KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIGNIN PEROXIDASE, MANGANESE PEROXIDASE, CELLULASE CỦA CHỦNG PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM KHI BỊ XỬ LÝ BẰNG SHOCK NHIỆT VÀ TIA UV

I) MỞ ĐẦU:Sau cellulose, lignin là một polime phong phú trong tự nhiên được thực

vật tổng hợp, là một nguồn chất thơm lớn trên trái đất. Lignin tạo độ cứng cho tế bào thực vật, giúp cho tế bào động vật tránh khỏi các xâm nhiễm của vi sinh vật.

Nó là một hợp chất cao phân tử đặc biệt của thực vật, thường tập trung ở những mô hóa gỗ, là chất kết dính tế bào, làm tăng độ bền cơ học, chống thắm nước qua vách tế bào mô xylem, ngăn cản sự xâm nhập của visinh vật gây bệnh .Khácc với xenlulo, hemixenlulo lignin hình thành từ các dẫn suất của phenyl, propan, một chất thơm có mạch nhánh. Nói cách chi tiết hơn, lignin là sản phẩm ngưng tụ của 3 thành phần chủ yếu rượu trans-p-cumaryl, trans-coniferyl, trans-cynapyl theo tỷ lệ khác nhau tùy loại thực vật. lignin của cây gỗ thực vật mềm điển hình gồm 80 conyferyl, 14 cumaryl và 6% coniferyl. Lignin của cây gỗ cứng gồm lượng bằng nhau của conyferyl và cynapyl; cumaryl khiếm tỷ lệ rất nhỏ. Trong đại phân tử lignin, các đại cấu trúc nối với nhau bằng rất nhiều liên kết và loại liên kết, trong đó liên kết chủ yếu chiếm 50-60% số liên kết giữa monome là kiểu liên kết aryl-glyxerol--aryl ete. Ngoài ra còn có các kiểu liên kết phenyl-cumaryl, biphenyl, diarylete. Vì dẫn suất của các hợp chất thơm có mạch bên với nhiều nhớm chức hoạt động, đặc biệt là OH của nguyên tử cacbon(đối với vịng thơm) nên lignin có thể tham gia vào nhiều loại phản ứng đặc trưng khác hẳn với xenlulo và hemixenlulo, như các phản ứng thế( clo hóa), phản ứng este hóa, oxy hóa, dimetyl hóa. Nó tan tốt trong dung dịch kiềm nóng, một phần trong dung môi hữu cơ.

Vi khuẩn và nấm có khả năng sinh ra enzyme phân hủy lignin, chủ yếu là nấm. Từ đó, đưa đến hướng nghiên cứu khả năng phân hủy lignin ở nấm. Nghiên cứu khả năng phân hủy lignin sẽ giúp cho ta có những kiến thức nhất

định về nó, do đó giúp ứng dụng vào sản xuất. Khi biết được các yếu tố ảnh hưởng sẽ kiểm soát được quá trình phân hủy lignin, biết được các yếu tố tác động để thúc đẩy hay kiềm hãm quá trình… Ngoài ra, còn có thể ứng dụng khả năng phân hủy lignin của chúng để biết được khả năng sản sinh enzyme phân hủy lignin, biết được thời điểm nào thu được lượng enzyme nhiều nhất, ứng dụng vào vấn đề thu nhận enzyme.Ngày nay, các enzyme có khả năng phân hủy lignin được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau với nhiều mục đích. Như trong thực phẩm và thức ăn gia súc, sử dụng các enzyme này nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn xơ cho động vật ăn cỏ; ứng dụng để xử lý chất thải tẩy trắng cellulose và các chất hữu cơ độc hại như PAH, PCB, dioxin; chuyển hóa lignin thành chất mới. Ngoài ra enzyme phân hủy lignin còn được ứng dụng vào công nghiệp sản xuất bột và giấy, tham gia quá trình sản xuất bột bằng phương pháp sinh học, tẩy trắng bột bằng phương pháp sinh học biến tính xơ sợi, phân hủy lignin ở dăm gỗ để giảm tính tiêu hao năng lượng trong sản xuất bột cơ và hóa.Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng phân hủy lignin ở nấm là cần thiết để có các dữ liệu ứng dụng vào sản xuất công nghiệp.

