T.C.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI

KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP

YÖNTEMİ İLE TANIMLANMASI

Dr. Dilek NAS ÖZERDEM

DOKTORA TEZİ

DANIŞMANI

Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ

ADANA-2009

ii

TEŞEKKÜR

Doktora eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen, tez konumun seçimi

ve yürütülmesinde yol gösteren ve destekleyen tez danışmanım Parazitoloji Anabilim

Dalı Başkanı Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ’a teşekkür ederim.

Tez çalışmalarım süresince bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan Parazitoloji

Anabilim Dalı Bilim Uzmanı Biyolog Fadime EROĞLU ve Biyokimya Anabilim Dalı

Doktora öğrencisi Biyolog Ahmet GENÇ’e teşekkür ederim.

Örneklerimin toplanmasında desteğini esirgemeyen Parazitoloji Anabilim Dalı

çalışanlarına ve tezimin yazılmasındaki katkılarından dolayı Dr. Günhan ÖZERDEM’e

teşekkür ederim.

Ayrıca tez çalışmasını TF2005D4 no’lu proje ile destekleyen Ç.Ü. Rektörlüğü

Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne teşekkür ederim.

Dr. Dilek NAS ÖZERDEM

iii

İÇİNDEKİLER

KABUL VE ONAY i

TEŞEKKÜR ii

İÇİNDEKİLER iii

ŞEKİLLER DİZİNİ vi

ÇİZELGELER DİZİNİ vii

ÖZET viii

ABSTRACT ix

1.GİRİŞ 1

2.GENEL BİLGİLER 3

2.1.Leishmania’ların Sınıflandırılması 4

2.2.Yapı 5

2.2.1.Amastigot Şekil 5

2.2.2.Promastigot Şekil 6

2.3.Leishmania Parazitlerinin İnce Yapısı 7

2.3.1.Plazma Zarı ve İlgili Organeller 7

2.3.2.Kamçı ve Bazal Cisim 8

2.3.3.Kinetoplast 8

2.3.4.Mitokondri 9

iv

2.3.5.Çekirdek 9

2.3.6.Diğer Organeller 9

2.4.Leishmania’ların Evrimi 9

2.5.Visseral Leyişmanyoz 12

2.5.1.Epidemiyoloji 12

2.5.1.1.Dünyada Visseral Leyişmanyoz 12

2.5.1.2.Türkiye’de Visseral Leyişmanyoz 12

2.5.2.İmmünoloji 13

2.5.3.Patogenez 15

2.5.4.Klinik 16

2.5.4.1.İmmun Yetmezliği Olan Kişilerde Kala-Azar 18

2.5.4.2. Kala-Azar Sonrası Deri Leyişmanyozu 19

2.5.5.Tanı 19

2.5.5.1.Etkensel Tanı 19

2.5.5.2.Serolojik Tanı 21

2.5.5.2.1.rK39 Hızlı Tanı Testi 22

2.5.5.3.Moleküler Tanı 22

2.5.5.3.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu 23

2.5.5.3.2.Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi 23

2.5.6.Tedavi 24

2.6.Leishmania Türlerinin PCR-RFLP ile Tanımlanması 25

3. GEREÇ VE YÖNTEMLER 28

3.1.Kan Örneklerinden DNA İzolayonu 28

v

3.2.Amplifikasyon İçin Gerekli Çözeltiler ve Kimyasal Maddeler 29

3.2.1.Çözeltiler 29

3.2.2.Amplifikasyon Koşulları 30

3.2.3.Termal Cycler ile PCR Protokolü 30

3.2.4.Agaroz Jelde Yürütme 31

3.2.5.1.Çözeltiler 31

3.2.5.2.Yöntem 31

3.3.Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi 32

4. BULGULAR 33

5. TARTIŞMA 37

6. SONUÇLAR ve ÖNERİLER 44

7. KAYNAKLAR 46

8. EKLER 51

9. ÖZGEÇMİŞ 53

vi

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil.1.1. Leishmania amastigotu 6

Şekil.1.2. Leishmania promastigotları 6

Şekil.2.1. Leishmania amastigot ince yapısı 7

Şekil.2.2. Leishmania promastigot ince yapısı 8

Şekil.3. Leishmania’nın yaşam döngüsü 11

Şekil.4. Miniekzon PCR-RFLP genotipleri 27

Şekil.5.13A-13B primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları 35

Şekil.6.Fme-Rme primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları 35

Şekil.7.Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.donovani bulunan örnekler 36

Şekil.8. Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.infantum bulunan örnekler 36

vii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 1. Visseral leyişmanyozlu hastaların klinik belirtileri 17

Çizelge 2. Visseral leyişmanyoz tanısında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması20

Çizelge 3. Araştırma ve gelişim dönemindeki antileishmania ilaçları 25

Çizelge 4. Leishmania cinsine özgül primer dizilimi 30

Çizelge 5. 13A-13B ve Fme-Rme primerleri için kullanılan PCR programı 30

Çizelge 6. Enterobacter aerogenes (Eae I) restriksiyon enzimi 32

Çizelge 7. rK39 ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 33

Çizelge 8. PCR ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 33

Çizelge 9. PCR ve rK39 ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması 34

viii

ÖZET

KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP YÖNTEMİ

İLE TANIMLANMASI

Kala azar( VL) özellikle Çukurova bölgesinde ve ülkemizde halen önemli

bir halk sağlığı sorunudur. Akdeniz’e kıyısı bulunan ülkelerde endemiktir.

Hastalığın tanısında kemik iliğinden ve kandan yapılan yayma preparat, kültür ve

serolojik yöntemler kullanılmaktadır. Visseral leyişmanyoz (VL) endemik

bölgelerde yaşayan immun sistemi baskılanmış HIV enfeksiyonlu hastalarda

olduğu gibi bağışıklığı yetersiz hastalarda da fırsatçı bir infeksiyon olarak

bildirilmektedir. Bu yüzden visseral leyişmanyozun tanısı böyle hastalarda zordur,

serolojik tanı güvenilir sonuçlar vermemekte, ayrıca kültür yöntemi ve doğrudan

mikroskop bakısı da hassas olmamakta ve kültür zaman alıcı olmaktadır. Bu

nedenle, son yıllarda hastalığın tanısı ve daha da önemlisi hangi türün hastalığa

neden olduğunu saptamak için özellikle DNA’ya dayalı moleküler yöntemler

geliştirilmiştir.

Bu çalışmada visseral leyişmanyoz ön tanısı ile izlenen 50 hastaya ait kan

örnekleri doğrudan mikroskop bakısı, rK39 hızlı tanı testi ve PCR-RFLP yöntemi

ile çalışıldı. On hastanın doğrudan mikroskop bakısında amastigotlar görülürken,

40 hastanın mikroskop bakısında amastigotlar görülmedi. On üç hasta rK39 (+)

pozitif, otuz yedi hasta rK39(-) negatif bulundu. Yirmi dokuz hastanın PCR (+)

pozitif, yirmi bir hastanın PCR (-) negatif olduğu görüldü. PCR’ ın doğrudan

mikroskop bakısı ve rK39 hızlı tanı testine oranla sırasıyla %90 -% 100 duyarlı ve

%50-% 56.8 özgül olduğu görüldü. Sonuç olarak bu çalışmada etken türlerin

L.infantum ve L.donovani olduğu saptandı.

Anahtar Sözcükler: Visseral leyişmanyoz, ayırıcı tanı, PCR-RFLP.

ix

ABSTRACT

IDENTIFICATION OF CAUSATIVE SPECIES IN PATIENTS WITH

VISCERAL LEISHMANIOSIS BY PCR-RFLP ASSAY

Visceral leishmaniosis is a health care problem especially in Çukurova

region and in Turkey. Visceral leishmaniosis is endemic in the countries beside of

the Meditterranean Sea. Direct microscopic examination from blood and bone

marrow, culture and serological tests are the methods that used for diagnosis of

visceral leishmaniosis. Visceral leishmaniosis has been reported to be an

oppurtunistic infection in immunosuppressed patients and immunocompromised

subjects such as patients with human immunodeficiency virus infections living in

areas in which visceral leishmaniosis is endemic. Because of this the diagnosis of

visceral leishmaniosis is difficult in such patients, serological diagnosis is not

reliable for immunosuppressed patients, direct diagnosis and culture is not

sensitive and culture is time consuming. Therefore recently several methods

especially based on DNA have been developed for the diagnosis and more

important from that for the identification of the species which caused infections.

In this study, blood samples belonging to 50 patients whose were following

by preliminary diagnosis of visceral leishmaniosis were studied by direct

microscopic examination, rK39 dipstick test and PCR-RFLP. Amastigote forms

were detected from 10 samples, and not detected other 40 samples by direct

microscopic examination. Thirteen samples were found to be rK39 (+) and 37

samples were found to be rK39 (-). Twenty nine samples were (+) and 21 samples

were (-) by PCR. Sensitivity of PCR was found to be %90-%100 compare to direct

microscopic examination and rK39 dipstick test. On the other side specifity of PCR

was found to be %50-%56.8 compare to direct microscopic examination and rK39

dipstick test. As a result, in this study we found the causative species as L.infantum

and L.donovani.

Key Words: Visceral leishmaniosis, identification, PCR-RFLP.

1

1.GİRİŞ

Leyişmanyoz (Leishmaniosis) dünyada vektör aracılığı ile yayılan hastalıklar

arasında önem sırasına göre üçüncü sırada yer alan, 72’si az gelişmiş veya gelişmekte

olan ülke olmak üzere toplam 88 ülkenin tropikal ve subtropikal bölgelerinde görülen

bir hastalıktır. Afrika, Amerika ve Asya’nın pek çok ülkesinde endemiktir. Dünyada

bilinen 12-13 milyon leyişmanyoz olgusu vardır ve yılda tahminen 500.000’i visseral

(organ leyişmanyozu, kala azar) leyişmanyoz olmak üzere 2 milyon yeni olgu

görülmektedir, 350 milyon insan infeksiyon riski altındadır. Hastalığın bildirimi 32

ülkede zorunludur ve önemli sayıda olgu tespit edilememektedir 1,2,3.

Avrupa’da; Fransa, İtalya, Yunanistan, Malta, İspanya ve Portekiz’in de içinde

bulunduğu 16 ülkede insan olguları görülmektedir. Deri leyişmanyozu olgularının

%90’ından fazlası İran, Afganistan, Suudi Arabistan, Suriye, Brezilya ve Peru’dadır.

Kala-azar olgularının %90’ından fazlası ise Bangladeş, Brezilya, Hindistan, Nepal,

Etiyopya ve Sudan’dadır. Kala-azardan iyileşmeyi takiben ortaya çıkabilen ve kala-azar

sonrası dermal leyişmanyoz (PKDL) olarak bilinen şekil ise Hindistan ile başlıca Sudan

ve Kenya olmak üzere diğer Afrika ülkelerinde görülmektedir. Deri leyişmanyozunu

takiben ortaya çıkabilen ve mukokutanöz leyişmanyoz olarak bilinen diğer şekli ise

Meksika ile Orta ve Güney Amerika’da endemiktir 1,2.

Yirmiden fazla Leishmania türü insanlarda infeksiyona neden olabilir ve 30’dan

fazla tatarcık türü hastalığın yayılımında rol alır 2.

Kala-azar, sıtma, tifo, tüberküloz gibi bir grup hastalıklar ile benzer klinik

şekillerde görülebildiğinden ve bunların bazıları da kala-azar ile birlikte olabileceğinden

(koenfeksiyon) klinik tanısı zordur. Ayrıca HIV nedeni ile bağışıklığı baskılanmış

hastalarda leyişmanyoz, fırsatçı infeksiyon olarak da karşımıza çıkabilmektedir. Bu

nedenle 1980’lerin başından beri leyişmanyoz tanısında kullanılan klasik metodlara

ilaveten DNA’ya bağlı moleküler teknikler gerek tanı gerek hastalığa neden olan türü

tanımlamak için geliştirilmiştir. Çeşitli moleküler yöntemler ile infeksiyon tanımı için

2

Leishmania DNA’sını bulma ve türlerin tanımlanması hedeflenmiştir. Birçok araştırıcı

tarafından Leishmania’ya özgü primerler ile PCR amplifikasyonu yapılarak (nükleer

veya minisörkıl kinetoplast DNA, small subunit RNA veya miniekson DNA sekansları)

tür tayini yapılmaktadır. Leishmania türlerini tanımlamak için kullanılan metodlar

multiplex PCR, rastgele amplifiye polimorfik DNA (RAPD), single-strand

konformasyon polimorfizmi, restriksiyon fragment length polimorfizmi (RFLP) ve

DNA dizi analizidir. DNA’ya dayalı bu genotipik moleküler teknikler diğer tanı

yöntemlerine oranla daha güvenilir ve özgüldür 5,6,7.

Bu çalışmada klasik metodlar ile tanısı konulan ya da konulamayan kala-azarlı

hastalarda tanı amacıyla polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemi kullanılmış ve

restriksiyon enzimi uzunluk polimorfizmi (RFLP) yöntemi ile de tür tayini yapılmıştır.

3

2. GENEL BİLGİLER

Antartika dışında bütün kıtalarda görülen leyişmanyoz vektör aracılığı ile

yayılım gösteren zoonotik/antroponotik karakterli bir paraziter infeksiyon hastalığıdır 3.

Protozoonların Mastigophora grubunda bulunan Trypanosomatidae ailesinin

Leishmania ve Trypanosoma cinsi insanların kan ve dokularında yerleşirler 5,8.

Leishmania türleri yaşam döngülerinde biri omurgalı diğeri omurgasız olmak

üzere iki konak kullanırlar; insan, köpek, kemirgen, sırtlan, kobay gibi omurgalı

canlıların vücudunda hücre içi paraziti olarak amastigot şeklinde; omurgasız konakta ve

in vitro kültür ortamlarında promastigot şeklinde bulunurlar. Bu parazitlerin vektörü ya

da omurgasız konağı Eski Dünya’da Phlebotomus ve Yeni Dünya’da Lutzomyia cinsi

kan emici kum sinekleridir. Sadece dişi olanlar biyolojik vektörlük yapabilir; çünkü

erkek tatarcık kan emmez 5,8,9.

Leyişmanyoz insanda üç klinik şekilde görülür.

-İç organlar leyişmanyozu (visseral leyişmanyoz, VL, kala-azar)

-Deri leyişmanyozu (Kutanöz leyişmanyoz, KL)

-Mukokutanöz leyişmanyoz (Espundia, MKL)

Sonraki yıllarda diffüz (yaygın) deri leyişmanyozu (DKL) ve kala-azar sonrası

deri leyişmanyozu (PKDL) da bu gruplara eklenmiştir 3,8,9.

Asya’da kara hastalık veya kala-azar olarak bilinen visseral leyişmanyoz uzamış

ve düzensiz ateş, splenomegali, hepatomegali, kilo kaybı, progresif anemi, pansitopeni,

hipergamaglobulinemi ve komplikasyon olarak ciddi infeksiyonlarla karakterizedir.

Visseral leyişmanyoz hastalığın en ciddi şeklidir ve tedavi edilmezse %100 ölümle

sonuçlanmakta, bağışıklık bırakmamaktadır 3,4.

Visseral leyişmanyoz 88 ülkede görülmekle birlikte olguların %90’ı Hindistan

ve Sudan’dadır. Visseral leyişmanyozdan iyileşmeyi takiben bazı hastalarda (Sudan’da

%50 ve Hindistan’da %1-3 oranında) uzun süreli ve pahalı tedaviyi gerektiren kala-azar

sonrası deri leyişmanyozu (PKDL) gelişmektedir. Visseral leyişmanyozun yayılımında

bu hastalar önemli role sahiptir. Visseral leyişmanyoza Leishmana donovani kompleksi

neden olmaktadır. Bu kompleks üç türü kapsar; L. donovani, L. infantum ve L. chagasi.

