanto, foi já

demonstrado que a staurosporina penetra facilmente a membrana celular e é um potente

inibidor da proteína cinase C e de outras cinases proteicas, quando usada em


50

concentrações mais elevadas (Ruegg e Burgess, 1989) além de levar, à libertação de

citocromo c, activação de caspases e acumulação de ROS mitocondrial (Kruman et al.,

1998; Krohn et al., 1998).

A indução da caspase-3 foi primeiro testada com o modelo celular L929. Os

resultados obtidos (figura 13) mostram no entanto que mesmo reduzindo a concentração

de soro de 10% para 4% (Stefanis et al., 1996) não há indução significativa da

actividade da caspase-3 para as concentrações de STS de 300 e 400nM.

Na presença de 1µM de STS, a actividade da enzima aumenta 1.89 ± 0.45 vezes. No

entanto, esta concentração de STS revelou-se deletéria para as células, como mostram

os resultados de viabilidade celular avaliada pela libertação de LDH, manifestamente

afectada para concentrações superiores a 300nM (figura 14).

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Cli

vag

em d

o A

c-D

EV

D-p

NA

(au

men

to r

elat

ivam

ente

ao

co

ntr

olo

)

Controlo

STS 300nM

STS 400nM

STS 1µM

Figura 13 – Avaliação da actividade da caspase-3 em fibroblastos da linha celular L929 através

da clivagem do substrato colorimétrico Ac-DEVD-pNA, na presença de meio de cultura

contendo apenas 4% soro. A incubação com staurosporina decorreu durante 6 horas. Para cada

coluna representa-se a média ± erro padrão de pelo menos 3 experiências distintas. A análise

estatística revelou não haver diferenças significativas quando relacionadas as diferentes

concentrações de staurosporina com a condição controlo.


51

Os resultados obtidos com os marcadores fluorescentes Hoechst 33342 e iodeto de

propídio corroboram a falta de resposta à staurosporina (figura 15). O marcador Hoechst

penetra nas células indiscriminadamente e marca os seus núcleos com uma cor azul,

sendo as células classificadas de acordo com o grau de condensação da cromatina e

fragmentação nuclear. Por outro lado, as células são impermeáveis ao iodeto de

propídio, que marca (com cor vermelha) apenas as células cuja membrana se encontre

danificada. As células que se encontrem marcadas com iodeto de propídio são

consideradas como necróticas (Liu et al., 2003).

Na verdade, a incubação na presença de STS não induz alterações significativas

relativamente ao controlo, observando-se apenas um pequeno número de células

necróticas (figura 15 (E-H) – setas brancas). Todas as restantes mantinham o aspecto de

células viáveis, de acordo com resultados semelhantes de outros autores (Humphreys e

Wilson, 1999) que concluem que a morte induzida por STS nesta linha celular poderá

ocorrer por um processo tão rápido que inviabilize o seguimento da cascata intracelular

de eventos, incluindo a actividade da caspase-3.

0 5 10 15 20 250

20

40

60

80

100Controlo

STS 200nM

STS 300nM

STS 400nM

***** ***

***

***

***

******

***

*

*

Tempo de incubação (horas)

% L

DH

libe

rtad

a

Figura 14 – Avaliação da integridade membranar dos fibroblastos na presença do estímulo

apoptótico. As células foram incubadas com staurosporina 200, 300 e 400nM e a viabilidade celular

determinada através da libertação de LDH durante 24 horas. As células controlo não foram

submetidas ao estímulo apoptótico. A % de LDH libertada para o meio extracelular encontra-se

representada como a média ± erro padrão de pelo menos 3 experiências independentes, realizadas em

duplicado. * p < 0.05, ** p < 0.01 e *** p < 0.001 em comparação com o respectivo controlo.


52

�

�

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�

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�

�

Figura 15 – Análise da condensação da cromatina em fibroblastos da linha celular L929. Após adesão

das células a lamelas, os fibroblastos foram sujeitos a um estímulo com staurosporina 300nM, durante 6

horas. De seguida, as células foram marcadas com os marcadores fluorescentes Hoechst 33342 e iodeto

de propídio, de modo a determinar a sua viabilidade. A-D: controlo; E-H: STS 300nM; A, C, E e G:

células marcadas com o marcador Hoechst; B, D, F e H: sobreposição de ambos os marcadores

(Hoechst e iodeto de propídio). As setas indicam células necróticas. Não foram encontradas quaisquer

células em estado de apoptose.

A B

C D

E F

G H


53

/"5"!" ��

A indução da activação da caspase-3 foi realizada com sucesso, utilizando o modelo

celular PC12 nas condições optimizadas por Oliveira et al. (2003). Nesta fase, apenas

foram testados os compostos FMA4 e FMA7. Apesar de possuírem uma menor

actividade anti-radicalar que os compostos FMA5 e FMA8, possuem uma maior

lipofilicidade, o que sugere que possam actuar de uma forma mais eficaz a nível

intracelular.

Como se observa na figura 16A, a incubação com staurosporina 1µM conduz a um

aumento significativo da actividade da caspase-3 de 3.63 ± 0.57 vezes, p < 0.001, sem

afectar significativamente a viabilidade neste modelo celular (resultados não

apresentados).

Na presença dos compostos FMA4 e FMA7 verificou-se redução da actividade da

enzima induzida pela staurosporina. Para ambos os compostos, os níveis de protecção

foram ligeiramente superiores aos evidenciados pelo �-tocoferol, o que revela uma

maior capacidade dos novos compostos para actuarem a nível das vias intracelulares

relacionadas com a indução da apoptose, impedindo a sua indução. No caso do FMA7,

o decréscimo é estatisticamente significativo tanto para o valor de CI50 (87.17%) como

para o valor de 2xCI50 (86.87%). Em relação ao FMA4, a protecção é de 89.62% e

74.61% para o CI50 e 2xCI50, respectivamente. Conclui-se assim que ambos os

compostos são igualmente efectivos em proteger a actividade da caspase, induzida por

STS, a concentrações na ordem dos 20 e 40µM, sendo essa protecção superior à

conseguida com o �-tocoferol.

No entanto, e como se observa na figura 16B esse efeito protector exige pré-

incubação, deixando de se verificar se a incubação com os compostos e a STS for

simultânea. Este facto pode ser explicado através do seu perfil de lipofilicidade (ver

tabela II). O seu carácter lipofílico não é suficientemente elevado, sendo necessária pré-

incubação de modo a que estes possam atravessar devidamente a membrana lipídica e

actuar a nível intracelular, prevenindo assim os efeitos deletérios do estímulo

apoptótico.


54

Foi analisada, através de microscopia de fluorescência, a capacidade para os novos

compostos em estudo protegerem as células dos efeitos deletérios induzidos pela

staurosporina. Para tal, as células foram incubadas durante o mesmo período de tempo e

A

B

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5

* *

Controlo

STS 1µM

Tocoferol 9.6µM

Tocoferol 19.2µM

FMA4 19.75µM

FMA4 39.5µM

FMA7 20.4µM

FMA7 40.8µM

+ STS 1µM

+++

*

Cliv

agem

do

Ac-

DE

VD

-pN

A(a

um

ento

rel

ativ

amen

te a

o c

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tro

lo)

0

1

2

3

4

5Controlo

STS 1µM

FMA4 19.75µM

FMA4 39.5µM

Cli

vag

em d

o A

c-D

EV

D-p

NA

(Au

men

to r

elat

ivam

ente

ao

co

ntr

olo

)

+++

Figura 16 – Avaliação da actividade da caspase-3 em células PC12. Os resultados estão expressos

como o aumento da clivagem do substrato colorimétrico Ac-DEVD-pNA, em relação a um controlo

contendo apenas células. As células foram incubadas com STS 1µM, durante 5 horas, em meio de

cultura com apenas 4% de soro. A: As células foram pré-incubadas na presença dos compostos

durante um período de 3 horas antes da adição da staurosporina. Nestas condições, os compostos

levaram à diminuição da actividade da caspase-3, superior à verificada com o �-tocoferol. B: Os

compostos foram incubados simultaneamente com a staurosporina, não revelando protecção. Para

cada coluna representa-se a média ± erro padrão de pelo menos 3 experiências independentes. A

análise estatística foi efectuada através do teste de t-student. * p < 0.05, em comparação com a

condição staurosporina 1µM. +++ p < 0.001, em comparação com o controlo contendo apenas células.


