Kerentanan Propionibacterium acnes yang Diisolasi dari Pasien dengan Acne
Vulgaris terhadap Askorbat Seng dan Antibiotik
Katsuhiro Iinuma¹,Norihisa Noguchi², Hidemasa Nakaminami², Masanori Sasatsu²,
Setsuko Nishijima³, Isami Tsuboi¹
Tujuan: aktivitas in vitro antimikroba dari turunan asam askorbat terhadap Propionibacterium acnes diuji baik sendiri atau kombinasi dengan berbagai agen antimikroba, dan indeks konsentrasi pecahan hambatnya ditentukan dengan menggunakan tes checkerboard. Efektivitas antimikroba Askorbat seng dalam pengobatan akne vulgaris, baik sendiri atau kombinasi dengan antibiotik seperti klindamisin, umum digunakan di Jepang untuk pengobatan acne vulgaris, karena itu dilakukan penelitian.Bahan dan metode: kerentanan antimikroba dari 41 strain klindamisin-sensitif dan / atau clindamycin resisten P. acnes diisolasi dari pasien acne vulgaris diuji, dibandingkan dengan strain P. acnes. Hasil: Zink askorbat menunjukkan aktivitas antimikroba terhadap 41 strain P. acnes dan konsentrasinya (0,064%) adalah cukup lebih rendah dari dosis normal (5%) dari turunan asam askorbat lainnya. Kombinasi Zink askorbat dengan klindamisin, eritromisin, dan kloramfenikol menunjukkan efek aditif, dan seng askorbat saja efektif menghambat pertumbuhan semua P. acnes termasuk yang resistan Klindamisin. Kesimpulan: Hasil penelitian ini memberikan bukti baru bahwa kombinasi askorbat seng dan klindamisin efektif untuk pengobatan acne vulgaris. Kata kunci: kerentanan antimikroba, turunan asam askorbat, terapi kombinasi, tes checkerboard.
Pendahuluan
Propionibacterium acnes adalah, bakteri anaerob gram positif di kulit yang
berkolonisasi pada kelenjar sebasea dan folikel pilosebaceous¹. Organisme ini
dianggap memainkan peran utama dalam perkembangan acne vulgaris¹. Acne
vulgaris adalah penyakit peradangan kronis yang ditandai oleh peristiwa inflamasi
khas, termasuk kelebihan produksi sebum, deskuamasi abnormal epitel folikel
sebasea, dan proliferasi P. acnes¹⁻³. Mengenai faktor patogenik untuk perkembangan
dan aggravation akne, irradiasi ultraviolet dan peroksidasi lipid sebum telah
dilaporkan mengaktifkan mediator inflamasi seperti spesies oksigen reaktif(ROS)⁴.
Turunan asam askorbat adalah beberapa antioksidan paling banyak digunakan untuk
melindungi kulit⁵⁻⁶. Efek antioksidan dari 5% natrium fosfat ascorbyl telah
menunjukkan keberhasilan dalam acne vulgaris⁷. Namun, masih belum jelas apakah
turunan asam askorbat memiliki aktivitas antimikroba terhadap P. acnes.
Banyak perawatan topikal dan sistemik yang telah diusulkan untuk acne vulgaris⁸.
Klindamisin dan eritromisin adalah agen yang paling sering digunakan terhadap P.
acnes⁸⁻⁹. Di sisi lain, banyak penelitian telah melaporkan munculnya P. acnes dengan
tingkat resistensi tinggi terhadap makrolida termasuk klindamisin karena terapi
antibiotik jangka panjang biasa digunakan untuk mengobati acne vulgaris¹º⁻¹². Di
Jepang, sebuah penelitian yang dilakukan antara tahun 1994 dan 1995
mengungkapkan bahwa strain resisten terhadap makrolid ditemukan pada hanya 4%
(2/50) dari P. acnes yang diisolasi dari pasien dengan acne vulgaris. Namun, antara
tahun 2006 dan 2007, ditemukan isolat P.acnes yang resisten makrolid sebanyak 10
% (5/48), menunjukkan resistensi P. acnes terhadap macrolides telah meningkat di
Jepang⁸⁻⁹.
