Kerentanan Propionibacterium acnes yang Diisolasi dari Pasien dengan Acne

Vulgaris terhadap Askorbat Seng dan Antibiotik

Katsuhiro Iinuma¹,Norihisa Noguchi², Hidemasa Nakaminami², Masanori Sasatsu²,

Setsuko Nishijima³, Isami Tsuboi¹

Tujuan: aktivitas in vitro antimikroba dari turunan asam askorbat terhadap Propionibacterium acnes diuji baik sendiri atau kombinasi dengan berbagai agen antimikroba, dan indeks konsentrasi pecahan hambatnya ditentukan dengan menggunakan tes checkerboard. Efektivitas antimikroba Askorbat seng dalam pengobatan akne vulgaris, baik sendiri atau kombinasi dengan antibiotik seperti klindamisin, umum digunakan di Jepang untuk pengobatan acne vulgaris, karena itu dilakukan penelitian.Bahan dan metode: kerentanan antimikroba dari 41 strain klindamisin-sensitif dan / atau clindamycin resisten P. acnes diisolasi dari pasien acne vulgaris diuji, dibandingkan dengan strain P. acnes. Hasil: Zink askorbat menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap 41 strain P. acnes dan konsentrasinya (0,064%) adalah cukup lebih rendah dari dosis normal (5%) dari turunan asam askorbat lainnya. Kombinasi Zink askorbat dengan klindamisin, eritromisin, dan kloramfenikol menunjukkan efek aditif, dan seng askorbat saja efektif menghambat pertumbuhan semua P. acnes termasuk yang resistan Klindamisin. Kesimpulan: Hasil penelitian ini memberikan bukti baru bahwa kombinasi askorbat seng dan klindamisin efektif untuk pengobatan acne vulgaris. Kata kunci: kerentanan antimikroba, turunan asam askorbat, terapi kombinasi, tes checkerboard.

Pendahuluan

Propionibacterium acnes adalah, bakteri anaerob gram positif di kulit yang

berkolonisasi pada kelenjar sebasea dan folikel pilosebaceous¹. Organisme ini

dianggap memainkan peran utama dalam perkembangan acne vulgaris¹. Acne

vulgaris adalah penyakit peradangan kronis yang ditandai oleh peristiwa inflamasi

khas, termasuk kelebihan produksi sebum, deskuamasi abnormal epitel folikel

sebasea, dan proliferasi P. acnes¹⁻³. Mengenai faktor patogenik untuk perkembangan

dan aggravation akne, irradiasi ultraviolet dan peroksidasi lipid sebum telah

dilaporkan mengaktifkan mediator inflamasi seperti spesies oksigen reaktif(ROS)⁴.

Turunan asam askorbat adalah beberapa antioksidan paling banyak digunakan untuk

melindungi kulit⁵⁻⁶. Efek antioksidan dari 5% natrium fosfat ascorbyl telah

menunjukkan keberhasilan dalam acne vulgaris⁷. Namun, masih belum jelas apakah

turunan asam askorbat memiliki aktivitas antimikroba terhadap P. acnes.

Banyak perawatan topikal dan sistemik yang telah diusulkan untuk acne vulgaris⁸.

Klindamisin dan eritromisin adalah agen yang paling sering digunakan terhadap P.

acnes⁸⁻⁹. Di sisi lain, banyak penelitian telah melaporkan munculnya P. acnes dengan

tingkat resistensi tinggi terhadap makrolida termasuk klindamisin karena terapi

antibiotik jangka panjang biasa digunakan untuk mengobati acne vulgaris¹º⁻¹². Di

Jepang, sebuah penelitian yang dilakukan antara tahun 1994 dan 1995

mengungkapkan bahwa strain resisten terhadap makrolid ditemukan pada hanya 4%

(2/50) dari P. acnes yang diisolasi dari pasien dengan acne vulgaris. Namun, antara

tahun 2006 dan 2007, ditemukan isolat P.acnes yang resisten makrolid sebanyak 10

% (5/48), menunjukkan resistensi P. acnes terhadap macrolides telah meningkat di

Jepang⁸⁻⁹.