4

L. donovani Hindistan’da görülen visseral leyişmanyoz etkenidir. L. infantum Akdeniz

bölgesinde çocuklarda görülen kala-azar etkenidir. Bununla birlikte bu bölgede HIV

infeksiyonunun artan prevalansı nedeniyle HIV-VL koenfeksiyonu erişkin

populasyonda sıklıkla rapor edilmektedir. L. chagasi ise Latin Amerika’da çocuklarda

görülen ve lenfadenopatinin baskın olduğu kala-azar etkenidir. Eski Dünya deri

leyişmanyozu etkeni olan L.tropica’nın bağışıklığı baskılanmış kişilerde kala-azara

neden olduğu da rapor edilmiştir 4.

Leishmania’nın 20’den fazla türü insanları infekte edebilir, özellikle HIV/AIDS

birlikteliğinde farklı türler görülebilmektedir. Hastalığın yayılımında rol alan 30 tatarcık

türü tanımlanmıştır. Leyişmanyoz hayvan rezervuarlardan dolayı zoonotik bir hastalık

iken bazı bölgelerde ise insan hastalığın tek rezervuarıdır, bu da vektör ve rezervuar

kontrolünü masraflı ve imkânsız kılmaktadır 2.

2.1. Leishmania’ların Sınıflandırılması

Leyişmanyozda insan infeksiyonu 30 Leishmania türünün 21’i tarafından

oluşturulmaktadır. Bu farklı türler yapısal olarak ayırt edilememekte ancak izoenzim

analizleri, moleküler metodlar veya monoklonal antikorlar kullanılarak tür tayinleri

yapılabilmektedir 3.

Alem: Protista

Alt alem: Protozoa

Şube: Sarcomastigophora

Alt şube: Mastigophora

Takım: Kinetoplastida

Aile: Trypanosomatidae

Cins: Leishmania

Türler: L. donovani, L. infantum, L. chagasi, L. tropica, L. major, L. aethiopica,

L. mexicana (L.m. mexicana, L.m. amazonensis, L.m. venezuelensis, L.m. pifanoi, L.m.

enrietti)

5

2.2. Yapı

Leishmania cinsine ait türlerin insan ve diğer memelilerin vücudunda kamçısız

(amastigot) ve tatarcık vücudunda kamçılı (promastigot) olmak üzere iki evrim şekli

vardır 3,5.

2.2.1 Amastigot Şekil

Amastigotlar 2.5-6.8 µm büyüklüğünde yuvarlak veya oval şekilli ve

hareketsizdir. Parçalı çekirdekli lökositler, monositler ve endotel hücreleri içinde tek tek

veya gruplar halinde veya hücre dışında bulunurlar. Besinlerini içinde bulundukları

hücreden alırlar, aeropturlar, büyük makrofajlar içinde boyuna ikiye bölünerek

çoğalırlar 3,8,10.

Amastigotlar çok küçük olduklarından dolayı ışık mikroskobunda Giemsa ile

boyalı preparatlarda mavi sitoplazmalı merkezi yerleşimli yuvarlak veya oval pembe-

koyu kırmızı çekirdek veya çekirdeğe bitişik fakat daha küçük olan yuvarlak veya

çubuk şeklinde parlak kırmızı-menekşe renkte boyanan bir sonraki dönemde kamçının

çıkacağı yer olan kinetoplast dışında iç yapısı ayırt edilemez (Şekil 1.1 ) 8,10.

Sitoplazmada ayrıca vakuoller, nokta şeklinde bleforablast (kamçı kökü) ve

bleforablasttan çıkıp ön kısımda sonlanan bir akson bulunmakta, ancak kamçı hücre

dışına serbest olarak çıkmamaktadır 3.

Bütün Leishmania türlerinde sitoplazmada tek bir mitokondrium, düz ve

granüllü endoplazmik retikulum, golgi cihazı ve lizozomlar yer almaktadır. Golgi cihazı

endositoz ve ekzositozda rol alır, lizozomlar içerdikleri hidrolitik enzimler sayesinde

çeşitli enzim aktiviteleri ile parazitin beslenmesine yardımcı olurlar 3,10.

6

Şekil 1.1. Leishmania amastigotu X100

2.2.2. Promastigot Şekil

Promastigotlar vektörü olan tatarcıkların bağırsaklarında ve amastigotların

uygun besiyerlerinde şekil değiştirmesinden sonra görülür. Promastigotlarda da

organeller sayıca değişmekle beraber aynıdır. En önemli fark promastigotların 8-15 µm

mekik şeklinde ve hareketli olmalarıdır. Ön uçtan çıkan 18-20 µm uzunluğunda serbest

bir kamçısı ve kamçı kökü yanında yerleşmiş 9 çift periferik ve bir çift merkezi liften

oluşmuş bir aksonemi bulunmaktadır. Ön uçta yuvarlak veya at nalı şeklinde bir

kinetoplast, kinetoplastın ön kısmında ve kamçının dip kısmında bleferoblast

bulunmaktadır. Merkezi bir çekirdek ve çekirdekçik ve çekirdek zarında da porlar

bulunmaktadır (Şekil 1.2 ) 8,10.

Şekil 1.2. Leishmania promastigotları X100

7

2.3 Leishmania Parazitlerinin İnce Yapısı 2.3.1. Plazma Zarı ve İlgili Organeller

Amastigot ve promastigot şekillerinde bulunan plazma zarı 2-4 nm genişliğinde

ve 3 tabakalı görünümdedir. Hemen altında 20-22 nm çaplı ve düşük yoğunlukları

nedeniyle plazma zarından ayırt edilebilen birbirine paralel yerleşimli subpelliküler

mikrotübüller uzanmaktadır, bunlar organizmanın iskeleti görevini görürler.

Mikrotübüllerin sayıları, kalınlıkları, birbirinden uzaklıkları türlere göre değiştiği için

Leishmania türlerinin ayırımında da kullanılmaktadır. L. donovani’de 80-120; L.

tropica’da 80-115 arasında mikrotübül bulunmaktadır. Bu ayrım Yeni Dünya ile Eski

Dünya türleri arasında daha belirgin olarak görülmektedir 3,10.

Plazma zarı parazitin ön ucunda invagine olarak bir kese oluşturmaktadır. Bu

kese "kamçı kesesi" veya "rezervuar" olarak adlandırılmakta ve parazit için hayati

öneme sahip olan kamçıyı barındırmaktadır (Şekil 2.1 ve 2.2) 3.

Şekil 2.1.* Leishmania amastigot ince yapısı 10

8

Şekil 2.2.* Leishmania promastigot ince yapısı 10

* n: çekirdek, k: kinetoplast, f: kamçı, fp: kamçı kesesi, ly: lizozom, g:

glikozom, gc: golgi kompleksi, mt: mikrotubül, mi: mitokondri, pm: plazma zarı

2.3.2 Kamçı ve Bazal Cisim

Promastigotlarda bulunan kamçı ince, uzun, ip gibi, dışı hücre zarından yapılı

kılıfla kaplı bulunmaktadır. Kılıf içinde 9 çift çevrede, bir çift ortada olmak üzere 10

çift mikrotübülden oluşmaktadır. Kamçı 200 nm kalınlığında olup parazitin

gövdesinden daha uzundur, başlangıç ucu kamçı kesesi ile çevrilidir 3.

2.3.3 Kinetoplast

Kinetoplastida takımında yer alan Leishmania, Trypanosoma, Crithida ve diğer

cinslere ait olan organizmaların hepsi kamçının bazal kısmında yerleşmiş kinetoplast

adı verilen bir hücresel organele sahiptir. Kinetoplast birkaç bin kopya sarmal DNA

molekülünden oluşmuştur, mitokondrium içine yerleşiktir. Bu DNA şebekesi

kinetoplast DNA (kDNA) olarak adlandırılmaktadır. Kinetoplast büyük sarmal

9

(maksisörkıl) ve küçük sarmal (minisörkıl) adı verilen iki gruptan oluşmuştur; her

kinetoplastta büyük sarmalda 20-35 kb büyüklüğünde, homojen 20-50 kopya; küçük

sarmalda ise 0.5-2 kb büyüklüğünde heterojen 5 bin-10 bin kopya bulunmaktadır 3,10.

2.3.4 Mitokondri

Tüm Leishmania türlerinde tek bir mitokondri bulunmaktadır, ancak bazen ek

olarak çok küçük ve az kristalı başka mitokondrilerde görülebilmektedir. Kinetoplast da

mitokondri içinde yer almaktadır 3.

2.3.5 Çekirdek

Parazitin ön kısmına yakın bulunan oval veya yuvarlak çekirdek 7 nm

kalınlığında iki zardan oluşmaktadır. Merkezi bir çekirdekçiği bulunmakta, dış çekirdek

zarı endoplazmik retikulum ile devam etmektedir 3.

2.3.6 Diğer Organeller

Endoplazmik retikulumun hem düz hem de granüllü tipleri bulunmakta ve

çekirdeğin etrafında yer almaktadır. Stoplazmanın her yerine dağılmış durumdadır.

Golgi cihazı çekirdek veya kinetoplasta yakın bir yerde bulunmaktadır. Lizozomlar

kamçı rezervuarı ile çekirdek arasındadır, vakuoller sitoplazmada yer alan zarla çevrili

yapılar olarak görülmektedir 3.

2.4 Leishmania’ların Evrimi

Leishmania türlerinin vektörü olan Phlebotomus veya Lutzomyia cinsi tatarcıklar

leyişmanyozlu bir omurgalı konaktan kan emerken makrofajlar içinde bulunan paraziti

amastigot şeklinde almaktadır. Tatarcık vücudunda amastigotlar gelişim sürecinde

birkaç farklı yapısal şekle dönüşürler, bunlar sırasıyla prosiklik promastigotlar,

nektomonad promastigotlar, haptomonad promastigotlar, paramastigotlar ve metasiklik

promastigotlar olarak adlandırılır 3.

İn vitro koşullarda uygun kültür ortamı ve sıcaklık ( genellikle 26oC)

sağlandığında amastigotların promastigotlara dönüşümü 24-48 saatte tamamlanır 3,5.

Tatarcıkların kan emmesinden 1 saat sonra amastigotlar abdominal midededir,

12-24 saat sonra abdominal midenin peritrof zarının içinde promastigotlar

10

görülmektedir. Nektomonadlar midede 36-48 saat sonra görülürler, 3. günde torasik

midede haptomonadlar, 6. günde bütün sindirim kanalında promastigotlar görülmeye

başlar, 14. güne kadar gittikçe artar. Tatarcıklardaki evrim süresi Leishmania’nın

türüne ve çevrenin sıcaklığına bağlı olarak 4-18 gündür 5,8,9.

İnfektif metasiklik promastigotları barındıran vektör tatarcık, kan emmek için

omurgalı konağı soktuğu zaman belli miktarda (500-1000) promastigotları da gidiş

yönü kan akımının tersine olduğu halde konağa inoküle ederler. Deriden vücuda giren

promastigotlar ilk saatlerde serumdaki kompleman tarafından opsonize edilmekte ve bu

şekilde komplemanla opsonize edilmiş parazit omurgalının makrofaj, monosit veya

Langerhans hücreleri tarafından kolayca fagosite edilmektedir. Fagosite edilen

promastigotlar kamçılarını kaybederek amastigot şekle dönüşürler, bu süreç 12-24

saatte tamamlanır 3,8.

Amastigotlar daha sonra konak hücrenin fagolizozomal kompartmanında

fagositik vakuol içinde bölünerek çoğalır. İnfekte hücre parazitin sayıca çoğalması

sonucunda parçalanır ve amastigotlar ortaya çıkarlar. Bu amastigotlar tekrar diğer

makrofajları infekte edebilmekte ve dalak, karaciğer, kemik iliği gibi organlara

dağılarak bu organlarda çeşitli patolojilere neden olmaktadır 3,11.

İnfeksiyonun bundan sonraki seyrini parazitin türü, invazyon yeteneği,

patojenitesi ve konağın immün cevabını yönlendiren genetik özellikleri belirler.

İnfeksiyon deride sınırlı kalabilmekte veya iç organlara göç edebilmektedir 3,11..

Seyrek olarak görülse de leyişmanyoz tranplasental yol ile kan transfüzyonu ve

kontamine iğneler ile de bulaşabilmektedir (Şekil 3) 2,3,11.

11

i

Şekil 3. Leishmania’nın yaşam döngüsü2

12

2.5 Visseral Leyişmanyoz

2.5.1 Epidemiyoloji

2.5.1.1 Dünyada Visseral Leyişmanyoz

Visseral leyişmanyoz dünyada 88 ülkenin tropikal ve subtropikal bölgelerinde

endemiktir. Dünyada bilinen 12 milyon leyişmanyoz olgusu vardır, her yıl 1.5 -2 milyon

yeni olgu görülmektedir. Her yıl görülen 500.000 yeni visseral leyişmanyozun % 90’ı

Nepal, Bangladeş, Hindistan, Sudan ve Brezilya’dadır. Dünyadaki olguların yaklaşık

%50’si Hindistan’da görülmektedir. İnfeksiyon erkeklerde kadından daha fazla

görülmektedir 1,2,3.

Visseral leyişmanyozda, sadece insanın rol aldığı "insan-vektör-insan" döngüsü

Hindistan gibi bazı bölgelerde meydana gelmekte diğer bölgelerde ise küçük

kemirgenler veya köpekgiller rezervuar olarak davranmaktadır 1,2,3.

Leyişmanyozun coğrafik yayılımı, infeksiyonun vektörü olan tatarcıkların

bulunduğu yerlerle sınırlıdır. Kentleşmenin getirdiği ekonomik gelişmeler, ormanların

yok edilmesi, yeni yerleşim alanlarının geliştirilmesi, kırsal alanlardan kentsel bölgelere

göç tatarcıkların yayılımında rol alan faktörlerdir. Ayrıca bağışıklığı yetersiz HIV ile

infekte hastalar özellikle Güney Avrupa ve Afrika’da yeni bir hasta grubunu

oluşturmaktadır. Leishmania/HIV koenfeksiyonu özellikle Güney Avrupa’ da; ki

buradaki erişkin VL olgularının %25-70’i HIV ile infektedir, gerçek bir "yeni ortaya

çıkan hastalık" olarak değerlendirilmelidir. Leyişmanyoz böyle hastalarda fırsatçı bir

infeksiyon gibi davranmaktadır. Ayrıca Leishmania parazitlerinin RES dışında, kanda

bulunması HIV ile infekte hastaları bir rezervuar ve vektörler için infeksiyon kaynağı

haline getirmektedir 4.

2.5.1.2. Türkiye’de Visseral Leyişmanyoz

Visseral leyişmanyoz daha çok Ege ve Akdeniz bölgelerinde görülmekle birlikte

hemen hemen bütün bölgelerimizden bildirilmiş olgular bulunmaktadır. Hastalığın

etkeni olan Leishmania parazitleri hem insandan hem de köpeklerden izole edilmiş,

izoenzim analizi, EF (excreted factor) analizi, monoklonal antikorlar ve PCR ile diğer

Akdeniz bölgesi ülkelerinde olduğu gibi etkenin Leishmania infantum olduğu ve

doğadaki rezervuarlığını da köpeklerin yaptığı epidemiyolojik çalışmalarla

kanıtlanmıştır 3.

13

Ülkemizde visseral leyişmanyozu bulaştıran vektör Phlebotomus türü kesin

olarak gösterilmemekle birlikte P. neglectus, P. syriacus ve P. tobbi olası vektörler

olarak saptanmışlardır 3.

Hastalık ülkemizde genelde 12 yaş altındaki çocuklarda görülmekle birlikte

Denizli, İzmir ve Çanakkale gibi bazı bölgelerimizde erişkinlerde görülebilmektedir 3.

2.5.2 İmmunoloji

Bağışıklık sisteminin Leishmania infeksiyonlarına karşı cevabı karmaşıktır.

