KIT-URILE DE TIPIZARE LIFECODES® HLA-SSO A se utiliza ... Documents/LC1436IVDRO... · prin PCR a ADN-ului este utilizată ca mijloc de creştere a numărului de copii ale unei regiuni

Legendă: Text subliniat = adăugare sau modificare semnificativă; ▲= text suprimat Pagina 1 din 12 LC1436IVDRO Rev. K

Immucor GTI Diagnostics, Inc. 20925 Crossroads Circle, Waukesha, WI SUA

Tel: +1 (855) 466-8267 WWW.IMMUCOR.COM

Informaţii despre produs şi traduceri disponibile la: www.Immucor.com

KIT-URILE DE TIPIZARE LIFECODES® HLA-SSO A se utiliza pentru diagnosticarea in vitro

CUPRINS

Definirea simbolurilor ................................ 1 Instrucţiuni de utilizare .................................. 6

Kit-uri/Reactivi în funcţie de număr de catalog ....................................................

2

A. Purificarea ADN-ului genomic ................. 6

B. Amplificarea ADN-ului (PCR) ................... 6

Domeniul de utilizare ................................. 4 C. Hibridizare ................................................. 7

Sumar şi explicaţie .................................... 4 D. Analiza cu aparatul Luminex ................... 8

Principiile procedurii ................................. 4

Reactivi ......................................................... 5 Rezultate ........................................................... 8

A. Identificare ............................................ 5 Controlul calităţii ............................................. 9

B. Avertizări şi precauţii ........................... 5 Limitările procedurii ....................................... 9

C. Instrucţiuni de depozitare ................... 5 Probleme tehnice ............................................ 9

D. Purificarea sau tratamentul necesar pentru utilizare .......................

5

Valori prevăzute .............................................. 10

Caracteristici specifice de performanţă ..... 10

E. Indicaţii privind instabilitatea ............... 5 Referinţe ........................................................... 10

Necesarul de instrumente ........................ 5 Licenţe limitate ................................................ 10

Recoltarea şi prepararea probelor .......... 5 Informaţii privind producătorul .................... 10

Procedură .................................................... 5 Mărci comerciale utilizate ............................. 10

A. Materialele furnizate ............................ 5 Anexa A ............................................................. 11

B. Materiale necesare, dar care

nu sunt furnizate ...................................

5

Electroforeza în gel ....................................... 11

Interpretarea gelului ...................................... 11

C. Materiale suplimentare ce urmează

a fi furnizate de utilizator .....................

6

DEFINIREA SIMBOLURILOR (Etichetele produselor şi documentaţia suplimentară)

Cod lot

Număr de

catalog

Limite de temperatură

Limita superioară de temperatură

Data expirării

A se feri de lumină

Suficient

pentru teste N

A nu se congela

Atenţie –A se vedea

instrucţiunile de utilizare

Consultaţi

instrucţiunile de utilizare

Producător

Reprezentant autorizat în

Comunitatea Europeană

Pericol

P R O S P E C T U L P R O D U S U L U I

http://www.archeus.ro/lingvistica/CautareDex?query=HART%C4%82



http://www.gen-probe.com/


KIT-URI/REACTIVI ÎN FUNCŢIE DE NUMĂRUL DE CATALOG

LCT-A LIFECODES HLA-A SSO - Kit de tipizare, Nr. Catalog 628911

LM-A LIFECODES HLA-A - Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 628410-50

Reactiv Număr produs Volum de umplere

Depozitare 50

Suficient pentru 50 de probe

MX-A LIFECODES HLA-A Master Mix 628405 870 µL 2 până la 8 °C

BM-A LIFECODES HLA-A Probe Mix ‡ 628453 810 µL 2 până la 8 °C


DS Soluţie pentru diluţie 628515 9,9 ml 18 până la 30 ºC

TAQ LIFECODES Polimerază Taq 628075 25 µL -10 până la -30 ºC

LCT-AE LIFECODES HLA-A eRES SSO – Kit de tipizare, Nr. Catalog 628913

LC-AE LIFECODES HLA-A eRES – Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 628459 -50


Depozitare 50


MX-A LIFECODES HLA-A Master Mix 628405 870 µL 2 până la 8 °C

BM-A LIFECODES HLA-A Probe Mix ‡ 628453 810 µL 2 până la 8 ºC


BM-AeRES LIFECODES HLA-A eRES Probe Mix ‡ 628455 810 µL

2 până la 8 ºC A se feri de lumină


TAQ LIFECODES Taq Polimerază 628075 25 µL -10 până la -30 ºC

LCT-B LIFECODES HLA-B SSO – Kit de tipizare, Nr. Catalog 628915

LM-B LIFECODES HLA-B – Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 628510-50


Depozitare 50


MX-B LIFECODES HLA-B Master Mix 628556 870 µL 2 până la 8 °C

BM-B LIFECODES HLA-B Probe Mix ‡ 628553 810 µL 2 până la 8 °C




LCT-BE LIFECODES HLA-B eRES SSO – Kit de tipizare, Nr. Catalog 628917

LC-BE LIFECODES HLA-B eRES – Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 628559-50


Depozitare 50


MX-B LIFECODES HLA-B Master Mix 628556 870 µL 2 până la 8 °C

BM-B LIFECODES HLA-B Probe Mix ‡ 628553 810 µL 2 până la 8 ºC


BM-BeRES LIFECODES HLA-B eRES Probe Mix ‡ 628554 810 µL 2 până la 8 ºC




‡Amestecurile de sonde sunt sensibile la acţiunea luminii: minimalizaţi expunerea la lumină. ATENŢIE: nu folosiţi componentele după data expirării. ATENŢIE: Abaterile de la protocolul recomandat şi de la materialele necesare, inclusiv LIFECODES Polimeraza Taq nu au fost validate.






