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(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】

　β４ＧａｌＮＡｃＴ３、ＭＧＡＴ５、ｇａｌｅｃｔｉｎ３、ｇａｌｅｃｔｉｎ７、Ｇｌ

ｃＣｅｒ　ｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｃｏｒｅ１β３ＧａｌＴ１及びβ３ＧｌｃＮＡｃＴＶから

なる群から選ばれる糖鎖関連遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する胚様

体分化制御剤。

【請求項２】

　β４ＧａｌＮＡｃＴ３の発現を抑制する核酸を有効成分として含有し、胚様体の未分化

性を解除するために用いられる、請求項１に記載の胚様体分化制御剤。

【請求項３】

　胚様体の外胚葉への分化を抑制し、内胚葉への分化を促進するために用いられる、請求

項２に記載の胚様体分化制御剤。

【請求項４】

　有効成分がｓｉＲＮＡ又は該ｓｉＲＮＡの発現ベクターである、請求項１～３のいずれ

か１項に記載の胚様体分化制御剤。

【請求項５】

　胚様体が哺乳類のＥＳ細胞に由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の胚様体分

化制御剤。

【請求項６】

　幹細胞に対してβ４ＧａｌＮＡｃＴ３、ＭＧＡＴ５、ｇａｌｅｃｔｉｎ３、ｇａｌｅｃ

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ｔ ｉ ｎ ７ 、 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 及 び β ３ Ｇ ｌ ｃ

Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ か ら な る 群 か ら 選 ば れ る 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 を 導 入 し 、 該 幹

細 胞 に 由 来 す る 胚 様 体 の 分 化 を 制 御 す る 、 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 。

【 請 求 項 ７ 】

　 幹 細 胞 に 対 し て β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 を 導 入 し 、 該 幹 細 胞 に 由 来

す る 胚 様 体 の 未 分 化 性 を 解 除 す る 、 請 求 項 ６ に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 。

【 請 求 項 ８ 】

　 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 し 、 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る 、 請 求 項 ７ に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制

御 方 法 。

【 請 求 項 ９ 】

　 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 が ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 又 は 該 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ の 発 現 ベ ク タ ー で

あ る 、 請 求 項 ６ ～ ８ の い ず れ か １ 項 に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 。

【 請 求 項 １ ０ 】

　 幹 細 胞 が 哺 乳 類 の Ｅ Ｓ 細 胞 で あ る 、 請 求 項 ６ ～ ９ の い ず れ か １ 項 に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制

御 方 法 。

【 請 求 項 １ １ 】

　 請 求 項 ６ ～ １ ０ の い ず れ か １ 項 に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 で 分 化 制 御 さ れ た 細 胞 。

【 発 明 の 詳 細 な 説 明 】

【 技 術 分 野 】

【 ０ ０ ０ １ 】

　 本 発 明 は 、 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 発 現 の 制 御 に よ る 胚 様 体 の 分 化 制 御 に 関 す る 。

【 背 景 技 術 】

【 ０ ０ ０ ２ 】

　 近 年 、 幹 細 胞 の 研 究 は 、 発 生 ・ 分 化 に 関 す る メ カ ニ ズ ム 解 明 や 再 生 医 療 な ど に お い て 非

常 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る 。

【 ０ ０ ０ ３ 】

　 幹 細 胞 は 、 そ の 出 現 時 期 に よ り 胚 性 幹 細 胞 、 胎 児 性 幹 細 胞 、 成 体 幹 細 胞 に 分 類 さ れ る 。

そ の 中 で も 胚 性 幹 細 胞 （ Ｅ Ｓ 細 胞 ） は 、 胎 盤 を 除 く す べ て の 細 胞 種 に 分 化 す る 能 力 を 有 す

る た め 、 再 生 医 療 の た め の 細 胞 ソ ー ス と し て 注 目 さ れ て お り 、 Ｅ Ｓ 細 胞 を ｉ ｎ 　 ｖ ｉ ｔ ｒ

ｏ で 種 々 の 分 化 細 胞 に 誘 導 す る 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ て い る 。

【 ０ ０ ０ ４ 】

　 Ｅ Ｓ 細 胞 か ら 特 定 の 細 胞 種 に 分 化 誘 導 さ せ る 場 合 、 そ の 中 間 段 階 に お い て 、 初 期 胚 に 類

似 し た 構 造 を 有 す る 胚 様 体 （ ｅ ｍ ｂ ｒ ｙ ｏ ｉ ｄ 　 ｂ ｏ ｄ ｙ ： Ｅ Ｂ ） と 呼 ば れ る 球 形 の 細 胞

塊 が 形 成 さ れ る 。 目 的 細 胞 へ の 分 化 効 率 や 分 化 し た 細 胞 の 機 能 発 現 は 、 胚 様 体 に 大 き く 影

響 を 受 け る も の と 考 え ら れ る 。 そ の た め 、 胚 様 体 の 分 化 状 態 を 制 御 す る こ と は 、 Ｅ Ｓ 細 胞

を ベ ー ス と し た 再 生 医 療 等 の 実 用 化 に お い て 重 要 な 課 題 と な っ て い る 。

【 ０ ０ ０ ５ 】

　 一 方 、 糖 鎖 は 、 細 胞 の 生 存 に 必 須 で あ る ば か り で な く 、 が ん 、 免 疫 、 発 生 ・ 分 化 や 感 染

症 な ど に お い て 特 に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 発 生 分 化 の 過 程 に

お い て は 、 そ の 分 化 程 度 や 状 態 に 敏 感 に 影 響 さ れ 、 糖 鎖 を 合 成 す る 糖 転 移 酵 素 遺 伝 子 の 発

現 パ タ ー ン が 変 化 し 、 合 成 さ れ る 糖 鎖 構 造 も 変 化 す る こ と が 知 ら れ て い る 。

【 ０ ０ ０ ６ 】

　 た と え ば 、 糖 転 移 酵 素 Ｅ Ｘ Ｔ １ が 細 胞 の 分 化 制 御 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る （ 特

許 文 献 １ ） 。

【 ０ ０ ０ ７ 】

　 し か し な が ら 、 胚 様 体 の 分 化 に 関 与 す る 種 々 の 糖 鎖 又 は 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 に つ い て は 報 告

が な さ れ て お ら ず 、 か か る 糖 鎖 又 は 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 を 利 用 し た 胚 様 体 分 化 制 御 の 手 段 の 開

発 が 望 ま れ て い た 。

【 先 行 技 術 文 献 】

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【 特 許 文 献 】

【 ０ ０ ０ ８ 】

【 特 許 文 献 １ 】 特 開 ２ ０ ０ ７ － ３ ２ ５ ５ ４ ２ 号

【 発 明 の 概 要 】

【 発 明 が 解 決 し よ う と す る 課 題 】

【 ０ ０ ０ ９ 】

　 本 発 明 の 課 題 は 、 胚 様 体 の 分 化 制 御 に 関 与 す る 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 を 同 定 し 、 そ れ ら を 利 用

し て 分 化 制 御 を 図 る 手 段 を 提 供 す る こ と で あ る 。

【 課 題 を 解 決 す る た め の 手 段 】

【 ０ ０ １ ０ 】

　 本 発 明 者 ら は 、 上 記 課 題 解 決 の た め に 鋭 意 検 討 を 行 い 、 所 定 の 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を

制 御 す る こ と に よ り 、 胚 様 体 の 分 化 を 制 御 で き る こ と を 見 い だ し 、 本 発 明 を 完 成 さ せ た 。

【 ０ ０ １ １ 】

　 本 発 明 の 要 旨 は 以 下 の 通 り で あ る 。

〔 １ 〕 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ 、 ｇ ａ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ３ 、 ｇ ａ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ 、

Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 及 び β ３ Ｇ ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ

か ら な る 群 か ら 選 ば れ る 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 を 有 効 成 分 と し て 含 有 す る

胚 様 体 分 化 制 御 剤 。

〔 ２ 〕 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 を 有 効 成 分 と し て 含 有 し 、 胚 様 体 の 未

分 化 性 を 解 除 す る た め に 用 い ら れ る 、 〔 １ 〕 に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 剤 。

〔 ３ 〕 胚 様 体 の 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 し 、 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る た め に 用 い ら れ る 、

〔 ２ 〕 に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 剤 。

〔 ４ 〕 有 効 成 分 が ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 又 は 該 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ の 発 現 ベ ク タ ー で あ る 、 〔 １ 〕 ～ 〔 ３ 〕 の

い ず れ か に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 剤 。

〔 ５ 〕 胚 様 体 が 哺 乳 類 の Ｅ Ｓ 細 胞 に 由 来 す る 、 〔 １ 〕 ～ 〔 ４ 〕 の い ず れ か に 記 載 の 胚 様 体

分 化 制 御 剤 。

〔 ６ 〕 幹 細 胞 に 対 し て β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ 、 ｇ ａ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ３ 、 ｇ ａ ｌ

ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ 、 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 及 び β ３ Ｇ

ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ か ら な る 群 か ら 選 ば れ る 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 を 導 入 し 、