Birtakım özel koşullara bağlı olarak hızla iyileşebilir veya daha da kötüleşebilir. Bunlar

kısmen memeli konakların genetik farklılıklarına, kısmen parazitin tür ve suşlarının

genetik farklılıklarına, kısmen de ısıran sinek sayısı, yeri ve büyüklüğü gibi faktörlere

bağlıdır 11.

L. donovani’ye karşı ise insanların direnci değişiktir. Normal insan serumunda

bu paraziti eriten bazı maddelerin varlığı gösterilmiştir. Bu eritici madde yeni doğan

çocuklarda vardır, fakat daha sonra azalır ve 5,5-6 yaşından sonra yeniden ortaya çıkar.

İnsanda Leishmania infeksiyonları sırasında antikorlar ve hücre aracılığıyla olan

bağışıklık gelişmektedir. Hücresel bağışıklık, geç tip aşırı duyarlılık reaksiyonu

şeklindedir ve bunun varlığını göstermek için Leishmanin (Montenegro) deri testi

kullanılır. Bu testte antijen olarak besiyerlerinde üretilmiş promastigotlar kullanılır. Test

türe özgül değildir, aktif kala azarda negatiftir fakat tedaviden veya infeksiyonun

kendiliğinden iyileşmesinden sonra pozitifleşir 3,5,8,9.

Leyişmanyoz infeksiyonları hasta serumunda anti-leishmania antikorlarının

varlığı ile karakterizedir. Deri leyişmanyozunda aktif lezyon döneminde antikor titreleri

genellikle çok düşük olarak bildirilmekle birlikte bazı çalışmalarda antikor takiplerinin

L. braziliensis infeksiyonlarında tanı ve prognoz takibinde kritik öneme sahip olduğu

vurgulanmaktadır. Ancak kala azar olgularında antikor seviyeleri tipik olarak çok

yüksek saptanmaktadır. Yapılan klinik çalışmalarda tüm hastalarda IgG1 artışı

saptanırken antimon tedavisine dirençli olgularda belirgin olarak IgG2 ve IgG3 artışı

olduğu, IgM, IgA ve IgE seviyelerinde değişiklik olmadığı saptanmıştır. Son

çalışmalarda IgG’nin koruyucu etkisi olmadığı gibi infeksiyonun ilerlemesine neden

olan faktörlerden olduğu anlaşılmıştır 11.

14

Leishmania parazitlerinin makrofaj içinde yaşama mecburiyeti göz önüne

alındığında bu parazitlerin makrofaj effektör mekanizmaları tarafından ortadan

kaldırılmaya çalışılacağı ve bu yüzden de nitrik oksit sentezini tetiklediği

görülmektedir. İn vitro ve in vivo modellerde bu sentezin parazitin hücre içinde yok

edilmesi için gerekli olduğu gösterilmiştir 11,12.

Leishmania parazitleri konak makrofajlarının fagolizozomları içinde gizlenmek

suretiyle sıvısal bağışıklıktan (antikor yanıtı) kaçmaktadırlar. Hücre içindeki parazit

dolaşımdaki antikorlara maruz kalmadığı için antikorların hastalığın seyri üzerine etkisi

yoktur. Hayvanlarda B hücrelerinin yokluğunun infeksiyonun seyrini etkilememesi,

anti-IgM ile antikorların baskılanmasının herhangi bir etki yaratmaması, yüksek

düzeyde IgG ve IgM seviyelerinin enfeksiyona karşı koruyucu bir etki göstermemesi

gibi delillerden dolayı da bağışıklığın tamamıyla hücresel bağışıklığa bağlı olduğu

belirtilmektedir 11.

Leyişmanyozdaki koruyucu bağışıklık da hücresel bağışıklık ile ilgilidir.

Bununla beraber T lenfositleri yabancı antijenleri sadece MHC II yüzey molekülüne

sahip olan makrofajlar, Langerhans hücreleri ve keratinositler gibi antijen sunan

hücreler tarafından sunulduğu zaman tanıyabilmektedir. Sistem çalıştığı zaman ve

antijen sunan hücre T hücre ile etkileştiğinde T hücre sitokin üretmekte ve bu da

makrofajlar tarafından Leishmania’nın öldürülmesini desteklemektedir 3,11.

Leishmania antijenlerinin T hücrelerine sunulması iki şekilde sonuçlanır; ya

etkili bir hücresel yanıt oluşur, bu Th 1 etkisidir veya etkisiz bir humoral yanıt oluşur bu

da Th 2 etkisidir. Th 1 yanıtı ile T hücreleri IL-2 ve IFN gamma sitokinlerinin sentezini

arttırarak makrofajları aktive ederler. Th 2 cevabı ile de IL-4, IL-5, IL-10 ve

Leishmania parazitlerinin makrofaj içinde yok edilmesini durduran TGF-β salınır. Buna

rağmen her bir Leishmania türü hastalığın bir şekli ile sonuçlanır, konak hücresel

bağışıklığı kliniği belirler; infeksiyon klinik veya subkliniktir, visseral, kutanöz veya

mukokutanöz şekildedir, lezyonlar azdır veya yaygındır ve tedaviye yanıt tam veya

yetersizdir 11,12.

15

2.5.3 Patogenez

Parazite ait faktörler ve konağın savunma mekanizmaları patogenezi doğrudan

şekillendirmektedir 11.

Kala azara neden olan Leishmania türleri tüm vücutta RES (retiküloendotelyal

sistem) hücrelerini infekte etmektedir. Dalakta mononükleer fagositlerin artması sonucu

hipertrofi görülür. Lenf düğümleri folliküllerinin yerini parazitli mononükleer

hücrelerin alması ile büyürler. Karaciğerde parçalı nekroz ve Kupffer hücrelerinin

büyümesi ve sayıca artması sonucu hipertrofi görülür. Kemik iliğinde genellikle

hiperplazi olur ve diseritropoez ile sonuçlanır. Kemik iliğinde yapısı bakımından

normoblast ile megaloblast arasında ara eritroblastlara daha fazla rastlanır.

Trombositopeni ve pıhtılaşma faktörlerinde azalma sonucunda kanamalar olabilmekte,

ayrıca dalaktaki hipertrofiye bağlı ortaya çıkan hipersplenizm eritrosit, granülosit ve

trombositlerin dalakta yıkımına neden olmakta, etkisiz eritropoez nedeniyle de ciddi

pansitopeni tablosu ortaya çıkmaktadır. Beyaz kan hücre sayısı genelikle mikrolitrede

4000’in altında, 2000- 3000 arasında değişmekte ve ilerleyici monositoz gelişmektedir.

Gamaglobülinler serum proteinlerinin %60-70’ini oluşturabilmektedir 3,5,9.

Kala azara bağlı olarak deri belirtileri de söz konusu olmaktadır. Bunlar

tedavinin sonlarına doğru veya tedaviden bir iki hafta sonra görülebildiği gibi,

tedaviden 1-2 yıl sonra, spontan iyileşmeden yıllarca sonra da görülebilirler. Kala azar

sonrası deri leyişmanyozu (PKDL) adı verilen deri belirtileri deri leyişmanyozunun

erken dönem deri belirtilerinden farklılık gösterir. Makülle başlar ve lezyon büyüdükçe

epidermisin incelmesine ve böylece hipopigmentasyona neden olur. Lezyonlar

eritamatöz ve nodülerdir, bol lenfosit ve plazma hücre infiltrasyonu vardır 3.

Glomerüler komplekslerde IgG, IgA, IgM, kompleman ve fibrinojen

tanımlanmıştır. Glomerüllerde subendotelyal ve mezenşimal immun komplekslerin

birikmesiyle böbreklerin hepatosplenik şistozomiyoz olgularına benzemekte olduğu

bildirilmiştir. Lenfosit ve plazma hücreleri infiltrasyonu ile interstisiyel nefrit

bildirilmiştir 9.

İnce bağırsağın lamina propriyasında parazit dolu makrofajlar, villuslarda

genişlemeye ve bölmeli kısalmaya neden olabilirler. Ancak ülserasyon yalnızca kalın

bağırsakta görülür. Ayrıca parazit içeren histiyositlere sürrenallerin sinüzoid

16

hücrelerinde, pankreas ve testisin interstisiyel bağ dokusunda ve diğer organlarda da

rastlamak mümkündür.13

2.5.4 Klinik

Visseral leyişmanyoz L. infantum ve L.donovani ’nin neden oldukları infeksiyon

ile karakterizedir. L.tropica ile de bazı olgular olabildiği bildirilmiştir. Bu iki tür de

benzer kliniğe neden olur, ancak L.infantum genellikle küçük çocukları etkiler ve lenf

bezi tutulumu daha önceliklidir 3.

Hastalık 2 hafta ile 6 ay arasında değişebilen bir inkübasyon periyodunu takiben

ortaya çıkmaktadır. Klinik bulgular ani veya sinsi başlangıçlıdır. Sinsi başlangıç

endemik bölgelerde sık görülür. Ani başlayan olgularda burun, diş eti ve bağırsak

kanamaları görülebilir. Anemi, granülositopeni ve hatta agranülositoz gelişebilir. Bu

olgularda birkaç haftada ölüm gerçekleşebilir. Subakut ve süregen olgularda ateş,

halsizlik, iştahsızlık, öksürük ve kilo kaybı vardır. Çocuklarda bu klinik bulgulara

gelişme geriliği ve organomegali eşlik edebilir 3,9.

Hastalık ilerledikçe zayıflama ve anemi belirginleşir. Sıklıkla karında şişlik

vardır. Akut başlangıç sıtma nöbetini andıran bir periyodisite gösterir. Bazen ishal ve

tifoid ateşi andıran bir başlangıç olabilir. Ateş sürekli, intermittant veya remittant

olabilmekte ve düzensiz aralıklarla oluşabilmekte, günde iki veya üç kez ateşin

yükselmesi tipik olsa da her zaman görülmemektedir. Ateşin yükselmesi ile birlikte

dalak ve daha yavaş olarak karaciğer büyür. Hepatomegali olguların 1/3’ünde görülür.

İki organ da sıklıkla yumuşak ve genelde hassas değildir. Hastalığın ilerleyen

dönemlerinde asit oluşabilmektedir. Çocuklarda ileriki dönemlerde periferal ödem

görülebilmektedir ve hipoalbuminemi ile birlikte olabilir. Olguların %5-10’unda hafif

bir hepatosellüler sarılık gelişir ve karaciğer enzimleri de yüksektir. Bu tablolar kötü

prognozu gösterir 3,9.

Deride pullanma, kepeklenme görülür ve saçlar dökülür. Kala azar, kara ateş

anlamındadır ve derinin tipik olarak koyulaşmasını anlatmaktadır. Deri koyulaşması

genellikle açık tenli kişilerde olmakta, çok açık tenli veya koyu tenli kişilerde bu

koyulaşmayı anlamak zorlaşmaktadır. Koyuluk özellikle alın, şakaklar ve ağız etrafında

belirgindir 3,9.

17

L. donovani genellikle deri lezyonlarına neden olmaz. Nadiren başlangıçta

ısırma yerinde bir papül oluşur. Deri leishmanoidi olarak bilinen bir durum bazen

visseral leyişmanyozun tedavi edildiği hastalarda veya subklinik olgularda görülebilir.

Deri lezyonları tüm vücudu kaplayan veya yama şeklinde olan eritematöz ya da

depigmente maküllerdir. Burun üzerinde kelebek şeklinde yayılım görülebilir. Daha

sonra lezyonlar nodüler olmaya eğilim gösterir ve bu evrede lepra nodülleri ile

karışabilir. Deri lezyonlarında parazit bulunabilir ve bu hastaların da bu yüzden

rezervuar olabileceği düşünülmektedir 3.

Visseral leyişmanyozlu hastalarda değişik klinik belirtiler görülür ( Çizelge 1) 3.

Çizelge 1. Visseral leyişmanyozlu hastaların klinik belirtileri3

Klinik belirti Sudan Hindistan Brezilya (%) (L. donovani) (L. donovani) (L. chagasi) Ateş 95 99 95 Splenomegali 95 98 99 Kilo kaybı 80 87 98 Anemi 75 96 98 Lenfadenopati 75 90 30 İştah kaybı 70 30 20 Öksürük 75 50 40 Hepatomegali 60 98 90 İshal 40 50 60 Bulantı 15 az az Ödem 5 _ 40

Birçok yerde sıtma daha yaygın olarak görülen bir infeksiyondur ve visseral

leyişmanyoz ile kliniği benzerdir. Uzun süren düzensiz ateşi olan, antimalarya ilaçlarına

yanıt vermeyen veya kan yaymaları birkaç kez incelendikten sonra sıtma parazitlerine

rastlanmayan hastalarda visseral leyişmanyoz mutlaka düşünülmelidir. Ayırıcı tanıda

ise; tifo, tuberküloz, AIDS, bruselloz, kronik hepatit, lenfoma ve lösemi gibi hastalıklar

akla gelmelidir 3.

Laboratuvarda lökopeni, trombositopeni ve serumda etkene özgü antikorların

saptanması klinik tanıyı doğrulamak için önemlidir. Pnömoni, bronşit, tuberküloz,

sıtma, ishal, viral infeksiyonlar, bakteriye bağlı deri infeksiyonları, orta kulak iltihabı,

ağızda yaralar visseral leyişmanyoz sırasında ortaya çıkabilen ikincil infeksiyonlardır.

18

Trombositopeni nedeniyle burun, diş eti ve bağırsak kanamaları olabilir. Ölüm ikincil

infeksiyonlar veya kanamalara bağlı olarak gelişir 3,13.

Serolojik çalışmalar ve leishmanin deri testi sonuçları spontan iyileşen L.

infantum ve L. chagasi’nin neden olduğu subklinik infeksiyonların L. donovani’nin

neden olduğu klinik kala azardan daha sıklıkla görüldüğünü göstermektedir. Ancak L.

donovani epidemilerinde infeksiyon çoğunlukla semptomatiktir ve ölüm oranı daha

yüksektir 12.

2.5.4.1 İmmun Yetmezliği Olan Kişilerde Kala-Azar

İmmun sistem ile son derece yakın ilişkili bir infeksiyon olan leyişmanyoz

hücresel immun yanıtın azaldığı her durumda atipik bir klinikle görülmekte ve tedaviye

daha dirençli olmaktadır. Bu durumdaki kişilerin çoğu HIV ile infekte kişilerdir ve

özellikle Güney Avrupa, Hindistan, Güney Amerika ve Afrika’da HIV/Leishmania

infeksiyonlarının birlikte görülme sıklığı artmaktadır 3,4,12.

Leishmania-HIV koenfeksiyonu özellikle visseral leyişmanyozlu erişkinlerin

%25-70’inin aynı zamanda AIDS de olduğu Güney Avrupa’da yeni bir hastalık gözüyle

değerlendirilmekte ki leyişmanyoz bu hastalarda fırsatçı bir infeksiyon gibi

davranmakta ve burada visseral leyişmanyozun AIDS ile sınırlı bir hastalık olarak ele

alınması önerilmektedir. Ayrıca Leishmania parazitlerinin RES dışında periferik kanda

da bulunması HIV ile infekte hastalarda bu kişileri vektörler için infeksiyon kaynağı ve

rezervuar yapmaktadır. Periferik kanda parazit yükü genellikle fazladır ve intravenöz

ilaç kullanıcıları arasında ortak şırınga paylaşımından dolayı bulaşmanın olduğu da

gösterilmiştir. Farklı coğrafik bölgelerde ve farklı konaklarda leyişmanyozun yeniden

ortaya çıkması infekte hastaların klinik bulgularının değişmesinden başka tanı alanında,

tedavi ve hastalık kontrolünde yeni yaklaşımların olmasını gerektirmiştir 4.