Việc chuyển hóa nguồn chất hữu cơ này thành các sản phẩm có ích cũng như giải quyết vấn đề ô nhiễm hiện gặp nhiều khó khăn.

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy Phanerochaete chrysosporium là loại vi sinh vật được biết và được nghiên cứu nhiều do khả năng phân hủy lignin bằng hệ enzyme của chúng. Với mục đích nâng cao chủng vi sinh vật nhằm thu được enzyme có hoạt tính cao sử dụng trong việc phân giải chất hữu cơ trong tự nhiên, chúng tôi đã sử dụng hai tác nhân UV và Shock nhiệt để gây đột biến cho Phanerochaete chrysosporium và theo dõi hoạt tính của Lignin Peroxidase (LiP) , Manganese Peroxidase (MnP) và cellulase theo thời gian chiếu tia UV và nhiệt độ gây shock nhiệt.

II. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA LiP, MnP VÀ CELLULASE THEO THỜI GIAN NUÔI CẤY PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM

1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:1.1. Nguyên liệu:- Chủng nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium được phòng Sinh

học phân tử của trường Đại Học Khoa học tự nhiên phân lập từ thân gỗ mục:

Loài nấm mục trắng là nhóm nấm dị tản thuộc nhóm Basidiomycetes, lớp Hymenomycetes, bộ Aphyllomycetes, chi Phanerochaete…

Cấu trúc tế bào: Phanerochaete chrysosporium là mô hình nấm thối trắng vì khả năng chuyên môn của nó làm suy giảm phong phú polymer lignin thơm, trong khi cellulase trắng gần như bị ảnh hưởng.

Có khả năng phân giải hoàn toàn Lignin thành carboxyl và H2O nhờ vào một hệ enzyme ngoại bào. Hệ enzyme giữ vai trò chủ yếu trong phân giải Lignin là peroxidase nhân heme ngoại bào, đó Manganese Peroxidase (MnP) và Lignin Peroxidase (LiP) cùng hệ thống tạo ra H2O2.

1.2. Phương pháp:- Phương pháp định hoạt tính LiP dựa vào sự oxi hóa xanh methylen làm

giảm sự hấp thu ở bước sóng 664nm.- Phương pháp định hoạt tính MnP dựa vào sự oxi hóa hợp chất Phenol

Red, gia tăng hấp thu ở bước sóng 610nm.- Phương pháp định hoạt tính cellulose: sử dụng CMC (Carboxylmethyl

Cellulase) như cơ chất, ủ chiết enzyme với CMC trong 1 giờ, pH 4,5. Hệ enzyme cellulose tác dụng lên CMC, phóng thích ra các phân tử đường glucose, dựa vào lượng đường khử ta xác định hoạt tính của Enzyme.

2. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN:Hoạt tính của LiP, MnP và cellulase theo thời gian nuôi cấy:Đặc tính của Phanerochaete chrysosporium là một loại vi sinh vật hiếu khí nên chúng tôi nuôi cáy lắc trong môi trường PGB (lỏng).Môi trường PGB ( Potatos Glucose Bloth):

Thành phấn môi trường (g/l):- Khoai tây: 200g- Glucose: 20g- Nước cất đầy đủ: 1000ml

Hấp khử trùng 121oC trong 20 phút.Trước khi thực hiện các thí nghiệm tạo đột biến cho Phanerochaete chrysosporium chúng tôi khảo sát thời gian nuôi cấy lắc để Phanerochaete chrysosporium phát triển tốt và cho hoạt tính 3 loại Enzyme một cách tối ưu:

- Hoạt tính LiP thay đổi không nhiều trong 12 ngày nuôi cấy lắc. Tuy nhiên hoạt tính LiP có xu hướng giảm dần khi thời gian nuôi cấy kéo dài. Vậy thu chế phẩm có hoạt tính LiP cao nhất là từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7.