Resistensi makrolid pada P. acnes dianggap disebabkan oleh mutasi dari daerah

transferase peptidil dalam 23S rRNA domain V, dan dengan perubahan sasaran situs

dengan dimethylase rRNA 23S yang dikodekan oleh erm (X)¹³. Selain itu, mutasi ini

dikaitkan dengan resistensi silang terhadap klindamisin¹⁴. Oleh karena itu,

peningkatan prevalensi P. acnes yang resisten makrolid, termasuk P. acnes resisten

klindamisin, adalah masalah serius, karena pengobatan akne dengan klindamisin

menjadi sangat sulit.

Baru-baru ini telah dilaporkan bahwa kombinasi antibiotik meningkatkan efek

terapeutik¹⁵⁻¹⁶. Dalam studi ini, efektivitas in vitro dari turunan asam askorbat

terhadap P. acnes dan kombinasi dengan klindamisin, eritromisin, kloramfenikol,

minocycline, atau levofloxacine diteliti.

Bahan dan metode

Strain bakteri dan obat-obatan

Sebanyak 41 strain P. acnes digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari pasien

dengan acne vulgaris antara tahun 2006 dan 2007 di Jepang, dan empat strain ini

adalah P. acnes resisten Klindamisin dengan mutasi dari daerah transferase peptidil

dari 23S rRNA gen: A2058G, atau A2059G di domain V⁹. Para pasien diberi

antibiotik topikal bukan antibiotik sistemik. Sampel dikultur pada media agar Gifu

anaerobik yang dimodifikasi(GAM) (Nissui Pharmaceutical Co, Tokyo, Jepang)

dalam kondisi anaerob pada suhu 35 ° C selama 72 jam. P. acnes diidentifikasi oleh

Api 20A (bioMerieux, Marcy I'Etoile, Perancis)⁹. Strain P. acnes JCM 6473 (ATCC

11828) digunakan sebagai strain kontrol kualitas untuk pengujian kerentanan

antimikroba. Klindamisin, eritromisin, kloramfenikol, dan minocycline yang dibeli

dari SigmaAldrich (Tokyo, Jepang). Semua bahan kimia lain yang digunakan adalah

dari grade analitis tertinggi.

Uji Kerentanan

Uji kerentanan dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran microbroth,

berdasarkan kriteria Perkumpulan Kemoterapi Jepang¹⁷⁻¹⁸. Sampel dikultur dalam

kaldu GAM (Nissui Farmasi Co) dan disesuaikan dengan standar Mc Farland nomor

1. Suspensi encer bakteri digunakan untuk menyuntik 96 lempeng, setiap sumur

mengandung konsentrasi yang berbeda dari obat yang diuji. Pengenceran dua kali

lipat dari obat disiapkan. Konsentrasi obat dalam kaldu GAM berkisar 0,06-128 μ g /

mL (agen antimikroba) atau 1,25-1280 μ g / mL (turunan asam askorbat), dan

konsentrasi akhir 10⁵ unit pembentuk koloni (CFU) bakteri uji per sumur telah

ditambahkan ke dalam pengenceran masing-masing. Pelat diinkubasi dalam kantong

gas yang anaerob (Anaero Kemas System; Mitsubishi Gas Chemical Co, Tokyo,

Jepang) pada suhu 35 ° C selama 48 jam. Setelah kontrol positif yang tidak memiliki

agen antimikroba menunjukkan pertumbuhan yang baik, konsentrasi hambat

minimum (KHM) untuk masing-masing antibiotik didefinisikan sebagai konsentrasi

terendah antibiotik yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan bakteri,

ditunjukkan dengan tidak adanya kekeruhan.