LCT-CE LIFECODES HLA-C eRES SSO – Kit de tipizare, Nr. Catalog 628921

LC-CE LIFECODES HLA-C eRES - Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 628850-50


Depozitare 50


MX-C LIFECODES HLA-C Master Mix 628803 870 µL 2 până la 8 °C

BM-CeRES LIFECODES HLA-C eRES Probe Mix ‡ 628804 810 µL 2 până la 8 °C


DS Soluţie pentru diluţie 628515 19,7 mL 18 până la 30 ºC


LCT-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 SSO – Kit de tipizare , Nr. Catalog 628923

LM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 – Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 628751-50


Depozitare 50


MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Master Mix 628753 870 µL 2 până la 8 °C

BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Probe Mix ‡ 628752 810 µL 2 până la 8 °C




LCT-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eRES SSO – Kit de tipizare, Nr. Catalog 628925

LC-DR1E LIFECODES HLA-DRB1 eRES – Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 628759-50


Depozitare 50


MX-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Master Mix 628753 870 µL 2 până la 8 °C

BM-DR1 LIFECODES HLA-DRB1 Probe Mix ‡ 628752 810 µL 2 până la 8 ºC


BM-DR1eRES LIFECODES HLA-DRB1 eRES Probe Mix ‡ 628755 810 µL 2 până la 8 ºC




LCT-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 SSO – Kit de tipizare, Nr. Catalog 628927

LC-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 - Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 629200-50


Depozitare 50


MX-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Master Mix

629201 870 µL 2 până la 8 °C

BM-DRB3,4,5 LIFECODES HLA-DRB 3,4,5 Probe Mix ‡

629202 810 µL 2 până la 8 ºC










LCT-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 SSO - Kit de tipizare, Nr. Catalog 628930

LM-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 – Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 200210-50


Depozitare

Suficient pentru 50 de

probe

MX-DQAB LIFECODES HLA-DQA1/B1 Master Mix 200200 870 µL 2 până la 8 °C

BM-DQAB LIFECODES HLA- DQA1/B1 Probe Mix ‡ 200201 810 µL 2 până la 8 °C


DS Soluție pentru diluție 628515 19,7 ml 18 până la 30 ºC

TAQ LIFECODES Polimerază Taq 628075 25 µL -10 ºC până la -30 ºC

LCT-DPAB LIFECODES HLA-DPA1/B1 SSO Kit de tipizare, Nr. Catalog 628936

LC-DPAB LIFECODES HLA-DPA1/B1 Kit de tipizare pentru utilizare cu Luminex Nr. Produs 200110-50


Depozitare

Suficient pentru 50 de

probe

MX-DPAB LIFECODES HLA DPA1/B1 Master Mix 200100 870 µL 2 până la 8 °C

BM-DPAB LIFECODES HLA DPA1/B1 Probe Mix ‡ 200101 810 µL 2 până la 8 °C


DS Soluție pentru diluție 628515 19,7 ml 18 până la 30 ºC

TAQ LIFECODES Polimerază Taq 628075 25 µL -10 ºC până la -30 ºC


DOMENIUL DE UTILIZARE Tipizarea ADN a alelelor HLA de clasă I şi clasă II pentru utilizare în transfuzii și potrivirea donatorului și beneficiarului unui transplant.

SUMAR ŞI EXPLICAŢIE Tipizarea HLA pe bază de ADN, folosind ADN-ul amplificat prin PCR (reacţie de polimerizare în lanţ), reprezintă o procedură de laborator obişnuită. Amplificarea prin PCR a ADN-ului este utilizată ca mijloc de creştere a numărului de copii ale unei regiuni de ADN. Pentru tipizarea HLA, este utilizat un test ulterior pentru determinarea proprietăţilor ADN-ului amplificat. Mai multe tipuri de analize, cum ar fi SSP (1), SSOP direct (2), RFLP (3) şi tehnologii inverse dot blot SSOP, au fost utilizate pentru tipizarea HLA. Asemeni metodei SSOP şi metodelor inverse dot blot, kit-urile de tipizare LIFECODES HLA-SSO utilizează oligonucleotide cu secvenţă specifică (SSO) pentru identificarea alelelor HLA, prezente într-o probă amplificată prin PCR. Setul de SSO folosit şi nu metodologia determină posibilitatea de a distinge diferitele alele prezente în amplificarea PCR. În timp ce metodele dot blot şi SSOP utilizează marcaje enzimatice şi substraturi colorimetrice ce necesită dezvoltarea ulterioară, testul LIFECODES reprezintă un sistem omogen multiplu. Adică, toate SSO sunt analizate simultan şi întregul test este realizat într-un singur vas de reacţie cu adăugarea unui singur reactiv.

PRINCIPIILE PROCEDURII Procedura de tipizare LIFECODES HLA-SSO se bazează pe hibridizarea produsului PCR monocatenar marcat, la sondele SSO. Amplificarea ADN-ului cu ajutorul PCR necesită, de obicei, cantităţi echimolare atât de primer sens, cât şi antisens pentru a genera ADN dublu catenar. Cu toate acestea, dacă un primer se găseşte într-o cantitate mai mare decât celălalt, reacţia va genera şi ADN monocatenar, pe lângă produsul dublu catenar. Pe parcursul ciclurilor iniţiale ale pasului de amplificare a LIFECODES, se generează ADN dublu catenar. După consumarea primerului de limitare, primerul rămas foloseşte produsul dublu catenar ca matriţă pentru generarea de ADN monocatenar. Această metodă generează atât produse monocatenare, cât şi dublu catenare care, după denaturare, vor participa împreună la reacţia de hibridizare.

Fiecare dintre diferitele sonde poate fi omoloagă cu o secvenţă a ADN-ului amplificat, specifică unei gene alele sau unui grup de alele. Cu alte cuvinte, aceste sonde sunt concepute astfel încât fiecare să hibridizeze preferenţial o regiune complementară care ar putea fi sau nu prezentă în ADN-ul amplificat. În plus, ADN-ul amplificat este, de asemenea, hibridizat la una sau mai multe sonde consens omoloage secvenţelor prezente în toate genele alele ale unui locus. Tipizarea SSO poate fi influenţată de tipul materialului biologic, metoda de purificare, cantitatea şi integritatea ADN-ului genomic. Aşadar, semnalul obţinut de la sonda(ele) conses poate servi ca indicator al reuşitei procedurilor de amplificare şi hibridizare. De asemenea, semnalul obţinut cu ajutorul sondei consens poate fi utilizat pentru normalizarea semnalului sondelor specifice alelelor şi corectarea variaţiilor cantităţii de produs amplificat în reacţia de hibridizare. Analiza rezultatelor generate de tipizarea SSO poate fi utilizată pentru determinarea prezenţei sau absenţei unei anumite secvenţe de ADN în ADN-ul amplificat şi pentru identificarea posibilelor alele din probă.