- Hoạt tính của MnP và cellulase đạt đươc mức cao nhất là ngày thứ 7.

Vậy qua kết quả khảo sát hoạt tính LiP, MnP và Cellulase theo thời gian nuôi cấy lắc Phanerochaete chrysosporium, chúng tôi nhận thấy thu được ngày thứ 7 sẽ cho hoạt tính của 3 loại Enzyme ở mức cao nhất. Trong các thí nghiệm sau ( chiếu tia UV, shock nhiệt) chúng tôi sử dụng chế phẩm được thu từ nuôi cấy lắc trong môi trường PGB trong vòng 7 ngày.

III. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA LIP, MNP VÀ XENLULASE CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM BẰNG SHOCK NHIỆT

Đối với phanerochaete chrysosporium nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển mạnh là từ 28-40oC nên việc thực hiện shock nhiệt được bắt đầu ở nhiệt độ 50oC và qua khảo sát cho thấy ở nhiệt độ 80oC thì hoạt tính của 3 loại enzyme đạt được rất thấp so với ở nhiệt độ bình thường trong khoảng thời gian 30 phút, nên các thí nghiệm được làm trong khoảng từ 50-70oC. Để nghiên cứu sự thay đổi hoạt tính của 3 loại Enzyme trên người ta sử dụng các sợi tơ nấm trên môi trưởng thạch nghiêng (PGA) cho vào dung dịch agar 0.05% và thực hiện ở 3 mức nhiệt độ là 50 60 và 70. Sau đó nuôi cấy các sợi tơ nấm này cho tăng sinh trong môi trường PGB và tạo enzyme trong điều kiện lắc đều.

1. Hoạt tính của Lignin Peroxisdase(LiP)

Ở nhiệt độ 50oC hoạt tính của LiP chưa có sự thay đổi bức phá cao, nếu tăng thời gian shock nhiệt lên thì hoạt tính của LiP tăng dần.

Ở nhiệt độ 60oC hoạt tính LiP đạt cực đại ở thời gian là 120 phút (0.077UI/ml) tăng thêm 2.5 lần so với mẫu không bị shock nhiệt (0.033UI/ml). khi tăng dần thời gian shock nhiệt lên tới 180 phút thì hoạt tính của LiP giảm chỉ còn 0.021UI/ml.

Ở nhiệt độ 70oC hoạt tính LiP cao nhất trong thời gian 15 phút là 0.5UI/ml và sau đó giảm dần, khi tăng thời gian lên tới 90 phút thì hoạt tình chỉ còn 0.018UI/ml

2. Hoạt tính Manganase Peroxidase (MnP)

Ở nhiệt độ 50oC hoạt tính của MnP thay đổi không đáng kể,

Ở nhiệt độ 60oC thì MnP đạt cực đại tại thời điểm 60 phút, tang gấp đôi so với khi không sock nhiệt (từ 60UI/ml tăng lên 120UI/ml).

Ở nhiệt độ 70oC thì hoạt tính của MnP giảm rất thấp chỉ 0.45Ui/ml ở thời gian là 15 phút và ở 60 phút là 0.15UI/ml

3. Hoạt tính của celluase

Ở nhiệt độ 60oC khi sock nhiệt ở thời gian là 90 phút thì hoạt tính của Cellulase đạt giá trị cao nhất là 0.6UI/ml. cao gấp 2 lần so với hoạt tính không được sock nhiệt.

Ở nhiệt độ 50oC thì hoạt tính hầu như không thay đổi.

Ở nhiệt độ 70oC hoạt tính của cellulose có chiều hướng giảm dần

4. Kết Luận

Khi shock nhiệt ở nhiệt độ 50, 60, 70 thì ở nhiệt độ 60oC thì hoạt tính của 3 loại enzyme để tăng đến cực đại và tùy vào thời gian shock nhiệt của mỗi lại enzyme.

IV. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CỦA LIP, MNP VÀ CENLULASE CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM BẰNG TIA UV.

1. Phương pháp

Phương pháp định hoạt tính LiP dựa vào sự oxi hóa xanh methylen, làm giảm sự hấp thu ở bước sóng 664nm.