55

à mesma concentração de staurosporina utilizada para determinar a protecção na

actividade da caspase-3 (figura 17).

As células que apresentavam condensação da cromatina e fragmentação nuclear

foram consideradas como sendo apoptóticas. As percentagens de células viáveis, células

apoptóticas e células necróticas foram determinadas através da contagem de pelo menos

300 células por cada experiência.

Após a exposição das células a staurosporina 1µM (figura 17), foi possível observar

em média 17.0 ± 2.5% de células apoptóticas e 11.7 ± 2.0% de células necróticas. No

entanto, a pré-incubação das células com o composto FMA7, para uma concentração

igual ao CI50, foi responsável pela redução de células apoptóticas para 14.3 ± 1.2% e de

células necróticas para 4.7 ± 0.7%. Com o aumento da concentração de composto para o

dobro não se verificam grandes diferenças na protecção, sendo possível contar 12.0 ±

1.7% de células apoptóticas e 5.3 ± 0.9% de células necróticas. Nas células utilizadas

como controlo, a percentagem de células apoptóticas e necróticas foi inferior a 2%.

Estes resultados, que inequivocamente mostram protecção de morte celular, corroboram

a protecção anteriormente demonstrada para a actividade da caspase-3.

A caspase-3 é uma caspase efectora que pode ser proteoliticamente activada através

de duas vias: uma mediada por receptores de membrana e outra regulada a nível da

mitocôndria. A caspase-8 desempenha um papel fundamental na iniciação da via

mediada por receptores de membrana. Após ligação do ligando, os receptores

membranares agregam-se e formam complexos que vão recrutar várias moléculas de

pró-caspase-8, resultando na posterior activação de outras caspases. Por sua vez, a

caspase-9 desempenha um papel importante na via mitocondrial, onde necessita da

presença de outras moléculas, tais como a Apaf-1 e o citocromo c para a sua activação

(Hengartner, 2000).

Demonstrada a capacidade dos novos compostos para reduzir a actividade da

caspase-3, torna-se importante saber de que forma essa redução é atingida, ou seja,

sobre qual das vias apoptóticas (a iniciada pela caspase-8 ou a mediada pela caspase-9)

é que os compostos exercem o seu efeito protector de forma mais acentuada.


56

Figura 17 – Análise da condensação da cromatina em células da linha celular PC12. O composto

FMA4 foi pré-incubado durante 3 horas, antes da adição de STS 1µM, cujo estímulo foi mantido

durante 5 horas. A, B: controlo; C, D: STS 1µM; E, F: FMA7 CI50; G, H: FMA7 2xCI50; A, C, E e G:

células marcadas com o marcador Hoechst; B, D, F e H: sobreposição dos marcadores Hoechst e iodeto

de propídio. As setas a cheio indicam células necróticas, enquanto que as células a tracejado indicam

células em apoptose

A B

D

E F

G H

C


57

A actividade das enzimas aumentou 1.92 ± 0.32 vezes, p < 0.05 (caspase-8) e 1.98 ±

0.30 vezes, p < 0.05 (caspase-9) (figuras 18 e 19). O efeito dos compostos (figura 18) é

indicativo da sua actuação também a nível da via apoptótica mediada por receptores de

membrana, uma vez que são capazes de levar à redução da actividade da caspase-8

induzida por staurosporina. Os dois compostos (FMA4 e FMA7) são perfeitamente

semelhantes no nível de protecção e as duas concentrações testadas também não

revelam qualquer diferença. No entanto, a redução observada na presença dos

compostos não é tão pronunciada como no caso do �-tocoferol, em que a clivagem do

substrato colorimétrico desce para o nível do controlo contendo apenas células,

indicando que o �-tocoferol é eventualmente mais eficaz nessa via.

O aumento da clivagem do substrato colorimétrico Ac-LEHD-pNA, indicativo da

actividade da caspase-9, está representado na figura 19, onde é possível observar uma

ligeira protecção. Neste caso, a redução da actividade da enzima foi idêntica ao �-

tocoferol, responsável por um aumento de cerca de apenas 1.31 vezes para ambas as

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5 Controlo

STS 2µM

Tocoferol 9.6µM

Tocoferol 19.2µM

FMA4 19.75µM

FMA4 39.5µM

FMA7 20.4µM

FMA7 40.8µM

+ STS 2µM

+

Cli

vag

em d

o A

c-IE

TD

-pN

A(a

um

ento

rel

ativ

amen

te a

o c

on

tro

lo)

Figura 18 – Avaliação do efeito protector dos compostos na via mediada por receptores de

membrana. A actividade da caspase-8 foi induzida através de staurosporina 2µM, durante 5

horas, e os resultados expressos como o aumento da clivagem do substrato colorimétrico Ac-

IETD-pNA, em relação a um controlo contendo apenas células. Tanto o FMA4 como o FMA7

(pré-incubados durante 3 horas antes da adição de STS) levam a uma redução da actividade da

caspase-8, embora menor que o �-tocoferol. Nenhum dos compostos apresenta diferenças

significativas em relação ao controlo contendo staurosporina. Para cada coluna encontra-se

representada a média ± erro padrão. A análise estatística foi efectuada através do teste de t-

student. + p < 0.05, em comparação com o controlo contendo apenas células.


58

concentrações testadas. Estes resultados revelam que tanto os compostos em estudo

como o �-tocoferol parecem actuar a nível da via mitocondrial.

Utilizando o composto FMA7 como exemplo (figura 20), é possível concluir que

estes compostos possuem um efeito protector a nível da apoptose, verificado pelo

evidente decréscimo da actividade da caspase-3 induzida por staurosporina. Além disso,

é também possível acrescentar que essa protecção é exercida nas duas vias apoptóticas,

tanto na via mitocondrial como na via mediada por receptores de membrana, como

demonstrado pela diminuição da clivagem dos substratos colorimétricos específicos

para as caspases 8 e 9. A protecção exercida pelos compostos nestas duas vias é

semelhante, indicando que não existe uma via preferencial para levar à redução final da

actividade da caspase-3.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Tocoferol 9.6µM

Controlo

STS 2µM

Tocoferol 19.2µM

FMA4 19.75µM

FMA4 39.5µM

FMA7 20.4µM

FMA7 40.8µM

+ STS 2µM

Cli

vag

em d

o A

c-L

EH

D-p

NA

(au

men

to r

elat

ivam

ente

ao

co

ntr

olo

)

Figura 19 – Avaliação do efeito protector dos compostos na actividade da caspase-9. A actividade da

enzima foi induzida por staurosporina 2µM durante 5 horas e os resultados expressos como o

aumento da clivagem do substrato colorimétrico Ac-LEHD-pNA, em relação a um controlo contendo

apenas células. Os compostos FMA4 e FMA7, pré-incubados durante 3 horas, levaram a uma redução

da actividade da caspase-9, semelhante ao �-tocoferol. Nenhum dos compostos apresenta diferenças

significativas em relação ao controlo contendo staurosporina. Para cada coluna encontra-se

representada a média ± erro padrão. A análise estatística foi efectuada através do teste de t-student. +

p < 0.05, em comparação com o controlo contendo apenas células.