該 幹 細 胞 に 由 来 す る 胚 様 体 の 分 化 を 制 御 す る 、 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 。

〔 ７ 〕 幹 細 胞 に 対 し て β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 を 導 入 し 、 該 幹 細 胞 に

由 来 す る 胚 様 体 の 未 分 化 性 を 解 除 す る 、 〔 ６ 〕 に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 。

〔 ８ 〕 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 し 、 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る 、 〔 ７ 〕 に 記 載 の 胚 様 体 分 化

制 御 方 法 。

〔 ９ 〕 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 が ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ 又 は 該 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ の 発 現 ベ ク タ

ー で あ る 、 〔 ６ 〕 ～ 〔 ８ 〕 の い ず れ か に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 。

〔 １ ０ 〕 幹 細 胞 が 哺 乳 類 の Ｅ Ｓ 細 胞 で あ る 、 〔 ６ 〕 ～ 〔 ９ 〕 の い ず れ か に 記 載 の 胚 様 体 分

化 制 御 方 法 。

〔 １ １ 〕 〔 ６ 〕 ～ 〔 １ ０ 〕 の い ず れ か に 記 載 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 で 分 化 制 御 さ れ た 細 胞

。

【 発 明 の 効 果 】

【 ０ ０ １ ２ 】

　 本 発 明 に よ り 、 非 常 に 簡 便 に 胚 様 体 分 化 を 制 御 ・ 管 理 す る こ と が で き 、 Ｅ Ｓ 細 胞 を ベ ー

ス と す る 再 生 医 療 の 実 現 に 貢 献 す る こ と が で き る 。

【 図 面 の 簡 単 な 説 明 】

【 ０ ０ １ ３ 】

【 図 １ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

【 図 ２ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

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【 図 ３ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

【 図 ４ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

【 図 ５ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

【 図 ６ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

【 図 ７ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

【 図 ８ 】 本 発 明 分 化 制 御 剤 を 作 用 さ せ た 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ

Ａ 発 現 量 を 示 す 図 で あ る 。

【 図 ９ 】 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ の 量 を Ｆ Ａ Ｃ Ｓ 分 析 で 調

べ た 結 果 を 示 す 図 で あ る 。 図 ９ 中 、 ａ は 陰 性 対 照 の 結 果 を 示 し 、 ｂ は β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ

３ － Ｋ Ｄ の 結 果 を 示 す 。

【 図 １ ０ 】 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る Ａ Ｌ Ｐ 活 性 を 調 べ た 結 果 を 示 す 図 で あ る

。 図 １ ０ 中 、 ａ は 陰 性 対 照 の 結 果 を 示 し 、 ｂ は β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の 結 果 を 示 す

。

【 図 １ １ 】 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る 未 分 化 マ ー カ ー Ｏ ｃ ｔ ３ ／ ４ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ

発 現 量 を リ ア ル タ イ ム Ｐ Ｃ Ｒ に よ り 調 べ た 結 果 を 示 す 図 で あ る 。 図 １ １ 中 、 ａ は 陰 性 対 照

の 結 果 を 示 し 、 ｂ は β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の 結 果 を 示 す 。

【 図 １ ２ 】 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る 未 分 化 マ ー カ ー Ｎ ａ ｎ ｏ ｇ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発

現 量 を リ ア ル タ イ ム Ｐ Ｃ Ｒ に よ り 調 べ た 結 果 を 示 す 図 で あ る 。 図 １ ２ 中 、 ａ は 陰 性 対 照 の

結 果 を 示 し 、 ｂ は β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の 結 果 を 示 す 。

【 図 １ ３ 】 Ｌ Ｉ Ｆ 非 存 在 下 で 培 養 し て 未 分 化 性 を 解 除 し た マ ウ ス Ｅ Ｓ 細 胞 に お い て 、 Ｌ ａ

ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ の 量 を 調 べ た 結 果 を 示 す 図 で あ る 。 ａ は Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 で 培 養 し た 結 果 を 示 し

、 ｂ は Ｌ Ｉ Ｆ 非 存 在 下 で 培 養 し た 結 果 を 示 す 。

【 図 １ ４ 】 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の 細 胞 増 殖 速 度 を 調 べ た 結 果 で あ る 。 ａ は 陰 性 対

照 の 結 果 を 示 し 、 ｂ は β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の 結 果 を 示 す 。

【 図 １ ５ 】 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る リ ン 酸 化 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ の 量 を ウ ェ ス タ ン ブ

ロ ッ ト に よ り 調 べ た 結 果 を 示 す 図 で あ る 。 ａ は 陰 性 対 照 の 結 果 を 示 し 、 ｂ は β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ

Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の 結 果 を 示 す 。

【 発 明 を 実 施 す る た め の 形 態 】

【 ０ ０ １ ４ 】

　 以 下 、 発 明 を 実 施 す る た め の 形 態 に よ り 、 本 発 明 を 詳 説 す る 。

【 ０ ０ １ ５ 】

　 本 明 細 書 に お い て 「 胚 様 体 」 と は 、 ヒ ト や マ ウ ス 等 の 哺 乳 類 由 来 の Ｅ Ｓ 細 胞 や ｉ Ｐ Ｓ 細

胞 な ど の 多 能 性 幹 細 胞 を 、 浮 遊 培 養 等 の 手 法 に よ り 分 化 さ せ た 際 に 形 成 さ れ る 胚 様 の 形 態

を し た 細 胞 塊 の こ と を 指 す 。

【 ０ ０ １ ６ 】

［ 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 ］

　 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 は 、 所 定 の 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 を 有 効 成 分 と し て

含 有 す る こ と を 特 徴 と す る 。

【 ０ ０ １ ７ 】

　 当 該 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 と し て は 、 目 的 と す る 分 化 状 態 に 応 じ て 、 Ｎ 結 合 型 糖 鎖 、 ム チ ン 型

糖 鎖 、 ガ レ ク チ ン 、 糖 脂 質 、 Ｌ ａ ｃ Ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ 、 ル イ ス 糖 鎖 、 ラ ク ト サ ミ ン 糖 鎖 等 の 合 成

に 関 与 す る 遺 伝 子 を 任 意 に 選 択 す る こ と が で き る 。 例 え ば 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ １ 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ２ 、 Ｍ

Ｇ Ａ Ｔ ３ 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ４ Ａ 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ４ Ｂ 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ４ Ｃ 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ 、 Ｆ Ｕ Ｔ ８ 、 ｐ ｐ Ｇ

ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ １ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ２ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ４

、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ５ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ６ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ７ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ

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Ａ ｃ Ｔ ９ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ １ ０ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ １ １ 、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ １ ２

、 ｐ ｐ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ １ ３ 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ ２ 、 Ｃ

ｏ ｒ ｅ ２ Ｇ ｎ Ｔ １ 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ ２ Ｇ ｎ Ｔ ２ 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ １ 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ２ 、 ｇ

ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ３ 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ４ 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ８ 、 ｇ

ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ９ 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ １ ２ 、 Ｇ ａ ｌ Ｃ ｅ ｒ Ｔ 、 Ｇ Ｍ ２ ／ Ｇ Ｄ ２ 、 β ３ Ｇ ａ

ｌ Ｔ ３ 、 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ Ｔ 、 β ３ Ｇ ｎ Ｔ ５ 、 β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ ４ 、 Ｓ Ｔ ３ Ｇ ａ ｌ ５ 、 β ４ Ｇ ａ ｌ

Ｔ ３ 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｔ ４ 、 β ４ Ｇ ａ Ｔ ６ 、 β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 、 Ｆ Ｕ Ｔ ４ 、 Ｆ Ｕ Ｔ ７ 、 Ｆ Ｕ Ｔ ９

、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 、 ｉ Ｇ ｎ Ｔ 、 β ３ Ｇ ｎ Ｔ ２ 、 β ３ Ｇ ｎ Ｔ ３ 、 β ３ Ｇ ｎ Ｔ ４ 、 β ３

Ｇ ａ ｌ Ｔ ２ 、 β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ ５ 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｔ ２ 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｔ ４ 、 β ４

Ｇ ａ ｌ Ｔ ５ 等 、 種 々 の 遺 伝 子 と す る こ と が で き る 。

【 ０ ０ １ ８ 】

　 か か る 遺 伝 子 の 中 で も Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 胚 様 体 に お け る

す べ て の 胚 葉 （ 原 始 内 胚 葉 、 遠 位 内 胚 葉 、 近 位 内 胚 葉 、 原 始 外 胚 葉 、 中 胚 葉 、 外 胚 葉 ） へ

の 分 化 を 抑 制 す る こ と が 可 能 で あ る 。 し た が っ て 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、

例 え ば 、 胚 様 体 の 分 化 を 抑 制 す る た め の 薬 剤 （ 未 分 化 性 を 維 持 す る た め の 薬 剤 ） の 有 効 成

分 と し て 用 い る こ と が で き る 。

【 ０ ０ １ ９ 】

　 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ３ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 原 始 内 胚 葉 及 び 中 胚 葉 へ の 分

化 を 抑 制 す る こ と 、 並 び に 外 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る こ と が 可 能 で あ る 。 し た が っ て 、

ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ３ の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、 例 え ば 、 胚 様 体 の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬

剤 （ 未 分 化 性 を 解 除 す る た め の 薬 剤 ） の 有 効 成 分 と し て 用 い る こ と が で き る 。 ま た 、 胚 様

体 の 外 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て も 好 適 に 使 用 す る こ と が で き

る 。

【 ０ ０ ２ ０ 】

　 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 原 始 内 胚 葉 、 遠 位 内 胚 葉 、 近

位 内 胚 葉 及 び 中 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る こ と 、 並 び に 外 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る こ と が

可 能 で あ り 、 特 に 中 胚 葉 へ の 分 化 を 強 力 に 抑 制 す る 。 し た が っ て 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ の

発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、 例 え ば 、 胚 様 体 の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て 使

用 す る こ と が で き る 。 ま た 、 胚 様 体 の 外 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤 や 中 胚 葉 へ の

分 化 を 抑 制 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て も 好 適 に 使 用 す る こ と が で き る 。

【 ０ ０ ２ １ 】

　 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 原 始 外 胚 葉 、 中 胚 葉 及 び 外

胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る こ と 、 並 び に 原 始 内 胚 葉 、 遠 位 内 胚 葉 、 近 位 内 胚 葉 （ す な わ ち 胚

体 外 内 胚 葉 ） へ の 分 化 を 促 進 さ せ る こ と が 可 能 で あ り 、 特 に 外 胚 葉 へ の 分 化 を 強 く 抑 制 す

る 。 し た が っ て 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、 例 え ば 、 胚 様 体 の 分 化

を 促 進 す る た め の 薬 剤 と し て 使 用 す る こ と が で き 、 胚 様 体 の 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る た

め の 薬 剤 や 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て も 好 適 に 使 用 す る こ と

が で き る 。

【 ０ ０ ２ ２ 】

　 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 遠 位 内 胚 葉 、 原

始 外 胚 葉 、 中 胚 葉 及 び 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る こ と 、 並 び に 原 始 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進

さ せ る こ と が 可 能 で あ り 、 特 に 原 始 外 胚 葉 、 中 胚 葉 及 び 外 胚 葉 へ の 分 化 を 強 く 抑 制 す る 。

し た が っ て 、 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ の 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、 例 え ば 、 胚 様 体

の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て 使 用 す る こ と が で き る 。 ま た 、 胚 様 体 の 原

始 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て も 好 適 に 使 用 す る こ と が で き る

。

【 ０ ０ ２ ３ 】

　 Ｓ Ｔ ３ Ｇ ａ ｌ Ｖ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 原 始 外 胚 葉 、 中 胚 葉 及 び 外 胚 葉 へ

の 分 化 を 抑 制 す る こ と 、 並 び に 原 始 内 胚 葉 、 遠 位 内 胚 葉 、 近 位 内 胚 葉 （ す な わ ち 胚 体 外 内

胚 葉 ） へ の 分 化 を 促 進 さ せ る こ と が 可 能 で あ り 、 特 に 外 胚 葉 へ の 分 化 を 強 力 に 抑 制 す る 。

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し た が っ て 、 Ｓ Ｔ ３ Ｇ ａ ｌ Ｖ の 遺 伝 子 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、 例 え ば 、 胚 様 体 の 分 化 を 促

進 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て 使 用 す る こ と が で き る 。 ま た 、 胚 様 体 の 内 胚 葉 へ の 分

化 を 促 進 す る た め の 薬 剤 や 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る た め の 薬 剤 の 有 効 成 分 と し て も 好 適

に 使 用 す る こ と が で き る 。

【 ０ ０ ２ ４ 】

　 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 原 始 内 胚 葉 、 原 始 外 胚

葉 及 び 中 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る こ と 、 並 び に 遠 位 内 胚 葉 、 近 位 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 さ

せ る こ と が 可 能 で あ り 、 特 に 中 胚 葉 へ の 分 化 を 強 力 に 抑 制 す る 。 し た が っ て 、 Ｓ Ｔ ３ Ｇ ａ

ｌ Ｖ の 遺 伝 子 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、 例 え ば 、 胚 様 体 の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤 の 有 効

成 分 と し て 使 用 す る こ と が で き る 。 ま た 、 胚 様 体 の 中 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る た め の 薬 剤

の 有 効 成 分 と し て も 好 適 に 使 用 す る こ と が で き る 。

【 ０ ０ ２ ５ 】

　 β ３ Ｇ ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ は 、 そ の 発 現 を 抑 制 す る こ と に よ り 、 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る

こ と 、 及 び 原 始 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 さ せ る こ と が 可 能 で あ る 。 し た が っ て 、 β ３ Ｇ ｌ ｃ

Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ の 遺 伝 子 発 現 を 抑 制 す る 核 酸 は 、 例 え ば 、 胚 様 体 の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤

と し て 使 用 す る こ と が で き る 。 ま た 、 胚 様 体 の 原 始 内 胚 葉 へ の 分 化 を 促 進 す る た め の 薬 剤

や 外 胚 葉 へ の 分 化 を 抑 制 す る た め の 薬 剤 と し て も 好 適 に 使 用 す る こ と が で き る 。

【 ０ ０ ２ ６ 】

　 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 の 有 効 成 分 で あ る 核 酸 は 、 所 定 の 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る

核 酸 で あ れ ば 、 デ オ キ シ リ ボ 核 酸 （ Ｄ Ｎ Ａ ） 、 リ ボ 核 酸 （ Ｒ Ｎ Ａ ） 、 １ 本 鎖 、 ２ 本 鎖 で あ

る か を 問 わ ず 、 い ず れ を も 包 含 す る も の と す る 。 ま た 、 ペ プ チ ド 核 酸 （ Ｐ Ｎ Ａ ： ｐ ｅ ｐ ｔ

ｉ ｄ ｅ 　 ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｃ 　 ａ ｃ ｉ ｄ ） 等 の 化 学 合 成 核 酸 ア ナ ロ グ も 本 発 明 の 核 酸 に 含 ま れ

る 。

【 ０ ０ ２ ７ 】

　 「 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 」 と し て は 、 Ｒ Ｎ Ａ 干 渉 （ Ｒ Ｎ Ａ 　 ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ

ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ 、 以 下 Ｒ Ｎ Ａ ｉ と 記 す ） の 効 果 に よ り 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 発 現 を 阻 害 す る 機 能

を 有 す る 核 酸 を 用 い る こ と が で き る 。 Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 利 用 し た 遺 伝 子 発 現 の 抑 制 は 、 効 果 が 安

定 で あ る 、 実 験 が 容 易 で あ る 、 費 用 が 安 価 で あ る 等 の 利 点 を 有 す る 点 で 好 ま し い 。

【 ０ ０ ２ ８ 】

　 Ｒ Ｎ Ａ ｉ に 用 い る 核 酸 は 、 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 又 は 当 該 遺 伝 子 の 部 分 領 域 と 完 全 な 相 同 性 を

有 す る こ と が 好 ま し い が 、 必 ず し も 完 全 同 一 で あ る 必 要 は な い 。

【 ０ ０ ２ ９ 】

　 上 記 Ｒ Ｎ Ａ ｉ に 用 い る 核 酸 と し て ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ （ 短 鎖 二 本 鎖 Ｒ Ｎ Ａ ） を 用 い る 場 合 、 そ の

設 計 に あ た っ て は 、 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 任 意 の 領 域 を 標 的 候 補 と す る こ と が で き る 。 例 え ば

、 胚 様 体 が マ ウ ス Ｅ Ｓ 細 胞 に 由 来 す る も の で あ れ ば 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 （ Ｇ ｅ

ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 　 Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ ． 　 Ｎ Ｍ ＿ １ ４ ５ １ ２ ８ ） 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ３

遺 伝 子 の 塩 基 配 列 （ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 　 Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ ． 　 Ｎ Ｍ ＿ ０ １ ０ ７ ０ ５

） 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 （ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 　 Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ

． 　 Ｎ Ｍ ＿ ０ ０ ８ ４ ９ ６ ） 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 （ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 　

Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ ． 　 Ｎ Ｍ ＿ １ ９ ８ ８ ８ ４ ） 、 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ

遺 伝 子 の 塩 基 配 列 （ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 　 Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ ． 　 Ｎ Ｍ ＿ ０ １ １ ６ ７ ３

） 、 Ｓ Ｔ ３ Ｇ ａ ｌ Ｖ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 （ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 　 Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ ． 　

Ｎ Ｍ ＿ ０ １ １ ３ ７ ５ ） 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 （ Ｇ ｅ ｎ ｂ ａ ｎ ｋ 　

Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ ． 　 Ｎ Ｍ ＿ ０ ５ ２ ９ ９ ３ ） 、 β ３ Ｇ ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ （ Ｇ ｅ ｎ ｂ

ａ ｎ ｋ 　 Ａ ｃ ｃ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ 　 Ｎ ｏ ． 　 Ｎ Ｍ ＿ ０ ５ ４ ０ ５ ２ ） 等 を も と に 作 製 す る こ と が