Resistensi makrolid pada P. acnes dianggap disebabkan oleh mutasi dari daerah
transferase peptidil dalam 23S rRNA domain V, dan dengan perubahan sasaran situs
dengan dimethylase rRNA 23S yang dikodekan oleh erm (X)¹³. Selain itu, mutasi ini
dikaitkan dengan resistensi silang terhadap klindamisin¹⁴. Oleh karena itu,
peningkatan prevalensi P. acnes yang resisten makrolid, termasuk P. acnes resisten
klindamisin, adalah masalah serius, karena pengobatan akne dengan klindamisin
menjadi sangat sulit.
Baru-baru ini telah dilaporkan bahwa kombinasi antibiotik meningkatkan efek
terapeutik¹⁵⁻¹⁶. Dalam studi ini, efektivitas in vitro dari turunan asam askorbat
terhadap P. acnes dan kombinasi dengan klindamisin, eritromisin, kloramfenikol,
minocycline, atau levofloxacine diteliti.
Bahan dan metode
Strain bakteri dan obat-obatan
Sebanyak 41 strain P. acnes digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari pasien
dengan acne vulgaris antara tahun 2006 dan 2007 di Jepang, dan empat strain ini
adalah P. acnes resisten Klindamisin dengan mutasi dari daerah transferase peptidil
dari 23S rRNA gen: A2058G, atau A2059G di domain V⁹. Para pasien diberi
antibiotik topikal bukan antibiotik sistemik. Sampel dikultur pada media agar Gifu
anaerobik yang dimodifikasi(GAM) (Nissui Pharmaceutical Co, Tokyo, Jepang)
dalam kondisi anaerob pada suhu 35 ° C selama 72 jam. P. acnes diidentifikasi oleh
Api 20A (bioMerieux, Marcy I'Etoile, Perancis)⁹. Strain P. acnes JCM 6473 (ATCC
11828) digunakan sebagai strain kontrol kualitas untuk pengujian kerentanan
antimikroba. Klindamisin, eritromisin, kloramfenikol, dan minocycline yang dibeli
dari SigmaAldrich (Tokyo, Jepang). Semua bahan kimia lain yang digunakan adalah
dari grade analitis tertinggi.
Uji Kerentanan
Uji kerentanan dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran microbroth,
berdasarkan kriteria Perkumpulan Kemoterapi Jepang¹⁷⁻¹⁸. Sampel dikultur dalam
kaldu GAM (Nissui Farmasi Co) dan disesuaikan dengan standar Mc Farland nomor
1. Suspensi encer bakteri digunakan untuk menyuntik 96 lempeng, setiap sumur
mengandung konsentrasi yang berbeda dari obat yang diuji. Pengenceran dua kali
lipat dari obat disiapkan. Konsentrasi obat dalam kaldu GAM berkisar 0,06-128 μ g /
mL (agen antimikroba) atau 1,25-1280 μ g / mL (turunan asam askorbat), dan
konsentrasi akhir 10⁵ unit pembentuk koloni (CFU) bakteri uji per sumur telah
ditambahkan ke dalam pengenceran masing-masing. Pelat diinkubasi dalam kantong
gas yang anaerob (Anaero Kemas System; Mitsubishi Gas Chemical Co, Tokyo,
Jepang) pada suhu 35 ° C selama 48 jam. Setelah kontrol positif yang tidak memiliki
agen antimikroba menunjukkan pertumbuhan yang baik, konsentrasi hambat
minimum (KHM) untuk masing-masing antibiotik didefinisikan sebagai konsentrasi
terendah antibiotik yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan bakteri,
ditunjukkan dengan tidak adanya kekeruhan.