59

O facto de os níveis de protecção verificados serem maiores para a actividade da

caspase-3 do que para as caspases 8 e 9 poderá indicar que a redução final obtida para a

caspase-3 pode ser atingida através de outros mecanismos. Um desses mecanismos pode

ser a regulação do cálcio intracelular, cuja libertação é também induzida pela própria

staurosporina (Kruman et al., 1998). Sendo assim, para a elucidação dos efeitos

exercidos pelos compostos nas vias apoptóticas, impõem-se outro tipo de estudos, tais

como da regulação da libertação intracelular de cálcio.

/";" 4� ��.��

Um dos objectivos do trabalho prende-se com a eventual alteração da estrutura

química dos compostos, no sentido de optimizar o seu potencial, nomeadamente como

protectores de stresse oxidativo. A ciclização das suas estruturas fazia prever a obtenção

de compostos mais estáveis e com maior actividade anti-oxidante. Numa fase inicial

0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5

Controlo

STS 1µM

STS + FMA7 20.4µM

STS 2µM

Caspase-3(Ac-DEVD-pNA)

Caspase-8(Ac-IETD-pNA)

Caspase-9(Ac-LEHD-pNA)

+++

+ +

*

Cli

vag

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o s

ub

stra

to c

olo

rim

étri

co(a

um

ento

rel

ativ

amen

te a

o c

on

tro

lo)

Figura 20 – Protecção nas diferentes vias apoptóticas do composto FMA7. Este composto a

uma concentração de 20.4µM protege as células dos efeitos deletérios induzidos pela

staurosporina 1µM, quando incubada durante 5 horas. Para cada coluna representa-se a

média ± erro padrão. A análise estatística foi efectuada através do teste de t-student. * p <

0.05, em comparação com a condição staurosporina 1µM. + p < 0.05, +++ p < 0.001, em

comparação com o controlo contendo apenas células.


60

foram testados os compostos FMA698 e FMA699 (estruturas cíclicas correspondentes

aos compostos FMA4 e FMA7, respectivamente).

Os resultados na figura 21A mostram que a incubação com os compostos cíclicos na

presença do par oxidante provoca um aumento dos níveis de TBARS, em vez de levar à

sua diminuição, o que significa um efeito pró-oxidante em vez de anti-oxidante.

Além disso, verificou-se que os níveis de peroxidação lipídica aumentaram, mesmo

quando as células foram incubadas apenas na presença de um desses novos compostos

(figura 21B). Estes resultados indicam que os compostos, por si só, são capazes de

remover iões hidrogénio directamente aos radicais livres, sendo que para uma

concentração relativamente baixa de composto (200µM) os níveis de peroxidação

lipídica foram aumentados para aproximadamente metade dos níveis induzidos pelo par

oxidante ascorbato-ferro, que actua de uma forma indirecta, uma vez que primeiro o

ascorbato reduz o ferro, e só depois este é que leva à formação de radicais livres. Sendo

Asc 2mM/

Fe2+ 100µM+

FMA698 50µM

FMA698 200µM

FMA699 50µM

FMA699 200µM

Controlo

2mM Asc/100µM Fe2+

FMA698 200µM0

1

2

3

4

5

6

Nív

eis

de

TB

AR

S(n

mol

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g pr

oteí

na)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

Nív

eis

de

TBA

RS

(nm

ol /

mg

prot

eína

)

FMA698 50µM

A

B

Figura 21 – Níveis de peroxidação lipídica obtidos para os compostos cíclicos, na presença e na

ausência do par oxidante 2mM ascorbato/ 100µM Fe2+. As células PC12 foram incubadas com os

compostos nas condições descritas anteriormente. A: Na presença do par oxidante; B: na ausência

do par oxidante. A produção de MDA foi determinada pelo método de TBARS com correcção para

a quantidade de proteína utilizada em cada caso. Para cada coluna, expressa em nmol de

TBARS/mg de proteína, encontra-se representado a média ± erro padrão de pelo menos 2

experiências distintas.


61

assim, pode-se afirmar que os compostos de cadeia cíclica possuem um ligeiro efeito

pró-oxidante.

A ausência de actividade anti-oxidante por parte dos compostos de estrutura cíclica

foi confirmada através do teste de descoloração do DPPH, que por sua vez corrobora os

dados paralelamente obtidos por estudos de voltametria cíclica (Areias et al., 2004).

Tal como se pode verificar na tabela III, os compostos cíclicos revelaram uma

ausência de actividade anti-radicalar, visto que mesmo quando incubados a uma

concentração de 500µM, não foram capazes de levar à redução de 50% do radical

DPPH. De facto, a descoloração do radical DPPH foi praticamente nula para todos os

compostos, à excepção do FMA676 que levou a uma diminuição de aproximadamente

29% para a concentração de 500µM.

Tabela III – Valores de CI50 obtidos através do método de descoloração do DPPH, para os compostos

cíclicos testados.

Foram adicionadas diferentes concentrações de cada composto a uma solução etanólica de DPPH e a

descoloração do DPPH foi lida espectrofotometricamente a 517nm, após 40 minutos. Os resultados foram

expressos como a percentagem de descoloração de DPPH, em relação a um controlo positivo contendo

apenas uma solução etanólica de DPPH.

Os altos potenciais de oxidação-redução determinados posteriormente para estes

compostos através de testes de voltametria cíclica (dados gentilmente cedidos pelo

Departamento de Química da Universidade do Minho) (Areias et al., 2004) e

apresentados na tabela IV, estão de acordo com os resultados pelo teste de DPPH: os

compostos que não apresentaram actividade anti-radicalar, apresentaram potenciais

redox elevados.

Composto CI50 (µµµµM)

FMA523 > 500

FMA676 > 500

FMA698 > 500

FMA699 > 500

FMA705 > 500


62

Um composto anti-oxidante deve possuir um grupo com capacidade remotora de

electrões, de modo a que quando o composto perde um ião hidrogénio para um radical

livre, o electrão que fica desemparelhado na sua estrutura seja logo removido e a

molécula estabilizada. Caso contrário, os radicais livres poderiam começar a remover

outros iões hidrogénio da molécula, tornando-a bastante instável. O que acontece no

caso destes novos compostos é que com a ciclização da sua estrutura, o efeito do grupo

dicianoimidazole (grupo remotor que deveria levar à estabilização do grupo hidroxilo na

posição C-3), é bastante forte, estabilizando a estrutura e dificultando a doação do ião

hidrogénio a partir do grupo hidroxilo. Esta explicação é evidenciada pela análise dos

resultados obtidos para o composto FMA676 e a sua forma cíclica FMA705 (tabelas III

e IV), onde se verifica a ausência de actividade anti-radicalar até uma concentração de

500µM e potenciais de oxidação-redução elevados (0.476V para o FMA676 e 0.760V

para o FMA705) (Areias et al., 2004). É importante referir que um composto anti-

oxidante deverá ter um potencial redox situado entre os 0.3 e os 0.4V (van Acker et al.,

1996).

Tabela IV – Potenciais redox (Eoxi) para os novos compostos em estudo.