Pentru procedura de tipizare LIFECODES HLA-SSO, sondele sunt legate la microsfere Luminex care sunt utilizare împreună cu instrumentul Luminex 100 sau 200. Până la 100 de populaţii diferite de microsfere Luminex pot fi amestecate şi analizate cu instrumentul Luminex 100 sau 200, deoarece fiecare populaţie de microsfere poate fi diferenţiată prin indicatorul său unic de fluorescenţă sau culoare. O sondă SSO diferită poate fi asociată fiecărei microsfere colorate. Aşadar,





un amestec de mai multe sonde poate fi diferenţiat de celelalte datorită asocierii cu anumite culori ale microsferelor. Instrumentul Luminex 100 sau 200 poate, de asemenea, să cuantifice cantităţile relative ale produsului PCR marcat ce hibridizează la fiecare microsferă Luminex. Aşadar, semnalul relativ obţinut cu sondele SSO în testul LIFECODES, ca şi cu alte metode SSOP, poate fi utilizat pentru stabilirea reactivităţii pozitive sau negative a sondelor la proba de ADN amplificat (a se vedea secţiunea Rezultate). Aceasta, la rândul ei, oferă informaţiile necesare pentru determinarea fenotipului HLA al probei.

REACTIVI A. Identificare

A se vedea tabelele din secţiunea Kit-uri/Reactivi în funcţie de numărul de catalog pentru lista completă a produselor şi numerelor de catalog.

B. Avertizări sau precauţii 1. A se utiliza pentru diagnosticarea in vitro. 2. Pipetele utilizate pentru manipulări Pre-PCR nu trebuie utilizate pentru manipulări post-PCR. 3. Avertizare cu privire la pericolul biologic: Toate probele biologice şi de sânge trebuie tratate ca potenţial infecţioase. Aplicaţi Măsurile de

Precauţie Universale atunci când la manipulaţi. 4. Soluţia pentru diluţie, amestecurile de sonde, polimeraza TAQ şi Streptavidina conjugată cu R-Ficoeritrină conţin compuşi periculoşi. Evitaţi

contactul cu pielea şi ochii şi aruncaţi toate materialele după utilizare conform normativelor locale. A se vedea Fişa Tehnică de Securitate pentru mai multe informaţii.

5. Rezultatele obţinute cu aceste kit-uri nu trebuie folosite ca bază unică pentru luarea unei decizii medicale ce afectează pacientul.

C. Instrucţiuni de depozitare 1. Consultaţi eticheta de pe ambalajul componentelor kit-ului pentru temperaturile adecvate de depozitare. 2. Amestecurile de sonde şi Streptavidina conjugată cu R-Ficoeritrină sunt sensibile la lumină. A SE FERI DE LUMINĂ; A NU SE CONGELA. 3. Nu folosiţi componentele după expirarea termenului de valabilitate.

D. Purificarea sau tratamentul necesar pentru utilizare A se vedea “Colectarea şi prepararea probelor.”

E. Indicaţii cu privire la instabilitate 1. Dacă sărurile au precipitat din soluţie în timpul transportului sau depozitării, dizolvaţi-le din nou complet înainte de utilizare prin agitare în

vortex, la temperatura camerei (18 până la 30 °C). 2. Nu utilizaţi Streptavidină conjugată cu R-Ficoeritrină care a fost congelată în timpul transportului sau depozitării. 3. Kit-urile sunt stabile cel puțin 6 luni după deschidere când sunt păstrate conform recomandărilor.

NECESARUL DE INSTRUMENTE 1. Instrumentul Luminex 100 sau 200 şi platforma XY (Număr produs 888300, 888302) 2. Următorii termociclori au fost validaţi: Sistem cu 96 de godeuri GeneAmp® PCR 9700 calibrat la modul MAX (Nr. cat. bază N8050200, Gold Block Cat Nr.

4314878), Termociclor Veriti™ cu 96 de godeuri calibrat la modul 9700 MAX (Cat. Nr. 4375786). Consultaţi Tabelul 2 pentru vitezele maxime de încărcare. Atenţie: Alţi termociclori şi viteze de încărcare nu au fost validate.

RECOLTAREA ŞI PREPARAREA PROBELOR

a. ADN-ul uman poate fi purificat din sânge integral, straturi leuco-trombocitare şi tampon bucal prin metode validate care întrunesc criteriile de mai jos

b. ADN-ul extras din sângele conservat în EDTA sau ACD (acid-citrat-dextroză) a fost testat, iar performanţa testului a fost cea aşteptată. ADN-ul extras din sângele conservat în heparină nu poate fi utilizat în acest test. Alţi stabilizatori ai sângelui conservat nu au fost testaţi.

c. ADN-ul izolat trebuie să se găsească în 10 mM de TRIS, la pH 8,0-9,0 sau în apă fără nucleaze. Dacă, în concentraţia finală, apare un agent de chelare, cum ar fi EDTA, concentraţia finală a agentului de chelare nu trebuie să depăşească 0,5 mM.

d. Prezenţa alcoolului, detergenţilor sau sărurilor poate influenţa negativ amplificarea ADN-ului e. Concentraţia finală a ADN-ului trebuie să fie cuprinsă între 10 şi 200 ng/µL. f. Determinările de absorbanţă ale probei de ADN la lungimile de undă de 260 şi 280 nm trebuie să dea un coeficient de 1,65 până la 2,0.

ADN-ul poate fi folosit imediat după izolare sau păstrat la –20ºC timp de maxim 1 an. Congelarea şi decongelarea repetată trebuie evitată deoarece poate determină degradarea ADN-ului.

PROCEDURĂ Atenţie: Abaterile de la protocolul recomandat şi de la materialele necesare nu au fost validate.

A. Materiale furnizate (A se vedea tabelele din secţiunea Kit-uri/Reactivi în funcţie de numărul de catalog pentru informaţii specifice)

• Master Mix (MX) adecvat • Amestec/amestecuri de sonde (BM) adecvat(e) • Soluţie pentru diluţie (DS)

• Tabel de valori limită, Tabelul(Tabelele) rezultatelor hibridizărilor • LIFECODES Polimerază Taq* (LIFECODES Cat. Nr. 628075)

B. Materiale necesare, dar care nu sunt furnizate Următoarele materiale au fost folosite la validarea kit-ului:

• Fluid Luminex (1x sau 20x, Lifecodes Cat. Nr. 628005) • Apă fără nucleaze (Lifecodes Cat. Nr. 757003; 20 ml) • Eprubete şi capace PCR – bandelete pentru eprubete Corning®

Thermowell (Costar® Cat. Nr. 6542, LIFECODES Cat. Nr. 888640) sau Axygen 8-Strip Eprubete PCR (Axygen Cat. Nr. PCR0208CPC) sau Applied Biosystems MicroAmp 8-Eprubete Strip şi MicroAmp 8-Cap Strip (ABI Cat. Nr. N8010580 şi N8010535) sau plăci PCR cu 96 de godeuri Corning® Thermowell (Cat. Nr. CLS6551) sau placă PCR cu 96 de godeuri Thermo Scientific™ AB Gene™ SuperPlate (Cat. Nr. AB-2100)