Indeks konsentrasi pecahan hambat (FICI)
Efektivitas kombinasi askorbat seng dan agen antimikroba terhadap P. acnes
ditentukan dengan metode tes checkerboard yang menggunakan metode dilusi
microboth.¹⁹ Indeks konsentrasi Pecahan hambat (FIC) dihitung menggunakan rumus
berikut: Indeks FIC = (MIC obat A dalam kombinasi / MIC obat A saja)+ (MIC B
obat dalam kombinasi / MIC obat B saja) .²º Indeks< 0,5 dianggap sebagai
sinergisme; bahwa< 1,0 tapi> 0,5 sebagai tindakan aditif, dan bahwa> 2.0 sebagai
antagonisme. Sampel disesuaikan dengan standar McFarland nomor 1 dan
konsentrasi akhir 10⁵ CFU / sumur bakteri uji. MIC dari kombinasi ditentukan
setelah inkubasi pada 35 ° C selama 48 jam.
Hasil
Kerentanan antibiotik P. acnes terhadap turunan asam askorbat
Kerentanan antibiotik P. acnes JCM 6473 terhadap asam askorbat seng turunan asam
askorbat, magnesium ascorbyl fosfat, dan natrium fosfat ascorbyl diteliti (Tabel 1).
MIC askorbat seng sebesar 640 mg / mL, sedangkan MIC asam askorbat, magnesium
ascorbyl phosphate, dan natrium fosfat ascorbyl adalah >= 1280 μ g / mL. Dosis
normal turunan asam askorbat adalah 5% (50 mg / mL).⁷ Hasil ini menunjukkan
bahwa askorbat seng cukup menghambat pertumbuhan P. acnes dalam dosis normal.
Dengan demikian, askorbat seng digunakan dalam percobaan lebih lanjut.
Efek kombinasi askorbat seng dan berbagai agen antimikroba terhadap P. acnes
Untuk mempelajari efek kombinasi askorbat seng dan agen antimikroba seperti
klindamisin, eritromisin, kloramfenikol, minocycline, dan levofloksasin, indeks FIC
ditentukan dengan tes checkerboard (Tabel 2). Pada kombinasi askorbat seng dengan
klindamisin, eritromisin, atau kloramfenikol, MIC dari askorbat seng berkurang, dan
indeks FIC berkisar 0,625-0,75. Nilai tersebut menunjukkan efek aditif terhadap P.
acnes JCM 6473. Sebaliknya, indeks FIC pada kombinasi askorbat seng dengan
minocycline atau levofloksasin menunjukkan tidak ada pengaruh.
Klindamisin disetujui dan umum digunakan di Jepang untuk pengobatan acne
vulgaris.⁸⁻⁹ Dengan demikian, efek antimikroba askorbat seng dikombinasikan
dengan klindamisin terhadap 37 strain P. acnes sensitif Klindamisin yang diisolasi
dari pasien dengan acne vulgaris diselidiki. Seperti ditunjukkan pada Tabel 3, kisaran
MIC askorbat seng adalah sekitar dua kali lipat lebih rendah pada kombinasi dengan
klindamisin dibandingkan dengan terapi hanya dengan askorbat seng atau klindamisin
saja. Indeks FIC rata-rata adalah 0,84, menunjukkan efek aditif.
Efek gabungan dari askorbat seng dan agen antimikroba terhadap berbagai P.
acnes resisten Klindamisin yang diisolasi dari pasien dengan acne vulgaris.
P. acnes resisten Klindamisin dengan mutasi dari daerah transferase peptidil pada 23S
rRNA domain V telah meningkat di Jepang.⁹ Efek antimikroba dari askorbat seng
yang dikombinasikan dengan klindamisin, eritromisin, dan kloramfenikol pada empat
strain (PA001-PA004) dari P. acnes resisten Klindamisin dengan transisi dari adenin
ke guanin pada posisi 2.058 (A2058G: PA001-PA003) atau 2059 (A2059G: PA004)
diselidiki. Seperti terlihat pada Tabel 4, askorbat seng sama efektif dalam
menghambat pertumbuhan strain P. acnes resisten Klindamisin (MIC 640 mg / mL).
