Upload
lethu
View
232
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Keahlian dalam teknik molekular secara umum meliputi:
1. Ekstraksi DNA2. PCR3. RFLP4. RAPD5. DOT BLOT6. Kloning7. PAGE8. dll
Apakah Elektroforesis?
Metode pemisahan molekul (DNA, RNA,
protein) melalui medium tertentu berdasarkan
ukuran dan muatan listriknya
Struktur dan Penyusun Protein
PROTEIN – asam amino polimer
STRUCTURE of Amino Acids
Asam amino mempunyai (-COOH) & amina group (-NH2 ) serta rantai samping
SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis)
Memisahkan protein berdasarkan ukuran
Sample harus dipanaskan selama 5 menit ‘sample buffer‘ yang berisi: SDS (CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+), Glukosa atau Glycerol
Ionizable tracking dye (i.e., bromophenol blue)
% acrylamide (w/v) Kisaran efektif
Dengan BIS 1:20 pemisahan - bp
3.5 1 000 - 2 000
5.0 80 - 500
8.0 60 - 400
12.0 40 - 200
15.0 25 - 150
20.0 6 - 100
Acrylamide Gel Elektroforesis
% Polyacrylamide
gel
Bromophenol
blue
Xylene cyanol
(41)
5 35 130
6 26 106
8 19 76
10 12 55
12 8 28
Migrasi Dye pada % Polyacrylamide Gel
yang berbeda
Protein Gel
Lanes:
1Molecular Weight Markers
2Supernatant
3Pellet
4Resin
5Fraction 2
6Fraction 1
216 kDa
132 kDa
78 kDa
45.7 kDa
32.5 kDa
18.4 kDa
Protein diukur dalam kiloDalton
1 amu = 1 Dalton
1,000 unit massa atom= 1 kiloDalton (kDa)
Resolving
gel only
Protein Standard
Calculating Protein Size
3 216 kDa
6 132 kDa
9 78 kDa
18 45.7 kDa
22 32.5 kDa
30 18.4 kDa
10 20 30
mm from top of gel
Pro
tein
siz
e2
0
4
0
6
0
8
0
10
0
12
0
Penggunaan kurfa standar untuk
penentuan berat molekul protein
1. Tempatkan gel pada peralatan
chamber
2. Masukkan sampel dalam
well/sumuran.
3. Run gel
Prinsip dasar pengerjaan
Agarose Gel Elektroforesis
Perlahan tambahkan buffer. Pastikan semua gel terendam dalam buffer.
Sebagai alternatif bisa memasukkan sampel setelah buffer dimasukkan (jangan lupa basic dye)
Setelah selesai keluarkan gel dan amati pada lampu UV jangan lupa untuk membuat stainingnya
dari EtBr.
Agarose vs SDS-PAGE
• Untuk asam nukleatseperti DNA dan RNA.
• Memisahkan berdasarkanmuatan listrik, ukurandan bentuk
• Gel dibuat dari agar yang berasal dari rumput laut
• Untuk protein dengan ukuran yang berbeda SIZE.
• Memisahkan berdasarkan ukuran
• Gel dibuat dari bubuk
Polyacrylamide