Composto Eoxi (V) Composto Eoxi (V)

Trolox 0.170 FMA676 0.476

FMA4 0.381 FMA698 0.732

FMA7 0.399 FMA699 0.800

FMA523 0.698 FMA705 0.760

Os compostos cíclicos (FMA523, FMA676, FMA698, FMA699 e FMA705) apresentam um

potencial redox elevado, o que faz prever a sua dificuldade em ceder um ião hidrogénio. Por outro lado, o

potencial redox baixo obtido para os compostos de cadeia linear (FMA4 e FMA7) e para o Trolox são

indicativos da sua capacidade para actuarem como anti-oxidantes (Areias et al., 2004).

No caso dos compostos FMA698 e FMA699 (estruturas cíclicas dos compostos

FMA4 e FMA7, respectivamente), a presença dos grupos metoxiamidina (FMA698) e

benzoxiamidina (FMA699) deveriam levar a uma redução dos potenciais redox, uma

vez que são grupos dadores, como se verifica no caso dos compostos de cadeia linear.

No entanto, com a ciclização das estruturas, o efeito dador desses grupos torna-se

irrelevante (os potenciais redox foram de 0.732V para o FMA698 e de 0.800V para o

FMA699), continuando o efeito remotor do grupo di-ciano a fazer-se sentir fortemente


63

(Areias et al., 2004). Essa ausência de efeito dos grupos dadores nos compostos cíclicos

é demonstrada pelos dados obtidos para o composto FMA523, que não possui nenhum

desses grupos e apresenta igualmente actividade anti-radicalar praticamente nula até

uma concentração de 500µM e um potencial redox bastante elevado (Eoxi = 0.698V).

Tendo como base os dados apresentados por van Acker et al. (1996), podemos

considerar estes compostos como neutros, ou seja, não funcionam como anti-oxidantes

nem como pró-oxidantes. De acordo com a mesma referência, para se considerar um

composto como pró-oxidante, o seu potencial redox deverá situar-se acima dos 0.9V.

/"?" -��

No que diz respeito aos compostos de cadeia linear, os estudos efectuados neste

trabalho deixaram algumas perspectivas para a sua utilização com fins terapêuticos,

nomeadamente como anti-oxidantes e protectores de vias apoptóticas. No entanto,

podem realizar-se alguns melhoramentos nas suas estruturas químicas que poderão

aumentar este potencial. Dados obtidos recentemente indicam que o potencial redox dos

compostos contendo dois grupos hidroxilo, um na posição C-3 e outro na posição C-4

(caso do FMA5 e do FMA8), é reduzido para metade, quando comparado com os

compostos que possuem apenas um grupo hidroxilo. A inclusão de um terceiro grupo

hidroxilo na posição C-5 parece igualmente promissora no aumento do potencial anti-

oxidante destes compostos. Além disso, e na continuação destes estudos, pretende-se

estudar o efeito protector destes novos compostos e seus derivados a nível dos danos

celulares causados no DNA (através da técnica de TUNEL) e nas proteínas (através da

quantificação dos grupos carbonilo). A avaliação do efeito protector dos novos

compostos na alteração da actividade de enzimas caracteristicamente associadas à

alteração das defesas anti-oxidantes naturais, como a superóxido dismutase (SOD), a

catalase, a glutationa redutase e a glutationa peroxidase poderá contribuir para a melhor

elucidação do potencial anti-oxidante dos novos compostos.

Os efeitos pró-oxidantes das formas cíclicas poderão vir a ser igualmente explorados

futuramente. É sabido que alguns fungos e a maioria das células tumorais possuem

níveis mais baixos de enzimas anti-oxidantes do que as células normais (Weydert et al.,

2003; Oberley e Oberley, 1997; Jamieson et al., 1996), sendo por isso mais susceptíveis

de sofrerem morte celular pelos efeitos de um composto com potencial pró-oxidante.


64

Por outro lado, moléculas como os imidazóis e os fenóis possuem efeitos anti-fúngicos,

anti-cancerígenos e mesmo anti-bacterianos bastante conhecidos, estando inclusive

algumas dessas moléculas já em uso clínico. Alguns exemplos conhecidos de imidazóis

são: o bifonazole, que possui actividade anti-micótica (Menozzi et al., 2004), o

cetoconozole, que é um anti-fúngico aprovado pela FDA para utilização como composto

activo de um conhecido champô anti-caspa (Parker et al., 2000), e o dacarbazine, que é

utilizado na terapia do melanoma maligno (Gogas et al., 2004). Como exemplos de

fenóis com uso terapêutico reconhecido temos o timol (Sanchez et al., 2004) e o

carvacrol (Nafisi et al., 2004). Uma vez que os imidazóis e os fenóis em separado

possuem elevadas actividades anti-fúngicas, anti-cancerígenas e anti-bacterianas, prevê-

se que a associação desses dois tipos de moléculas, presente nos compostos estudados,

resulte em compostos ainda mais potentes e com maior capacidade para poderem ser

utilizados como anti-fúngicos e anti-cancerígenos.

Mestrado em Genética Molecular Conclusões

65

2"2"2"2" 4��(��4��(��4��(��4��(��

A análise dos resultados obtidos ao longo do trabalho desenvolvido permitem

concluir que:

• Os compostos de cadeia linear possuem uma actividade anti-radicalar

elevada, determinada pelo método de descoloração do radical DPPH. No

caso do FMA5 e do FMA8 esta é mais elevada do que para os anti-oxidantes

tradicionais �-tocoferol e a sua forma hidrossolúvel Trolox.

• Os compostos de cadeia linear não apresentam toxicidade para as células:

nenhum deles causa alterações a nível da actividade redutora das células

(MTT) nem levam à perda da integridade membranar (LDH).

• O par oxidante ascorbato /Fe2+ foi o escolhido para a indução da peroxidação

lipídica nos dois modelos celulares usados: linha celular L929 e células

PC12. Além de induzir níveis superiores de produção de TBARS, não

compromete irreversivelmente a viabilidade celular.

• Os compostos testados evidenciaram um perfil protector da peroxidação

lipídica induzida por este par oxidante para concentrações da ordem do CI50.

O efeito protector verificado, nomeadamente para os compostos FMA4 e

FMA7, correlaciona-se com a respectiva solubilidade em lípidos. Em células

PC12 a capacidade anti-oxidante destes compostos é claramente superior ao

Trolox, mas inferior ao �-tocoferol (protecção na peroxidação lipídica

induzida pelo par ascorbato/Fe2+, de cerca de 50%), confirmando a sua

capacidade para reverter os danos a nível da membrana plasmática.

• Igualmente relacionado com o seu perfil de lipofilicidade são os resultados

de protecção das vias apoptóticas induzidas pela staurosporina. Na verdade o

efeito protector dos compostos apenas se verificou quando estes foram pré-

incubados durante um período de 3 horas antes da adição de staurosporina. O

Mestrado em Genética Molecular Conclusões

66

período de pré-incubação é necessário para os compostos penetrarem na

membrana plasmática e poderem actuar intracelularmente.

• O envolvimento das diferentes vias apoptóticas na morte celular induzida

por staurosporina foi avaliada por activação das caspases 3, 8 e 9. Os

compostos mais activos, FMA4 e FMA7, revelaram-se especialmente

efectivos na reversão da actividade da caspase-3. No entanto para a

protecção verificada nesta caspase efectora parece contribuir, ainda que

moderadamente, a protecção verificada tanto a nível da via mitocondrial,

mediada pela caspase-9, como da via mediada por receptores membranares,

iniciada pela caspase-8.