• Placă Costar® (Costar® Cat. Nr. 6509, LIFECODES Cat. Nr. 888630)

• Bandă de polietilenă transparentă Thermowell (Costar® Nr. 6524 (LIFECODES Cat. Nr. 888635 )

• Streptavidină conjugată cu R-Ficoeritrină (SA-PE), 1 mg/ml (LIFECODES Cat. Nr. 628511)

• Kit-uri de calibrare Luminex (Kit de calibrare Luminex 100/200, Kit de verificare a performanţei Luminex 100/200, LIFECODES Cat. Nr. 628018 şi repectiv 628019)





C. Materiale suplimentare ce urmează a fi furnizate de utilizator • Agitator de tip Vortex • Placă de compresie din silicon Axygen Scientific nr. CM-FLAT sau echivalent • Baie ultrasonică • Microcentrifugă • Vârfuri de pipetă cu filtru • Pipete, pipete multicanal şi vârfuri (1-20 µL, 20-200 µL, 1000 µL) • Software pentru analiză cu foi de calcul • Incintă de încălzire • 70% Izopropanol sau înălbitor 20% • Placă suport – Applied Biosystems nr. 403081 (pentru utilizare exclusiv cu termociclorul 9700)

INSTRUCŢIUNI DE UTILIZARE

NOTE: • Amestecurile de sonde şi SA-PE sunt sensibile la lumină: a se feri de lumină şi a nu se congela.

• Încălziţi sferele la 55º până la 60 ºC cel puţin 5-10 minute pentru solubilizarea completă a componentelor din amestecul de sonde. • Curăţaţi cu ultrasunete rapid (~15 sec), apoi agitaţi cu ajutorul vortexului amestecul de sonde aproximativ 15 secunde pentru

suspendarea completă a sferelor. • Acordaţi o atenţie deosebită procesului de alicotare, folosind pipete calibrate. Nerespectarea acestui criteriu poate duce la pierderi de

reactivi şi eşecul testului. • Toate temperaturile trebuie respectate cu precizie. Fluctuaţii chiar şi de +/- 0,5 °C pot afecta rezultatele. • În faza de hibridizare, probele nu trebuie să rămână în starea diluată la 56 °C mai mult de 5 minute (A se vedea secţiunea Rezultate). • Se recomandă testarea probelor amplificate cât mai repede posibil. Dacă probele nu pot fi prelucrate cu ajutorul instrumentului

Luminex 100 sau 200 în aceeaşi zi, produsul amplificat poate fi păstrat până la 3 zile la 2-8 ºC înainte de utilizare. O depozitare mai îndelungată trebuie făcută la –20 ºC timp de până la o săptămână, când sunt pregătite pentru testare. Produsul amplificat poate fi congelat şi decongelat o singură dată. Congelare şi decongelarea repetată va determina degradarea probelor amplificate şi va determina rezultate slabe dacă sunt testate.

A. Purificarea ADN-ului genomic, folosind o metodă la alegere; concentraţia finală trebuie să fie cuprinsă între 10 şi 200 ng/µL.

Ajustaţi, dacă este necesar, cu apă fără nucleaze. Probele trebuie să aibă concentraţii similare.

B. Amplificarea ADN-ului (PCR) 1. Încălziţi Master Mix până la temperatura camerei (18 până la 30 °C). 2. Amestecaţi uşor cu ajutorul vortexului aproximativ 10 secunde. Aceasta va asigura prezenţa sărurilor în soluţie. Centrifugaţi rapid (5

până la 10 secunde) în microcentrifugă pentru a aduce conţinutul în partea inferioară a eprubetei. 3. Folosind Tabelul 1 de mai jos, preparaţi componentele pentru amplificare pentru n+1 reacţii, folosind cantitatea indicată din fiecare

componentă pentru fiecare reacţie (exceptând ADN-ul). Aduceţi la un volum final de 20µL per reacţie cu apă fără nucleaze. Amestecaţi uşor cu vortexul.

4. Pipetaţi cantitatea potrivită de ADN genomic (40 până la 120 ng) în eprubete pentru PCR.

5. Alicotaţi amestecul de amplificare în eprubetele pentru PCR ce conţin ADN-ul genomic. (Volumul total al amestecului de amplificare şi al ADN-ului genomic trebuie să fie egal cu 20 µL pentru fiecare reacţie de probă).

6. Închideţi bine capacul eprubetelor pentru a evita evaporarea în timpul PCR. 7. Puneţi probele în termociclor şi porniţi programul, a se vedea Tabelul 2 şi Tabelul 3.

Tabe lul 1. Componentele reacţiei pentru amplificare

Tabelul 2. Condiţiile termociclorului pentru amplificare

Termociclor Mod (Viteză de încărcare)

Sistem GeneAmp® PCR 9700 Mod MAX

(3,9 °C/sec)

Termociclor Veriti™ cu 96 godeuri

Mod 9700 MAX (3,9 °C/sec)

Componentă Cantitate per reacţie probă PCR

LIFECODES Master Mix 6 µL

ADN genomic 10-200 ng/µL

Total ~80 ng

Polimerază Taq 0,2 µL (1 U)

Apă fără nucleaze Până la volumul final de 20 µL





Tabelul 3. Condiţiile termociclorului pentru amplificare

Etapa Temperatura şi durata de

incubare Nr. de cicluri

1 95 º C timp de 3 min 1

2

95 ºC timp de 15 sec

12 60º C timp de 30 sec


3


28 63 ºC timp de 30 sec


4 72 ºC timp de 2 min 1

5 4 ºC în permanenţă 1

Notă: Pentru a fi siguri de amplificarea probei, citiţi Electroforeza în gel (Anexa A).

C. Hibridizarea • Asiguraţi-vă de solubilizarea componentelor soluţiei tampon de hibridizare ale amestecului de sonde LIFECODES şi de

suspensia completă a sferelor. • Porniţi instrumentul Luminex 100 sau 200 şi Platforma XY pentru a permite încălzirea timp de 30 de minute.

1. Încălziţi amestecul de sonde într-o incintă de încălzire la o temperatură de 55 ºC până la 60 ºC timp de cel puţin 5-10 minute pentru solubilizarea completă a componentelor amestecului de sonde.

