KANDAN GENOMİK DNA İZOLASYONU

• DNA hücre içerisinde bulunduğu bölgede yoğunlaşmış bir kitle

oluşturur.• Paketlenmiştir

• RNA• İki değerlikli katyonlar• Di ve poli aminler

• Proteinler

• Her türlü hücreden DNA izole edilebilir:

1)Hücrelerin Parçalanması2) DNA – Protein Kompleksinin Çözünmesi3)DNA’nın ortamdaki Diğer moleküllerden

Uzaklaştırılması.

1) HÜCRELERİN PARÇALANMASI• EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetikasit) lı tüpe alınmış

kandan 400 µl alınır.• 1000 µl TE (Tris EDTA) eklenir.• 12000 rpm de 1 dk santrifüj

• Süpernatant atılır. Dipteki hücrelerle aynı işlem üç sefer tekrarlanır.

• Son yıkamadan sonra Hücrelerin Üzerine 320 µl TE, 90 µl NaCl, 80 µl SDS (Sodyum Dodesil Sülfat), 10 µl

Proteinaz K eklenir.• 56 C de 1,5 saat veya 37 C de tam gece bekletilir.

• EDTA ; Antikoaglükan maddedir.• TE; Özellikle eritrositlerin parçalanmasında

kullanılan bir çözeltidir.• SDS; bir deterjan türevidir ve özellikle hücre

zarındaki lipitleri uzaklaştırır.• NaCl; tuz çözeltisi

• Poreteinaz K ; Proteolitik bir enzimdir.

2) DNA PROTEİN KOMPLEKSİNİN ÇÖZÜNMESİ

• Lizatın üzerine 250 µl Fenol 250 µl Kloroform eklenir, karıştırılır.

• 2500 rpm de 2 dk. Santrifüj edilir.• Üst faz başka tüpe alınır alt faz atılır.

• Üst faz ile aynı işlem iki sefer daha tekrarlanır.• Fenol proteinleri degrede ederken, kloroform

gradient farkı yaratarak DNA nın fenol ve parçalanmış etıklarla beraber dibe çökmesini

engeller.

3) DNA nın DİĞER MOLEKÜLLERDEN UZAKLAŞTIRILMASI

• Son fenol muamelesinden sonra farklı tüpe alınan DNA içeren üst faz’a soğuk % 99 luk etanol eklenir

ve DNA çöktürülür.• Soğuk etanolde DNA tüm diğer moleküllerden

(degrede olmuş veya olmamış RNA, protein parçaları, fenol kalıntısı gibi) daha hızlı çökelir.

İZOLE DNA ‘ nın ANALİZİ

• SPEKTROFOTOMETRİK• ELEKTROFORETİK

SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ

• Nükleik Asitler 260 nm de maksimum absorbsiyon gösterirler.

• Proteinler 280 nm de maksimum absorbsiyon gösterirler.

SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ

SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ

• Optik Densite (OD)• OD= 260 nm deki abs./280 nm deki abs.

• OD = 1,7 – 1,8 ise DNA saf• OD= 2 ise kabul edilebilir sınırı

• OD=1 ise protein konteminasyonu• OD< 0,5 ise DNA yok

SPEKTROFOTOMETRİK ANALİZ

• Çift Zincirli DNA molekülü için 1 OD 50 µg/ml ye karşılık gelmektedir

• DNA (µg/ml) = 260 nm abs. X 50 X Sulandırma oranı.