• A protecção a nível da apoptose foi confirmada através de microscopia de

fluorescência, utilizando os marcadores Hoechst e iodeto de propídio. Os

resultados mostram que, na presença de staurosporina 1µM, e após pré-

incubação com o composto (FMA7), a uma concentração de 20.4 µM (CI50),

se verifica uma redução de células apoptóticas para 14.3 ± 1.2% e de células

necróticas para 4.7 ± 0.7%.

• A ciclização das estruturas dos novos compostos fazia prever compostos

com uma actividade anti-oxidante superior. No entanto, os compostos

cíclicos, FMA698 (forma cíclica de FMA4) e FMA699 (forma cíclica de

FMA7) levam a um ligeiro aumento dos níveis de peroxidação lipídica. A

ausência de efeito anti-oxidante por parte dos compostos cíclicos ficou

adicionalmente demonstrada através da incapacidade para reduzir o radical

DPPH até uma concentração de 500µM e pelos elevados potenciais de

oxidação-redução, determinados por voltametria cíclica.

O potencial terapêutico destes compostos, como agentes pró-oxidantes,

continua a ser investigado.

Mestrado em Genética Molecular Referências bibliográficas

67

5"5"5"5" 3��C��3��C��3��C��3��C��

Areias, F. M., Bettencourt, A. P., Coutinho, O. P., Fernandes, F., Proença, M. F. e Silva, J. P., Antioxidant

Activity of Phenol Incorporated in Nitrogen-Containing Compounds (2004) - 1st International

Congress on Antioxidant Methods, USA - Poster

Areias, F. M., Rego, C., Oliveira, C. e Seabra, R. M., Antioxidant Effect of Flavonoids After

Ascorbate/Fe2+-Induced Oxidative Stress in Cultured Retinal Cells, Biochemical Pharmacoloy, vol.

62 (2001), pp. 111-118

Arnao, M., Some Methodological Problems in the Determination of Antioxidant Activitiy Using

Chromogen: Radicals: a Practical Case, Trends in Food Science & Technology, vol. 11 (2002)

Arrigoni, O. e De Tullio, M. C., Ascorbic Acid: Much More Than Just an Antioxidant, Biochim. Biophys.

Acta, vol. 1569, n.º 1-3 (2002), pp. 1-9

Bastianetto, S. e Quirion, R., Natural Extracts As Possible Protective Agents of Brain Aging,

Neurobiology of Aging, n.º 5687 (2002), pp. 1-7

Beal, M. F., Oxidatively Modified Proteins in Aging and Disease, Free Radic. Biol. Med., vol. 32, n.º 9

(2002), pp. 797-803

Beckman, K. B. e Ames, B. N., The Free Radical Theory of Aging Matures, Physiol Rev, vol. 78, n.º 2

(1998), pp. 547-581

Behl, C., Alzheimer's Disease and Oxidative Stress: Implications for Novel Therapeutic Approaches,

Prog. Neurobiol., vol. 57, n.º 3 (1999), pp. 301-323

Behl, C. e Moosmann, B., Antioxidant Neuroprotection in Alzheimer's Disease As Preventive and

Therapeutic Approach, Free Radic. Biol Med., vol. 33, n.º 2 (2002), pp. 182-191

Belmokhtar, C. A., Hillion, J. e Ségal-Bendirdjian, E., Staurosporine Induces Apoptosis Through Both

Caspase-Dependent and Caspase-Independent Mechanisms, Oncogene, vol. 20 (2001), pp. 3354-

3362

Berlett, B. S. e Stadtman, E. R., Protein Oxidation in Aging, Disease, and Oxidative Stress, J. Biol.

Chem., vol. 272, n.º 33 (1997), pp. 20313-20316

Bhat, K., Garg, A. e Bock, C., Calculated Values of the Octanol–Water Partition Coefficient and

Aqueous Solubility for Aminoazobenzene Dyes and Related Structures, Dyes and Pigments, vol. 52

(2002), pp. 145-159


68

Bonnefont, A. B., Munoz, F. J. e Inestrosa, N. C., Estrogen Protects Neuronal Cells From the

Cytotoxicity Induced by Acetylcholinesterase-Amyloid Complexes, FEBS Lett., vol. 441, n.º 2 (1998),

pp. 220-224

Boulares, A. H., Yakovlev, A. G., Ivanova, V., Stoica, B. A., Wang, G., Iyer, S. e Smulson, M., Role of

Poly(ADP-Ribose) Polymerase (PARP) Cleavage in Apoptosis. Caspase 3-Resistant PARP Mutant

Increases Rates of Apoptosis in Transfected Cells, J Biol Chem., vol. 274, n.º 33 (1999), pp. 22932-

22940

Brody, T., Larner, J. e Minneman, K., Human Pharmacology: Molecular to Clinical, 3ª edição, (1998),

Brody, T., Larner, J. e Minneman, K., Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, Missouri

Cain, K., Bratton, S. B. e Cohen, G. M., The Apaf-1 Apoptosome: a Large Caspase-Activating Complex,

Biochimie, vol. 84, n.º 2-3 (2002), pp. 203-214

Cande, C., Cohen, I., Daugas, E., Ravagnan, L., Larochette, N., Zamzami, N. e Kroemer, G., Apoptosis-

Inducing Factor (AIF): a Novel Caspase-Independent Death Effector Released From Mitochondria,

Biochimie, vol. 84, n.º 2-3 (2002), pp. 215-222

Cardoso, S. M., Pereira, C. e Oliveira, C. R., The Protective Effect of Vitamin E, Idebenone and Reduced

Glutathione on Free Radical Mediated Injury in Rat Brain Synaptosomes, Bioch. Biophys. Res.

Comm., vol. 246 (1998), pp. 703-710

Chandra, J., Samali, A. e Orrenius, S., Triggering and Modulation of Apoptosis by Oxidative Stress, Free

Radic. Biol Med., vol. 29, n.º 3-4 (2000), pp. 323-333

Chen, J., Nagayama, T., Jin, K., Stetler, R. A., Zhu, R. L., Graham, S. H. e Simon, R. P., Induction of

Caspase-3-Like Protease May Mediate Delayed Neuronal Death in the Hippocampus After Transient

Cerebral Ischemia, J Neurosci., vol. 18, n.º 13 (1998), pp. 4914-4928

Chepda, T., Cadau, M., Lassabliere, F., Reynaud, E., Perier, C., Frey, J. e Chamson, A., Synergy Between

Ascorbate and Alpha-Tocopherol on Fibroblasts in Culture, Life Sci., vol. 69, n.º 14 (2001), pp.

1587-1596

Choi, J., Malakowsky, C. A., Talent, J. M., Conrad, C. C., Carroll, C. A., Weintraub, S. T. e Gracy, R.

W., Anti-Apoptotic Proteins Are Oxidized by Ah25–35 in Alzheimer's Fibroblasts, Biochim. Biophys.

Acta, vol. 1637 (2003), pp. 135-141

Cregan, S. P., MacLaurin, J. G., Craig, C. G., Robertson, G. S., Nicholson, D. W., Park, D. S. e Slack, R.