2. Curăţaţi cu ultrasunete rapid (~15 sec), apoi amestecaţi folosind vortexul timp de aproximativ 15 secunde pentru suspendarea completă a sferelor.

3. Combinaţi 15 µL din amestecul de sonde adecvat cu 5 µL de produs PCR specific locusului în fiecare godeu al unei plăci cu 96 de godeuri pentru termociclor (Costar® Nr. 6509). Notă: Kit-urile A eRES, B eRES şi DRB1 eRES necesită două godeuri pentru fiecare probă, unul pentru amestecul de sonde eRES, iar celălalt pentru amestecul de sonde standard. Amestecul de sonde eRES şi cel standard nu trebuie testate împreună. Ambele amestecuri de sonde sunt necesare pentru obţinerea rezultatelor eRES pentru aceste kit-uri. Kit-urile C eRES conţin numai un amestec de probe standard. Când alicotaţi amestecul de sonde în

mai mult de 10 godeuri, agitaţi uşor cu ajutorul vortexului amestecul de sonde după fiecare set de zece. Sigilaţi placa cu bandă de polietilenă (Costar® Nr..6524).

4. Puneţi suportul de compresie din silicon deasupra plăcii înainte de hibridizare. 5. Hibridizaţi probele în următoarele condiţii de incubare:

Tabelul 4. Condiţiile termociclorului pentru hibridizare

Asiguraţi-vă că laserul detector de pe Instrumentul Luminex 100 sau 200 este activat cu cel puţin 30 de minute înainte de încheierea hibridizării.

6. În timp ce probele sunt hibridizate, pregătiţi un amestec 200:1 soluţie pentru diluţie/SA-PE. Combinaţi 170 µL soluţie pentru diluţie (DS) şi 0,85 µL 1mg/ml SA-PE per probă. Este recomandat să pregătiţi suficient amestec de soluţie pentru diluţie pentru n+1 probe, pentru a ţine cont şi de pierderile apărute în urma pipetării. (A se vedea Tabelul 5)

7. Păstraţi amestecul de soluţie pentru diluţie/SA-PE la întuneric, la temperatura camerei; SA-PE este sensibil la lumină! Soluţia pentru diluţie poate fi încălzită la 45 ºC timp de 5 minute şi amestecată cu ajutorul vortexului când este adusă pentru a vă asigura că toate componentele sunt în soluţie. Soluţia pentru diluţie trebuie să fie la temperatura camerei (18 până la 30 °C) înainte de prepararea amestecului. Preparaţi înainte de folosire şi aruncaţi orice cantitate rămasă.

Tabelul 5. Volumele de preparare ale soluţiei pentru diluţie

Notă: NU ANULAŢI PROGRAMUL DE HIBRIDIZARE ÎNAINTE DE ÎNDEPĂRTAREA PLĂCII DIN TERMOCICLOR!

8. În faza de menţinere la temperatura de 56 ºC, în timp ce placa este în termociclor, diluaţi fiecare probă cu 170 µL din amestecul de soluţie pentru diluţie/SA-PE. Este foarte important să diluaţi toate probele în 5 minute (după pasul de 8 minute al menţinerii la 56 °C).

9. Îndepărtaţi placa cu probele din termociclor şi plasaţi-o în instrumentul Luminex 100 sau 200.

97 ºC timp de 2 minute 47 ºC timp de 10 minute 56 ºC timp de 8 minute

56 ºC MENŢINERE

Nr. de probe Soluţia pentru diluţie (DS)

SA-PE

1 170 µL 0,85 µL

5 850 µL 4,25 µL

10 1.700 µL 8,5 µL

20 3.400 µL 17 µL

50 8.500 µL 42,5 µL





D. Analizarea probei folosind instrumentul Luminex 100 sau 200* Pentru cele mai bune rezultate, analizaţi probele imediat cu ajutorul instrumentului Luminex 100 sau 200. Probele pot fi citite în cel mult 30 de minute după diluţie. Dacă nu sunt citite imediat, feriţi-le de lumină. 1. Porniţi instrumentul Luminex 100 sau 200 cu 30 de minute până la 4 ore înainte de citirea probelor. 2. Înainte de analizarea probelor cu instrumentul Luminex 100 sau 200, stabiliţi un program de testare a setului conform căruia vor fi

analizate probele. a) Selectaţi Create a New Batch din meniul File.

• De exemplu, dacă analizaţi HLA-DRB1, adăugaţi Batch pentru HLA-DRB1.

• Batch Template este furnizat şi, în acest caz, denumit HLA-DRB1.

• Aveţi în vedere că versiunile model sunt specifice lotului şi corespund numerelor de loturi din kit-uri.

• Urmaţi pas cu pas instrucţiunile afişate pe ecran pentru crearea seturilor.

• Când denumiţi setul, nu includeţi virgule în nume deoarece informaţiile de după virgulă vor fi pierdute la exportarea datelor.

• Pentru mai multe instrucţiuni privind crearea seturilor şi a seturilor multiple, consultaţi Manualul de utilizare pentru Luminex. b) Daţi clic pe pictograma Eject pentru a scoate suportul de plăci. Aşezaţi placa termociclorului cu 96 de godeuri ce conţine probele

în incinta de încălzire XYP aflată pe suportul pentru placă. c) Daţi clic pe pictograma Retract. Probele sunt acum pregătite pentru analiză. O etapă iniţială trebuie efectuată înainte de

începerea analizei. d) După ce probele au fost analizate cu ajutorul instrumentului, se efectuează dezinfecţia cu izopropanol 70% sau înălbitor obişnuit

20%, urmată de două etape de spălare. Instrumentul poate fi oprit în acest moment dacă nu va mai fi folosit în restul zilei. 3. După terminarea unui set, datele sunt exportate ca fişiere de valori separate prin virgulă (csv). Aceste fişiere sunt numite

‘REZULTAT.CSV’ şi salvate într-un director cu numele setului. Datele sunt apoi disponibile pentru tipizare, după cum este descris mai jos.

*A se vedea Manualul de utilizare Luminex pentru funcţionarea instrumentului, inclusiv punerea în funcţiune zilnică, calibrarea, întreţinerea şi procedurile de închidere.

REZULTATE Software-ul MATCH IT!™ DNA este destinat ca instrument în analiza kit-urilor de tipizare LIFECODES SSO Tipizarea probelor poate fi realizată după cum urmează: Fişierele CSV generate pot fi deschise, iar datele procesate cu ajutorul programelor obişnuite de procesare tabelară, cum sunt Microsoft Excel, Lotus 123, Corel Quattro Pro sau alte programe similare. Analiza constă din următorii paşi:

1) Verificaţi dacă este atins numărul minim de evenimente pentru fiecare SSO, la fiecare probă, Această informaţie poate fi găsită în secţiunea DataType: Count a fişierului CSV.

