Két Foton Mikroszkópia

8/18/2019 Két Foton Mikroszkópia

1/17

Két-foton mikroszkópia a

neurobiológiában

Tóth Tímea

Info-bionika MSc


2/17

Fluoreszcens és konfokális

mikroszkópia

Henry Mühlpfordt https://www.microscopyu.com/articles/confoc

al/confocalintrobasics.html


3/17

Miért nem konfokális mikroszkópot

használunk élő állathoz?

Fritjof Helmchen & Winfried Denk

Nature Methods 2, 932 - 940 (2005)


4/17

Miért nem konfokális mikroszkópot

használunk élő állathoz?

Stem cell-based photodynamic therapy

Tej B. Shrestha et al.

Photochem. Photobiol. Sci., 2012,11, 1251-1258


5/17

Szórás

• Rayleigh-féle szórás:• A szórt fény intenzitásának szögeloszlását a

következő összefüggés írja le:

I: fényintenzitás, θ: szögeltérés, λ: hullámhossz

• Ha a képalkotást a közeli-infravörös

fénytartományban végezzük, minimalizálhatjuk az

abszorpció és a szórás okozta kellemetlenségeket


6/17

Egy-fotonos és két-fotonos gerjesztés

http://mcb.berkeley.edu/labs2/robey/content/2-photon-imaging

Mindkét fotonnak egyidőben

kell érkeznie (


7/17

Két-fotonos gerjesztés

• A folyamat létrejöttéhez szükséges, hogy a két

foton szinte egyidőben érkezzen

• => gerjesztés csak a fókuszpont közelében

történik (ahova lézerfény a legkoncentrál-

tabban érkezik)


8/17

Egy- és két-foton mikroszkópia

http://parkerlab.bio.uci.edu/microscopy_construction/build_your_own_twophoton_

microscope.htm


9/17

Lézer

Mindez femtoszekundum pulzushosszúságú, ún.

"mode-lock" lézer használatával lehetséges,

amely a pulzusok ideje alatt a kétfoton-

gerjesztéshez szükséges igen nagy fotonfluxust

képes előállítani, ugyanakkor a két pulzus között

eltelt nanoszekundumos idő alatt "alszik",

amivel az átlagos energiaközlés rendkívül alacsony szinten tartható (Denk és Svoboda,

1997).


10/17

Egy- és két-foton mikroszkópia

http://parkerlab.bio.uci.edu/microscopy_construction/build_your_own_twophoton_

microscope.htm


11/17

Két-foton mikroszkópia

https://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/

multiphoton/multiphotonintro.html

Két-foton

mikroszkópiánál

• Nincs szükség

konfokális résre

• Mivel minden emittált

fény a fókuszpontból

érkezik, nem kell róla

képet alkotni, csak

intenzitást rögzíteni • Egész minta pásztázása


12/17

Két-foton mikroszkópia előnyei

• Penetráció

• Fokális gerjesztés

•

A fotonszóródás kihasználása • Hangolhatóság

• Időbeni felbontás


13/17

Példák

Egér neocortex

• Transgenic egér

• Clomeleont expresszál

• Clomeleon: fúziós protein,

ami két fluorofórt tartalmaz

(YFP és CFP)

Fritjof Helmchen & Winfried Denk

Nature Methods 2, 932 - 940 (2005)


14/17

Példák

GABAerg neuronok

PV: paralbumint expresszál

Sst: szomatosztatint expresszál

Genetikai módosítás: tdTomato protein-expresszió (piros)

ChR2-t expresszáló neuron (zöld)

Aurélie Pala and Carl

C.H. PetersenNeuron 85, 68 –75,

January 7, 2015


15/17

Példák

Balazs Lendvai et al.

Learn. Mem. 2000 7: 433-441

Piramissejtek• EGFP fehérjét (Enhanced

Green Fluorescent Protein)

tartalmazó piramissejtek egy

patkány szomatoszenzoroskérgében élő, altatott állatban

• Az fluoreszkáló fehérje génjét

vírusok segítségével jutatták

az állat agyába.


16/17

Felhasznált irodalom

• https://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintr

obasics.html

• Deep tissue two-photon microscopy : Fritjof Helmchen &

Winfried Denk, Nature Methods 2, 932 - 940 (2005)

• http://www.termeszetvilaga.hu/szamok/kulonszamok/k0602/l

endvai.html

• http://mcb.berkeley.edu/labs2/robey/content/2-photon-

imaging


17/17

Köszönöm a figyelmet!

Documents

Két Foton Mikroszkópia