Phương pháp định hoạt tính MnP dựa vào sự oxi hóa hợp chất Phenol red, gia tăng hấp thu ở bước sóng 610nm.

Phương pháp định hoạt tính Cellulase: sử dụng CMC (carboxylmethyl cellulase) như cơ chất, ủ chiết dịch enzyme với CMC trong 1 giờ, pH 4.5. Hệ enzyme cellulase tác dụng lên CMC, phóng thích ra các phân tử đường glucose, dựa vào lượng đường khử ta xác định được hoạt tính enzyme.

2. Nguyên tắc của phương pháp

Tia UV là tia tử ngoại có bước sóng trung gian (giữa ánh sáng nhìn thấy được và tia X). Tác dụng của tia tử ngoại (UV) là kiềm hãm sự sao mã, phiên mã của vi sinh vật, vì vậy nó là một tác nhân gây đột biến tạo giống mới. George M.Savage 1949 đã dùng năng lượng tia UV và tia X để làm tăng khả năng tạo kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces griseus. Do đó,người ta cũng dùng tia UV để tiến hành khảo sát hoạt tính LiP, MnP và cellulase của Phanerochaete chrysosporium.

Hoạt tính của các enzyme LiP, MnP và cellulase thay đổi theo thời gian khác nhau khi chiếu trên tia UV.

3. Cách tiến hành

Cho một lượng vi sinh vật vào đĩa petri đã được khử trùng và đặt dưới nguồn sáng đèn UV (đèn UV trong tủ cấy vô trùng hiệu BASSII, bước sóng 253 – 257, công suất gần 1kw), tại vị trí cách đèn chiếu 45cm, chiếu trong những khoảng thời gian xác định (15, 30, 45 phút).

Một số hình ảnh tủ cấy vô trùng thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm:

Sau đây là các đồ thị biểu thị sự thay đổi hoạt tính của LiP, MnP, cellulasse theo thời gian khi được chiếu trên tia UV

Qua đồ thị trên ta nhận thấy rằng tia UV có ảnh hưởng đến hoạt tính LiP của Phanerochaetechrysosporium.

Sau đó cho lượng vi sinh vật này vào môi trường PGB và nuôi cấy lắc.

Nếu Phanerochaete chrysosporium chịu tác động của tia UV trong 30 phút thì hoạt tính LiP đạt được cao nhất là 0.0485UI/ml so với hoạt tính ban đầu là 0.0328UI/ml.

Hoạt tính MnP theo thời gian chiếu UV lên Phanerochaete chrysosporium

Theo đồ thị trên, trong 3 enzyme thì cellulase là enzyme chịu ảnh hưởng tốt từ việc chiếu UV. Hoạt tính tăng tốt nhất khi Phanerochaete chrysosporium được chiếu UV trong thời gian là 30 phút, hoạt tính đạt 1.51UI/ml, tăng khoảng 5 lần so với ban đầu là (0.28UI/ml). Nhưng nếu thời gian chiếu UV tăng lên đến 45 phút thì hoạt tính cellulase giảm xuống gần bằng 0 (0.1025UI/ml).

Vậy nếu Phanerochaete chrysosporium chịu tác động của tia UV thì chỉ có hoạt tính của LiP và cellulase tăng còn MnP sẽ giảm và bằng 0 nếu chiếu tia UV trong vòng 45 phút.

4. KẾT QUẢ

Tia UV có tác dụng làm tăng hoạt tính của cellulase, không có tác động rõ đối với hoạt tính LiP và làm giảm hoạt tính của MnP

Hoạt tính cellulase đạt 1.51UI/ml (gấp 5 lần so với ban đầu là 0.28UI/ml) dưới tác động của tia UV trong 30 phút.

Hoạt tính LiP đạt được 0.0485UI/ml (ban đầu là 0.0328UI/ml) dưới tác động của tia UV trong 30 phút.

Hoạt tính MnP của Phanerochaete chrysosporium có xu hướng giảm dần và bằng 0 dưới tác động của tia UV trong 45 phút.

Tài Liệu Tham Khảo.