Indeks konsentrasi pecahan hambat (FICI)

Efektivitas kombinasi askorbat seng dan agen antimikroba terhadap P. acnes

ditentukan dengan metode tes checkerboard yang menggunakan metode dilusi

microboth.¹⁹ Indeks konsentrasi Pecahan hambat (FIC) dihitung menggunakan rumus

berikut: Indeks FIC = (MIC obat A dalam kombinasi / MIC obat A saja)+ (MIC B

obat dalam kombinasi / MIC obat B saja) .²º Indeks< 0,5 dianggap sebagai

sinergisme; bahwa< 1,0 tapi> 0,5 sebagai tindakan aditif, dan bahwa> 2.0 sebagai

antagonisme. Sampel disesuaikan dengan standar McFarland nomor 1 dan

konsentrasi akhir 10⁵ CFU / sumur bakteri uji. MIC dari kombinasi ditentukan

setelah inkubasi pada 35 ° C selama 48 jam.

Hasil

Kerentanan antibiotik P. acnes terhadap turunan asam askorbat

Kerentanan antibiotik P. acnes JCM 6473 terhadap asam askorbat seng turunan asam

askorbat, magnesium ascorbyl fosfat, dan natrium fosfat ascorbyl diteliti (Tabel 1).

MIC askorbat seng sebesar 640 mg / mL, sedangkan MIC asam askorbat, magnesium

ascorbyl phosphate, dan natrium fosfat ascorbyl adalah >= 1280 μ g / mL. Dosis

normal turunan asam askorbat adalah 5% (50 mg / mL).⁷ Hasil ini menunjukkan

bahwa askorbat seng cukup menghambat pertumbuhan P. acnes dalam dosis normal.

Dengan demikian, askorbat seng digunakan dalam percobaan lebih lanjut.

Efek kombinasi askorbat seng dan berbagai agen antimikroba terhadap P. acnes

Untuk mempelajari efek kombinasi askorbat seng dan agen antimikroba seperti

klindamisin, eritromisin, kloramfenikol, minocycline, dan levofloksasin, indeks FIC

ditentukan dengan tes checkerboard (Tabel 2). Pada kombinasi askorbat seng dengan

klindamisin, eritromisin, atau kloramfenikol, MIC dari askorbat seng berkurang, dan

indeks FIC berkisar 0,625-0,75. Nilai tersebut menunjukkan efek aditif terhadap P.

acnes JCM 6473. Sebaliknya, indeks FIC pada kombinasi askorbat seng dengan

minocycline atau levofloksasin menunjukkan tidak ada pengaruh.

Klindamisin disetujui dan umum digunakan di Jepang untuk pengobatan acne

vulgaris.⁸⁻⁹ Dengan demikian, efek antimikroba askorbat seng dikombinasikan

dengan klindamisin terhadap 37 strain P. acnes sensitif Klindamisin yang diisolasi

dari pasien dengan acne vulgaris diselidiki. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, kisaran

MIC askorbat seng adalah sekitar dua kali lipat lebih rendah pada kombinasi dengan

klindamisin dibandingkan dengan terapi hanya dengan askorbat seng atau klindamisin

saja. Indeks FIC rata-rata adalah 0,84, menunjukkan efek aditif.

Efek gabungan dari askorbat seng dan agen antimikroba terhadap berbagai P.

acnes resisten Klindamisin yang diisolasi dari pasien dengan acne vulgaris.

P. acnes resisten Klindamisin dengan mutasi dari daerah transferase peptidil pada 23S

rRNA domain V telah meningkat di Jepang.⁹ Efek antimikroba dari askorbat seng

yang dikombinasikan dengan klindamisin, eritromisin, dan kloramfenikol pada empat

strain (PA001-PA004) dari P. acnes resisten Klindamisin dengan transisi dari adenin

ke guanin pada posisi 2.058 (A2058G: PA001-PA003) atau 2059 (A2059G: PA004)

diselidiki. Seperti terlihat pada Tabel 4, askorbat seng sama efektif dalam

menghambat pertumbuhan strain P. acnes resisten Klindamisin (MIC 640 mg / mL).