S., Bax-Dependent Caspase-3 Activation Is a Key Determinant in P53-Induced Apoptosis in

Neurons, J Neurosci., vol. 19, n.º 18 (1999), pp. 7860-7869


69

Curti, D., Rognoni, F., Gasparini, L., Cattaneo, A., Paolillo, M., Racchi, M., Zani, L., Bianchetti, A.,

Trabucchi, M., Bergamaschi, S. e Govoni, S., Oxidative Metabolism in Cultured Fibroblasts Derived

From Sporadic Alzheimer's Disease (AD) Patients, Neurosci. Lett., vol. 236, n.º 1 (1997), pp. 13-16

Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., Milzani, A. e Colombo.R., Protein Carbonyl Groups As

Biomarkers of Oxidative Stress, Clinica Chimica Acta, vol. 329 (2003), pp. 23-38

Dalton, T. P., Shertzer, H. G. e Puga, A., Regulation of Gene Expression by Reactive Oxygen, Annu Rev

Pharmacol Toxicol, vol. 39 (1999), pp. 67-101

Darzynkiewicz, Z., Juan, G., Gorczyca, W., Murakami, T. e Traganos, F., Cytometry in Cell

Necrobiology: Analysis of Apoptosis and Accidental Cell Death (Necrosis), Cytometry, vol. 27, n.º 1

(1997), pp. 1-20

Drexler, H. G., Matsuo, A. Y. e MacLeod, R. A., Continuous Hematopoietic Cell Lines As Model Systems

for Leukemia-Lymphoma Research, Leuk. Res., vol. 24, n.º 11 (2000), pp. 881-911

du Toit, R., Volsteedt, Y. e Apostolides, Z., Comparison of the Antioxidant Content of Fruits, Vegetables

and Teas Measured As Vitamin C Equivalents, Toxicology, vol. 166, n.º 1-2 (2001), pp. 63-69

Eaton, J. W. e Qian, M., Molecular Bases of Cellular Iron Toxicity, Free Radic. Biol. Med., vol. 32, n.º 9

(2002), pp. 833-840

Fagan, J., Sleczka, B. G. e Sohar, I., Quantitation of Oxidative Damage to Tissue Proteins~, Int J

Biochem Cell Biol, vol. 31 (1999), pp. 751-757

Ferri, K. F. e Kroemer, G., Organelle-Specific Initiation of Cell Death Pathways, Nat. Cell Biol, vol. 3,

n.º 11 (2001), E255-E263

Freshney, R. I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3ª edição, (1994), John Wiley &

Sons, Inc., New York

Fuchs, J., Potentials and Limitations of the Natural Antioxidants RRR-Alpha-Tocopherol, L-Ascorbic

Acid and Beta-Carotene in Cutaneous Photoprotection, Free Radic. Biol. Med., vol. 25, n.º 7 (1998),

pp. 848-873

German, J. B. e Walzem, R., The Health Benefits of Wine, Annu Rev Nutr, vol. 20 (2000), pp. 561-593

Gogas, H., Bafaloukos, D. e Bedikian, A. Y., The Role of Taxanes in the Treatment of Metastatic

Melanoma, Melanoma Res., vol. 14, n.º 5 (2004), pp. 415-420

Greene, L. A. e Tischler, A. S., Establishment of a Noradrenergic Clonal Line of Rat Adrenal

Pheochromocytoma Cells Which Respond to Nerve Growth Factor, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A,

vol. 73, n.º 7 (1976), pp. 2424-2428


70

Halliwell, B. e Gutteridge, J. M. C., Free Radicals in Biology and Medicine, 3ª edição, (1999), Halliwell,

B. e Gutteridge, J. M. C., Oxford University Press, New York

Hengartner, M. O., The Biochemistry of Apoptosis, Nature, vol. 407, n.º 6805 (2000), pp. 770-776

Humphreys, D. T. e Wilson, M. R., Modes of L929 Cell Death Induced by TNF-Alpha and Other

Cytotoxic Agents, Cytokine, vol. 11, n.º 10 (1999), pp. 773-782

Hutchins, J. B. e Barger, S. W., Why Neurons Die: Cell Death in the Nervous System, Anat. Rec., vol.

253, n.º 3 (1998), pp. 79-90

Jamieson, D. J., Stephen, D. e Terriere, E. C., Analysis of the Adaptive Oxidative Stress Response of

Candida Albicans, FEMS Microbiology Letters, vol. 138 (1996), pp. 83-88

Jang, J. H., Aruoma, O. I., Jen, L. S., Chung, H. Y. e Surh, Y. J., Ergothioneine Rescues PC12 Cells

From Beta-Amyloid-Induced Apoptotic Death, Free Radic. Biol Med., vol. 36, n.º 3 (2004), pp. 288-

299

Jin, Z. Q. e Chen, X., A Simple Reproducible Model of Free Radical-Injured Isolated Heart Induced by

1,1-Diphenyl-2-Picryl-Hydrazyl (DPPH), J. Pharmacol. Toxicol. Methods, vol. 39, n.º 2 (1998), pp.

63-70

Katayama, H., Demitsu, T. e Yaoita, H., Biological and Biochemical Responses of Skin Fibroblast to

Oxidative Stress Induced by Fe3+-Ascorbate, Dermatologica, vol. 179 Suppl 1 (1989), 142

Kelley, E., Wagner, B., Buettner, G. e Burns, C., Nitric Oxide Inhibits Iron-Induced Lipid Peroxidation in

HL-60 Cells, Arch. Biochem. Biophys., vol. 370, n.º 1 (1999), pp. 97-104

Kim, E. H., Jang, M. H., Shin, M. C., Shin, M. S. e Kim, C. J., Protective Effect of Aqueous Extract of

Ginseng Radix Against 1-Methyl-4-Phenylpyridinium-Induced Apoptosis in PC12 Cells, Biol Pharm.

Bull., vol. 26, n.º 12 (2003), pp. 1668-1673

Krammer, P. H., CD95's Deadly Mission in the Immune System, Nature, vol. 407, n.º 6805 (2000), pp.

789-795

Krohn, A. J., Preis, E. e Prehn, J. H., Staurosporine-Induced Apoptosis of Cultured Rat Hippocampal

Neurons Involves Caspase-1-Like Proteases As Upstream Initiators and Increased Production of

Superoxide As a Main Downstream Effector, J Neurosci., vol. 18, n.º 20 (1998), pp. 8186-8197

Kruman, I., Guo, Q. e Mattson, M. P., Calcium and Reactive Oxygen Species Mediate Staurosporine-

Induced Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis in PC12 Cells, J Neurosci. Res., vol. 51, n.º 3

(1998), pp. 293-308


71

Lebeau, J., Furman, C., Bernier, J. L., Duriez, P., Teissier, E. e Cotelle, N., Antioxidant Properties of Di-

Tert-Butylhydroxylated Flavonoids, Free Radic. Biol. Med., vol. 29, n.º 9 (2000), pp. 900-912

Lehuédé, J., Fauconneau, B., Barrier, L., Ourakow, M., Piriou, A. e Vierfond, J.-M., Synthesis and

Antioxidant Activity of New Tetraarylpyrroles, Eur. J. Med. Chem., vol. 34 (1999), pp. 991-996

Leist, M. e Jaattela, M., Four Deaths and a Funeral: From Caspases to Alternative Mechanisms, Nat.

Rev Mol. Cell Biol, vol. 2, n.º 8 (2001), pp. 589-598

Leonard, M., Noy, N. e Zakim, D., The Interactions of Bilirubin With Model and Biological Membranes,

J. Biol. Chem., vol. 264, n.º 10 (1989), pp. 5648-5652

Levi, S., Santambrogio, P., Corsi, B., Cozzi, A. e Arosio, P., Evidence That Residues Exposed on the

Three-Fold Channels Have Active Roles in the Mechanism of Ferritin Iron Incorporation, Biochem.

J., vol. 317 ( Pt 2) (1996), pp. 467-473

Liu, Y., Understanding the Biological Activity of Amyloid Proteins in Vitro: From Inhibited Cellular

MTT Reduction to Altered Cellular Cholesterol Homeostatis, Prog. Neuropsychopharmacol. Biol.

