Upload
others
View
15
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Kök Hücre Kaynakları, Seçimi,
Toplama, Saklama ve İşleme
DoDoçç. . Dr. Dr. Fevzi Fevzi AltuntaAltuntaşşAnkara Onkoloji EAnkara Onkoloji Eğğitim ve Araitim ve Araşşttıırma Hastanesirma Hastanesi
KKöök Hk Hüücre Nakli ve Aferez cre Nakli ve Aferez ÜÜnitesinitesi
THD, Hematoloji Okulu, Kök Hücre Nakli Kursu, 27 Haziran 2009, Mardin
Kendini yenileyebilen (Self-Renewal)
Farklı
hücrelere yönlenebilen
(Differentiation)
Yamalanma yapabilen (Engrafment)
Klonal
hücreler
Kök Hücre Nedir?1
KKöök hk hüücreler ycreler yüüzeyinde belli zeyinde belli proteinler eksprese ederlerproteinler eksprese ederler::
CD34CD34
CD34+ CD34+ hhüücrelercreler
akakıım m sitometrisitometri
kullankullanıılarak larak
ööllçüçülebilirlebilir
En kEn kıısa zaman dilimi isa zaman dilimi iççinde kinde köök k hhüücreyi tespit etmek icreyi tespit etmek iççin in indirektindirekt
bir teknik,bir teknik,
BirkaBirkaçç
saat alsaat alıırr
CD34 eksprese eden tüm hücreler kök hücre değildir.
Kök hücre nasıl tespit edilir?2
Kök Hücre kaynakları nelerdir?
Kaynak
Kemik İliği
Periferik
Kan
Kord
Kanı
Verici
AllojeneikAkrabaAkraba dışı
Otolog
Singeneik
3
Uygulama kolaylıkları
Genel anestezi gerektirmemesi
Hastaneye yatırılmadan, ayaktan yapılabilmesi
Daha az travmatik
olması
Daha ağrısız olması
Aferez
öncesi transfüzyon gereksiniminin daha az olması
Nakil sonrası
engraftmanın
daha hızlı
gerçekleşmesi
Trombosit
süspansiyonu gereksiniminin daha az olması
Hastanede kalış
süresinin daha kısa olması
Morbidite
ve mortalite
oranının daha düşük olması
Periferik
Kök Hücre: AVANTAJLAR
Altuntas
F, et al. Peripheral
Blood
Progenitor
Cell
Collection. Transfus
Apher
Sci. 2007;36(2):159-167
Vasküler
giriş
yolu gerektirmesi
Mobilizasyon
protokolüne gereksinim duyulması
Toplama işleminin birkaç
gün (seans) sürebilmesi
Sitokinlere
veya aferez
işlemine bağlı
görülebilecek komplikasyonlar
Dondurulmuş
ürünün infüzyonu
sırasında görülebilecek yan etkiler
PKH içeriğinin Kİ’ne
göre yaklaşık 10 kat daha fazla T-lenfosit
içermesi GVHH riskini arttırabilir
Akut GVHH gelişimine etkisi yok
Kronik GVHH insidansını
arttırabilir
Periferik
Kök Hücre: DEZAVANTAJLAR
Altuntas
F. et al.
Transfusion
Med
& Hemother
2008
KordKord
kankanıı
kköök hk hüücrecre
Kord
kanı
kök hücreden zengin bir kaynak
Miktar az (75-200 cc): toplam kök hücre sayısı/kg başına sınırlı
50 kg kadar bireyler (çocuk) için yeterli
Kök hücreler PK veya Kİ’ne
göre daha az
Graft
yetmezliği ve engraftman
gecikmesi
Proliferasyon
hızı
yüksek
Düşük miktarda kök hücre tolere
edilebilir
2 x106
CD34+
hücre/kg
2 x107
NC/kg
Graft
rejeksiyon
ve GVHH gelişme riski daha düşüktür
Kısmi HLA match
(4/6) durumu tolere
edilebilir
Verici bulmayı
ve verici havuzu oluşturmayı
kolaylaştırmakta
Kordon Kanı Kİ/PK
Donör
için risk Yok Var
Arama süresi (ay) ≤1 3-6
Graft
yerleşimini sınırlayan faktör Hücre sayısı HLA uygunluğu
Sonucu etkileyen ana faktör Graft
yerleşmemesiGecikmiş
immün
düzelme GvHH
Uygunluk en az 4/6 9/10
GvHH
riski Az Yüksek
DLİ YOK Olası
KHT sonrası
infeksiyon Daha yüksek Yüksek
İmmünoterapi
olasılığı Yok Var
Kök Hücre Kaynakları
Kemik İliği Kaynaklı
Kök Hücre Toplama
(KI >MNH %1-4)
Alıcının kilogramı
başına ~10-20 ml ilik materyali alınır.