Pada kombinasi seng askorbat dengan klindamisin, eritromisin, dan kloramfenikol,

MIC dari askorbat seng berkurang (MIC kisaran: 160-320 μ g / mL). Selain itu,

indeks FIC dari strain PA004 dengan P. acnes resistant Klidamisisn adalah 0,75,

menunjukkan efek aditif.

Diskusi

Dalam metode pengenceran microboth, menurut kriteria Perkumpulan Kemoterapi

Jepang, serangkaian pengenceran dua kali lipat digunakan untuk menentukan

efektivitas obat uji, dengan 1 μ g / mL sebagai pengenceran primer.¹⁷⁻¹⁸ Dalam studi

ini, konsentrasi obat berkisar 0,06-128 μ g / mL. Namun, turunan asam askorbat

menunjukkan tidak berpengaruh pada konsentrasi ini. Itu menegaskan bahwa MIC

seng sebesar 1280 μ g / mL (data tidak ditunjukkan), yang mirip dengan yang

dilaporkan oleh Fluhr dkk.²¹ Oleh karena itu, konsentrasi turunan asam askorbat

berkisar antara 1,25 hingga 1280 μg/mL

Lima persen natrium fosfat ascorbyl telah dilaporkan mengurangi lesi jerawat

20,14% dan 48,82%, masiing-masing dalam waktu 4 dan 8 minggu.⁷⁻⁸ Selain itu, zink

topikal (1,2%) dan sistemik (30 mg) telah dilaporkan menunjukkan keberhasilan

dalam pengobatan akne vulgaris.²¹⁻²²

Dalam studi ini, MIC (640 μ g / mL) askorbat seng terhadap P. acnes JCM 6473

adalah 0,064%, dan nilai MIC lebih rendah dari turunan asam askorbat lainnya (MIC

1280 >= μ g / mL). Meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menguji

kinetika obat dan stabilitas askorbat seng, diharapkan bahwa konsentrasi perhitungan

askorbat seng mencapai 2800 μ g / mL bila digunakan pada kulit (4 mg / cm) sebagai

preparat eksternal.²³

Hasil ini menunjukkan kemungkinan bahwa seng askorbat (MIC 640 μ g / mL)

cukup menghambat pertumbuhan P. acnes pada konsentrasi yang lebih rendah dari

dosis normal turunan asam askorbat lain dan seng.

Choi dkk²⁴ melaporkan bahwa mekanisme antimikroba melibatkan kemampuan ion

seng untuk menghambat glikolisis mikroorganisme dengan mengoksidasi kelompok

tiol enzim glikolitik penting, oleh karena itu, mekanisme antimikroba askorbat seng

mungkin mirip dengan seng. Namun, efek gabungan dari askorbat seng dan

minocycline atau levofloksasin tidak terbukti. Klindamisin, eritromisin, dan

kloramfenikol menghambat sintesis protein bakteri dengan mengikat subunit 50S dari

ribosom bakteri.²⁵ Sebaliknya, situs pengikatan minocycline dan levofloksasin

masing-masing adalah pada subunit 30S ribosom dan pada DNA topoisomerase

IV.²⁶⁻²⁷ Dengan demikian, perbedaan dalam mekanisme antibakteri mungkin

berhubungan dengan efek gabungan dari masing-masing antibiotik. Selain itu, ada

kemungkinan bahwa minocycline dan levofloksasin khelat dengan ion logam,

termasuk seng²⁸⁻²⁹, mengakibatkan aktivitas antimikroba berkurang. Percobaan lebih

lanjut diperlukan untuk memperjelas mekanisme askorbat seng terhadap P. acnes.