Pada kombinasi seng askorbat dengan klindamisin, eritromisin, dan kloramfenikol,
MIC dari askorbat seng berkurang (MIC kisaran: 160-320 μ g / mL). Selain itu,
indeks FIC dari strain PA004 dengan P. acnes resistant Klidamisisn adalah 0,75,
menunjukkan efek aditif.
Diskusi
Dalam metode pengenceran microboth, menurut kriteria Perkumpulan Kemoterapi
Jepang, serangkaian pengenceran dua kali lipat digunakan untuk menentukan
efektivitas obat uji, dengan 1 μ g / mL sebagai pengenceran primer.¹⁷⁻¹⁸ Dalam studi
ini, konsentrasi obat berkisar 0,06-128 μ g / mL. Namun, turunan asam askorbat
menunjukkan tidak berpengaruh pada konsentrasi ini. Itu menegaskan bahwa MIC
seng sebesar 1280 μ g / mL (data tidak ditunjukkan), yang mirip dengan yang
dilaporkan oleh Fluhr dkk.²¹ Oleh karena itu, konsentrasi turunan asam askorbat
berkisar antara 1,25 hingga 1280 μg/mL
Lima persen natrium fosfat ascorbyl telah dilaporkan mengurangi lesi jerawat
20,14% dan 48,82%, masiing-masing dalam waktu 4 dan 8 minggu.⁷⁻⁸ Selain itu, zink
topikal (1,2%) dan sistemik (30 mg) telah dilaporkan menunjukkan keberhasilan
dalam pengobatan akne vulgaris.²¹⁻²²
Dalam studi ini, MIC (640 μ g / mL) askorbat seng terhadap P. acnes JCM 6473
adalah 0,064%, dan nilai MIC lebih rendah dari turunan asam askorbat lainnya (MIC
1280 >= μ g / mL). Meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menguji
kinetika obat dan stabilitas askorbat seng, diharapkan bahwa konsentrasi perhitungan
askorbat seng mencapai 2800 μ g / mL bila digunakan pada kulit (4 mg / cm) sebagai
preparat eksternal.²³
Hasil ini menunjukkan kemungkinan bahwa seng askorbat (MIC 640 μ g / mL)
cukup menghambat pertumbuhan P. acnes pada konsentrasi yang lebih rendah dari
dosis normal turunan asam askorbat lain dan seng.
Choi dkk²⁴ melaporkan bahwa mekanisme antimikroba melibatkan kemampuan ion
seng untuk menghambat glikolisis mikroorganisme dengan mengoksidasi kelompok
tiol enzim glikolitik penting, oleh karena itu, mekanisme antimikroba askorbat seng
mungkin mirip dengan seng. Namun, efek gabungan dari askorbat seng dan
minocycline atau levofloksasin tidak terbukti. Klindamisin, eritromisin, dan
kloramfenikol menghambat sintesis protein bakteri dengan mengikat subunit 50S dari
ribosom bakteri.²⁵ Sebaliknya, situs pengikatan minocycline dan levofloksasin
masing-masing adalah pada subunit 30S ribosom dan pada DNA topoisomerase
IV.²⁶⁻²⁷ Dengan demikian, perbedaan dalam mekanisme antibakteri mungkin
berhubungan dengan efek gabungan dari masing-masing antibiotik. Selain itu, ada
kemungkinan bahwa minocycline dan levofloksasin khelat dengan ion logam,
termasuk seng²⁸⁻²⁹, mengakibatkan aktivitas antimikroba berkurang. Percobaan lebih
lanjut diperlukan untuk memperjelas mekanisme askorbat seng terhadap P. acnes.