Kemik İliği Kaynaklı
Kök Hücre Toplama
Amaç:
2-3 x 108
çekirdekli
hücre/kg
>2 x 106
CD34+ hücre/kg
Kemik İliği harvest
10
ml x 100-200 aspirasyon
Mobilizasyon
Nedir? ve Rasyoneli Nedir?
Periferal
kan kök hücre içeriği kemik iliği kavitesindekinden
daha azdır:
Kİ
= hücrelerin %3-5’i
CD34 eksprese eder
PK
= hücrelerin %0.03-% 0.05
CD34 eksprese eder
Tanım:
Mobilizasyon
periferal
kandaki kök hücre içeriğini artırmak için kullanılan metot
İyi bir mobilizasyon
metodu:
Hematopoetik
yeniden yapılanmanın desteklenmesi ve
Transplant
sonrası
iyileşmenin hızlı
olması
için
Az sayıda aferez
işlemi ile
Yeterli kök hücre toplanmasına imkân sağlamalıdır
5
Kök Hücre Mobilizasyon
metotları
nelerdir?
Mobilizasyon
protokolleri:
Kemoterapi:
Periferik
kanda kök
hücre konsantrasyonunu 20-25
kat arttırır
SikSikloloffososffamiamitt
EtoposiEtopositt
SikSikloloffososffamiamit t + + EtoposiEtopositt
Sitokin
(G-CSF)
Filgrastim
Lenograstim
Kombinasyon (Kemoterapi
+ sitokin):
Periferik
kanda kök
hücre konsantrasyonunu
100-160
kat arttırır
Lemoli
RM,
et al. Haematologica. 2008 Mar;93(3):321-4, Narayanasami
U et al. Blood
2001; 98: 2059-2064
6
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Normal KT Sitokin KT + Sitokin
GG--CSF: CSF: mobilizasyondamobilizasyonda
rolrolüü
nedir?nedir?
ProteazlarProteazlar kköök hk hüücre cre mobilizasyonundamobilizasyonunda
rol oynamaktarol oynamakta
G-CSF kemik iliğinde osteoblastosteoblast aktivitesini aktivitesini supresesuprese
eder ve eder ve
SekonderSekonder
olarak da olarak da mRNAmRNA
ddüüzeyinde zeyinde
SDFSDF--11↓↓
de dde düüşşüüşşe yol ae yol aççar ve ar ve
Kritik basamak olan Kritik basamak olan SDFSDF--1/CXCR41/CXCR4 sinyalizasyonu kesersinyalizasyonu keser
BBööylece HKH ylece HKH mobilizasyonunumobilizasyonunu sasağğlarlar……
Pruijt, Fibbe
et al. 1999; Heissig, Hattori et al. 2002
G-CSF ve KT+G-CSF takiben periferal CD 34+ kök hücre değişimi
05
1015202530354045
1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Günler
CD
34
+ H
ücre
Narayanasami U, et al. Randomized trial of filgrastim versus chemotherapy and filgrastim mobilization of HSC. Blood 2001; 98: 2059-2064
Kök hücre aferezine
ne zaman başlanır?