Makrolid digunakan tidak hanya sebagai agen antimikroba tetapi juga sebagai agen

anti-inflamasi, dan yang paling umum digunakan untuk mengobati acne vulgaris.⁹

Klindamisin menunjukkan efek yang sama dengan makrolida dan merupakan

antibakteri topikal yang paling populer untuk akne vulgaris di Jepang. Namun, strain

P. acnes resisten Klindamisin telah meningkat di Jepang.⁸’⁹ Meningkatnya P. acnes

resisten Klindamisin termasuk makrolida dan epidemi dari Multi Drug Resistent P.

acnes dapat terjadi di masa depan. Dilaporkan bahwa terapi kombinasi dengan agen

antimikroba dan agen lain seperti retinoid eksternal dan peroksida benzoil efektif

dalam mencegah munculnya strain resisten antibiotik dari P. acnes.¹⁵’¹⁶ Dalam

penelitian ini, ditemukan bahwa askorbat seng menghambat pertumbuhan strain P.

acnes yang resisten Klindamisin (MIC 640 μ g / mL). Selain itu, meskipun FIC dari

askorbat seng yang dikombinasi dengan klindamisin tidak dapat dihitung karena MIC

terapi tunggal klindamisin dan dengan kombinasi adalah >= 128 µg / mL (3/4 strain),

hal tersebut mengurangi MIC askorbat seng terhadap semua strain. Selain itu, indeks

FIC dari strain PA004 dengan P. acnes yang resisten Klindamisin adalah 0,75,

menunjukkan efek aditif. Hasil penelitian ini sangat merekomendasikan bahwa

kombinasi askorbat seng dan klindamisin akan berguna untuk mencegah munculnya

P. acnes yang resisten Klindamisin dan untuk mengobati akne vulgaris.

Kesimpulan

Hasil penelitian ini memberikan bukti baru bahwa askorbat seng menghambat

pertumbuhan P. acnes, dan konsentrasi (0,064%) cukup rendah dari dosis normal

(5%) dari turunan asam askorbat lainnya. Selain itu, seng askorbat menunjukkan efek

aditif antimikroba in vitro pada kombinasi dengan klindamisin, eritromisin, dan

kloramfenikol terhadap P.acnes yang resisten maupun sensitif terhadap Klindamisin.

Temuan ini dapat memberikan wawasan baru terapi akne. Baru-baru ini, kombinasi

terapi dengan benzoil peroksida dan klindamisin telah menjadi umum di seluruh

dunia. Percobaan lebih lanjut diperlukan untuk membandingkan askorbat seng

ditambah klindamisin dan peroksida benzyol ditambah klindamisin.

Disclosure

Penulis dilaporkan tidak memiliki conflict of interest pada penelitian ini.

Daftar Pustaka :

1. Bojar RA, Holland KT. Acne and Propionibacterium acnes. Clin Dermatol.

2004;22:357–379.

2. Iinuma K, Sato T, Akimoto N, et al. Involvement of Propionibacterium acnes

in the augmentation of lipogenesis in hamster sebaceous glands in vivo and in

vitro. J Invest Dermatol. 2009;129:2113–2119.

3. Farrar MD, Ingam E. Acne: Inflammation. Clin Dermatol. 2004;22: 380–384.

4. Akamatsu H, Horio T, Hattori K. Increased hydrogen peroxide generation by

neutrophils from patients with acne inflammation. Int J Dermatol.

2003;42:366–369.

5. Pinnell S, Madey D. The benefits of topical Vitamin C (L-ascorbic acid) for

skin care and UV-protection. J Appl Cosmetol. 1999;18:126–134.

6. Burgess C. Topical vitamins. J Drugs Dermatol. 2008;7:2–6.

7. Ruamrak C, Lourith N, Natakankitkul S. Comparison of clinical effca-

cies of sodium ascorbyl phosphate, retinol and their combination in acne

treatment. Int J Cosmet Sci. 2009;31:41–46.

8. Nishijima S, Kurokawa I, Kawabata S. Sensitivity of Propionibacterium acnes

isolated from acne patients: comparative study of antimicrobial agents. J Int

Med Res. 1996;24:473–477.

9. Ishida N, Nakaminami H, Noguchi N, Kurokawa I, Nishijima S, Sasatsu M.

Antimicrobial susceptibilities of Propionibacterium acnes isolated from

patients with acne vulgaris. Microbiol Immunol. 2008;52: 621–624.