Psychiatry, vol. 23, n.º 3 (1999), pp. 377-395

Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y. e Zuo, J., Glucose Deprivation Induces Mitochondrial

Dysfunction and Oxidative Stress in PC12 Cell Line, J Cell Mol. Med., vol. 7, n.º 1 (2003), pp. 49-56

Lopez-Lluch, G., Buron, M. I., Alcain, F. J., Quesada, J. M. e Navas, P., Redox Regulation of CAMP

Levels by Ascorbate in 1,25-Dihydroxy- Vitamin D3-Induced Differentiation of HL-60 Cells,

Biochem. J., vol. 331 ( Pt 1) (1998), pp. 21-27

Lovell, M. A., Xie, C. e Markesbery, W. R., Acrolein, a Product of Lipid Peroxidation, Inhibits Glucose

and Glutamate Uptake in Primary Neuronal Cultures, Free Radic. Biol. Med., vol. 29, n.º 8 (2000),

pp. 714-720

Markesbery, W. R., Oxidative Stress Hypothesis in Alzheimer's Disease, Free Radic. Biol. Med., vol. 23,

n.º 1 (1997), pp. 134-147

Mathiesen, L., Malterud, K. E. e Sund, R. B., Hydrogen Bond Formation As Basis for Radical

Scavenging Activity: a Structure-Activity Study of C-Methylated Dihydrochalcones From Myrica

Gale and Structurally Related Acetophenones, Free Radic. Biol. Med., vol. 22, n.º 1-2 (1997), pp.

307-311

McKeehan, W. L., Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-free Animal

Cell Culture, (1984), A.R. Liss, New York

Meagher, E. A. e Fitzgerald, G. A., Indices of Lipid Peroxidation in Vivo: Strengths and Limitations, Free

Radic. Biol. Med., vol. 28, n.º 12 (2000), pp. 1745-1750


72

Menozzi, G., Merello, L., Fossa, P., Schenone, S., Ranise, A., Mosti, L., Bondavalli, F., Loddo, R.,

Murgioni, C., Mascia, V., La Colla, P. e Tamburini, E., Synthesis, Antimicrobial Activity and

Molecular Modeling Studies of Halogenated 4-[1H-Imidazol-1-Yl(Phenyl)Methyl]-1,5-Diphenyl-1H-

Pyrazoles, Bioorg. Med. Chem., vol. 12, n.º 20 (2004), pp. 5465-5483

Minotti, G. e Aust, S. D., The Requirement for Iron (III) in the Initiation of Lipid Peroxidation by Iron

(II) and Hydrogen Peroxide, J. Biol. Chem., vol. 262, n.º 3 (1987), pp. 1098-1104

Miranda, S., Opazo, C., Larrondo, L. F., Munoz, F. J., Ruiz, F., Leighton, F. e Inestrosa, N. C., The Role

of Oxidative Stress in the Toxicity Induced by Amyloid Beta-Peptide in Alzheimer's Disease, Prog.

Neurobiol., vol. 62, n.º 6 (2000), pp. 633-648

Mosmann, T., Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation

and Cytotoxicity Assays, J Immunol. Methods, vol. 65, n.º 1-2 (1983), pp. 55-63

Multhaup, G., Ruppert, T., Schlicksupp, A., Hesse, L., Beher, D., Masters, C. L. e Beyreuther, K.,

Reactive Oxygen Species and Alzheimer's Disease, Biochem. Pharmacol., vol. 54, n.º 5 (1997), pp.

533-539

Nafisi, S., Hajiakhoondi, A. e Yektadoost, A., Thymol and Carvacrol Binding to DNA: Model for Drug-

DNA Interaction, Biopolymers, vol. 74, n.º 5 (2004), pp. 345-351

Nenadis, N., Zafiropoulou, I. e Tsimidou, M., Commonly Used Food Antioxidants: a Comparative Study

in Dispersed Systems, Food Chemistry, vol. 82 (2003), pp. 403-407

Noctor, G. e Foyer, C., Ascorbate and Glutathione: Keeping Active Oxygen Under Control, Annu. Rev.

Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 49 (1998), pp. 249-279

Nordberg, J. e Arner, E. S., Reactive Oxygen Species, Antioxidants, and the Mammalian Thioredoxin

System, Free Radic. Biol. Med., vol. 31, n.º 11 (2001), pp. 1287-1312

Oberley, T. D. e Oberley, L. W., Antioxidant Enzyme Levels in Cancer, Histol. Histopathol., vol. 12, n.º 2

(1997), pp. 525-535

Ohkawa, H., Ohishi, N. e Yagi, K., Assay for Lipid Peroxides in Animal Tissues by Thiobarbituric Acid

Reaction, Anal. Biochem., vol. 95, n.º 2 (1979), pp. 351-358

Okawa, M., Kinjo, J., Nohara, T. e Ono, M., DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl) Radical Scavenging

Activity of Flavonoids Obtained From Some Medicinal Plants, Biol. Pharm. Bull., vol. 24, n.º 10

(2001), pp. 1202-1205

Oliveira, M. T., Rego, A. C., Morgadinho, M. T., Macedo, T. R. e Oliveira, C. R., Toxic Effects of Opioid

and Stimulant Drugs on Undifferentiated PC12 Cells, Ann. N. Y. Acad. Sci., vol. 965 (2002), pp.

487-496


73

Paine, R. e Ward, P. A., Cell Adhesion Molecules and Pulmonary Fibrosis, Am. J. Med., vol. 107, n.º 3

(1999), pp. 268-279

Parejo, I., Codina, C., Petrakis, C. e Kefalas, P., Evaluation of Scavenging Activity Assessed by

Co(II)/EDTA-Induced Luminol Chemiluminescence and DPPH* (2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl)

Free Radical Assay, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, vol. 44, n.º 3 (2000), pp. 507-512

Parker, R. S., Sontag, T. J. e Swanson, J. E., Cytochrome P4503A-Dependent Metabolism of Tocopherols

and Inhibition by Sesamin, Biochem Biophys. Res. Commun., vol. 277, n.º 3 (2000), pp. 531-534

Percival, M. D., Human 5-Lipoxygenase Contains an Essential Iron, J. Biol. Chem., vol. 266, n.º 16

(1991), pp. 10058-10061

Pereira, C., Santos, M. S. e Oliveira, C., Involvement of Oxidative Stress on the Impairment of Energy

Metabolism Induced by Ab Peptides on PC12 Cells: Protection by Antioxidants, Neurobiology of

Disease, vol. 6 (1999), pp. 209-219

Reed, J. C., Apoptosis-Regulating Proteins As Targets for Drug Discovery, Trends Mol. Med., vol. 7, n.º

7 (2001), pp. 314-319

Rego, A. C., Santos, M. S., Proenca, M. T. e Oliveira, C. R., Influence of Vitamin E Succinate on Retinal

Cell Survival, Toxicology, vol. 128, n.º 2 (1998), pp. 113-124

Rogachev, I., Serra, C., Farran, A., Cortina, J. L., Gressel, J. e Warshawsky, A., Prediction of the

Octanol–Water Distribution of Dithiocarbamate Derivatives, Reactive & Functional Polymers, vol.