Mobilizasyon
ürün belirleyicisi: aferez
öncesi PK CD34 sayısı
İlk mobilizasyonda 1. aferez günü toplanan CD34 ürünü ile periferal CD34 sayısı korelasyon göstermektedir
y = 72,633x + 531225R2 = 0,5961
0,00E+00
2,00E+06
4,00E+06
6,00E+06
8,00E+06
1,00E+07
1,20E+07
0,00E+00 2,00E+04 4,00E+04 6,00E+04 8,00E+04 1,00E+05 1,20E+05
Periferal kanda dolaşan CD34 sayısı (hücre/ml kan)
CD
34 +
ürü
n (h
ücre
/ kg
)
Periferik
kan CD 34 sayısı
önemli midir?7
Altuntas
F et al. Transfus
Apher
Sci
2007;36(2):159-167.
Allojeneik
Transplant: Alıcı
Yaşı
Eğilimi 1987-2004
0
20
40
60
80
100
1987-1992 1993-1998 1999-2004
Tra
nsp
lant,
%
20 yrs21-40 yrs41-50 yrs51-60 yrs60 yrs
NATIONAL MARROW DONOR PROGRAM®
©2005
Aferez-
YAŞ
sınırı
var mı? Yaş
önemli mi?
Yaş:
Sağlıklı
vericilerde yaş
sınırı= 4-79
Akraba nakillerinde yaş
sınırı
yok
Akraba dışı
nakillerde yaş
sınırı
belirlenmemiş
Yaş
artıkça PK mobilizasyon
başarısızlığı
artabilir
Yaş
arttıkça GVHH riski artmakta
McCarty
J. IBMTR 2007 Meeting
Education
Book
Kavukcu
S, Altuntas
F. et al Transfusion
Med
& Hemother
2008
İnfeksiyon:
Vericiler:
İlk 30 gün içerisinde bulaşıcı
hastalık yönünden taraması yapılmış
ve normal olmalıdır.
Hastalar=
FEN ve infeksiyonu kontrol altında olan hastada aferez sürdürülürken infeksiyon bulaşına
yönelik önlemler alınmalıdır;
Aferez
ürünün dondurulması
sırasında otolog
plazma kullanılmamalı
Aferez
ürünü
eritilip geri infüze
edilirken yıkanmalı
Pnömonili
hastalarda aferez
ertelenmelidir
Viral
infeksiyon durumunda hastaya göre karar vermek gerekir
Kültür örnekleri alınmalıdır
Smith
AM, J Hemathother
1994;3:331-348
Aferez-
Febril
nötropeni
var. Tamam mı? Devam mı? Ne yapayım?
Aferez-
Trombositopeni
var. Ne yapayım?
TAM KAN SAYIMI:
Vericiler:
PLT
(x109/L)
Hb
(g/dL)
İşlem
Öncesi
>150
>12.5
1. Aferez Sonrası
>120
>10
2. Aferez Sonrası
>70
>10
Hastalar:
Trombosit: >20 x109/L
olmalıdır
• Aferez
ile kan hacminin 2 katı
işlenmesi sonrası
PLT sayısı
%5-30 azalır
• G-CSF kullanımı
da PLT sayısında azalmaya yol açar (dilusyonel)
Altuntas
F. et al Transfusion
Med
& Hemother
2008
Allogeneik
Transplant:
20yaş, CIBMTR
1989-2004
-
Verici
Tipi
ve
Kök Hücre Kaynağı
Eğilimi-
0
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
4.500
1989-90 1991-92 1993-94 1995-96 1997-98 1999-00 2001-02 2003-04
Tra
nsp
lant
AkrabaAkraba dışı
– Kİ
veya
PKAkraba dışı
– Kord kanı
NATIONAL MARROW DONOR PROGRAM®
©2005
Kordon kanKordon kanıı
nasnasııl toplanl toplanıır?r?
KK toplama aKK toplama ağğrrııssıız, kolay ve riski minimal bir z, kolay ve riski minimal bir
iişşlemdir. lemdir.
Bebek doBebek doğğduktan ve kordon duktan ve kordon klemplendiktenklemplendikten
sonra plasenta ve sonra plasenta ve umblikalumblikal
korddakordda
kalan 40kalan 40--100 100
ml kan, ml kan, umblikalumblikal
kordun antiseptik solkordun antiseptik solüüsyonla syonla
temizlenmesini takiben enjekttemizlenmesini takiben enjektöör yardr yardıımmııyla kan yla kan
torbastorbasıına toplanna toplanıır. r.