2) Stabiliţi că valorile pentru sondele consens pentru fiecare probă sunt peste minima Mediei Intensităţii de Fluorescenţă (MFI). Pragurile minime sunt specifice fiecărui lot şi pot fi găsite în Tabelul de valori limită.

Atenţie: • Pentru a obţine rezultate corecte, instrumentul Luminex 100 sau 200 trebuie să colecteze suficiente date . • Colectaţi cel puţin 40 de evenimente pentru HLA-DQA1/B1 (Nr. piesă 628930) și HLA-DPA1/B1 (Nr. piesă 628936). Colectați cel puțin

60 de evenimente pentru restul kit-urilor enumerate în Secțiunea ”KIT-URI/REACTIVI ÎN FUNCȚIE DE NUMĂRUL DE CATALOG” sau cel mai mic număr de evenimente specificate în documentele specifice lotului.

3) Scădeţi valoarea Background Control (Control de Fond) pentru fiecare sondă din valorile probelor; astfel obţineţi setul corectat al datelor de fond. Valorile Backgound Control se regăsesc în Tabelul de valori limită şi sunt specifice fiecărui lot. Valorile de fond sunt valorile MFI medii pentru fiecare sferă care compensează zgomotul de fond datorat variaţiei sferelor.

4) Pentru fiecare probă, împărţiţi datele de fond corectate pentru fiecare sondă la valoarea de fond corectată pentru sonda consens corespunzătoare şi veţi obţine setul normalizat de date.

MFI (Sondă) – MFI (Control blank pentru sondă) MFI (Consens) – MFI (Control blank pentru consens)

5) Pentru fiecare sondă, înregistraţi valoarea normalizată în Tabelul de lucru al valorilor limită. 6) După ce au fost alocate toate valorile, modelul rezultatelor sondelor (adică acea combinaţie de alocări pozitive şi negative pentru o

anumită sondă) poate fi comparat cu Tabelul(Tabelele) rezultatelor hibridizării furnizat(e).

Atenţie: • Există un tabel al valorilor limită separat pentru fiecare locus şi pentru fiecare amestec de sonde. • Aceste tabele ale valorilor limită sunt specifice fiecărui Lot; asiguraţi-vă că numărul de Lot din tabelele cu valorile limită

corespunde numărului de Lot din kit-ul pentru tipizare. • Dacă o valoare normalizată pentru o anumită sondă depăşeşte limita maximă pentru o alocare negativă şi se află sub limita minimă

pentru o alocare pozitivă, proba trebuie considerată nedeterminată pentru această sondă. Proba trebuie tipizată, mai întâi presupunând valoarea ca fiind negativă, apoi din nou presupunând că aceasta este pozitivă.

• A se vedea Secţiunea REZULTATE PREVĂZUTE pentru mai multe informaţii despre valorile limită.





CONTROLUL CALITĂŢII Se recomandă realizarea unui control negativ şi a unuia pozitiv la fiecare testare, de exemplu folosind o probă de control a apei şi respectiv o probă tipizată anterior. Sondele SSO consens, regăsite în Tabelul pentru valorile limită, hibridizează în locusul respectiv alele specifice. Valorile obţinute cu ajutorul SSO consens de la controlul pozitiv trebuie să depăşească valoarea limită pentru SSO stabilită în Fişa de lucru cu Tabelul valorilor limită. Valorile obţinute cu ajutorul SSO consens din probele de control ale apei trebuie să fie sub valoarea limită pentru SSO stabilită în Fişa de lucru cu Tabelul valorilor limită. Amestecul(rile) de sonde LIFECODES conţin(e) una sau mai multe sonde SSO consens, identificate în fişele de lucru ale kit-ului pentru tipizare. Aceste sonde consens hibridizează toate alelele şi acţionează ca un control intern pentru a verifica amplificarea şi pentru a confirma realizarea hibridizării. Dacă nu se obţine valoarea minimă pentru aceste SSO, proba ar putea să nu ofere o tipizare corectă, iar testul pentru probă va trebui repetat. Testul trebuie să se desfăşoare conform recomandărilor din prospect şi trebuie realizat împreună cu celelalte proceduri de control al calităţii conform normativelor locale, de stat, federale şi/sau conform cerinţelor agenţiilor de acreditare.

LIMITĂRILE PROCEDURII Condiţiile pentru PCR şi condiţiile de analiză descrise necesită respectarea unor condiţii controlate cu precizie. Abaterile de la aceşti parametri pot duce la eşecul produsului. Toate instrumentele trebuie calibrate conform recomandărilor producătorului şi acţionate conform parametrilor stabiliţi de producător.

1) Sferele trebuie preîncălzite şi suspendate complet înainte de utilizare. Aceasta asigură prezenţa în soluţie a tuturor componentelor soluţiei

tampon de hibridizare. 2) Incubările la 47 ºC şi 56 ºC necesită un grad ridicat de acurateţe (+/- 0,5 ºC). Trebuie utilizat un termociclor. Temperatura trebuie verificată în

godeurile plăcii cu 96 de godeuri a termociclorului, folosind un termocuplu (ex., Bio-Rad, Model VPT-0300 sau echivalent). Temperatura de la nivelul godeurilor şi dintre godeuri nu trebuie să varieze cu mai mult de +/- 0,5 ºC.

3) Durata de timp la 56 ºC este extrem de importantă şi nu trebuie să depăşească 13 minute. Aceasta include incubarea de 8 minute şi nu mai mult de 5 minute pentru diluarea tuturor probelor cu amestecul soluţie pentru diluţie/SA-PE.

4) După diluare, probele sunt stabile la temperatura camerei (18 până la 30 °C) până la 2 ore (ferite de lumină). Deoarece o placă completă cu 96 de godeuri poate necesita până la 1,5 ore în instrumentul Luminex 100 sau 200, analiza trebuie începută în maxim 30 de minute după diluţie pentru a se asigura analiza ultimei probă în limita celor 2 ore.

5) Nu amestecaţi componentele din loturi sau kit-uri diferite. Datorită naturii complexe a tipizării HLA, interpretarea datelor şi alocarea tipizării trebuie examinate de către personal calificat.

PROBLEME TEHNICE

PROBLEMĂ CAUZĂ POSIBILĂ SOLUŢIE

Număr redus de sfere

Amestecul de sonde nu a fost bine suspendat

Preîncălziţi, curăţaţi cu ultrasunete şi agitaţi amestecul de sonde în vortex, apoi repetaţi testul.