で き る 。

【 ０ ０ ３ ０ 】

　 よ り 具 体 的 に は 、 上 述 し た 配 列 の 一 部 の 領 域 を 標 的 と し 、 該 領 域 と 同 一 の 塩 基 配 列 を 有

す る ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ を 作 製 す る こ と が で き 、 例 え ば 、 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ の 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 一 部 領

域 （ 配 列 番 号 １ ） 、 ｇ ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ３ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 一 部 領 域 （ 配 列 番 号 ２ ） 、 ｇ

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ａ ｌ ａ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 一 部 領 域 （ 配 列 番 号 ３ ） 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 遺

伝 子 の 塩 基 配 列 の 一 部 領 域 （ 配 列 番 号 ４ ） 、 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ 遺 伝 子 の 塩

基 配 列 の 一 部 領 域 （ 配 列 番 号 ５ ） 、 Ｓ Ｔ ３ Ｇ ａ ｌ Ｖ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 一 部 領 域 （ 配 列 番

号 ６ ） 、 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 一 部 領 域 （ 配 列 番 号 ７ ） 、 β ３ Ｇ

ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 の 一 部 領 域 （ 配 列 番 号 ８ ） 等 と 同 一 の 配 列 を 有 す る ｓ ｉ

Ｒ Ｎ Ａ を 作 製 す る こ と が で き る 。

【 ０ ０ ３ １ 】

　 ま た 、 上 述 し た 配 列 を 標 的 に す る ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ に お い て 、 １ 又 は 数 個 の 塩 基 の 置 換 、 欠 失

、 挿 入 又 は 転 位 を 有 す る も の で あ っ て も 、 上 述 の 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る 機 能 を

有 す る も の で あ れ ば 、 本 発 明 の 核 酸 に 含 ま れ る 。 な お 、 上 記 「 数 個 」 と は 、 構 成 す る 塩 基

全 数 の 好 ま し く は ２ ０ ％ 未 満 （ ２ １ 塩 基 か ら な る 核 酸 で あ れ ば ４ 塩 基 以 下 ） 、 よ り 好 ま し

く は １ ０ ％ 未 満 （ ２ １ 塩 基 か ら な る 核 酸 で あ れ ば ２ 塩 基 以 下 ） の 整 数 を 表 す 。 ま た 、 上 記

「 １ 又 は 数 個 」 と は 、 １ ～ １ ０ 個 の 整 数 、 好 ま し く は １ ～ ５ 個 の 整 数 を 表 わ す 。

【 ０ ０ ３ ２ 】

　 さ ら に 、 こ れ ら の ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ の 相 補 鎖 と ス ト リ ン ジ ェ ン ト な 条 件 下 に お い て ハ イ ブ リ ダ

イ ズ し う る 核 酸 も 、 本 発 明 の 核 酸 に 包 含 さ れ る 。 こ こ で 、 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン は 、 例

え ば 、 Ｓ ａ ｍ ｂ ｒ ｏ ｏ ｋ ら 、 Ｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ 　 Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ， 　 Ａ 　 Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ

ｔ ｏ ｒ ｙ 　 Ｍ ａ ｎ ｕ ａ ｌ ， ２ ｄ 　 Ｅ ｄ ． ， 　 Ｃ ｏ ｌ ｄ 　 Ｓ ｐ ｒ ｉ ｎ ｇ 　 Ｈ ａ ｒ ｂ ｏ ｒ 　 Ｌ

ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ （ １ ９ ８ ９ ） に 記 載 の 方 法 に よ り 実 施 す る こ と が で き 、 「 ス ト リ ン ジ

ェ ン ト な 条 件 」 と し て は 、 例 え ば 、 ６ × Ｓ Ｓ Ｃ （ １ × Ｓ Ｓ Ｃ の 組 成 ： ０ ． １ ５ Ｍ 　 Ｎ ａ Ｃ

ｌ 、 ０ ． ０ １ ５ Ｍ 　 ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 、 ｐ Ｈ ７ ． ０ ） 、 ０ ． ５ ％ Ｓ Ｄ Ｓ 、 ５ × デ ン ハ ル

ト 、 １ ０ ０ μ ｇ ／ ｍ ｌ サ ケ 精 子 Ｄ Ｎ Ａ を 含 む 溶 液 中 、 プ ロ ー ブ と と も に ６ ５ ℃ で 一 晩 保 温

す る と い う 条 件 な ど が 挙 げ ら れ る 。 ま た 、 「 ス ト リ ン ジ ェ ン ト な 条 件 」 と し て 好 ま し く は

、 ６ ０ ℃ 、 １ × Ｓ Ｓ Ｃ 、 ０ ． １ ％ Ｓ Ｄ Ｓ 、 よ り 好 ま し く は 、 ６ ０ ℃ 、 ０ ． １ × Ｓ Ｓ Ｃ 、 ０

． １ ％ 　 Ｓ Ｄ Ｓ に 相 当 す る 温 度 及 び 塩 濃 度 で 、 １ 回 、 よ り 好 ま し く は ２ ～ ３ 回 洗 浄 す る 条

件 が 挙 げ ら れ る 。

【 ０ ０ ３ ３ 】

　 こ こ で 、 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ に は 、 シ ョ ー ト ヘ ア ピ ン Ｒ Ｎ Ａ （ ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ ： ｓ ｈ ｏ ｒ ｔ 　 ｈ ａ ｉ

ｒ ｐ ｉ ｎ 　 Ｒ Ｎ Ａ ） の よ う な 、 分 子 内 に お い て 二 本 鎖 Ｒ Ｎ Ａ 構 造 を 形 成 し 得 る 分 子 も 含 む

。

【 ０ ０ ３ ４ 】

　 ま た 、 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ は 、 必 ず し も 標 的 配 列 に 対 す る 一 組 の 二 本 鎖 Ｒ Ｎ Ａ で あ る 必 要 は な く

、 標 的 配 列 を 含 ん だ 領 域 に 対 す る 複 数 組 の 二 本 鎖 Ｒ Ｎ Ａ の 混 合 物 で あ っ て も よ い 。 例 え ば

、 標 的 と な る 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 全 長 又 は 全 長 に 近 い 領 域 に 対 応 す る 長 鎖 二 本 鎖 Ｒ

Ｎ Ａ を 予 め Ｄ Ｉ Ｃ Ｅ Ｒ 酵 素 で 分 解 し 、 そ の 分 解 産 物 を 本 発 明 の 核 酸 と し て 用 い る こ と が で

き る 。

【 ０ ０ ３ ５ 】

　 さ ら に 、 「 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 」 は 、 上 述 し た Ｒ Ｎ Ａ を 発 現 し 得 る 発

現 ベ ク タ ー で あ っ て も 良 い 。 か か る 発 現 ベ ク タ ー と し て は 、 例 え ば 、 二 本 鎖 Ｒ Ｎ Ａ の 一 方

の 鎖 を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ 及 び 他 方 の 鎖 を コ ー ド す る Ｄ Ｎ Ａ が そ れ ぞ れ 発 現 し 得 る よ う に プ

ロ モ ー タ ー と 連 結 し た 構 造 を 有 す る Ｄ Ｎ Ａ が 挙 げ ら れ る 。 か か る 発 現 ベ ク タ ー は 、 当 業 者

で あ れ ば 、 一 般 的 な 遺 伝 子 工 学 技 術 に よ り 適 宜 作 製 す る こ と が で き る 。 発 現 ベ ク タ ー と し

て 、 ｐ Ｂ Ａ ｓ ｉ や ｐ ｉ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ と い っ た Ｎ ａ ｋ ｅ ｄ プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー 、 ア デ ノ ウ イ ル ス

ベ ク タ ー 、 レ ト ロ ウ イ ル ス ベ ク タ ー 等 を 好 適 に 用 い る こ と が で き る 。

【 ０ ０ ３ ６ 】

　 「 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 」 は 、 上 述 し た も の の 他 に 、 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の

転 写 産 物 又 は そ の 一 部 に 対 す る ア ン チ セ ン ス 核 酸 や 、 当 該 遺 伝 子 の 転 写 産 物 を 特 異 的 に 開

裂 す る リ ボ ザ イ ム 活 性 を 有 す る 核 酸 等 が 挙 げ ら れ る 。

【 ０ ０ ３ ７ 】

　 ア ン チ セ ン ス 核 酸 の 配 列 は 、 当 該 遺 伝 子 又 は そ の 一 部 と 相 補 的 な 配 列 で あ る こ と が 好 ま

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し い が 、 遺 伝 子 発 現 を 有 効 に 抑 制 で き る 限 り に お い て 、 完 全 同 一 で な く て も 良 い 。

【 ０ ０ ３ ８ 】

　 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 の 有 効 成 分 と な る 核 酸 の 合 成 は 、 当 業 者 で あ れ ば 本 明 細 書 中 に 開 示

さ れ て い る 情 報 に 基 づ き 適 宜 既 存 技 術 を 用 い て 行 う こ と が で き る 。

【 ０ ０ ３ ９ 】

　 な お 「 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 」 と し て は 、 上 述 し た 核 酸 の 他 に 、 当 該 糖

鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 促 進 さ せ る 機 能 を 有 す る 核 酸 や 、 当 該 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 を 過 剰 発 現 し

得 る 核 酸 を 用 い る こ と が で き る 。 こ れ ら の 核 酸 を 用 い る こ と に よ り 、 当 該 糖 鎖 関 連 遺 伝 子

発 現 抑 制 時 の 効 果 と は 逆 の 効 果 を 得 る こ と が 可 能 で あ る 。 す な わ ち 、 遺 伝 子 発 現 抑 制 時 に

分 化 促 進 効 果 を 有 す る も の は 分 化 抑 制 効 果 を 、 同 じ く 分 化 抑 制 効 果 を 有 す る も の は 分 化 促

進 効 果 を 得 る こ と が 可 能 で あ る 。

【 ０ ０ ４ ０ 】

　 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 は 、 該 分 化 制 御 剤 の 有 効 成 分 で あ る 核 酸 が Ｅ Ｓ 細 胞 や ｉ Ｐ Ｓ 細 胞 に

導 入 さ れ る こ と で 、 該 Ｅ Ｓ 細 胞 や ｉ Ｐ Ｓ 細 胞 に 由 来 す る 胚 葉 体 中 に お い て 、 特 定 の 遺 伝 子

発 現 を 直 接 又 は 間 接 的 に 制 御 す る こ と が で き る 。 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 の 有 効 成 分 で あ る 核

酸 を Ｅ Ｓ 細 胞 や ｉ Ｐ Ｓ 細 胞 に 導 入 す る 方 法 は 通 常 の 方 法 で 行 う こ と が で き る 。 本 発 明 の 分

化 制 御 剤 は 、 単 独 で 又 は 複 数 組 み 合 わ せ て 使 用 す る こ と に よ り 、 目 的 の 分 化 状 態 に あ る 細

胞 （ 細 胞 塊 ） を 形 成 す る こ と が 可 能 で あ る 。

【 ０ ０ ４ １ 】

　 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 は 、 有 効 成 分 で あ る 核 酸 の 他 、 該 核 酸 の 安 定 化 剤 、 緩 衝 液 、 防 腐 剤

、 塩 等 の 他 の 成 分 を 含 有 し て も よ い 。 ま た 、 本 発 明 の 分 化 制 御 剤 は 、 レ ト ロ ウ イ ル ス や ア

デ ノ ウ イ ル ス 等 の 細 胞 感 染 能 を 有 す る ウ イ ル ス の 形 態 で あ っ て も よ い 。

【 ０ ０ ４ ２ 】

［ 本 発 明 の 分 化 制 御 方 法 ］

　 本 発 明 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 は 、 対 象 と な る 細 胞 に 対 し て 、 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制

御 す る 核 酸 を 導 入 し 、 当 該 胚 様 体 の 分 化 を 制 御 す る こ と を 特 徴 と す る 。

【 ０ ０ ４ ３ 】

　 対 象 と な る 細 胞 と は 、 未 分 化 な 細 胞 又 は 脱 分 化 し た 細 胞 で あ り 、 例 え ば 、 哺 乳 類 の 胚 性

幹 細 胞 （ Ｅ Ｓ 細 胞 ） 、 人 工 多 能 性 幹 細 胞 （ ｉ Ｐ Ｓ 細 胞 ） 等 が 挙 げ ら れ る 。

【 ０ ０ ４ ４ 】

　 本 発 明 の 胚 様 体 分 化 制 御 方 法 に 用 い る 「 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 」 は 、 上

記 の 胚 様 体 分 化 制 御 剤 に お い て 説 明 し た 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 と 同 義 で あ

る 。

【 ０ ０ ４ ５ 】

　 対 象 と な る 細 胞 に 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 を 導 入 す る た め の 方 法 は 、 通 常

の 方 法 を 採 用 す る こ と が で き る 。

　 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 と し て Ｒ Ｎ Ａ ｉ 効 果 に よ る 阻 害 作 用 を 有 す る 核 酸

を 用 い る 場 合 に は 、 例 え ば 、 合 成 ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ を Ｅ Ｓ 細 胞 等 の 細 胞 内 に 導 入 し た り 、 ｓ ｉ Ｒ

Ｎ Ａ を 発 現 し う る 発 現 ベ ク タ ー を Ｅ Ｓ 細 胞 等 の 細 胞 内 に 導 入 し て 細 胞 内 で ｓ ｉ Ｒ Ｎ Ａ を 形

成 さ せ た り す る こ と で 、 胚 様 体 の 分 化 を 制 御 す る こ と が で き る 。

【 ０ ０ ４ ６ 】

　 糖 鎖 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 核 酸 の 発 現 ベ ク タ ー へ の 挿 入 に 際 し て は 、 核 酸 の 機 能

を 損 な わ な い 限 り に お い て 、 制 限 酵 素 断 片 の 連 結 や 核 酸 の 末 端 領 域 の 一 部 切 断 を 行 っ て も

よ い 。 ま た 、 か か る 発 現 ベ ク タ ー は 、 本 発 明 の 分 化 制 御 方 法 を 適 用 す る 対 象 細 胞 で 用 い る

こ と の で き る ベ ク タ ー で あ れ ば 特 に 限 定 は さ れ な い 。 例 え ば 、 ｐ Ｂ Ａ ｓ ｉ や ｐ ｉ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ

と い っ た Ｎ ａ ｋ ｅ ｄ プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー 、 ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー 、 レ ト ロ ウ イ ル ス ベ ク

タ ー 等 か ら 、 当 業 者 で あ れ ば 目 的 に 合 わ せ て 適 宜 選 択 し て 使 用 す る こ と が 容 易 で あ る 。

【 ０ ０ ４ ７ 】

［ 本 発 明 の 細 胞 ］

　 本 発 明 の 細 胞 は 、 上 記 本 発 明 の 分 化 制 御 方 法 に よ り 分 化 が 制 御 さ れ た 細 胞 で あ る 。 該 細

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胞 に は 、 分 化 開 始 前 の 細 胞 、 分 化 過 程 の 細 胞 、 分 化 し た 細 胞 の い ず れ も が 含 ま れ る 。 本 発

明 の 細 胞 に は 、 本 発 明 の 分 化 制 御 方 法 に よ っ て 胚 様 体 か ら 分 化 し た 組 織 や 器 官 に 含 ま れ る

細 胞 を も 含 む 。

【 ０ ０ ４ ８ 】

　 以 下 、 実 施 例 に よ り 本 発 明 を 具 体 的 に 説 明 す る 。 た だ し 、 本 発 明 は 以 下 の 記 述 に 限 定 さ

れ る も の で は な い 。

【 実 施 例 】

【 ０ ０ ４ ９ 】

　 各 種 標 的 配 列 （ 配 列 番 号 １ ～ ８ ） 及 び そ れ と 相 補 的 な 配 列 を 含 む ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 レ ト ロ

ウ イ ル ス ベ ク タ ー ｐ Ｓ Ｕ Ｐ Ｅ Ｒ ． ｒ ｅ ｔ ｒ ｏ ． ｐ ｕ ｒ ｏ （ Ｏ ｌ ｉ ｇ ｏ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ 社 製 ）

並 び に 、 陰 性 対 照 と し て Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 配 列 及 び そ れ と 相 補 的 な 配 列 を 含 む 同 ベ ク タ ー を パ ッ ケ

ー ジ ン グ 細 胞 で あ る Ｐ Ｌ Ａ Ｔ － Ｅ 細 胞 に ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン し 、 レ ト ロ ウ イ ル ス を 産 生

さ せ た 。

【 ０ ０ ５ ０ 】

　 産 生 さ せ た レ ト ロ ウ イ ル ス を マ ウ ス Ｅ Ｓ 細 胞 で あ る Ｒ １ セ ル ラ イ ン （ Ｐ ｒ ｏ ｃ ． Ｎ ａ ｔ

ｌ ． Ａ ｃ ａ ｄ ． Ｓ ｃ ｉ ． Ｕ Ｓ Ａ 　 ９ ０ （ １ ９ ９ ３ ） ８ ４ ２ ４ － ８ ４ ２ ８ に 記 載 、 自 然 科 学

研 究 機 構 　 生 理 学 研 究 所 　 分 子 神 経 生 理 研 究 部 門 　 よ り 供 与 ） に 感 染 さ せ た 後 、 ５ 日 か ら

７ 日 間 ピ ュ ー ロ マ イ シ ン 存 在 下 で セ レ ク シ ョ ン を 続 け 、 各 種 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ 安 定 発 現 細 胞 を 得

た 。

【 ０ ０ ５ １ 】

　 得 ら れ た ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ 安 定 発 現 細 胞 を ｌ ｅ ｕ ｋ ｅ ｍ ｉ ａ 　 ｉ ｎ ｈ ｉ ｂ ｉ ｔ ｏ ｒ ｙ 　 ｆ ａ ｃ