10. Ross JI, Snelling AM, Eady EA, et al. Phenotypic and genotypic

characterization of antibiotic-resistant Propionibacterium acnes isolated from

acne patients attending dermatology clinics in Europe, the USA, Japan and

Australia. Br J Dermatol. 2001;144:339–346.

11. Eady EA, Gloor M, Leyden JJ. Propionibacterium acnes resistance: a

worldwide problem. Dermatology. 2003;206:54–56.

12. Heller S, Kellenberger L, Leyden JJ. Antipropionibacterial activity of

BAL19403, a novel macrolide antibiotic. Antimicrob Agents Chemother.

2007;51:1956–1961.

13. Ross JL, Snelling AM, Carnegie E, et al. Antibiotic-resistant acne: lessons

from Europe. Br J Dermatol. 2003;148:467–478.

14. Ross JL, Eady EA, Carnegie E, Cove JH. Detection of transpospn Tn5432-

mediated macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLSB) resistance in

cutaneous propionibacteria from six European cities. J Antimicrob

Chemother. 2002;49:165–168.

15. Gollnick H, Cunliffe W, Berson D, et al. Management of acne: a report from a

Global Alliance to Improve Outcomes in Acne. J Am Acad Dermatol.

2003;49:S1–S37.

16. Dreno B. Topical Antibacterial Therapy for Acne Vulgaris. Drugs.

2004;64:2389–2397.

17. Japan Society of Chemotherapy. Method for the determination of minimum

inhibitory concentration (MIC) of anaerobic bacteria by agar dilution method.

Chemotherapy. 1979;27:559–560.

18. Japan Society of Chemotherapy. Microbroth dilution methods for

determination of the minimum inhibitory concentrations in bacteria.

Chemotherapy. 1993;41:183–189.

19. Horrevorts AM, de Ridder CM, Poot MC, et al. Chequerboard titrations: the

influence of the composition of serial dilutions of antibiotics on the fractional

inhibitory concentration index and fractional bactericidal concentration index.

J Antimicrob Chemother. 1987;19: 119–125.

20. Hewlett PS. Measurement of the potencies of drug mixtures. Biometrics.

1969;25:477–487.

21. Fluhr JW, Bösch B, Gloor M, Höffler U. In-vitro and in-vivo efficacy of zinc

acetate against propionibacterium alone and in combination with

erythromycin. Zentralbl Bakteriol. 1999;289:445–456.

22. Dreno B, Moyse D, Alirezai M, et al. Multicenter randomized comoarative

double-bind controlled clinical trial of the safety and efficacy of zinc

gluconate versus minocycline hydrochloride in the treatment of inflammatory

acne vulgaris. Dermatology. 2001;203:135–140.

23. Long CC, Finlay AY. The finger-tip unit – a new practical measure. Clin Exp

Dermatol. 1991;16:444–447.

24. Choi EK, Lee HH, Kang MS, et al. Potentiation of bacterial killing activity of

zinc chloride by pyrrolidine dithiocarbamate. J Microbiol. 2010;48:40–43.

25. Vannuffel P, Cocoto C. Mechanism of action of streptogramins and

macrolides. Drugs. 1996;51:20–30.

26. Griffin MO, Fricovsky F, Ceballos G, Villarreal F. Tetracyclines: a pleitropic

family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the

literature. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299: 539–548.

27. Tanaka M, Onodera Y, Uchida Y, Sato K, Hayakawa I. Inhibitory activities of

quinolones against DNA gyrase and topoisomerase IV purified from

Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41:2362–2366.

28. Brion M, Lambs L, Berthon G. Metal ion-tetracycline interactions in

biological fluids. Part 5. Formation of zinc complexes with tetracycline and

some of its derivatives and assessment of their biological significance.

Agents Actions. 1985;17:229–242.

29. Stein GE. Drug interactions with fluoroquinolones. Am J Med. 1991;91: 81S–

86S.