Kortikosteroid kullanan, immun baskılayıcı tedavi alan hastalar, lenfomalı,

lösemili, kronik hepatitli, böbrek nakli olan, sarkoidozisli, Crohn hastalığı olanlar,

sistemik lupus eritematozisli hastalar gibi başka nedenlerle immun sistemi baskılanan

hastalar visseral leyişmanyoza daha duyarlı kişiler olarak bildirilmektedir 3.

19

2.5.4.2 Kala-Azar Sonrası Deri Leyişmanyozu

Kala azar sonrası deri leyişmanyozu genel olarak visseral leyişmanyozun bir

komplikasyonudur. Visseral leyişmanyoz geçirmiş ve iyileşmiş, bazen geçirmemiş

hastalarda maküler, makülopapüler ve nodüler döküntü ile karakterizedir 3,12,13.

Kala azar sonrası deri leyişmanyozunn ortaya çıkışında hastaların immun

yanıtındaki olayların etken olduğu görüşü ağırlık kazanmakla birlikte mekanizması tam

olarak açıklanamamıştır 3.

L. donovani’nin neden olduğu visseral leyişmanyozun başarılı tedavisinden

sonra kala azar sonrası deri leyişmanyozu gelişebilmektedir ancak L. infantum ve L.

chagasi’ nin etken olduğu olgularda ise çok ender olarak görülmektedir 3,12.

Dünyada post kala-azar dermal leyişmanyoza Asya’da Nepal, Bangladeş ve

Hindistan’da, Doğu Afrika’da ise Sudan, Etopya ve Kenya’da rastlanılmaktadır, ancak

genel özellikleri arasında farklar olduğu belirtilmektedir 3.

Afrika’da ya başarılı olduğu kesin olan tedavinin sonuna doğru ya da tedaviden

sonra birkaç hafta ile bir ay sonraki sürede ortaya çıkar. Sudan’da subklinik ve klinik

visseral leyişmanyozlu hastaların yaklaşık %55’inde kala azar sonrası deri

leyişmanyozu gelişir. Hindistan’da ise daha az sıklıkla gelişmekle birlikte tedaviden

aylar hatta yıllar sonra ortaya çıkabilir. Kala azar sonrası deri leyişmanyozu genellikle

ani ve ciddi başlangıçlıdır, deri ve mukozalarda deskuamasyonlara neden olur. Daha

sıklıkla hipopigmente yamalar, nodüller ve plaklarla karakterizedir. Biyopsilerde parazit

yok veya çok azdır. Salgınlarda kala azar sonrası deri leyişmanyozlu hastalar L.

donavani rezervuarı olabilirler 3,12.

2.5.5 Tanı

Visseral leyişmanyoz tanısında eğer olanak varsa birden fazla tanı yönteminin

kullanılması önerilmektedir. Böylelikle diğer hastalıklardan ayırıcı ve doğru tanı

konulması mümkün olmaktadır 3,4.

2.5.5.1 Etkensel Tanı

Leyişmanyoz, klinik özellikleri ile akla gelebilir, serolojik ve deri testleri ile de

desteklenebilir ancak doğrudan bakı veya kültür ile parazit görülerek doğrulanmalıdır 10.

20

Etkene yönelik araştırmalar, doğrudan etkenin kendisine veya ona karşı oluşan

reaksiyonlara dayandırılmakta olup her tanı metodunun parazitin tipi ya da incelenen

klinik örnekten bağımsız olarak kendi içinde avantajları ve dezavantajları bulunduğu

çeşitli araştırmalarla ortaya konmuştur (Çizelge 2) 14.

Çizelge 2. Visseral leyişmanyoz tanısında kullanılan yöntemlerin karşılaştırılması14

Yöntem Avantajlar Dezavantajlar

Doğrudan tanı *Basit *Hızlı *Parazitin doğrudan araştırılması *Parazit sayısı yüksek olmadığından *Yapısal olarak farklı düşük duyarlılık göstermesi, organizmaların ayrımı *Benzer yapıdaki organizmaların ayırt edilememesi, *Deneyimli personele gereksinim duyulması Kültür ile tanı *Virulans ve infektivitenin *Pahalı ve yavaş olması ölçülebilmesi *Örnekte parazitlerin canlılığının *Canlı parazitlerin saptanabilmesi sürdürülmesi gerekliliği *Türler arasında varyasyonların saptanmaması *Hayvan kullanımı Serolojik tanı *Basit ve hızlı *Düşük özgüllük *Çok sayıda örneğin incelenmesine *Aktif ve geçirilmiş ya da latent elverişli olması infeksiyonun ayırt edilememesi *Standardize ayıraçların gerekliliği Moleküler tanı *Doğrudan parazitin türünün *Çok aşamalı ve pahalı araştırılması ve ayrımı *Ölü organizmaların da saptanması *İnhibitörleri nedeniyle olası yanlış negatiflik (PCR) *Kontaminasyon nedeniyle olası yanlış pozitiflik (PCR)

Leishmania parazitlerini görerek tanı koymak için kemik iliği, dalak, karaciğer,

lenf bezi aspirasyonu yapılabilmekte veya periferik kan örneğindeki çekirdekli hücreler

incelenmektedir. Alınan materyallerin bir kısmı Giemsa ile boyalı preparatlarda

amastigotların gösterilmesi amacıyla kullanılır. Kalanı ise kültür amacıyla 26-28

derecede uygun besiyerlerine ekilir ve 2 hafta içinde hareketli promastigotlar pozitif

kültürlerde görülür 4,13.

21

Ayrıca, aspirasyonla elde edilen örnekler veya doğrudan kan kullanılarak

polimeraz zincir reaksiyonu uygulanabilmektedir 15,16,17,18. Özellikle immun yetmezliği

olan hastalarda perifer kanda parazit sayısı çok miktarda olduğundan uygun türdeki

tatarcıklar kullanılmak suretiyle hastadan kan emdirilmekte ve tatarcıkta

promastigotların gelişimi disseksiyon ile araştırılmaktadır (ksenodiagnosis) 4.

Visseral leyişmanyozda parazitin görülmesi; dalak aspirasyonlarında %95’den

fazla, kemik iliği ve karaciğerden yapılan aspirasyonlarda %70-85 oranında, lenf bezi

aspirasyonlarında (Afrika’da) %58-65 oranında ve kandan yapılan bufy coatlarda

%70’lere varan orandadır. Doğru yapıldığı takdirde kültürde parazitin görülme olasılığı

yaklaşık %10 oranındadır 13.

Yeni bir latex aglütinasyon testi (KATEX) idrardaki antijeni saptayarak tanı

koymak amacıyla kullanılmaktadır. İnvaziv olmayan bu testin özellikle antikor yanıtı

yetersiz olan immunsupresif kişilerde ve visseral leyişmanyoz tedavisinin takibinde çok

yararlı olacağı bildirilmektedir 3.

2.5.5.2 Serolojik Tanı

Leyişmanyozun serolojik tanısı için IFA (dolaylı floresan antikor) testi, IHA

(dolaylı hemaglütinasyon antikor) testi, ELISA, rK39 özgül antijeninin kullanıldığı

ELISA, rK39 hızlı tanı testi, DAT (doğrudan aglütinasyon testi), FAST (hızlı

aglütinasyon tarama testi) ve western blot (WB) gibi yöntemler geliştirilmiş olmasına

rağmen söz konusu bu yöntemlerin duyarlılıkları arasında farklar olabilmektedir 4,19.

Son yıllarda geliştirilen ve visseral leyişmanyoz etkenine özgü rekombinant

antijene karşı antikor varlığını gösteren rK39 hızlı tanı testi yaygın olarak

kullanılmaktadır. Bu test yüksek duyarlılığı ve özgüllüğünden dolayı referans test

olmuştur. Bu testin kullanımı kolaydır, hızlıdır, minimal düzeyde teknoloji ve

laboratuvar ekipmanı gerektirmektedir 1.

22

2.5.5.2.1 rK39 Hızlı Tanı Testi

K39 proteini visseral leyişmanyoza neden olan Leishmania türlerinin

amastigotlarında bulunan bir epitoptur ve visseral leyişmanyozun hızlı tanısı için uygun

bir proteindir 20.

Rekombinant antijen (rK39) Escherichia coli’den klonlanan 39 aminoasitten

oluşur. Bu 39 aminoasit, L.major’un kinesin proteininin C terminalindedir. rK39 hızlı

tanı testi yapılan birçok çalışmanın sonucunda hem visseral leyişmanyoz hem de kala

azar sonrası deri leyişmanyozunun tanısında yüksek oranda duyarlı ve özgül

bulunmuştur 20.

rK39 hızlı tanı testi insan serumunda L.donovani’ye karşı oluşan antikorların

kalitatif tanımlanması için geliştirilmiş bir immunokromatografik testtir. Striplerin zarı

test bölgesinde rekombinant VL antijeni ile kontrol bölgesinde ise tavuk anti-protein A

ile kaplıdır. Eğer serumda antikor varsa zar üzerindeki rK39 antijeni ile reaksiyon

gerçekleşir ve test bölgesinde kırmızı bir çizgi oluşması pozitif sonuçtur, test bölgesinde

bu çizginin yokluğu negatif sonuçtur. VL antijenine karşı antikor olmadığı zaman

kırmızı çizgi tavuk anti-protein A’nın bulunduğu kontrol bölgesinde oluşmaktadır; bu

çizginin varlığı da örneğin yeterli ve ayıraçların doğru olduğunu kanıtlamaya hizmet

etmektedir 20.

2.5.5.3 Moleküler Tanı

Leishmania türlerinin yapısal olarak ayırt edilmesi mümkün olmadığından

patojenik türlerin sınıflandırılması için monoklonal antikorlarla izoenzim elektroforezi

veya minisörkıl DNA probları gibi türe özgü problarla hibridizasyon gibi çeşitli

biyokimyasal, immunolojik ve moleküler yöntemler geliştirilmiştir 21.

Polimeraz zincir reaksiyonu teknolojisinin ilerlemesiyle tür tayini amacıyla pek

çok PCR’a dayalı yöntem geliştirilmiştir. Amplifikasyon için ya nükleer DNA (SSU

rRNA gen bölgesi, internal transcribed spacer gen bölgesi-ITS-, gp63 gen bölgesi,

tubulin gen, mikrosatellit DNA) veya ekstrakromozomal DNA (minisörkıl kinetoplast

DNA) bölgeleri hedef bölgeler olarak belirlenmiştir 21.

Leishmania türlerini tiplendirmek için kullanılan metotlar multiplex PCR,

rastgele amplifiye polimorfik DNA (RAPD), single-strand konformasyon polimorfizmi,

restriksiyon fragment length polmorfizmi (RFLP) ve DNA dizi analizidir. DNA’ya

23

dayalı bu genotipik moleküler teknikler diğer tanı yöntemlerine kıyasla daha güvenilir

ve özgüldür 5,6,7.

2.5.5.3.1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Polimeraz zincir reaksiyonu; dizisi bilinen iki bölge arasında uzanan bir DNA

parçasını çoğaltmak için genomik DNA’ya ait primerlerin kullanıldığı yapay bir

tepkimedir. Bu tepkime DNA polimeraz tarafından katalizlenir ve sonunda genomik

DNA konsantrasyonu moleküler yöntemlerle görüntülenebilir düzeye çıkartılır 22.

Amplifikasyon için önce DNA iki oligonükleotit (primer) ve dört

deoksinükleotit trifosfatın (dNTP) varlığında 95oC’ye kadar ısıtılarak denatüre edilir.

Daha sonra 55-65oC arasında bir ısıya düşürülerek özgül primerlerin komplementer

dizilerine yapışması (annealing) sağlanır. Son olarak 72 oC’de DNA polimeraz aktivitesi

gösteren ve yüksek ısıdan etkilenmeyen Taq polimeraz enzimi ortamda bulunan

dNTP’ların 5’-3’ yönünde eklenmesiyle zincirin uzamasını sağlar. Denatürasyon,

annealing ve DNA sentezi döngüsü defalarca tekrarlanır. Amplifikasyonun bir

döngüsünün ürünleri sonraki döngü için kalıp olduğundan dolayı her bir döngü ile DNA

iki katına çıkmakta ve üssel olarak artmaktadır 22,23.

2.5.5.3.2 Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi

Restriksiyon enzimleri çift iplikçikli DNA’da özgül bölgelerden kesim yapan ve

DNA’dan bir gen bölgesinin veya gen taşıyan bir DNA segmentinin çıkartılmasında rol

alan enzimlerdir 21.

Restriksiyon enzimlerinin büyük DNA moleküllerini özgün parçacıklara

ayırması bu parçacıkların ana moleküle nazaran daha net bir şekilde görüntülenmesini

sağlar, çünkü değişik uzunluktaki DNA parçacıkları aralarındaki ufak uzunluk

farklılıkları nedeniyle jel ektroforezinde farklı yerlere göç etmektedir. Jel elektroforezi

için yüksek çözünürlüğe sahip agaroz jeller tercih edilmektedir. Ethidium bromid

sayesinde jelde oluşan DNA bantları görüntülenebilmekte, bu bantların yeri ve sayısına

göre gen haritaları kullanılarak tür tayini yapılabilmektedir 21,22.

24

2.5.6 Tedavi

Leyişmanyoz tedavisinin başarılı olarak sonuçlanması uygun ilaç seçimi ile

mümkündür. İlaçların seçimi esnasında birçok faktör göz önüne alınmalıdır. Tedaviyi

etkileyen faktörlerin en önemlilerinden biri olan Leishmania’ nın türü, ilaç seçiminde de

önemli bir rol oynar. İnsanda infeksiyon etkeni olabilen 15’den fazla Leishmania

türünün ilaçlara gösterdiği duyarlılığın farklı olması, Leishmania türlerinin

biyokimyasal ve moleküler özelliklerinin farklı olmasından kaynaklanmaktadır. İn vitro

çalışmalarda L.donovani ve L.brasiliensis’in sodyum stiboglukonat tedavisine L.major,

L.tropica ve L.mexicana’dan 3-5 kat daha duyarlı olduğu gösterilmiştir 24,25.

Visseral leyişmanyoz, deri leyişmanyozu, mukokutanöz leyişmanyoz ve yaygın

deri leyişmanyozu olarak dört farklı klinik tabloya neden leyişmanyozun tedavisinde

halen en yaygın kullanılan ilaç grubu pentavalan antimon bileşikleridir 26.

Pentamidin antimonlara dirençli visseral leyişmanyoz olgularının tedavisinde

kullanılmaktadır, ancak dirençli olgularda pentamidinlerin de başarı oranı %75’dir 27.

Paromomisin (aminosidin) visseral leişmanyozda günde bir defa IM yolla

kullanılan aminoglikozid grubu antibiyotiktir. Antimon direncinin yüksek olduğu

Hindistan’da ilk seçenek ilaç olarak tek başına kullanılmaktadır, ancak bu antibiyotiğin

de ciddi ototoksik ve nefrotoksik yan etkileri vardır 27.

Tedavide allopurinolün antimonlarla kombine kullanımının tedavi etkinliğini

değiştirmediği, fakat antimona dirençli olgularda allopurinol-pentamidin

kombinasyonunun tek başına pentamidin uygulamasından daha iyi yanıt verdiği

randomize kontrollü çalışmalarla gösterilmiştir 27.

Antifungal bir ajan olan amfoterisin B güçlü bir leishmaniasid ilaçtır.

Antimonlara karşı gelişen ilaç direnci ve bu olgularda pentamidinin de etkisiz kalması,

amfoterisinin popularitesini arttırmıştır. Hindistan’da bu tür olgularda amfoterisin B

dezoksilat ile %98 oranında başarı elde edilmiştir 24.