ｔ ｏ ｒ （ Ｌ Ｉ Ｆ ） 非 存 在 下 、 非 接 着 性 シ ャ ー レ で あ る ロ ー セ ル バ イ ン デ ィ ン グ ６ ｃ ｍ デ ィ

ッ シ ュ （ Ｎ ｕ ｎ ｃ ） に て ４ 日 か ら １ ２ 日 間 培 養 し 、 経 時 的 に 回 収 し た 。

【 ０ ０ ５ ２ 】

　 回 収 し た 胚 様 体 か ら ｃ Ｄ Ｎ Ａ を 作 成 し 、 Ａ Ｂ Ｉ 　 Ｐ Ｒ Ｉ Ｓ Ｍ （ 登 録 商 標 ） ７ ７ ０ ０ 　 ｓ

ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ 　 ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｓ ｙ ｓ ｔ ｅ ｍ を 用 い て 常 法 に 従 っ て リ ア ル タ イ ム

Ｐ Ｃ Ｒ を 行 い 、 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の 発 現 量 を 測 定 し た 。 使 用 し た プ ラ イ マ ー 及 び プ

ロ ー ブ を 下 記 表 １ に 示 す 。 な お 、 上 記 の 各 種 ｓ ｈ Ｒ Ｎ Ａ 安 定 発 現 細 胞 に お い て 、 ｓ ｈ Ｒ Ｎ

Ａ の 標 的 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 量 が 、 陰 性 対 照 の レ ト ロ ウ イ ル ス 感 染 細 胞 に 比 べ て 半 分 以 下 に

減 少 し て い る こ と を Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ に よ り 確 認 し た 。

【 ０ ０ ５ ３ 】

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【 表 １ 】

【 ０ ０ ５ ４ 】

　 結 果 を 図 １ ～ 図 ８ に 示 す 。 グ ラ フ の 縦 軸 は 、 胚 様 体 に お け る 各 種 胚 葉 マ ー カ ー 遺 伝 子 の

ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 量 を β ア ク チ ン の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 量 で 補 正 し 、 培 養 ０ 日 目 に お け る 陰 性 対 象 の

ｍ Ｒ Ｎ Ａ を １ と し た 場 合 の 相 対 値 を 示 す 。

【 ０ ０ ５ ５ 】

　 Ｍ Ｇ Ａ Ｔ ５ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 １ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 行 っ た 胚 様 体

に お い て は 、 中 胚 葉 マ ー カ ー Ｔ 及 び Ｇ ｏ ｏ ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 量 が 、 培 養 ４ 日 目

に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て 約 １ ／ ２ に 減 少 し て い た 。 ま た 、 そ の 他 の 胚 葉 マ ー カ ー （ 原 始 内

胚 葉 、 遠 位 内 胚 葉 、 近 位 内 胚 葉 、 原 始 外 胚 葉 、 外 胚 葉 マ ー カ ー ） に お い て も ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現

の 減 少 が 確 認 さ れ た 。

【 ０ ０ ５ ６ 】

　 ｇ ａ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ３ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ２ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 行 っ

た 胚 様 体 に お い て は 、 原 始 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｇ ａ ｔ ａ ６ 並 び に 中 胚 葉 マ ー カ ー Ｔ 及 び Ｇ ｏ ｏ

ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 が 陰 性 対 象 と 比 較 し て 減 少 し て い た 。 一 方 で 、 外 胚 葉 マ ー カ

ー Ｍ ａ ｓ ｈ １ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 は 、 培 養 １ ２ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て 約 ２ 倍 に 増 加 し て

い た 。

【 ０ ０ ５ ７ 】

　 ｇ ａ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ７ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ３ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 行 っ

た 胚 様 体 に お い て は 、 原 始 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｇ ａ ｔ ａ ６ 、 遠 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｉ

ｎ Ｂ １ 、 近 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｂ ｍ ｐ ２ 及 び 中 胚 葉 マ ー カ ー Ｔ 及 び Ｇ ｏ ｏ ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ の ｍ

Ｒ Ｎ Ａ 発 現 が 減 少 し て い た 。 特 に 中 胚 葉 マ ー カ ー の 発 現 減 少 は 著 し く 、 培 養 ４ 日 目 に 、 陰

性 対 象 と 比 較 し て Ｔ で 約 １ ／ ５ 、 Ｇ ｏ ｏ ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ で 約 １ ／ ３ に 減 少 し て い た 。 一 方 で

、 外 胚 葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 は 、 培 養 １ ２ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て Ｍ ａ ｓ ｈ １ で

約 ２ 倍 、 Ｐ ａ ｘ ６ で 約 １ ． ３ 倍 に 増 加 し て い た 。

【 ０ ０ ５ ８ 】

　 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ４ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 行

っ た 胚 様 体 に お い て は 、 原 始 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｇ ａ ｔ ａ ６ 、 遠 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｌ ａ ｍ ｉ ｎ

ｉ ｎ Ｂ １ 、 近 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｂ ｍ ｐ ２ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 が 陰 性 対 象 と 比 較 し て 増 加 し て い

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た 。 一 方 で 、 原 始 外 胚 葉 マ ー カ ー Ｆ ｇ ｆ ５ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 は 、 培 養 ４ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と

比 較 し て 約 ２ ／ ３ に 減 少 し て い た 。 ま た 、 中 胚 葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 も 、 培 養 ４ 日 目

に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て Ｔ 及 び Ｇ ｏ ｏ ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ で 約 ２ ／ ３ に 減 少 し て い た 。 さ ら に 、

外 胚 葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ は 、 培 養 １ ２ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て Ｍ ａ ｓ ｈ １ で 約 ２ ／

３ 、 Ｐ ａ ｘ ６ で 約 １ ／ ２ に 減 少 し て い た 。

【 ０ ０ ５ ９ 】

　 Ｇ ｌ ｃ Ｃ ｅ ｒ 　 ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ａ ｓ ｅ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ５ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ

Ｎ Ａ ｉ を 行 っ た 胚 様 体 に お い て は 、 原 始 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｇ ａ ｔ ａ ６ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 が 増 加

し た が 、 遠 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｉ ｎ Ｂ １ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 が 、 培 養 ４ 日 目 に 、 陰 性

対 象 と 比 較 し て 約 ３ ／ ５ に 減 少 し て い た 。 ま た 、 中 胚 葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 も 、 培 養

４ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て Ｔ で 約 ３ ／ ５ 、 Ｇ ｏ ｏ ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ で 約 １ ／ ２ に 減 少 し て

い た 。 さ ら に 、 外 胚 葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ は 、 培 養 １ ２ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て Ｍ ａ

ｓ ｈ １ で 約 ２ ／ ３ 、 Ｐ ａ ｘ ６ で 約 １ ／ ３ に 減 少 し て い た 。

【 ０ ０ ６ ０ 】

　 Ｓ Ｔ ３ Ｇ ａ ｌ Ｖ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ６ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 行 っ た 胚

様 体 に お い て は 、 原 始 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｇ ａ ｔ ａ ６ 、 遠 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｉ ｎ Ｂ

１ 、 近 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｂ ｍ ｐ ２ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 が 陰 性 対 象 と 比 較 し て 増 加 し て い た 。 特

に Ｂ ｍ ｐ ２ で は 、 培 養 ４ 日 目 に 、 陰 性 対 象 の 約 ２ ． ４ 倍 と 著 し く 増 加 し て い た 。 一 方 で 、

原 始 外 胚 葉 マ ー カ ー Ｆ ｇ ｆ ５ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 は 、 培 養 ４ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て 約 ２

／ ３ に 減 少 し て い た 。 ま た 、 中 胚 葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 も 、 培 養 ４ 日 目 に 、 陰 性 対 象

と 比 較 し て Ｔ で 約 ５ ／ ７ 、 Ｇ ｏ ｏ ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ で 約 ４ ／ ５ に 減 少 し て い た 。 さ ら に 、 外 胚

葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ は １ ２ 日 目 に 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て Ｍ ａ ｓ ｈ １ で 約 ２ ／ ３ 、 Ｐ ａ ｘ

６ で 約 １ ／ ２ と 著 し く 減 少 し て い た 。

【 ０ ０ ６ １ 】

　 Ｃ ｏ ｒ ｅ １ β ３ Ｇ ａ ｌ Ｔ １ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ７ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ Ｎ Ａ ｉ

を 行 っ た 胚 様 体 に お い て は 、 中 胚 葉 マ ー カ ー の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 が 、 培 養 ４ 日 目 に 、 陰 性 対 象

と 比 較 し て Ｔ 及 び Ｇ ｏ ｏ ｓ ｅ ｃ ｏ ｉ ｄ で 約 １ ／ ５ と 著 し く 減 少 し て い た 。 ま た 、 原 始 内 胚

葉 マ ー カ ー Ｇ ａ ｔ ａ ６ 及 び 原 始 外 胚 葉 マ ー カ ー Ｆ ｇ ｆ ５ に お い て も ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 の 減 少 が

確 認 さ れ た 。 一 方 で 、 遠 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｌ ａ ｍ ｉ ｎ ｉ ｎ Ｂ １ 、 近 位 内 胚 葉 マ ー カ ー Ｂ ｍ

ｐ ２ は 、 培 養 ８ 日 目 に 、 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 の 増 加 が 確 認 さ れ た 。