54 (2003), pp. 17-24

Roguet, R. e Schaefer, H., Overview of In Vitro Cell Culture Technologies and Pharmaco-Toxicological

Applications, Toxicology In Vitro, vol. 11 (1997), pp. 591-599

Ruegg, U. T. e Burgess, G. M., Staurosporine, K-252 and UCN-01: Potent but Nonspecific Inhibitors of

Protein Kinases, Trends Pharmacol Sci., vol. 10, n.º 6 (1989), pp. 218-220

Saija, A., Scalese, M., Lanza, M., Marzullo, D., Bonina, F. e Castelli, F., Flavonoids As Antioxidant

Agents: Importance of Their Interaction With Biomembranes , Free Radic. Biol Med., vol. 19 (1995),

pp. 481-486

Sakagami, H., Satoh, K., Fukuchi, K., Gomi, K. e Takeda, M., Effect on an Iron-Chelator on Ascorbate-

Induced Cytotoxicity, Free Radic. Biol. Med., vol. 23, n.º 2 (1997), pp. 260-270

Sanchez, M. E., Turina, A., V, Garcia, D. A., Nolan, M. V. e Perillo, M. A., Surface Activity of Thymol:

Implications for an Eventual Pharmacological Activity, Colloids Surf. B Biointerfaces., vol. 34, n.º 2

(2004), pp. 77-86


74

Sapan, C. V., Lundblad, R. L. e Price, N. C., Colorimetric Protein Assay Techniques, Biotechnol. Appl.

Biochem., vol. 29 ( Pt 2) (1999), pp. 99-108

Schroeter, H., Williams, R. J., Matin, R., Iversen, L. e Rice-Evans, C. A., Phenolic Antioxidants Attenuate

Neuronal Cell Death Following Uptake of Oxidized Low-Density Lipoprotein, Free Radic. Biol.

Med., vol. 29, n.º 12 (2000), pp. 1222-1233

Scott, D. e Cleymer, J., Estimation of Distribution Coefficients From the Partition Coefficient and pKa,

Pharmaceutical Technology (2002), pp. 30-40

Sedmak, J. J. e Grossberg, S. E., A Rapid, Sensitive, and Versatile Assay for Protein Using Coomassie

Brilliant Blue G250, Anal. Biochem, vol. 79, n.º 1-2 (1977), pp. 544-552

Shapiro, S. S. e Saliou, C., Role of Vitamins in Skin Care, Nutrition, vol. 17, n.º 10 (2001), pp. 839-844

Sharma, P. e Morgan, P., Ascorbate Reduces Superoxide Production and Improves Mitochondrial

Respiratory Chain Function in Human Fibroblasts With Electron Transport Chain Deficiencies,

Mitochondrion, vol. 1 (2001), pp. 191-198

Silva, J. P., Santos, M. L., Areias, F. M. e Coutinho, O. P., Protective Effects of Newly Synthesised

Nitrogen Compounds on Oxidative Stress Induced in a Rat Fibroblast Cell Line, 1st Luso-Spanish

Congress on Free Radicals & 6th Portuguese Congress on Free Radicals in Chemistry, Biology and

Medicine (2003) - Poster

Slee, E. A., Adrain, C. e Martin, S. J., Serial Killers: Ordering Caspase Activation Events in Apoptosis,

Cell Death. Differ., vol. 6, n.º 11 (1999), pp. 1067-1074

Spiteller, G., Lipid Peroxidation in Aging and Age-Dependent Diseases, Exp. Gerontol., vol. 36 (2001),

pp. 1425-1457

Spiteller, P. e Spiteller, G., 9-Hydroxy-10,12-Octadecadienoic Acid (9-HODE) and 13-Hydroxy-9,11-

Octadecadienoic Acid (13-HODE): Excellent Markers for Lipid Peroxidation, Chemistry and

Physics of Lipids, vol. 89 (1997), pp. 131-139

Steenbergen, R. H., Drummen, G. P., Op den Kamp, J. A. e Post, J. A., The Use of Cis-Parinaric Acid to

Measure Lipid Peroxidation in Cardiomyocytes During Ischemia and Reperfusion, Biochim.

Biophys. Acta, vol. 1330, n.º 2 (1997), pp. 127-137

Stefanis, L., Park, D. S., Yan, C. Y., Farinelli, S. E., Troy, C. M., Shelanski, M. L. e Greene, L. A.,

Induction of CPP32-Like Activity in PC12 Cells by Withdrawal of Trophic Support. Dissociation

From Apoptosis, J Biol Chem., vol. 271, n.º 48 (1996), pp. 30663-30671

Stryer, L., Biochemistry, 4ª edição, (1998), W. H. Freeman and Company, New York


75

Supino, R., MTT Assays in Methods in Molecular Biology: In Vitro Toxicity Testing Protocols, O'Hara, S.

e Atterwill, C. K., Human Press Inc., Totowa, NJ, (1995)

Tang, D., Lahti, J. M. e Kidd, V. J., Caspase-8 Activation and Bid Cleavage Contribute to MCF7

Cellular Execution in a Caspase-3-Dependent Manner During Staurosporine-Mediated Apoptosis, J

Biol Chem., vol. 275, n.º 13 (2000a), pp. 9303-9307

Tang, L., Zhang, Y., Qian, Z. e Shen, X., The Mechanism of Fe(2+)-Initiated Lipid Peroxidation in

Liposomes: the Dual Function of Ferrous Ions, the Roles of the Pre-Existing Lipid Peroxides and the

Lipid Peroxyl Radical, Biochem. J., vol. 352 Pt 1 (2000b), pp. 27-36

van Acker, S. A., van den Berg, D. J., Tromp, M. N., Griffioen, D. H., van Bennekom, W. P., van der

Vijgh, W. J. e Bast, A., Structural Aspects of Antioxidant Activity of Flavonoids, Free Radic. Biol

Med., vol. 20, n.º 3 (1996), pp. 331-342

Viswanath, V., Wu, Y., Boonplueang, R., Chen, S., Stevenson, F. F., Yantiri, F., Yang, L., Beal, M. F. e

Andersen, J. K., Caspase-9 Activation Results in Downstream Caspase-8 Activation and Bid

Cleavage in 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine-Induced Parkinson's Disease, J

Neurosci., vol. 21, n.º 24 (2001), pp. 9519-9528

Wajant, H., The Fas Signaling Pathway: More Than a Paradigm, Science, vol. 296, n.º 5573 (2002), pp.

1635-1636

Westerink, R. H., Klompmakers, A. A., Westenberg, H. G. e Vijverberg, H. P., Signaling Pathways

Involved in Ca2+- and Pb2+-Induced Vesicular Catecholamine Release From Rat PC12 Cells, Brain

Res., vol. 957, n.º 1 (2002), pp. 25-36

Weydert, C., Roling, B., Liu, J., Hinkhouse, M. M., Ritchie, J. M., Oberley, L. W. e Cullen, J. J.,

Suppression of the Malignant Phenotype in Human Pancreatic Cancer Cells by the Overexpression

of Manganese Superoxide Dismutase, Mol. Cancer Ther., vol. 2, n.º 4 (2003), pp. 361-369

Yokozawa, T., Chen, C. P., Dong, E., Tanaka, T., Nonaka, G. I. e Nishioka, I., Study on the Inhibitory

Effect of Tannins and Flavonoids Against the 1,1-Diphenyl-2 Picrylhydrazyl Radical, Biochem.

Pharmacol., vol. 56, n.º 2 (1998), pp. 213-222

Zeng, Y., Han, X. e Gross, R., Phospholipid-Subclass-Specific Partitioning of Lipophilic Ions in

Membrane–Water Systems, Biochem. J., vol. 338 (1999), pp. 651-658

Zimmermann, K. C., Bonzon, C. e Green, D. R., The Machinery of Programmed Cell Death, Pharmacol

Ther., vol. 92, n.º 1 (2001), pp. 57-70

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