Son zamanlarda, visseral leyişmanyoz tedavisinde amfoterisin B’nin özellikle

yağlı formüllerinin kullanımı gündeme gelmiştir. Bu grup ilaçlar, lipid ilişkili

amfoterisin B (lipid kompleks, kolesterol dispersiyon, lipozomal amfoterisin B gibi) ya

da yağ emülsiyonu içindeki amfoterisin B şeklinde olabilir. Bu yağlı formüllerin ilacın

etkinliğini arttırdığı ve konvansiyonel amfoterisin B’nin toksisitesini sınırladığı

kanıtlanmıştır 26,27 .

25

Alkilfosfokolinler serisinden bir ilaç olan miltefosin başlangıçta antineoplastik

bir ilaç olarak geliştirilmiştir ancak visseral leyişmanyozda oral olarak etkili olduğu

çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. Miltefosinin antileishmania etkisi sadece sitotoksik

etki ile değil ayrıca hücresel bağışıklık mekanizmalarının aktivasyonuyla da ilişkili

olduğu gösterilmiştir 24,28.

Visseral leyişmanyoz tedavisinde ketokonazol, itrakonazol, flukonazol,

terbinafin ve metronidazol gibi farklı oral ilaçlar tek başına ve kombine olarak

denenmiş fakat hiçbiri umut verici olmamıştır. Bir 8-aminokinolin türevi olan sitamakin

ile ilgili yaklaşık 8 yıldır süren araştırmalar halen ilacın etkisi ve toksisitesi ile ilgili

yeterli bilgi vermemektedir 27.

İnterferon gama bir makrofaj uyarıcıdır, farelerle yapılan çalışmalarda

antimonlarla sinerjistik aktivitesi olduğu görülmüştür, ancak insan visseral leyişmanyoz

olgularında tek başına interferon gama etkisi sınırlıdır. Bazı ağır olgularda kombine

interferon tedavisinin antimonlara yanıtı hızlandırdığı bildirilmektedir 24,27.

Tedavide direnç gelişimi, parenteral kullanım zorluğu gibi nedenler yeni ilaç

araştırmalarını gerektirmektedir (Çizelge 3) 26.

Çizelge 3. Araştırma ve gelişim dönemindeki antileishmania ilaçları26 Geç keşif fazı Faz1/Faz2 Faz3 Faz4

Bifosfanatlar (risedronat ve Sitamakin Paromomisin Miltefosin pamidronat)(VL ve KL) (VL) (VL) (VL) Likokalkon A deriveleri (VL ve KL) Topikal paromomisin (KL) Miltefosin (KL)

Propilkinolinler Antimonlarla kombine

topikal imikuimod (KL)

Azoller: posokonazol (KL) Azoller: itrakonazol,

ketokonazol,flukonazol

2.6 Leishmania Türlerinin PCR-RFLP ile Tanımlanması

Leishmania populasyon genetiği çalışmalarında, tür tayininde ve suş ayırımında

kullanılan polimorfik DNA sekansları PCR’a dayalı yöntemlerle amplifiye

edilmektedir. Tür tayini tedavinin ve kontrol yöntemlerinin planlanması kadar doğru

tanı ve hastalığın prognozunun takibi açısından da çok önemlidir 29.

26

Leishmania türlerinin tanımlanmasında kullanılan standart metodlar izoenzim

elektroforezi (zimodem analizi), monoklonal antikorlar veya minisörkıl DNA probları

gibi türe özgül problarla hibridizasyondur. Ancak bu yöntemler yavaş, zahmetli ve

pahalı, kültür yapılmasını gerektiren, sadece uzmanlaşmış laboratuarlarda yapılabilen

yöntemlerdir. PCR’a dayalı yöntemler ise daha kolay ve sadece az miktarda organizma

gerektirmektedir 21,29.

Leishmania’nın PCR ile amplifikasyonu için genomik DNA’ya ait internal

transkript spacer (ITS) gen bölgesi, splice leader mini-exon (SLME), SSU rRNA geni,

gp 63 gen bölgesi, tubulin geni gibi gen bölgeleri ve kinetoplast DNA’nın minisörkılları

gibi ekstranükleer DNA’ya ait gen bölgeleri kullanılmaktadır 21,30.

kDNA her hücrede büyüklüğü yaklaşık 800 bç olan (200 bç uzunluğunda

korunmuş bölgeden ve 600 bç uzunluğunda değişken bölgeden oluşan) 10000-20000

civarında minisörkıl içerir. Değişken bölgedeki bu heterojenlik aynı türler arasındaki

suş farklılığını açıklamaktadır. Leishmania’nın her türünde 10000-20000 kadar

minisörkıl olduğu için bir etkenin Leishmania olup olmadığını tanımlamak için kDNA

ile çalışmak çok uygun olmaktadır. Bu yüzden tanıda kDNA PCR yöntemi oldukça

duyarlı bulunmaktadır 21,30.

Miniekzon geni ise her nükleer genomda 100-200 kez tekrar etmektedir ve

omurgalı konaklar ile omurgasız vektörlerde bulunmamaktadır. Leishmania türlerinin

tekrarlı miniekzon geni içinde bulunan transkript edilmeyen spacerların dizi analizi ile

DNA dizilerinin çıkarılmasıyla görülen çeşitlilik sonucunda bunların filogenetik marker

olabilecekleri tespit edilmiştir. Miniekzon genin bu özelliğinden dolayı PCR ürünleri

restriksiyon enzimi ile kesilerek tür tayini mümkün olmaktadır. Restriksiyon enzimi ile

kesim sonucunda elde edilen fragmanların uzunlukları her tür için tipiktir (Şekil 4 ) 21.

27

L. naiffi (X69454) 220 L amazonensis I (L05000) 285 L. donovani I (X69453) 378L. naiffi (AY1555505) 221 L amazonensis II (X64317) 283 L. donovani II (X69456) 389L. panamensis (X69450) 223 L. mexicana (X69447) 308 L. donovani III (X69443) 424L. panamensis (AY155509) 226 L. mexicana (AY155508) 327 L. infantum (X69445) 434L. braziliensis (X69441) 226 L. colombiensis (AY155502) 420 L. infantum (AY155503) 435L. guyanensis (X69452) 226 L. venezuelensis (AY155507) 443 L. tropica (X69451) 403L. peruviana (AY155506) 226 L. chagasi (X69446) 418 L. killicki (AY155504) 402

L. aethiopica (X68788) 406L. aethiopica (AY155501) 418L. major (X69449) 427

Eae I: no digest* 155/130 184/107/87145/138 281/108149/102/57 230/107/87112/102/60/53 326/108277/143 327/108

Rsa I L. naiffi 139/81 138/120/94/70/21 227/178L. naiffi 139/82 245/104/41/28 232/170

327/108 213/193276/142125/119/92/70/21

Hae III L. braziliensis 118/108 309/111 208/104L. peruviana 119/107 221/197

232/190/21159/149 274/104165/162 284/105

320/104Nco I L. guyanensis 173/53 214/94 326/108

L. panamensis 223 233/94 330/105L. panamensis 173/53

194/91200/83

L. colombiensis L. venezuelensis L. chagasi I L. chagasi II

Eae I L. amazonensis L. amazonensis L. mexicana L. mexicana

New World Viannia (220-226 bp) New World Leishmania (283-443 bp) Old World Leishmania(378-435 bp)

PCR products: PCR products: PCR products:

Eae I L. donovani I L. donovani II L. donovani III L. infantum L. infantum L. tropica L. killicki L. aethiopica L. aethiopica L. major

L. infantum L. infantum

Mbo I L. colombiensis

Not I L. venezuelensis L. mexicana L. mexicana

Mlu I L. mexicana L. mexicana

Sma I L. aethiopica L. aethiopica

Nco I L. donovani I L. donovani II L. donovani III

Hae III L. tropica 225/178 L. killicki 230/172 L. major 127/68/60/59/39/38/21/15 C. fascicul. 318/88

Eco72 I L. amazonensis I L. amazonensis II

Şekil 4.Miniekzon PCR-RFLP genotipleri21

28

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. Kan Örneklerinden DNA İzolasyonu Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Enfeksiyon,

Pediatrik Hematoloji, Pediatrik Onkoloji, Süt Çocuğu, Yetişkin İnfeksiyon Hastalıkları

ve Başkent Üniversitesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi Çocuk İnfeksiyon

Hastalıkları kliniğine visseral leyişmanyoz ön tanısı ile yatırılan hastalardan alınan 50

kan örneği kullanıldı. Örneklerden amastigot şekillerin saptanması amacıyla ince yayma

preperatlar yapıldı. Ayrıca, serum örneklerinde visseral leyişmanyoz etkenine özgül

rekombinant antijene karşı antikor bulunup bulunmadığını tanımlamak amacıyla rK39

hızlı tanı testi yapıldı. Serumu ayrılmış olan kan örnekleri daha sonra DNA izolasyonu

yapmak amacıyla -200C’de saklandı. -200C’de saklanan kan oda sıcaklığına getirildi ve çözülmesi beklendi. Çözülen

kan örnekleri temiz bir ependorf tüpüne alındı ve Agencourt DNA izolasyon kitinin

(BeckmanCoulter) kullanım talimatina göre işlem yapıldı. Aşağıda Agencourt DNA

izolasyon kitinin kullanım talimatı verilmektedir. 1.200 µL kan örneği alındı. 2.400 µL parçalıyıcı tampon solusyonu ve 10 µL proteinaz K eklendi. 3.Etüvde 370C’de 20 dakika inkübe edildi.

4.Etüvden alınan karışıma 300 µL bağlayıcı tampon solusyonu eklendi ve

karışım vortekslendi. 5.Bağlayıcı tampon solusyonu içindeki manyetik boncukların karışımdaki

DNA’lara bağlanabilmesi amacıyla oda sıcaklığında 5 dakika beklendi. 6.Örnekler manyetik boncuk plağına yerleştirildi ve 15 dakika beklendi. 7.Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 8.Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine 800 µL yıkama tampon solusyonu 1

eklendi ve vortekslendi. 9.Ependorflar tekrar plağa yerleştirildi ve 10 dakika beklendi. 10.Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi.

29

11.Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine tekrar 800 µL yıkama tampon

solusyonu 1 eklendi ve vortekslendi. 12. Ependorflar tekrar plağa yerleştirildi ve 10 dakika beklendi. 13. Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 14. Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine 500 µL yıkama tampon sulusyonu

2 eklendi ve vortekslendi. 15. Örnekler manyetik boncuk plağına yerleştirildi ve 6 dakika beklendi. 16. Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 17. Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine tekrar 500 µL yıkama tampon

solusyonu 2 eklendi ve vortekslendi. 18. Örnekler manyetik boncuk plağına yerleştirildi ve 6 dakika beklendi. 19. Örnekler plakta iken ependorftaki üst kısım aspire edildi. 20. Ependorflar plaktan çıkarıldı ve her birine 50 µL damıtık su eklendi ve

vortekslendi. 21.Örnekler tekrar plağa yerleştirildi, sıvı renksiz kalıncaya kadar beklendi,

örnekler plakta iken alınan üst kısımlar temiz ependorflara kondu. Bu yöntemle kandan

amastigot DNA’ları izole edildi.

Çalışmada kullanılacak olan DNA’ların varlığı elektroforez yöntemi ile saptandı. 3.2.Amplifikasyon İçin Gerekli Çözeltiler ve Kimyasal Maddeler 3.2.1. Çözeltiler 1. 10X (NH4)2SO4 Tamponu

700 mM/L Tris-HCl (pH:8.8)

200 mM/L (NH4)2SO4

% 0.1 Tween 20

2. PCR Karışımı

10X (NH4)2SO4 Tamponu 5 µL

12,5 mM dNTP karışımı 1 µL

25 mM MgCl2 5 µL

Steril distile su 33 µL

30

3.Primerler: PCR ile mikroskop bakısını karşılaştırmak amacıyla Leishmania

kinetoplast DNA’sına ait olan ve en az 10 parazite karşı duyarlı olan 13A ve 13B

(Alpha DNA) primerleri kullanıldı. Leishmania tiplendirmesi yapmak için Leishmania

parazitinin kinetoplast DNA’sından daha özgül, miniekzon gen bölgesine ait olan Fme-

Rme (Alpha DNA) primerleri kullanıldı (Çizelge 4).

Çizelge 4. Leishmania cinsine özgül primer dizilimi 21

3.2.2. Amplifikasyon Koşulları PCR karışımı 44 µL

5' Forward primer 13A veya Fme 0.5 µL

3' Reverse primer 13B veya Rme 0.5 µL

gDNA (0.5–1 µg/mL) 5.0 µL

Taq polimeraz (5 U/uL) 0.2 µL

Toplam hacim 50 µL’dir.

3.2.3. Termal Cycler ile PCR Protokolü

Bu çalışmada 13A-13B ve Fme-Rme primerleri ile yapılan PCR protokolündeki

sıcaklık, süre ve döngü sayısı çizelge 5’te gösterilmektedir.

Çizelge 5. 13A-13B ve Fme-Rme primerleri için kullanılan PCR programı

13 A 5'- TTG ACC CCC AAC CAC ATT ATA- 3'

13 B 5'- GTG GGG GAG GGG CGT TCT -3'

Fme 5'- ACA GAA ACT GAT ACT TAT ATA GCG -3'

Rme 5'- TAT TGG TAT GCG AAA CTT CCG -3'

95°C 5 dakika Ön Denatürasyon →1 döngü 95°C 1 dakika Denatürasyon

→40 döngü 54°C 1 dakika Primer bağlanması 72°C 1 dk 30 sn Zincir uzaması 72°C 10 dakika Son döngüde zincir uzaması →1 döngü

31

3.2.4.Agoroz Jelde Yürütme

Amplifiye edilmiş DNA örnekleri, 50 bp ve 100 bp’lik DNA markırları (Bio

Basic) ile birlikte %3’lük agaroz jelde 120 V’da 45 dk. yürütüldü.

3.2.5.1. Çözeltiler

1. 5×Tris Borat EDTA (TBE) Tamponu pH 8.0:

Tris baz 54.0 g

Borik asit 27.5 g

EDTA [0.5 M, pH:8.0] 20 mL

Bir miktar damıtık suda çözünerek 1 L’ye tamamlandı.

2. Elektroforez için 0.5X TBE Tamponu:

5×TBE’den 10 mL alınarak damıtık su ile 200 mL’ye tamamlandı.

3. %3’lik agaroz jel:

3 g Agaroz 100 mL 0.5×TBE tamponu içeresinde mikrodalga fırında eritildi. Jel

hafif soğuyunca içerisine tarak yerleştirilmiş jel aparatlarına döküldü.

4. Yükleme tamponu

Brom fenol Mavisi %0.05

Gliserol %10

Ficoll %15

0.5×TBE tamponu ile 100 mL’ye tamamlandı.

5. Etidyum Bromür çözeltisi:

Etidyum bromür 5 µg/µL olacak şekilde damıtık suda çözülerek hazırlandı.

3.2.5.2. Yöntem

3 gr agaroz tartılıp temiz bir erlen içine alındı, üzerine 100 mL 0,5 X TBE tamponu

ilave edildi ve bu karışım mikrodalga fırında homojen hale gelene kadar ısıtıldı. Erlen

içerisindeki jel soğuduktan sonra içerisine tarak yerleştirilen elektroforez tankına

döküldü ve tank 0.5×TBE tamponuyla dolduruldu. Jel içindeki tarak çıkarılıp

aplikasyon kuyuları tampon ile temizlendi. Amplifiye edilen örnekten 10 µL alınıp 5 µL

32

yükleme tamponu ile karıştırılarak kuyulara aplike edildi. Kuyulardan birine fragman

uzunluklarını değerlendirmek için DNA markeri (50 bp Bio Basıc) aplike edildi. Bu jel

120 voltta 45 dakika yürütüldü. Elektroforez sonrası jel, elektroforez tankından

çıkartılıp etidyum bromür ile 1 dakika boyandı ve damıtık suda yarım saat bekletilerek

boya atıklarından temizlendi. Ultraviyole ışık (UV) altında görülen DNA

fragmanlarının fotoğrafı çekilerek sonuç değerlendirildi.