【 ０ ０ ６ ２ 】

　 β ３ Ｇ ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ Ｔ Ｖ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ８ ） を 標 的 配 列 と し た Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 行

っ た 胚 様 体 に お い て は 、 培 養 １ ２ 日 目 に 、 外 胚 葉 マ ー カ ー の 発 現 が 、 陰 性 対 象 と 比 較 し て

Ｍ ａ ｓ ｈ １ で ４ ／ ５ 、 Ｐ ａ ｘ ６ で １ ／ ２ に 減 少 し て い た 。

【 ０ ０ ６ ３ 】

　 続 い て 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ 遺 伝 子 配 列 の 一 部 （ 配 列 番 号 ４ ） を 標 的 配 列 と し て Ｒ Ｎ

Ａ ｉ を 行 っ た マ ウ ス Ｅ Ｓ 細 胞 （ 以 下 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ と 呼 ぶ 。 ） に つ い て 、

そ の 分 化 の 態 様 を さ ら に 詳 細 に 調 べ た 。 な お 、 以 下 で 陰 性 対 照 と し て 使 用 し て い る の は 、

特 に 断 り の な い 限 り 、 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 配 列 を 標 的 配 列 と し て Ｒ Ｎ Ａ ｉ を 行 っ た マ ウ ス Ｅ Ｓ 細 胞 で

あ る 。

【 ０ ０ ６ ４ 】

［ β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に 存 在 す る Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ の 解 析 ］

　 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ は 、 Ｕ Ｄ Ｐ － Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ を ド ナ ー 基 質 、 Ｇ ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ β １ － を

ア ク セ プ タ ー 基 質 と し 、 β １ － ４ 結 合 に よ っ て Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ を 転 移 し 、 Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ β １

－ ４ Ｇ ｌ ｃ Ｎ Ａ ｃ 構 造 （ Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ 構 造 ） を 合 成 す る 酵 素 で あ る 。 そ こ で 、 β ４ Ｇ

ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ の 量 を Ｆ Ａ Ｃ Ｓ 分 析 に よ り 調 べ た 。

　 具 体 的 に は 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ を Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト デ ィ ッ シ ュ

（ Ｎ ｕ ｎ ｃ ） に て １ 日 間 培 養 後 に ピ ュ ー ロ マ イ シ ン 存 在 下 で １ 日 間 培 養 し た 後 、 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ

で 処 理 し て 細 胞 を 回 収 し 、 こ の 細 胞 懸 濁 液 を Ｆ Ａ Ｃ Ｓ 緩 衝 液 （ ０ ． ５ 質 量 ％ ウ シ 血 清 ア ル

ブ ミ ン （ Ｂ Ｓ Ａ ） 及 び ０ ． １ 質 量 ％ ア ジ 化 ナ ト リ ウ ム を 含 む Ｐ Ｂ Ｓ 溶 液 ） で 希 釈 し た Ｆ Ｉ

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Ｔ Ｃ 標 識 Ｗ Ｆ Ａ レ ク チ ン （ Ｅ Ｙ 社 製 ） 溶 液 中 で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 洗 浄 後 、 Ｆ Ａ Ｃ Ｓ Ａ

ｒ ｉ ａ 　 Ｃ ｅ ｌ ｌ 　 Ｓ ｏ ｒ ｔ ｅ ｒ （ ベ ク ト ン デ ィ ッ キ ン ソ ン 社 製 ） を 用 い て Ｆ Ａ Ｃ Ｓ 分 析

を 行 っ た 。

　 結 果 を 図 ９ に 示 す 。

　 図 ９ に 示 す よ う に 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お い て 、 陰 性 対 照 よ り も Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ

Ｎ Ａ ｃ 構 造 の 存 在 量 が 減 少 （ 蛍 光 強 度 が 減 少 ） し て い る こ と が わ か っ た 。

【 ０ ０ ６ ５ 】

［ β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の Ａ Ｌ Ｐ 活 性 の 解 析 ］

　 未 分 化 で 自 己 複 製 能 を 有 し た 状 態 の Ｅ Ｓ 細 胞 で は 、 ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ （ Ａ Ｌ Ｐ

） が 高 レ ベ ル で 発 現 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 そ こ で 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ

に お け る Ａ Ｌ Ｐ 活 性 を 調 べ た 。

　 具 体 的 に は 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ を Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト デ ィ ッ シ ュ

（ Ｎ ｕ ｎ ｃ ） に て ２ 日 間 培 養 し た 。 そ の 後 低 密 度 に ま き な お し て か ら ５ 日 後 に 、 Ｂ Ｃ Ｉ Ｐ

－ Ｎ Ｂ Ｔ 溶 液 キ ッ ト （ ナ カ ラ イ テ ス ク 社 製 ） を 用 い て Ａ Ｌ Ｐ 活 性 を 発 色 性 基 質 に よ り 発 色

さ せ た 。 顕 微 鏡 下 で Ａ Ｌ Ｐ 陽 性 細 胞 数 を 数 え る こ と で Ａ Ｌ Ｐ 陽 性 細 胞 数 を 測 定 し た 。

　 結 果 を 図 １ ０ に 示 す 。

　 図 １ ０ に 示 す よ う に 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お い て 陰 性 対 照 よ り も Ａ Ｌ Ｐ 陽 性

細 胞 数 が 減 少 し て い た 。 こ の 結 果 は 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ は 未 分 化 性 が 維 持 で き

て お ら ず 、 分 化 が 促 進 さ れ て い る こ と を 示 し て い る 。

【 ０ ０ ６ ６ 】

［ β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る 未 分 化 マ ー カ ー 遺 伝 子 の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 発 現 量 の 解 析 ］

　 さ ら に 、 未 分 化 マ ー カ ー で あ る Ｏ ｃ ｔ ３ ／ ４ と Ｎ ａ ｎ ｏ ｇ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 量 に つ い て リ ア ル

タ イ ム Ｐ Ｃ Ｒ に よ り 調 べ た 。

　 具 体 的 に は 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ を Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト デ ィ ッ シ ュ

（ Ｎ ｕ ｎ ｃ ） に て ４ 日 間 培 養 し た 後 回 収 し 、 回 収 し た 細 胞 か ら ｃ Ｄ Ｎ Ａ を 作 成 し 、 Ａ Ｂ Ｉ

　 Ｐ Ｒ Ｉ Ｓ Ｍ （ 登 録 商 標 ） ７ ７ ０ ０ 　 ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ 　 ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ 　 ｓ ｙ ｓ ｔ

ｅ ｍ を 用 い て 常 法 に 従 っ て リ ア ル タ イ ム Ｐ Ｃ Ｒ を 行 っ た 。 使 用 し た プ ラ イ マ ー 及 び プ ロ ー

ブ を 下 記 表 ２ に 示 す 。

【 ０ ０ ６ ７ 】

【 表 ２ 】

【 ０ ０ ６ ８ 】

　 Ｏ ｃ ｔ ３ ／ ４ の 結 果 を 図 １ １ に 、 Ｎ ａ ｎ ｏ ｇ の 結 果 を 図 １ ２ に 示 す 。

　 図 １ １ 及 び １ ２ に 示 す よ う に 、 い ず れ の マ ー カ ー に つ い て も 、 そ の ｍ Ｒ Ｎ Ａ 量 が 陰 性 対

照 に 比 べ て 顕 著 に 低 下 し て い た 。 こ の 結 果 も 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ は 未 分 化 性 が

維 持 で き て お ら ず 、 分 化 が 促 進 さ れ て い る こ と を 支 持 す る 。

【 ０ ０ ６ ９ 】

［ Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ と 未 分 化 性 の 関 係 ］

　 マ ウ ス Ｅ Ｓ 細 胞 を Ｌ Ｉ Ｆ 非 存 在 下 で 培 養 す る と 、 Ｌ Ｉ Ｆ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ シ グ ナ ル が 働 か な

く な り 、 そ の 結 果 未 分 化 性 が 維 持 で き な く な っ て 分 化 が 促 進 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る 。

上 述 し た よ う に 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ で は Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ の 量 が 減 少 し て お り

、 未 分 化 性 も 解 除 さ れ て い る 。 実 際 に Ｌ Ｉ Ｆ 非 存 在 下 で 培 養 し て 未 分 化 性 を 解 除 し た マ ウ

ス Ｅ Ｓ 細 胞 に お い て 、 Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ の 量 が ど の よ う に 変 化 す る か を 上 記 と 同 様 に Ｆ Ａ

Ｃ Ｓ 分 析 に よ り 調 べ た 。

　 結 果 を 図 １ ３ に 示 す 。

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　 図 １ ３ に 示 す よ う に 、 Ｌ Ｉ Ｆ 非 存 在 下 で 培 養 し た Ｅ Ｓ 細 胞 で は 、 Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 で 培 養 し

た 場 合 に 比 べ て 、 Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ の 量 が 減 少 し て い る こ と が わ か っ た 。 こ の 結 果 は 、 Ｅ