Instrumentul nu funcţionează corect

Necalibrat

Calibraţi instrumentul. (A se vedea Manualul de utilizare Luminex IS.)

Calea de trecere a probelor blocată

Scoateţi şi curăţaţi cu ultrasunete acul. Spălaţi în contracurent. Sunaţi la Immucor GTI Diagnostics, Inc. dacă problema continuă. +1 (855) 466-8267

Eroare a limitei CON

Proba nu a fost amplificată sau a fost amplificată insuficient *

ADN redus Verificaţi concentraţia şi puritatea ADN-ului.

Sărurile din Master Mix nu sunt în soluţie

Încălziţi Master Mix la 37 ºC timp de 5 minute, amestecaţi în vortex uşor şi centrifugaţi rapid.

Polimerază Taq slabă Utilizaţi LIFECODES Polimerază Taq validată, nr. catalog 628075.

Condiţiile de amplificare nu se încadrează în parametrii specifici

Rulaţi profilul termic pe termociclor pentru a verifica dacă parametrii se încadrează în limitele specificate.

Valoare mică a Mediei Intensităţii de Fluorescenţă (MFI) Încălziţi soluţia pentru diluţie la 45 ºC timp de 5 minute înainte de folosire şi amestecaţi în vortex. Păstraţi la temperatura camerei.

Înlocuiţi Streptavidina conjugată cu R-Ficoeritrină .

Eşecuri multiple ale SSO sau nu se reuşeşte obţinerea rezultatului tipizării HLA a probei

Amplificare specifică alelelor

Condiţiile de amplificare nu se încadrează în parametri specifici

Rulaţi profilul termic pe termociclor pentru a verificarea dacă parametrii se încadrează în limitele specificate.

Probă de ADN contaminată Repetaţi izolarea ADN-ului din proba de sânge.

ADN parţial degradat

Evaporare în timpul desfăşurării hibridizării Dacă nu se foloseşte o placă completă, lăsaţi un rând liber pe fiecare parte a probelor ce urmează a fi analizate pentru a permite sigilarea etanşă a plăcii.

* Amplificarea PCR poate fi verificată cu ajutorul electroforezei pe gel (a se vedea Anexa A).





VALORI PREVĂZUTE În mod normal, valorile pot fi separate ca pozitive şi negative. În unele cazuri rare, valorile pot fi nedeterminate. O „valoare nedeterminată” reprezintă un domeniu în care nu au fost observate nici valori pozitive, nici negative. Dacă, în cazul unei probe, sunt stabilite valori nedeterminate pentru o anumită sondă SSO, proba trebuie tipizată cu sonda considerată negativă, iar apoi din nou cu ea pozitivă. Pot apărea trei situaţii:

1. Una dintre opţiuni (adică Pozitiv sau Negativ) furnizează o corespondenţă. 2. Ambele opţiuni furnizează corespondenţe.

• Proba poate fi reanalizată sau alelele obţinute din ambele tipizări pot fi raportate. 3. Niciuna dintre opţiuni nu furnizează o corespondenţă.

• În acest caz, probabil că sunt şi alte sonde alocate greşit. Această probă trebuie reanalizată şi dacă este posibil reamplificată.

• Dacă mai mult de două sonde sunt nedeterminate, proba trebuie reanalizată.

• În cazul în care combinaţia de alocări negative şi pozitive ale unei sonde nu furnizează un tip de HLA, proba trebuie reamplificată şi reanalizată. Este posibil să fie necesară şi repetarea izolării ADN-ului din probă, iar apoi repetarea amplificării şi testării.

• După cum am notat în secţiunea Limitările procedurii, este foarte importantă urmarea exactă a protocolului. Orice abatere poate duce la eşecul procesului de tipizare a probei.

CARACTERISTICI SPECIFICE DE PERFORMANŢĂ Când kit-urile pentru tipizare LIFECODES HLA SSO sunt utilizate respectând procedura descrisă în prospectul produsului, pot fi determinate HLA de Clasa I şi Clasa II din probele de ADN. ▲ Kitul HLA A (număr de catalog 628911) prezintă o concordanță de 98,46% pentru Alelele HLA A (95,24% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA la 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate. Kitul HLA A eRes (număr de catalog 628913) prezintă o concordanță de 98,46% pentru Alelele HLA A (95,24% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA la 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate. Kitul HLA B (număr de catalog 628915) prezintă o concordanță de 99,23% pentru Alelele HLA B (96,40% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA la 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate. Kitul HLA B eRes (număr de catalog 628917) prezintă o concordanță de 100% pentru Alelele HLA B (97,72% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA la 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate. Kitul HLA C eRes (număr de catalog 628921) prezintă o concordanță de 99,23% pentru Alelele HLA C (96,40% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA la 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate. Kitul HLA DRB1 (număr de catalog 628923) prezintă o concordanță de 98,46% pentru Alelele HLA DRB1 (95,24% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA la 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate. Kitul HLA DRB1 eRes (număr de catalog 628925) prezintă o concordanță de 100% pentru Alelele HLA DRB1 (97,72% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA cu 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate. Kitul HLA DRB 3, 4, 5 (număr de catalog 628927) prezintă o concordanță de 100% pentru Alelele HLA DRB 3, 4, 5 (97,72% limita inferioară, cu utilizarea metodei exacte unilaterale la un interval de încredere de 95%) la compararea rezultatelor tipizării HLA la 2 câmpuri pentru 130 de probe bine caracterizate.” Kit-ul HLA-DQA1/B1 (nr. de catalog 628930) prezintă o concordanță de 99,2% pentru alele DQA (96.2% limita inferioară folosind o metodă exactă unilaterală la un interval de încredere de 95%) și o concordanță de 98,4% pentru alele DQB (95,2% limita inferioară folosind o metodă exactă unilaterală la un interval de încredere de 95%) când se compară rezultatele de tipizare HLA la 2 câmpuri în probele bine caracterizate 123 și respectiv 130. Kit-ul HLA-DPA1/B1 kit (nr. de catalog 628936) prezintă o concordanță de 100% pentru alele DPA (97,7% limita inferioară folosind o metodă exactă unilaterală la un interval de încredere de 95%) și o concordanță de 98,5% pentru alele DPB (95.4% limita inferioară folosind o metodă exactă unilaterală la un interval de încredere de 95%) când se compară rezulatele de tipizare HLA la 2 câmpuri în probele bine caracterizate 133 și respectiv 135. În analizele de laborator, următoarele substanțe au demonstrat o oarecare inhibiție când au fost evaluate cu kit-urile de tipizare LIFECODES HLA-DQA1/B1 și LIFECODES HLA-DPA1/B1 SSO. Cea mai mare concentrație a substanțelor interferente fără inhibiție este cea de Dodecil Sulfat de Sodiu (0,005% (w/v)), Etanol (500 mM), Fenol (0,125% (v/v)), Sucroză (0,1M), EDTA (500 µM), ACD, (0,1% (v/v)), Colesterol (3µg/mL), Bilirubină (16,4 µM), Hemoglobină (0,0156 mg/mL) și sânge hemolizat (0,1% (v/v)).