3.3. Restriksiyon Enzimi Uzunluk Polimorfizmi

Fme-Rme primerleri ile amplifiye olmuş her PCR ürününden 10 µL alınıp PCR

tüplerine aktarıldı ve üzerlerine 1 µL Eae I (5U/ µL) enzimi ilave edildi. Bu karışım

370C’de 1 gece inkübe edildikten sonra %4’lük agaroz jelinde marker ile beraber

yürütüldü. Agaroz jelde yürütülüp, etidyum bromür boyası ile boyandıktan sonra

fragman uzunlukları kaynak 21’deki verilere göre değerlendirildi.

Enterobacter aerogenes (Eae I) restriksiyon enziminin Fme-Rme primerleri ile

amplifiye olmuş Leishmania parazitlerinde kestiği gen bölgeleri çizelge 6’da

gösterilmektedir.

Çizelge 6. Enterobacter aerogenes (Eae I) restriksiyon enzimi 21

Enzim Köken Tanıma alanı Tepkime şartları Eae I Enterobacter aerogenes 5’-Py*GGCCPu-3’ 370C 1 gece Eae I restriksiyon enziminin Leishmania parazitinde kestiği gen bölgeleri Eae I .L.donovani I ……184/107/87 L.donovani II ….. 281/108 L.donovani III …. 230/107/87 L.infantum …… 327/108 L.tropica ………. 227/178 L.kilicki ……….. 232/170 L.aethiopica ……. 213/193 L.aethiopica ……. 276/142 L.major………… 125/ 119/ 92/ 70/ 21

33

4.BULGULAR

Elli hastadan alınan kan örnekleri Giemsa boyası ile hazırlanıp X100 büyütmede

incelendi ve bu inceleme sonucunda 10 hastanın mikroskop bakısı (+), 40 hastanın

mikroskop bakısı (-) bulundu. Aynı zamanda rk39 ve PCR çalışıldı. Bu çalışma

sonucunda 13 hastada rk39 (+) , 37 hastada rk39 (-) , 29 hastanın PCR (+) , 21 hastanın

PCR (-) olduğu görüldü (Çizelge 7, 8 ve 9).

Çizelge 7. rK39 ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması

Mikroskop bakısı(+

Mikroskop bakısı(-)

TOPLAM

rK39 (+)

6

7

13

rK39 (-)

4

33

37

Toplam

10

40

50

Çizelge 8. PCR ve mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçları karşılaştırılması

Mikroskop

bakısı(+)

Mikroskop bakısı(-) Toplam

PCR(+) 9 20 29

PCR(-) 1 20 21

Toplam 10 40 50

34

Çizelge 9. PCR ve rK39 ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması

rK39 (+)

rK39 (-)

TOPLAM

PCR (+)

13

16

29

PCR (-)

0

21

21

Toplam

13

37

50

PCR ile mikroskop bakısının karşılaştırılması sonucunda PCR’ın duyarlılığı

%90, özgüllüğü %50 bulundu. PCR ile rK39 sonuçları karşılaştırıldığında PCR’in

duyarlılığı % 100, özgüllüğü %56.8 bulundu.

Bu çalışmada PCR ile diğer tanı yöntemlerini karşılaştırmak için kinetoplast

DNA (kDNA)’sında bulunan ve 10 Leishmania parazitine kadar hassas olan 13A-13B

primerleri kullanıldı. 13A-13B primerleri ile yapılan PCR çalışmasında elde edilen PCR

ürünleri %2’lik agaroz jelde yürütüldü ve 120 bp uzunluğunda elde edilen fragmanlar

pozitif kabul edildi (Şekil 5). 13A-13B primerleri ile PCR pozitif olan DNA örnekleri

ile tiplendirme yapmak için Fme-Rme primerleri ile çalışıldı ve agaroz jelde 400-500 bp

uzunluğundaki fragmanlar pozitif kabul edildi (Şekil 6).

Daha sonra Fme-Rme primerleri ile Leishmania paraziti tespit edilen 7 örnek

Eae I restriksiyon enzimi ile kesildi ve 4’ünün L.donavani, 3’ünün L.infantum olduğu

görüldü. (Şekil 7 ve 8).

35

Şekil 5. 13A-13B primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları

(1.Marker (50bp-Bio Basic), 2-4 Hastalardan alınan örnekler)

Şekil 6. Fme-Rme primerleri ile amplifiye olmuş örneklerin PCR sonuçları.

(1.100 bp marker (Biobasic) 2-4 Hastalardan alınan örnekler)

1 2 3 4 500 400 300 200 150 100 50

4 3 2 1

600 500 400 300 200 100

36

Şekil 7. Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.donavani bulunan örnekler

(1.100 bp marker (Biobasic) 2-4 Hastalardan alınan örnekler)

Şekil 8. Eae I restriksiyon enzimi ile kesilen ve L.infantum bulunan örnekler

(1.50 bp marker (Biobasic) 2-4 Hastalardan alınan örnekler)

1 2 3 4 5

1 2 3 4

600 500 400 300 250 200 150 100

600 500 400 300 200 100

37

5.TARTIŞMA

Leyişmanyoz, ülkemizin de dahil olduğu tropikal ve subtropikal ülkelerde

oldukça yaygındır. Ülkemizde insanlarda visseral (kala-azar) ve deri leyişmanyozu

(şark çıbanı) klinik şekillerinde görülmektedir. İnsanlarda Leishmania amastigotları

dalak, karaciğer, lenf bezleri ve kemik iliğine yerleşerek visseral leyişmanyoza neden

olmaktadır, tedavi edilmediği takdirde ölümcül olabilmektedir 19,31.

Ülkemizde başta Ege ve Akdeniz bölgesi olmak üzere hemen hemen her

bölgemizde sporadik veya endemik olarak görülen kala-azarın etkeninin L.infantum

olduğu bildirilmiştir 32.

Çalışmamızda, visseral leyişmanyoz ön tanısı ile kiniklerde izlenen olgularda

serolojik tanının (rK39 hızlı tanı testi) yanı sıra doğrudan mikroskop tanısı ve PCR’ın

karşılaştırılması amaçlanmıştır.

Türkiye’de kala azar daha çok çocuklarda görülmekte olup hastalığın sporadik

olgular halinde ortaya çıkması nedeniyle tanıda güçlükler yaşanmaktadır. Klinik

bulguları birçok hastalığın kliniği ile benzerlik gösterdiğinden dolayı kala azar öncelikli

olarak düşünülmemektedir. Ayırıcı tanı amaçlı kemik iliği aspirasyonu uygulanması

durumunda örnekte amastigot sayısının az olması ve deneyim gerektirmesi nedeniyle

gözden kaçabildiği belirtilmektedir. Kala azarın düşünülmesi durumunda tanıda

yardımcı olmak amacıyla dünyanın birçok bölgesinde olduğu gibi ülkemizde de yüksek

duyarlılık ve özgüllükte olan serolojik testler uygulanmaktadır. Uzun zamandır

uygulanan indirek floresan antikor (IFA) testine ek olarak ELISA, rK39 antijeninin

kullanıldığı hızlı tanı testi ve doğrudan aglütinasyon (DAT) testi de antileishmania

antikorlarının saptanması için rutinde ve sero-epidemiyolojik çalışmalarda yaygın

olarak kullanılmaktadır 19,32,33.

Visseral leyişmanyoz tedavi edilmediğinde öldürücü olabildiğinden tedavide

başarı etkenin tanımlanmasını gerektirmektedir. Yapılan bir moleküler çalışma ile deri

etkeni olarak bilinen L.tropica’nın visserotropik olduğu tespit edilmiştir. Başka bir

araştırmaya göre de Güney Batı Avrupa’da L.infantum’un hem deri hem de visseral

38

leyişmanyozdan sorumlu olduğu belirlenmiştir 31. Bu nedenle bölgemizde visseral

leyişmanyoza neden olan etkenlerin moleküler yöntemlerle tanımlanması önemlidir.

Serin ve ark 34 visseral ve deri leyişmanyozlu olgularda miniekzon bölgesi ile

yaptıkları PCR-RFLP ile tür tayini çalışmasında üç deri leyişmanyoz olgusunda kala

azar öyküsü olmadığı halde L.infantum tespit etmişler, kolay ve hızlı sonuç verdiğinden

dolayı PCR-RFLP’nin rutinde kullanılmasını önermişlerdir.

Polimeraz zincir reaksiyonu birçok hastalıkta olduğu gibi leyişmanyoz tanısında

da yaygın olarak uygulanmakta, klinik örneklerde az miktarda bulunan paraziti

saptayabilmesi, direk tanıda yardımcı olacak deneyimli personele ihtiyaç duyulmaması,

tedavi sonrası izlemin yapılabilmesi gibi avantajları bulunmaktadır. PCR’da parazit

genomuna veya kinetoplast DNA’ya ait primerler kullanılarak tanı konulması yanı sıra

türe özgü primerler kullanılarak parazitin tür ayrımı da yapılabilmektedir 7,19,35,36,37.

Bu yüzden çalışmamızda PCR yönteminin kala azar tanısında rutine

konulabilmesi amacıyla bütün Leishmania türlerinin kinetoplast DNA’sında bulunan bir

bölgeden elde edilen, 10 parazite kadar saptayabilen ve tanıda yaygın olarak kullanılan

13A ve 13B primer çifti ile klinikte izlenen olgulara PCR uygulanmıştır. Çalışmamızda

daha sonra PCR ile kinetoplast DNA’sını tespit ettiğimiz başka bir deyişle kala azar

tanısı koyduğumuz örneklere tür tayini yapabilmek için daha özgül bir gen bölgesi olan

miniekzon gen bölgesinde ITS-I gen bölgesini çoğaltan Fme ve Rme primer çifti ile

PCR uygulanmıştır. En son burada pozitif sonuç elde ettiğimiz yedi olguya Eae I

restriksiyon enzimi kullanılarak kesim yapılmıştır. Çalışmamızda bu olgulardan 3’ünün

L.infantum ve 4’ünün de L.donovani ile infekte olduğu tespit edilmiştir (Şekil 7 ve 8).

Ayırıcı tanıda visseral leyişmanyoz düşünülen hastalarda invaziv olmayan ve

yüksek oranda duyarlılık ve özgüllük gösteren serolojik testler büyük oranda yardımcı

olmaktadır. Antikor saptanan olgularda hala altın standart olarak kabul edilen kemik

iliği aspirasyon yaymasında parazitlerin gösterilmesi ile kesin tanı konmaktadır. Fakat

kemik iliği aspirasyonu sırasında zaman zaman kanama olabilmekte, yetersiz materyal

alınabilmekte ve örnekte amastigot görülmeyebilmektedir. Kemik iliği aspirasyonlarının

kültürü de sensitiviteyi arttırabilmektedir, fakat pahalı ve deneyimli donanıma

gereksinim duyulduğundan rutinde pek tercih edilmemektedir. DAT veya rK39 hızlı

tanı testi gibi antikor saptamaya dayalı testler de yüksek oranda duyarlıdır, ancak

tedaviden sonra bile pozitif sonuç verebildiğinden relapsların tanısında kullanımı tercih

39

edilmemektedir. Alınan örnekte çok az sayıdaki parazitin dahi DNA’sını saptayabilen

PCR yöntemi kemik iliği aspirayonu ile tanının hassasiyet ve duyarlılığını

arttırmaktadır. 7,38. Çalışmamızda mikroskop bakısı ile parazite rastlanmayan 20

olgunun PCR ile pozitif olduğu saptanmıştır. Bu sonuç, leyişmanyoz tanısında

moleküler çalışmanın önemini bir kez daha ortaya çıkarmıştır.

Piarroux ve ark7 kala azar tanısında hiçbir yöntemin %100 hassasiyet

göstermediğini, en hassas yöntemin PCR olduğunu bildirmişlerdir. Serolojik

yöntemlerinde yüksek derecede hassasiyet gösterdiğini, ancak relapsları tanımada

başarısız olduğunu belirtmişlerdir. Çalışmamızda rK39 hızlı tanı testi ile negatif

bulunan 37 olgunun 16’sının PCR ile pozitif olduğu saptanmıştır.

Chappius ve ark39 iki farklı rK39 hızlı tanı testi ile yaptıkları çalışmada bu testin

visseral leyişmanyoz tanısında oldukça duyarlı ve özgül olduğunu tespit etmişlerdir.

Kullandıkları testlerden biri aynı zamanda sıtma tanısında da kullanılmaktadır ve

bununla elde edilen sonuçlar %97 duyarlı ve %97 özgül iken, sadece kala azar tanısında

kullanılan test ile duyarlılığı %99 ve özgüllüğü %82 olarak bulmuşlar ve rK39’a karşı

oluşan antikorların tedaviden sonra kanda uzun süre bulunduğundan dolayı dalak

aspirasyonunun relapsların tanısını doğrulamak açısından zorunlu olduğunu

bildirmişlerdir.

Nahhas ve ark40 rK39 hızlı tanı testi ile yaptıkları çalışmada 80 olguda testin

pozitif olduğunu, ancak bunların sadece 10’unun semptomatik ve bunların da 3’ünün

mikroskop bakısında amastigot görüldüğünü ve testin hızlı, duyarlı ve seçici olmasından

dolayı asemptomatik olan fakat endemik bölgede yaşayan ve klinik olarak farklı

hastalıkları düşündürebilen olgularda hızlı ve özel bir ekipmana ihtiyaç

duyulmadığından rutinde kullanılabileceğini belirtmişlerdir.

Son zamanlarda, kala azar ile ilgili yayınlarda kala azarın doğru tanısı için

kullanılan yöntemlerin önemi üzerinde durulmaktadır. Erken tanı ve tedavi özellikle

Hindistan gibi tek rezervuarın insan olduğu ülkelerde hem kala azarın hem de kala azar

sonrası deri leyişmanyozunun kontrolu açısından çok önemlidir. Saha koşullarında

rahatlıkla kullanılabilecek duyarlı, seçici, basit ve zahmetsiz bir testin geliştirilmesi

visseral leyişmanyozun kontrolu açısından çok önemlidir. rK39 hızlı tanı testi bu amaç

doğrultusunda atılmış önemli bir adımdır 41.

40

Çalışmamızda mikroskop bakısı pozitif 10 ve mikroskop bakısı negatif 40 olgu

olmak üzere toplam 50 visseral leyişmanyoz ön tanısı ile klinikte izlenen olgulara rK39

hızlı tanı testi uygulanmış ve %60 duyarlı ve %82 özgül bulunmuştur (Çizelge 7).

Carvalho ve ark42 mikroskop bakısı veya kültür ile doğrulanmış 128 olguda

ELISA yöntemi ve rK39 hızlı tanı testini çalışmışlar ve rK39 hızlı tanı testinin ve

ELISA’ nın duyarlılığını sırasıyla %90 ve %89 bulurken, özgüllüğü de %100 ve %98

bulmuşlardır. Kala azar ön tanısı ile izlenen olgularda ilk değerlendirmelerde bu basit ve

hızlı testin %100 seçici olduğundan dolayı daha invaziv metodların yerini alabileceğini

ve hem endemik bölgelerde yaşayan hem de seyahat eden kişilerde güvenle

kullanılabileceğini öne sürmüşlerdir.

Çalışmamız ve önceki yıllarda yapılan altı çalışmayı karşılaştırdığımızda

sonuçlar arasında önemli farklılıklar olduğunu görmekteyiz. Çalışmalarda rK39 hızlı

tanı testinin duyarlılığı %46-%100 arasında değişmektedir. En yüksek

duyarlılığın(%100) Hindistan ve Nepal’ den gelen olgularda olduğu görülmektedir 42-47.