Makrolid digunakan tidak hanya sebagai agen antimikroba tetapi juga sebagai agen
anti-inflamasi, dan yang paling umum digunakan untuk mengobati acne vulgaris.⁹
Klindamisin menunjukkan efek yang sama dengan makrolida dan merupakan
antibakteri topikal yang paling populer untuk akne vulgaris di Jepang. Namun, strain
P. acnes resisten Klindamisin telah meningkat di Jepang.⁸’⁹ Meningkatnya P. acnes
resisten Klindamisin termasuk makrolida dan epidemi dari Multi Drug Resistent P.
acnes dapat terjadi di masa depan. Dilaporkan bahwa terapi kombinasi dengan agen
antimikroba dan agen lain seperti retinoid eksternal dan peroksida benzoil efektif
dalam mencegah munculnya strain resisten antibiotik dari P. acnes.¹⁵’¹⁶ Dalam
penelitian ini, ditemukan bahwa askorbat seng menghambat pertumbuhan strain P.
acnes yang resisten Klindamisin (MIC 640 μ g / mL). Selain itu, meskipun FIC dari
askorbat seng yang dikombinasi dengan klindamisin tidak dapat dihitung karena MIC
terapi tunggal klindamisin dan dengan kombinasi adalah >= 128 µg / mL (3/4 strain),
hal tersebut mengurangi MIC askorbat seng terhadap semua strain. Selain itu, indeks
FIC dari strain PA004 dengan P. acnes yang resisten Klindamisin adalah 0,75,
menunjukkan efek aditif. Hasil penelitian ini sangat merekomendasikan bahwa
kombinasi askorbat seng dan klindamisin akan berguna untuk mencegah munculnya
P. acnes yang resisten Klindamisin dan untuk mengobati akne vulgaris.
Kesimpulan
Hasil penelitian ini memberikan bukti baru bahwa askorbat seng menghambat
pertumbuhan P. acnes, dan konsentrasi (0,064%) cukup rendah dari dosis normal
(5%) dari turunan asam askorbat lainnya. Selain itu, seng askorbat menunjukkan efek
aditif antimikroba in vitro pada kombinasi dengan klindamisin, eritromisin, dan
kloramfenikol terhadap P.acnes yang resisten maupun sensitif terhadap Klindamisin.
Temuan ini dapat memberikan wawasan baru terapi akne. Baru-baru ini, kombinasi
terapi dengan benzoil peroksida dan klindamisin telah menjadi umum di seluruh
dunia. Percobaan lebih lanjut diperlukan untuk membandingkan askorbat seng
ditambah klindamisin dan peroksida benzyol ditambah klindamisin.
Disclosure
Penulis dilaporkan tidak memiliki conflict of interest pada penelitian ini.
Daftar Pustaka :
1. Bojar RA, Holland KT. Acne and Propionibacterium acnes. Clin Dermatol.
2004;22:357–379.
2. Iinuma K, Sato T, Akimoto N, et al. Involvement of Propionibacterium acnes
in the augmentation of lipogenesis in hamster sebaceous glands in vivo and in
vitro. J Invest Dermatol. 2009;129:2113–2119.
3. Farrar MD, Ingam E. Acne: Inflammation. Clin Dermatol. 2004;22: 380–384.
4. Akamatsu H, Horio T, Hattori K. Increased hydrogen peroxide generation by
neutrophils from patients with acne inflammation. Int J Dermatol.
2003;42:366–369.
5. Pinnell S, Madey D. The benefits of topical Vitamin C (L-ascorbic acid) for
skin care and UV-protection. J Appl Cosmetol. 1999;18:126–134.
6. Burgess C. Topical vitamins. J Drugs Dermatol. 2008;7:2–6.
7. Ruamrak C, Lourith N, Natakankitkul S. Comparison of clinical effca-
cies of sodium ascorbyl phosphate, retinol and their combination in acne
treatment. Int J Cosmet Sci. 2009;31:41–46.
8. Nishijima S, Kurokawa I, Kawabata S. Sensitivity of Propionibacterium acnes
isolated from acne patients: comparative study of antimicrobial agents. J Int
Med Res. 1996;24:473–477.
9. Ishida N, Nakaminami H, Noguchi N, Kurokawa I, Nishijima S, Sasatsu M.
Antimicrobial susceptibilities of Propionibacterium acnes isolated from
patients with acne vulgaris. Microbiol Immunol. 2008;52: 621–624.