Ｓ 細 胞 の 未 分 化 性 の 維 持 に Ｌ ａ ｃ ｄ ｉ Ｎ Ａ ｃ が 関 与 し て い る こ と を 示 す 。

【 ０ ０ ７ ０ 】

　 ［ β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ の 増 殖 速 度 の 解 析 ］

　 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ を Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト デ ィ ッ シ ュ （ Ｎ ｕ ｎ ｃ ）

に て 培 養 し た と き の 増 殖 速 度 を Ｃ ｅ ｌ ｌ 　 Ｃ ｏ ｕ ｎ ｔ ｉ ｎ ｇ 　 Ｋ ｉ ｔ － ８ （ 同 仁 化 学 社 製

） を 用 い て 測 定 し た 。

　 結 果 を 図 １ ４ に 示 す 。

　 図 １ ４ に 示 す よ う に 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ で は 、 陰 性 対 照 に 比 べ て 増 殖 速 度 が

顕 著 に 低 下 し て い た 。 一 般 に 分 化 が 開 始 さ れ た 細 胞 は 、 未 分 化 細 胞 に 比 べ て 増 殖 が 遅 く な

る 傾 向 が あ る 。 し た が っ て こ の 結 果 も β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お い て 未 分 化 性 が 解

除 さ れ 、 分 化 が 促 進 さ れ て い る こ と を 支 持 す る 。

【 ０ ０ ７ １ 】

［ β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る Ｌ Ｉ Ｆ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ シ グ ナ ル の 解 析 ］

　 Ｌ Ｉ Ｆ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ シ グ ナ ル は 、 マ ウ ス Ｅ Ｓ 細 胞 の 未 分 化 性 を 維 持 す る た め に 重 要 な シ

グ ナ ル 経 路 で あ り 、 未 分 化 状 態 で は Ｌ Ｉ Ｆ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ シ グ ナ ル が 活 性 化 さ れ て い る こ と

が 知 ら れ て い る 。 そ こ で 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お け る Ｌ Ｉ Ｆ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ シ グ

ナ ル の 状 態 を ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト に よ り 調 べ た 。

　 具 体 的 に は 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ を Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 、 ゼ ラ チ ン コ ー ト デ ィ ッ シ ュ

（ Ｎ ｕ ｎ ｃ ） に て １ 日 間 培 養 後 、 ピ ュ ー ロ マ イ シ ン の 存 在 下 で １ 日 間 培 養 し た 。 続 い て 細

胞 を 血 清 及 び Ｌ Ｉ Ｆ の 非 存 在 下 で ４ 時 間 培 養 後 、 Ｌ Ｉ Ｆ を 添 加 し 、 又 は 添 加 せ ず に ２ ０ 分

培 養 し て か ら 回 収 し 、 溶 解 緩 衝 液 （ １ ５ ０ ｍ Ｍ 　 Ｎ ａ Ｃ ｌ 、 １ ％ Ｔ ｒ ｉ ｔ ｏ ｎ Ｘ － １ ０ ０

、 １ ｍ Ｍ Ｎ ３ Ｖ Ｏ ４ 、 １ ０ ｍ Ｍ 　 Ｎ ａ Ｆ 、 プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー （ シ グ マ 社 製 ） を 含

む ５ ０ ｍ Ｍ 　 Ｔ ｒ ｉ ｓ － Ｈ Ｃ ｌ 　 ｐ Ｈ ７ ． ４ ） で 溶 解 し た 。 こ の 細 胞 溶 解 液 を １ ０ ％ Ｓ Ｄ

Ｓ － Ｐ Ａ Ｇ Ｅ に か け た 後 、 Ｐ Ｖ Ｄ Ｆ メ ン ブ レ ン （ ミ リ ポ ア 社 製 ） に ト ラ ン ス フ ァ ー し た 。

こ の メ ン ブ レ ン を ブ ロ ッ キ ン グ 後 、 プ ラ イ マ リ ー 抗 体 と し て 抗 リ ン 酸 化 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ 抗 体 （

マ ウ ス Ｉ ｇ Ｇ 、 ベ ク ト ン デ ィ ッ キ ン ソ ン 社 製 ） を 、 ２ 次 抗 体 と し て ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識

抗 マ ウ ス Ｉ ｇ Ｇ 抗 体 （ Ｃ ｅ ｌ ｌ 　 Ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｉ ｎ ｇ 社 製 ） を そ れ ぞ れ 反 応 さ せ た 。 洗 浄

後 、 メ ン ブ レ ン 上 の ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ を Ｅ Ｃ Ｌ 　 Ｐ ｌ ｕ ｓ 試 薬 （ Ｇ Ｅ ヘ ル ス ケ ア 社 製 ） を

用 い て 発 色 さ せ た 。 な お 、 プ ラ イ マ リ ー 抗 体 と し て 抗 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ 抗 体 （ マ ウ ス Ｉ ｇ Ｇ 、 ベ

ク ト ン デ ィ ッ キ ン ソ ン 社 製 ） を 用 い て 同 様 の 実 験 を 行 っ た 。 リ ン 酸 化 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ （ ｐ － Ｓ

Ｔ Ａ Ｔ ３ ） の 量 は 、 プ ラ イ マ リ ー 抗 体 と し て 抗 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ 抗 体 を 用 い た と き の バ ン ド 強 度

に 対 す る 、 プ ラ イ マ リ ー 抗 体 と し て 抗 リ ン 酸 化 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ 抗 体 を 用 い た と き の バ ン ド 強 度

の 割 合 と し て 評 価 し た 。 な お 、 バ ン ド 強 度 は Ｎ Ｉ Ｈ ｉ ｍ ａ ｇ ｅ で 測 定 し た 。

　 結 果 を 図 １ ５ に 示 す 。

　 図 １ ５ に 示 す よ う に 、 Ｌ Ｉ Ｆ 存 在 下 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ で は 陰 性 対 照 に 比 べ

て Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ の リ ン 酸 化 が 抑 制 さ れ て い る こ と か ら 、 Ｌ Ｉ Ｆ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ シ グ ナ ル の 働 き

が 低 下 し て い る こ と が わ か る 。 こ の 結 果 は 、 β ４ Ｇ ａ ｌ Ｎ Ａ ｃ Ｔ ３ － Ｋ Ｄ に お い て 、 Ｌ Ｉ

Ｆ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ シ グ ナ ル を 介 し た 未 分 化 性 維 持 機 構 が 抑 制 さ れ 、 分 化 が 促 進 さ れ て い る こ

と を 示 す 。 な お 、 図 １ ５ の 結 果 か ら 、 Ｌ Ｉ Ｆ 非 存 在 下 で は 、 Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ３ の リ ン 酸 化 が 検 出

で き な い こ と も 確 認 で き た 。

【 産 業 上 の 利 用 可 能 性 】

【 ０ ０ ７ ２ 】

　 本 発 明 は 、 非 常 に 簡 便 に 胚 様 体 分 化 を 制 御 ・ 管 理 す る こ と を 可 能 と す る た め 、 医 療 ・ バ

イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に 関 わ る 広 範 な 技 術 に 使 用 で き る 。 特 に 再 生 医 療 分 野 に お い て 、 特 定 の

分 化 状 態 に あ る 胚 様 体 を 意 図 的 に 作 製 す る こ と が で き る と 共 に 、 胚 様 体 の 品 質 管 理 に 利 用

す る こ と が で き る 。

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【 図 １ 】 【 図 ２ 】

【 図 ３ 】 【 図 ４ 】

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【 図 ５ 】 【 図 ６ 】

【 図 ７ 】 【 図 ８ 】

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【 図 ９ 】

【 図 １ ０ 】

【 図 １ １ 】

【 図 １ ２ 】

【 図 １ ３ 】

【 図 １ ４ 】

【 図 １ ５ 】

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【 配 列 表 】

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(56)参考文献　特開２００７－３２５５４２（ＪＰ，Ａ）　　　

　　　　　　　国際公開第２００８／０８７２５８（ＷＯ，Ａ１）　　

　　　　　　　米国特許出願公開第２００７／００８２９４２（ＵＳ，Ａ１）　　

　　　　　　　Norihiko Sasaki, et al.，The Journal of Biological Chemistry，２００７年１１月１６日，

　　　　　　　Vol. 283, No. 6，PP. 3594-3606，[online]，ＵＲＬ，http://www.jbc.org/content/283/6/359

　　　　　　　4

　　　　　　　Anna Diaz-Font, et al.，Blood Cells, Molecules, and Diseases，２００６年　９月　７日，

　　　　　　　Vol. 37, Issue. 3，PP. 197-203，[online]，ＵＲＬ，http://www.sciencedirect.com/science

　　　　　　　/article/pii/S1079979606001604

　　　　　　　James W. Dennis, et al.，Biochimica et Biophysica Acta，２００２年　９月１１日，Vol. 1

　　　　　　　573, Issue. 3，PP. 414-422，[online]，ＵＲＬ，http://www.sciencedirect.com/science/art

　　　　　　　icle/pii/S0304416502004117

(58)調査した分野(Int.Cl.，ＤＢ名)

　　　　　　　Ｃ１２Ｎ　　１５／００－９０

　　　　　　　ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

　　　　　　　ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）