Venezuella’ daki olgularda %88 oranında, Sudan ve diğer bölgelerden olan olgularda

ise daha düşük duyarlılık tespit edilmiştir 44-46.

rK39 hızlı tanı testi ile elde edilen bu farklı sonuçlar birkaç hipotez ile

açıklanmaktadır. L.donovani kompleksinin alt türlerinden dolayı test sonuçları farklı

olabilmektedir. Aynı zamanda bu alt türler arasında bölgesel farklılıklar da

olabilmektedir. Başka bir olası durum olgular arasındaki genetik farklılıklar veya ırksal

alt gruplar olabileceği ihtimali ile açıklanmaktadır. Konağın immun cevabında rol alan

genetik faktörler de sonuçlar arasında bu değişkenliğe neden olabilmektedir 42.

Carvahallo ve ark42 çalışmalarında ayrıca visseral leyişmanyoz tedavisi

tamamlanan hastalarda rK39 antijenine karşı oluşan antikorların 6 aya kadar anlamlı

oranda (%46) pozitif kalabildiğini de belirtmişlerdir.

Zijlstra ve ark48 pozitif rK39 hızlı tanı testi sonucu aldıkları olguların K39

antijenine karşı oluşan antikor titrelerini ELISA ile çalışmışlar ve bunlardan elde

ettikleri sonuçları rK39 negatif sonuç aldıkları olguların ELISA sonuçları ile

karşılaştırdıklarında anlamlı farklılık (p<0.0001) bulmuşlar ve bu sonucun hastalığın

şiddeti ve süresi gibi epidemiyolojik faktörlere bağlı olabileceğini belirtmişlerdir.

Son yıllarda visseral leyişmanyoz tanısında PCR yöntemi sıkça tercih edilmekte

olup bununla ilgili pek çok araştırma yapılmıştır.

41

Lachaud ve ark35 PCR, kültür ve serolojik yöntemleri karşılaştırmak üzere

yaptıkları 237 kala azar hastasını kapsayan çalışmada PCR yönteminin kültürden,

mikroskop bakısından ve serolojik yöntemlerden daha duyarlı olduğunu bulmuşlardır.

Olguların periferik kanından yapılan PCR ve kültür yöntemini karşılaştırdıklarında

duyarlılık sırasıyla %97 ve %55 iken, kemik iliği aspiratları ile yaptıkları PCR ve

kültürde sırasıyla %100 ve %81 duyarlılık saptamışlardır. 19’u aynı zamanda AIDS

olan toplam 23 hastayı hem tedavi sırasında hem de tedaviden sonra 3 yıla kadar takip

etmişler, 7 hastada çalışma devam ederken relaps görülmüş ve bu relapsların 6’sı ilk

olarak PCR ile tespit edilmiştir. Bu bulguların neticesinde kan örnekleri ile yapılan PCR

yönteminin hem bağışıklığı baskılanmış hem de baskılanmamış hastalarda tanı için

yeterli olacağı kanısına varmışlar ve tedavi sonrası bağışıklığı baskılanmış hastaların

PCR yöntemi ile sistematik olarak takip edilmesini önermişlerdir.

Salotra ve ark36 L.donovani’nin kinetoplast DNA’sına özgü PCR ile hastaların

periferik kanından parazit DNA’sını araştırdıkları çalışmalarında %96 duyarlılık

bulmuşlar ve bu yöntemin yaklaşık 0.1 paraziti dahi tespit edebildiğini ileri

sürmüşlerdir. Çalışmalarında periferik kanın kullanımını daha az invaziv ve dalak veya

kemik iliği aspirasyonundan daha güvenli olduğu için tercih ettiklerini belirtmişlerdir.

Ancak az sayıda da olsa ellerindeki kemik iliği aspirasyonları ile yaptıkları PCR

duyarlılığını ise %100 bulmuşlar ve bunu da kemik iliğinde parazit yoğunluğunun

periferik kana oranla daha fazla oluşu ile ilişkilendirmişlerdir.

L.donovani’nin etken olduğu visseral leyişmanyozun tanısı için kan örnekleri ile

yapılan PCR çalışmalarında %45-%94 arasında değişen oranlarda duyarlılık olduğu

tespit edilmiştir 37,49-52.

L.infantum’un etken olduğu visseral leyişmanyozun tanısı için kan örnekleri ile

yapılan PCR çalışmalarında ise %64-%97 arasında değişen oranlarda duyarlılık olduğu

gösterilmiştir 35,50,53,54.

Çalışmamızda, mikroskop bakısı pozitif 10 ve mikroskop bakısı negatif 40 olgu

olmak üzere toplam 50 kala azar ön tanısı ile izlenen hasta kanları ile PCR çalışılmış ve

duyarlılık %90 bulunmuştur. Çalışmamızda ayrıca bu 50 hastaya rK39 dipstick testi

uygulanmış ve 13 hastada rK39 pozitif ve 37 hastada rK39 negatif bulunmuştur. rK39

negatif 37 hastanın 16’sında ve rK39 pozitif 13 hastada PCR ile pozitif sonuç elde

edilmiş ve PCR duyarlılığı %100 ve özgüllüğü %56.8 bulunmuştur (Çizelge8 ve 9).

42

Campino ve ark55 immun sistemi çeşitli hastalıklar nedeniyle baskılanmış

hastalarda filtre kağıdına emdirilmiş kan ile PCR çalışmışlar ve tam kan ile çalışan

Mathis ve ark53 ile benzer sonuçlar elde etmişlerdir.

Osman ve ark51 ise filtre kağıdına emdirilen kan ile yapılan PCR’da elde edilen

pozitif sonuçların EDTA’lı tüplerde saklanan tam kan örneklerinden daha fazla

olduğunu tespit etmişlerdir.

Costa ve ark 56 ise 13 HIV pozitif hastadan EDTA’lı tüplere alınan 44 örnek ile

PCR çalışmışlar ve %98 duyarlılık tespit etmişlerdir.

Leyişmanyoz tedavisinin başarılı olarak sonuçlanması uygun ilaç seçimi ile

mümkündür. İlaçların seçimi esnasında birçok faktör göz önüne alınmalıdır. Tedaviyi

etkileyen faktörlerin en önemlilerinden biri olan Leishmania’ nın türü, ilaç seçiminde de

önemli bir rol oynar. İnsanda infeksiyon etkeni olabilen 15’den fazla Leishmania

türünün ilaçlara gösterdiği duyarlılığın farklı olması, Leishmania türlerinin

biyokimyasal ve moleküler özelliklerinin farklı olmasından kaynaklanmaktadır24,25.

Dünyanın birçok ülkesinde olduğu gibi ülkemizde de leyişmanyoz halk sağlığını

yakından ilgilendiren bir sorundur. Hastalığın kliniği ve tedaviye alınan yanıtlar

farklılık gösterebilmektedir. Bu nedenle, Leishmania türlerinin doğru tanımlanması

endemik bölgelerde klinik iyileşme ve tedaviye yanıt olasılığını arttırmaktadır. Örneğin

bazı türlerde ancak kombinasyon tedavisi ile iyileşme sağlanabilmektedir.

Çalışmamızda elde ettiğimiz PCR pozitif olgulara RFLP uygulayarak tür tayini yapmayı

ve böylelikle kliniğin çalışmalarına destek olmak amaçlandı. Çalışmamızda Fme-Rme

primerleri kullanarak PCR pozitif bulduğumuz olgulara Eae I enzimi ile kesim

uygulandı ve sonuçta 7 örnek Marfurt ve ark21 yaptıkları çalışmadaki referans suşlarla

karşılaştırıldı, 3’ünün L.infantum ve 4’ünün L.donovani olduğu görüldü (Şekil 7 ve8).

Marfurt ve ark21 yaptıkları çalışmada Fme-Rme primerleri ile Leishmania

parazitinin ITS I gen bölgesini çoğaltmışlar ve bu bölgeyi Hae III ve Eae I enzimleri ile

keserek elde ettikleri sonuçlara göre tiplendirme yapmışlar ve tiplendirme için en uygun

gen bölgesinin ITS I olduğu fikrini ileri sürmüşlerdi.

Serin ve ark57 2007 yılında miniekzon gen bölgesini çoğaltarak yaptıkları

çalışmada RFLP profillerinin L.enrietti, L.tarentolae ve L.gerbilli’ye özgü olduğunu ilk

defa tespit etmişler ve miniekzon PCR-RFLP yöntemini türlerin ayrımını yapmada

basit, duyarlı ve seçici bir yöntem olduğunu bir defa daha onaylamışlardır.

43

Marfurt ve ark58 yaptıkları diğer bir çalışmada miniekzon gen bölgesini

çoğaltmışlar ve elde ettikleri sonuçları kültür, seroloji ve iki farklı gen bölgesi ile

yaptıkları başka bir moleküler çalışma ile karşılaştırmışlar, miniekzon yöntemi en

yüksek duyarlılık (%89.7) gösterirken diğerlerinin duyarlılığı sırasıyla %70.6, %57.1,

%51.7 ve %79.3 olarak bulunmuştur. Miniekzon PCR-RFLP yöntemini diğer moleküler

yöntemlere kıyasla daha güvenilir ve doğru bulduklarından bu yöntemin tanıyı

kolaylaştırabileceği gibi tanı ve tedavide gelişmeleri de destekleyebileceğini öne

sürmüşlerdir.

Hide ve Banuls59 sistein proteaz B(cpb) gen bölgesini çoğaltarak yaptıkları

çalışma ile sadece L.donovani ve L.infantum ayrımını yapmışlar ve diğer trypanasoma

ailesi türleri için çoğaltma yapmadığını belirtmişlerdir.

Sonuç olarak çalışmamızda direk mikroskop bakısının gerek örnek alımındaki

hatalar gerekse parazitin az sayıda olmasından kaynaklanan nedenler yüzünden

duyarlılığı düşük bulunmuştur. PCR yöntemi ile çok az sayıdaki parazit dahi

saptanabildiğinden tanıda duyarlılık artmaktadır. Serolojik yöntemler de yüksek

duyarlılık ve özgüllük gösterebilmektedir, ancak antikor düzeyi eşik değerin altındaki

olgularda yalancı negatif sonuçlar görülebilmektedir. Oysa PCR ile çok az sayıda

parazit dahi olsa parazit DNA’sı saptanabilmektedir. Buna karşın nadir de olsa gerek

uygun örnek alınmamasından dolayı gerekse PCR inhibitörlerine bağlı olarak yanlış

negatif sonuçlar alınabilmektedir. Nitekim çalışmamızda mikroskop bakısında

amastigot görülen bir olguda PCR yöntemi ile negatif sonuç alınmıştır. Ayrıca

çalışmamızda PCR-RFLP yöntemi ile Leishmania türlerinin tanımlandırılabileceği

sonucu elde edilmiştir. PCR-RFLP ile tür tayini hastalığın epidemiyolojisi, tedavisi ve

kontrolü açısından çalışmalarımızda yol gösterici olacaktır.

44

6.SONUÇLAR VE ÖNERİLER

Ülkemizde başta Ege ve Akdeniz bölgesinde olmak üzere hemen hemen her

bölgede endemik olarak görülen kala azar tedavi edilmediği takdirde ölümle

sonuçlanabildiğinden dolayı başarılı ve doğru tedavi en az tanının doğru konması kadar

önemlidir. Leyişmanyoz tedavisinin başarılı olarak sonuçlanması da ancak uygun ilaç

seçimi ile mümkündür.

Bu bilgiler doğrultusunda çalışmamızda öncelikle leyişmanyoz tanısında

kullanılan üç farklı yöntem karşılaştırıldı. Mikroskop bakısı ile elde edilen sonuçlar

tatmin edici değildi, gerek örneklerin uygunsuz alınmasından gerekse periferik kanda

parazit sayısının az olmasından dolayı 50 hasta grubu ile yapılan çalışmada 10 olguda

amastigotlar saptandı.

Ayrıca, Leishmania K39 antijenine karşı oluşan antikorları saptamaya yarayan

rK39 hızlı tanı testi de bütün hastalara uygulandı ve 13 olguda rK39 pozitif, 37 olguda

rK39 negatif bulundu. Bütün olgulara ayrıca PCR yöntemi uygulandı ve rK39 pozitif

olan 13 olgunun ve rK39 negatif olan 16 olgunun bu yöntem ile pozitif olduğu tespit

edildi. Tanıda kullandığımız bu üç yöntemi karşılaştırdığımızda PCR yöntemi rK39’a

oranla %100 duyarlı ve %56.8 özgül ve mikroskobiye kıyasla %90 duyarlı ve %50

özgül bulundu. Bölgemizde çoğunlukla hasta grubumuzu oluşturan kişilerin de tedavi

amacıyla başvurdukları kliniklerde tanıya destek olmak amacıyla laboratuvarda bu

yöntemin rutin kullanılması gerektiği sonucuna varıldı.

Visseral leyişmanyoz tedavi edilmediğinde öldürücü olabildiğinden tedavide

başarı etkenin tanımlanmasını da gerektirmektedir. Son yıllarda yapılan bazı

çalışmalarda deri leyişmanyoz etkeni olarak bilinen L.tropica’nın visserotropik olduğu,

başka bir araştırmaya göre de L.infantum’un hem deri hem de visseral leyişmanyozdan

sorumlu olduğu görülmüştür. Bu yüzden çalışmamızda PCR-RFLP yöntemi ile klinikte

kala azar ön tanısı ile izlenen olgularda hastalığa neden olan türlerin tipleri tanımlandı

ve bu türlerin 3 hastada L.infantum, 4 hastada ise L.donovani olduğu görüldü; bu

sonuçlar bugüne kadar hastalık ile ilgili bilgilerimizle paraleldi.

45

Çalışma sonunda, PCR-RFLP ile tür tayini yaparak türe özgü tedavi

yaklaşımlarının belirlenmesi için kliniğe destek olunabileceği sonucuna varıldı.

Gerek hastalığa doğru tanı koymada gerekse türe özgü tedavi yaklaşımlarında

önemli adımların atılması için daha fazla sayıda hasta grubu ile çalışmalar yapılmalıdır.

-

46

7.KAYNAKLAR

1. Reithinger R, Dujardin JC., Molecular Diagnosis of Leishmaniasis: Current Status and Future Applications. Journal of Clinical Microbiology 2007: 21-25

2. World Health Organization web sayfası (http://www.who.int/tdr/diseases/Leish,Progress 2003-

2004,17thProgrammeReport) Erişim Tarihi: 05.12.2007 3. Özbel Y, Töz ÖS, Leishmaniosis, Özcel MA. Tıbbi Parazit Hastalıkları 1. Baskı, İzmir: Mete

Basım Matbaacılık Hizmetleri, 2007: 198-230 4. Sundar S, Rai M. Laboratory Diagnosis of Visceral Leishmaniasis. Clinical and Diagnostic

Laboratory Immunology 2002: 951-958 5. Unat EK, Yücel A, Altaş K, Samastı M. Unat’ın Tıp Parazitolojisi 5. Baskı, İstanbul: Doyum

Matbaası, 1995: 564-586 6. Gangneux JP, Merotti J, Lorenzo F, Sarfati J, Blanche H. Bui H, Pratlong F, Garin YJF,

Derovin F. Prospective Value of PCR Amplification and Sequencing for Diagnosis and Typing of Old World Leishmania Infections in an Area of Nonendemicity. Journal of Clinical Microbiology. 2003: 1419-1422

7. Piarroux R, Gambarelli F, Dumon H, Fontes M, Dunan S, Mary C, Toga B, Quilici M.

Comparison of PCR with Direct Examination of Bone Marrow Aspiration, Myeloculture and Serology for Diagnosis of Visceral Leishmaniasis in Immunocompromised Patients. Journal of Clinical Microbiology. 1994: 746-749

8. Saygı G. Temel Tıbbi Parazitoloji, Sivas: Esnaf Ofset Matbaacılık, 1998: 47-55 9. Unat EK, Yaşarol Ş. Leishmaniasis: Kala-azar ve Şark Çıbanı Ege Üniversitesi Matbaası Bornova-

İzmir, 1981: 1-45 10. Ashford RW, Bates PA. Leishmaniasis in the Old World, Cox F, Kreier J, Wakelin D.