REFERINŢE1. Olerup, O., et al. (1992) Tissue Antigens 39:225 2. Saiki, RK., et al. (1986) Nature 324: 163

3. Maeda, M., et al. (1989) Tissue Antigens 34: 290 4. Bugawan, TL., et al. (1990) Immunogenetics 32: 231

LICENŢE LIMITATE PolimerazaTaq este produsă de Promega Corp pentru Immucor GTI Diagnostics. Promega deţine licenţa pentru aceasta sub brevetele S.U.A. nr. 5,338,671 și 5,587,287 şi brevetele străine corespunzătoare. Achiziţionarea acestui produs include o licenţă limitată, netransferabilă conform brevetului U.S. 5,981,180 sau echivalentelor sale străine, deţinut de Luminex Corporation, pentru realizarea unui analize multiple a probelor clinice pentru tipizarea HLA.

REPREZENTANT AUTORIZAT

Reprezentant autorizat: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Strasse 32, 63303 Dreieich, Germania

Serviciul Tehnic din Europa: Telefon: +32/3 385 4791

Ultima revizuire şi emitere a acestui document: 2019-07-24





MĂRCI COMERCIALE UTILIZATE AB Gene® AB Gene House Costar® Corning Incorporated Microseal™ Bio-Rad Laboratories, Inc. IDNA® Agarose Lonza Group, Ltd. GelStar® Lonza Group, Ltd.

Luminex® Luminex Corporation Gene Amp® Roche Molecular System Veriti™ Applied Biosystem LIFECODES® Immucor Inc.





ANEXA A Electroforeza în gel Reacţiile PCR realizate în kit-urile de tipizare LIFECODES HLA-SSO sunt destinate atât producerii produselor monocatenare, cât şi a celor dublu catenare, produsele predominante care hibridizează la SSO. Pentru asigurarea calităţii sau pentru rezolvarea problemelor apărute la un experiment, ar putea fi necesară realizarea electroforezei în gel în vederea examinării reacţiei PCR pentru prezenţa ADN-ului amplificat.

Materiale necesare (conform listei de mai jos sau echivalente)

• Agaroză pentru electroforeză ( Lonza Group, Ltd. IDNA® Agaroză Nr. 50170)

• Aparat de electroforeză/sursă de alimentare

• 1X tampon gel (40xTAE, Promega Nr. V4281)

• GelStar® Nucleic Acid Stain - pentru colorarea acizilor nucleici (Lonza Group, Ltd. Nr. 50535)

• Transiluminator UV (ChromatoVUE, UVP Inc. Model TM36)

• Sistem imagistic fotografic

Migrarea relativă a produsului monocatenar este dependentă de concentraţia gelului şi de sistemul tampon utilizat. Migraţiile aproximative pentru fiecare amplificare sunt indicate mai jos pentru probe testate într-un gel de agaroză 2% în 1X tampon TAE.

Condiţii pentru electroforeză Notă: Nu se aplică pentru HLA-DQA1/B1 (Nr. piesă 628930), HLA-DRB 3,4,5 (Nr. piesă 628927) și HLA-DPA1/B1 (Nr. piesă 628936) deoarece

benzile individuale nu se pot distinge în combinația multiplex.

1. Scoateţi GelStar® Nucleic Acid Stain (Lonza Group, Ltd. No 50535) de la congelator pentru dezgheţare. Ţineţi la întuneric. 2. Gelul utilizat pentru această procedură trebuie să aibă o concentraţie de 2%, adică pentru 200 ml suport de gel, utilizaţi 4 grame de agaroză la 200 ml 1X

TAE (Diluaţi din 40X TAE). Adăugaţi 10 µL GelStar® Nucleic Acid Stain în agaroza topită. Când turnaţi gelul, asiguraţi-vă că lăsaţi suficient spaţiu pentru ca ADN-ul să migreze pe o distanţă semnificativă (între 1 şi 2 inci). FIŢI PRECAUŢI: GelStar® are potenţial carcinogen.

NOTĂ: Este posibil să folosiţi geluri cu 20 µL din 10 mg/ml bromură de etidiu în locul GelStar® Nucleic Acid Stain. Intensitatea benzilor va fi mai redusă în gelurile care conţin bromură de etidiu comparativ cu cele care conţin GelStar®. FIŢI PRECAUŢI: Bromura de etidiu este un agent carcinogen recunoscut. 3. Ţineţi gelul la întuneric şi permiteţi solidificarea acestuia. 4. Încărcaţi un amestec de 2,5 µL al fiecărui produs PCR şi 2,5 µL 2X soluţie tampon de încărcare cu colorant vizibil pentru fiecare probă, pentru fiecare

amplificare. Lăsaţi gelul la întuneric pentru migrare, la aproximativ 160 volţi, timp de 45 de minute sau până când probele au migrat suficient încât să observaţi benzi separate pentru produsele monocatenare şi dublu catenare (banda albastră de bromfenol sau alţi indicatori vizibili migrează 1 până la 2 inci din godeuri).

5. Fotografiaţi folosind transiluminatorul UV împreună cu un filtru fotografic galben GelStar® (Lonza Group, Ltd. Nr. 50536). ATENŢIE: Purtaţi echipament de protecţie când manipulaţi GelStar® Nucleic Acid Stain sau bromura de etidiu şi când fotografiaţi gelul folosind transiluminatorul UV. 6. Analiza gelului

HLA-A HLA-B HLA-C

HLA-DRB1

Dublu catenar (bp) ~420 ~370, ~340 ~476, ~447 ~280

Monocatenar (bp) ~240 ~200 ~250, ~200 ~180

Interpretarea gelului Amplificare Lipsa amplificării Godeu

ADN dublu catenar ----(luminos)

ADN monocatenar --------(mai puţin luminos) Banda primerului