10. Ross JI, Snelling AM, Eady EA, et al. Phenotypic and genotypic
characterization of antibiotic-resistant Propionibacterium acnes isolated from
acne patients attending dermatology clinics in Europe, the USA, Japan and
Australia. Br J Dermatol. 2001;144:339–346.
11. Eady EA, Gloor M, Leyden JJ. Propionibacterium acnes resistance: a
worldwide problem. Dermatology. 2003;206:54–56.
12. Heller S, Kellenberger L, Leyden JJ. Antipropionibacterial activity of
BAL19403, a novel macrolide antibiotic. Antimicrob Agents Chemother.
2007;51:1956–1961.
13. Ross JL, Snelling AM, Carnegie E, et al. Antibiotic-resistant acne: lessons
from Europe. Br J Dermatol. 2003;148:467–478.
14. Ross JL, Eady EA, Carnegie E, Cove JH. Detection of transpospn Tn5432-
mediated macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLSB) resistance in
cutaneous propionibacteria from six European cities. J Antimicrob
Chemother. 2002;49:165–168.
15. Gollnick H, Cunliffe W, Berson D, et al. Management of acne: a report from a
Global Alliance to Improve Outcomes in Acne. J Am Acad Dermatol.
2003;49:S1–S37.
16. Dreno B. Topical Antibacterial Therapy for Acne Vulgaris. Drugs.
2004;64:2389–2397.
17. Japan Society of Chemotherapy. Method for the determination of minimum
inhibitory concentration (MIC) of anaerobic bacteria by agar dilution method.
Chemotherapy. 1979;27:559–560.
18. Japan Society of Chemotherapy. Microbroth dilution methods for
determination of the minimum inhibitory concentrations in bacteria.
Chemotherapy. 1993;41:183–189.
19. Horrevorts AM, de Ridder CM, Poot MC, et al. Chequerboard titrations: the
influence of the composition of serial dilutions of antibiotics on the fractional
inhibitory concentration index and fractional bactericidal concentration index.
J Antimicrob Chemother. 1987;19: 119–125.
20. Hewlett PS. Measurement of the potencies of drug mixtures. Biometrics.
1969;25:477–487.
21. Fluhr JW, Bösch B, Gloor M, Höffler U. In-vitro and in-vivo efficacy of zinc
acetate against propionibacterium alone and in combination with
erythromycin. Zentralbl Bakteriol. 1999;289:445–456.
22. Dreno B, Moyse D, Alirezai M, et al. Multicenter randomized comoarative
double-bind controlled clinical trial of the safety and efficacy of zinc
gluconate versus minocycline hydrochloride in the treatment of inflammatory
acne vulgaris. Dermatology. 2001;203:135–140.
23. Long CC, Finlay AY. The finger-tip unit – a new practical measure. Clin Exp
Dermatol. 1991;16:444–447.
24. Choi EK, Lee HH, Kang MS, et al. Potentiation of bacterial killing activity of
zinc chloride by pyrrolidine dithiocarbamate. J Microbiol. 2010;48:40–43.
25. Vannuffel P, Cocoto C. Mechanism of action of streptogramins and
macrolides. Drugs. 1996;51:20–30.
26. Griffin MO, Fricovsky F, Ceballos G, Villarreal F. Tetracyclines: a pleitropic
family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the
literature. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;299: 539–548.
27. Tanaka M, Onodera Y, Uchida Y, Sato K, Hayakawa I. Inhibitory activities of
quinolones against DNA gyrase and topoisomerase IV purified from
Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41:2362–2366.
28. Brion M, Lambs L, Berthon G. Metal ion-tetracycline interactions in
biological fluids. Part 5. Formation of zinc complexes with tetracycline and
some of its derivatives and assessment of their biological significance.
Agents Actions. 1985;17:229–242.
29. Stein GE. Drug interactions with fluoroquinolones. Am J Med. 1991;91: 81S–
86S.