Topley&Wilson’s Microbiology and Microbial İnfections. 9th Ed. Oxford University Press, Inc. New York 1998: 215-240

11. Özcel MA, İnci A, Turgay N, Köroğlu E. Tıbbi ve Veteriner İmmunoparazitoloji, Türkiye

Parazitoloji Derneği. 2007: 21: 155-166 12. Davidson NR. Leishmaniasis, Cohen J, Powderly W. Infectious Diseases 2th Ed, Edinburg, Mosby.

2004: 1621-1626

47

13. Özcel MA, Özbilgin A. Güney Doğu Anadolu Projesini Tehdit Eden Parazit Hastalıkları. Altıntaş N. Leishmaniosis. Bornova-İzmir: Ege Üniversitesi Basımevi, 1995: 97-127

14. Alkan Z, Özbel Y, Özensoy S, Atambay M. Moleküler Biyolojik Yöntemler, Özcel MA, Altıntaş

N. Parazit Hastalıklarında Tanı, Türkiye Parazitoloji Derneği.1997:15:373-411 15. Marti-Sanchez J, Pineda JA, Morillas-Marquez F, Garcia-Garcia JA, Acedo C, Macias J.

Detection of Leishmania Infantum Kinetoplast DNA in Peripheral Blood From Asymptomatic Individuals at Risk for Parenterally Transmitted Infections: Relationship Between Polymerase Chain Reaction Results and Other Leishmania Infection Markers. Am. J. Trop. Med. Hyg.2004: 545-548

16. Lachaud L, Chabbert E, Dubessay P, Reynes J, Lamothe J, Bastien P. Comparison of Various

Sample Preparation Methods for PCR Diagnosis of Visceral Leishmaniasis Using Peripheral Blood. Journal of Clinical Microbiology. 2001:613-617

17. Spanakos G, Patsoula E, Kremastinou T, Saroglou G, Vakalis N. Development of a PCR-based

Method for Diagnosis of Leishmania in Blood Samples. Moleculer and Cellular Probes. 2002: 415-420

18. Disch J, Caligiorne RB, Maciel F, Oliveira MC, Orsini M, Dias-Neto E, Rabello A. Single-Step

Duplex kDNA-PCR for Detection of Leishmania Donovani Complex in Human Peripheral Blood Samples. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2006: 395-400

19. Özensoy S, Özbel Y, Turgay N, Alkan MZ, Gül K, Gilman-Sachs A, Chang KP, Reed SG,

Özcel MA. Serodiagnosis and Epidemiology of Visceral Leishmaniasis in Turkey. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998: 363-369

20. www.namp.gov.in Erişim Tarihi: 25.12.2008 21. Marfurt J, Niederwieser I, Makia ND, Beck HP, Felger I. Diagnostic Genotyping of Old and

New World Leishmania Species by PCR-RFLP. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2003: 115-124

22. Aksoy K, Kayrın L, Tuli A. Tanıda Moleküler Genetik Yöntemler. Adana: 9.Biyokimya Yaz

Okulu, 2006 23. White BA. PCR Protocols: Current Methods and Applications for DNA Amplification, Humana

Press, Totwa New Jersey. 1993 24. Rosenthal E, Marty P. Recent Understanding in the Treatment of Visceral Leishmaniasis. J

Postgrad Med. 2003: 49: 61-68 25. Croft SL. Monitoring Drug Resistance in Leishmaniasis. Trop Med Int Health. 2001: 605-899 26. Delibaş BS, Akısü Ç. Diğer Kan ve Doku Protozoon Hastalıklarının Tedavisi. Ed Akısü Ç,

Korkmaz M, Tıbbi Parazitolojide Tedavi. Tıbbi Parazitoloji Derneği, Ege Üniversitesi, Yayın No:20 27. Singh RK, Pandey HP, Sundar S. Visceral Leishmaniasis (Kala-azar): Challenges Ahead. Indian

J. Med. Res. 123. 2006: 331-344

48

28. Sundar S, Rai M. Advances in the Treatment of the Leishmaniasis. Curr. Opin Infect Dis. 2002: 15: 593-598

29. Schönian G, Fari ME, Lewin S, Schweynoch Carola, Presber W. Molecular Epidemiology and

Population Genetics in Leishmania. Med. Microbiol Immunol. 2001: 61-63 30. Cortes S, Mauricio I, Almeida A, Cristovão JM, Pratlong F, Dedet JP, Campino L. Application

of kDNA as a Molecular Marker to Analyse Leishmania Infantum Diversity in Portugal. Parasitology International. 2006: 277-283

31. Dilmeç F, Matur A, Alhan E, Aksaray N. Çukurova Bölgesi Visseral Leishmania Etkenlerinde

Total DNA Restriksiyon Endonükleaz Profilleri. Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi. 1999: 158-164

32. Özensoy S, Özbel Y, Atay MG, Ertabaklar H, Şakru N, Taylan A, Hökelek M. İnsan ve

Köpeklerden Alınan Klinik Örneklere Leishmania Tanısı için Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) Uygulanması. Türkiye Parazitoloji Dergisi. 2002: 239-244

33. Reithinger R, Quinnell RJ, Alexender B, Dovies CR. Rapid Detection of Leishmania Infantum

Infection in Dogs: Comparative Study Using on Immunochromatographic Dipstick Test, Enzyme-Linked Immunosurbent Assay, and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2002: 2352-2356

34. Serin MS, Dağlıoğlu K, Bagirova M, Allahverdiyev A, Uzun S, Vural Z, Kayar B, Tezcan S,

Yetkin M, Aslan G, Emekdaş G, Köksal F. Rapid Diagnosis and Genotyping of Leishmania Isolates from Cutaneous and Visceral Leishmaniasis by Microcapillary Cultivation and Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism of Miniexon Region. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2005: 209-214

35. Lachaud L, Dereure J, Chabbert E, Reynes J, Mauboussin JM, Oziol E, Dedet JP, Bastien P.

Optimized PCR Using Patient Blood Samples For Diagnosis and Follow-Up of Visceral Leishmaniasis, With Special Reference to AIDS Patients. Journal of Clinical Microbiology. 2000: 236-240

36. Salotra P, Sreenivas G, Pogue GP, Lee N, Nakhasi HL, Ramesh V, Negi NS. Development of a

Species-Specific PSR Assay for Detection of Leishmania donovani in Clinical Samples from Patients with Kala-Azar and Post Kala-Azar Dermal Leishmaniasis. Journal of Clinical Microbiology. 2001: 849-854

37. Katakura K, Kawazu SI, Naya T, Nagakura K, Ito M, Aikawa M, Qu JQ, Guan LR, Zuo XP,

Chai JJ, Chang KP, Matsumoto Y. Diagnosis of Kala-Azar by Nested PCR Based on Amplification of the Leishmania Mini-Exon Gene. Journal of Clinical Microbiology. 1998: 2173-2177

38. Maurya R, Singh K, Kumar B, Salotra P, Rai M, Sundar S. Evaluation of PCR for Diagnosis of

Indian Kala-Azar and Assessment of Cure. Journal of Clinical Microbiology. 2005: 3038-3041 39. Chappuis F, Mueller Y, Nguimfack A, Rwakimari JB, Couffignal S, Boelaert M, Cavailler P,

Loutan L, Piola P. Diagnostic Accuracy of Two rK39 Antigen-Based Dipsticks and the Formol Gel Test for Rapid Diagnosis of Visceral Leishmaniasis in Northeastern Uganda. Journal of Clinical Microbiology. 2005: 5973-5977

49

40. Al-Nahhas S, Shabaan M, Hammoud L, Al-Taweel A, Al-Jorf S. Visceral Leishmaniasis in the

Syrian Arab Republic: Early Detection Using rK39. La Revue de Santé de la Méditerranée Oriantele. 2003: 856-862

41. Salotra P, Singh R. Rapid&Reliable diagnostic Tests for Visceral Leishmaniasis. Indian J Med Res.

2005: 464-467 42. Carvalho SFG, Lemo EM, Corey R, Dietze R. Performance of Recombinat K39 Antigen in the

Diagnosis of Brazilian Visceral Leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2003: 321-324 43. Sundar S, Reed S, Singh V, Kumar P, Murray H. Rapid Accurate Field Diagnosis of Indian

Visceral Leishmaniasis. Lancet. 1998: 563–565 44. Sundar S, Pai K, Sahu M, Kumar V, Murray, HW. Immunochromatographic Strip-Test

Detection of Anti-K39 Antibody in Indian Visceral Leishmaniasis. Ann Trop Med Parasitol 2002: 19–23

45. Bern C, Jha SN, Joshi AB, Thakur GD, Bista MB. Use of the Recombinant K39 Dipstick Test

and the Direct Agglutination Test in a Setting Endemic for Visceral Leishmaniasis in Nepal. Am J Trop Med Hyg. 2000: 153–157

46. Delgado O, Feliciangeli MD, Coraspe V, Silva S, Perez A, Arias J. Value of a Dipstick Based on

Recombinant rK39 Antigen for Differential Diagnosis of American Visceral Leishmaniasis from Other Sympatric Endemic Diseases in Venezuela. Parasite. 2001: 355–357

47. Burns JM Jr, Shreffler WG, Benson DR, Ghalib HW, Badaro' R, Reed SG. Molecular

Characterization of a Kinesin-Related Antigen of Leishmania chagasi that Detects Antibody in African and American Visceral Leishmaniasis. Proc Nat Acad Sci USA. 1993: 775–779

48. Zijlstra E, Daifalla N, Kager P, Khalil E, El-Hassan, Reed S, Ghalib H. K39 Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay for Diagnosis of Leishmania donovani Infection. Clin Diagn Lab Immunol. 1998: 717–720

49. Andresen K, Gasim S, Elhassan AM, Khalil EAG, Barker DC, Theander TG, Kharazmi A.

Diagnosis of Visceral Leishmaniasis by Polymerase Chain Reaction Using Blood, Bone Marrow and Lymph Node Samples From Patients From the Sudan. Trop Med Int Health. 1997 440-444

50. Nuzum E,White F, Thakur J, Dietze R, Wages J,Grogl M, Berman J. Diagnosis of Symptomatic

Visceral Leishmaniasis by Use of the Polymerase Chain Reaction on Patient Blood. J Infect. Dis. 1995: 751-754

51. Osman OF, Oskam L, Zijlstra EE, Kroon NC, Schoone GJ, Khalil EAG, Hassan M, Karger

PA. Evaluation of PCR for Diagnosis of Post-Kala-Azar Dermal Leishmaniasis. Journal of Clinical Microbiology. 1997: 2454-2457

52. Singh N, Curran MD, Rastogi AK, Middleton D, Sundar S. Diagnostic PCR with Leishmania

donovani Using Sequences from the Variable Region of Kinetoplast Minicircle DNA. Trop Med Int Health. 1999: 448-453

50

53. Mathis A, Deplazes P. PCR and In Vitro Cultivation for Detection of Leishmania spp. In Diagnostic Samples from Human and Dogs. Journal of Clinical Microbiology. 1995: 1145-1149

54. Fissore C, Delaunay P, Ferrua B, Rosenthal E, Del Guidice P, Aufeuvre JP, Le Fichoux Y,

Marty P. Convenience of Serum for Visceral Leishmanisis Diagnosis by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2004: 5332-5333

55. Campino L, Cortes S, Pires R, Oskam L, Abranches P. Detection of Leishmania in

Immunocompromised Patients Using Peripheral Blood Spots on Filter Paper and the Polymerase Chain Reaction. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000: 396-398

56. Costa JM, Durand R, Deniau M, Rivollet D, Izri M, Houin R, Vidaud M, Bretagne S. PCR

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of Leishmaniasis in Human Immunodeficiency Virus Infected Patients. Journal of Clinical Microbiology. 1996: 1831-183

57. Serin MS, Waki K, Chang KP, Aslan G, Direkel Ş, Otag F, Kayar B, Köksal F, Emekdaş G.

Consistence of Miniexon Polymerase Chain Reaction –Restriction Fragment Length Polymorphism and Single-Copy Gene Sequence Analyses in Discriminating Leishmania Genotypes. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2007: 295-299

58. Marfurt J, Nasereddin A, Niederwieser I, Jaffe CL, Beck HP, Felger I. Identification and

Differentiation of Leishmania Species in Clinical Sampes by PCR Amplification of the Miniexon Sequence and Subsequent Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis. .Journal of Clinical Microbiology. 2003: 3147-3153

59. Hide M, Banuls AL. Species-Specific PCR Assay for L.infantum/ L.donovani Discrimination. Acta

Tropica. 2006: 241-245

51

8. EKLER

EK.1:AYDINLATILMIŞ ONAM KALA-AZARLI HASTALARDA ETKEN TÜRLERİN PCR-RFLP

YÖNTEMİ İLE TANIMLANMASI

Değerli katılımcı,

Ülkemizde ve bölgemizde bazı paraziter hastalıklar hala önemli bir halk sağlığı

problemi olmaya devam etmektedir. Bu hastalıkların kontrolü ve yayılımının önlenmesi

büyük bir önem taşımaktadır. Aksi takdirde ölümle sonuçlanabilecek ciddi durumlar

yaşanabilmektedir. Onay vermeniz koşuluğuyla katılacağınız bu çalışmada sizden kan

örneği ve kemik iliği alınacaktır. Böylece hastalığınıza neden olan parazit

infeksiyonunun tanısı konulucaktır.

Ayrıca kişisel bilgileriniz ve hastalığınızla ilgili 5 dakikalık bir anket yapılacaktır.

Çalışmalar sonucunda elde edilen bilgiler infeksiyonun tedavisinin yönlendirilmesi

amacıyla tarafınıza bildirilecektir.

Çalışmaya devam edilebilmeniz için bu bilgiler ışığında ve diğer sorularınızın

aydınlatılması sonucunda ONAY vermeniz gerekmektedir.

İlgili çalışma konusunda tarafıma her türlü bilgi aktarıldı. Sorduğum sorulara yeterli

cevap aldım. Vücudumdan kan örneği ve kemik iliği alınmasını kabul ediyorum. Kendi

isteğimle çalışmaya katılmayı kabul ediyorum.

Katılımcının adı, soyadı:

Katılımcının imzası

52

Ç.Ü.T.F. PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI ANKET FORMU ANKET NO:

1. ADI:

2. SOYADI:

3. YAŞI

4. CİNSİYETİ: ERKEK( ) KADIN( )

5. TEL NO:

6. ADRESİ:

7. ATEŞ VAR( ) YOK( )

8. KANSIZLIK VAR( ) YOK( )

9. İSHAL VAR( ) YOK( )

10.KİLO KAYBI VAR( ) YOK( )

11.İŞTAH KAYBI VAR( ) YOK( )

12.DALAK BÜYÜKLÜĞÜ VAR( ) YOK( )

13.KARACİĞER BÜYÜKLÜĞÜ VAR( ) YOK( )

14.LENF NODU BÜYÜKLÜĞÜ VAR( ) YOK( )

53

9.ÖZGEÇMİŞ

1971 yılında Adana’da doğdu. İlköğrenimini Adana Hayriye Kemal Kusun

İlkokulu’nda, ortaöğrenimini Adana Kurttepe Anadolu Lisesi’nde, lise öğrenimini

Gaziantep Fen Lisesi’nde tamamladı. 1996 yılında Ankara Üniversitesi Tıp

Fakültesi’nden mezun oldu. 2003 yılında Çukurova Üniversitesi Sağlık Bilimleri

Enstitüsü Parazitoloji Anabilim Dalı’nda doktora eğitimine başladı. Halen Adana’da bir

aile sağlığı merkezinde görev yapmaktadır. Evli ve iki kız çocuğu annesidir.