Toplama iToplama işşlemi 2lemi 2--4 dakika s4 dakika süürmektedir. rmektedir.
9
Kordon Kanının İşlenmesi
Toplanan üründen kültür alınır
İnfeksiyöz
tarama: Sifilis, HIV, HBV, HCV
ve CMV taraması
yapılır
Hacim: Toplanan kord
kanın hacmi kayıt edilir (ortalama 120 cc)
Hücre sayısı: MNH (>2x107
/kg) ve CD34+ hücre (>2x106
/kg) sayılır
HLA tiplemesi yapılır
Class
I serolojik, Class
II ise DNA (PCR-SSO veya PCR-SSP)
Kordon Kanı
Nerde, Ne kadar Süre Saklanabilir?
Bilgisayarlı
kademeli dondurucuda dondurulup -196°C de sıvı azot tankına aktarılır
Kordon kanındaki hücre canlılığı
10 yıllık sürede yeterli düzeyde korunabilmekte
En uzun 10 yıllık kord
kanı
başarılı
bir şekilde nakilde kullanılmış
10
CD34+ hCD34+ hüücre miktarcre miktarıı
öönemli midir?nemli midir?
KKöök hk hüücre dozu cre dozu KHTKHT’’nnıınn
babaşşararııssıınnıı
etkileretkiler
TRM, TRM, RelapsRelaps
riski, postriski, post--KHT MDS/AML ve LOSKHT MDS/AML ve LOS
Yeterli hYeterli hüücre miktarcre miktarıı::
SitopenilerSitopeniler
ile iliile ilişşkili maliyet ve yan etkileri skili maliyet ve yan etkileri sıınnıırlamak irlamak iççin in ççok ok hhıızlzlıı
(8(8--14 g14 güün) n) nnöötrofiltrofil
(>500)(>500)
ve ve trombosittrombosit
engraftmanengraftmanıı
(>20,000(>20,000))
sasağğlayan dozdur:layan dozdur:
AzalmAzalmışış
transftransfüüzyon gereksinimizyon gereksinimi
Daha az Daha az sepsissepsis
ataatağığı
Daha az antibiyotik kullanDaha az antibiyotik kullanıımmıı
Hastanede kalHastanede kalışış
ssüüresinde kresinde kıısalmasalma
McCarty
J. IBMTR 2007 Meeting
Education
Book
11
CD34 DoCD34 Dozuzu
Ne olmalNe olmalıı??
Otolog
KHT
> 2 x106
CD34+
hücre/kg
Allojeneik
KHT
> 5 X106
CD34+
hücre/kg
Kord
Kanı
KHT
> 2 x106
CD34+
hücre/kg
HematopoetikHematopoetik
yapyapıılanmalanma
MobilizasyonMobilizasyon
babaşşararııssıızlzlığıığı? nedenleri nelerdir?? nedenleri nelerdir?
<<2 x106
CD34+
hücre/kg
= %10= %10--2020
YaYaşş: Ya: Yaşşllıı
hastalarhastalar
PrimerPrimer
hastalhastalıık: k: LenfomaLenfoma
hastalarhastalarıı
(%35)(%35)
ÖÖnceki nceki KemoTerapilerKemoTerapiler: :
SaySayııssıı: Artt: Arttııkkçça risk artmaktaa risk artmakta
AlkilleyiciAlkilleyici
ajanlarajanlar
MobilizasyondanMobilizasyondan
2 ay 2 ay öönce nce fludarabinfludarabin
tedavisitedavisi
Kemik iliKemik iliğği alanlari alanlarıına RT almasna RT almasıı
TrombositopeniTrombositopeni
(d(düüşşüük k üürrüün belirteci)n belirteci)
MobilizasyonMobilizasyon
ööncesi PK CD34+ hncesi PK CD34+ hüücre saycre sayııssıı
ddüüşşüüklklüüğğüü
KemoKemo--mobilizasyonmobilizasyon
sonrassonrasıı
nnöötrofiltrofil
recoveryrecovery’’dede
gegeççikmeikme
McCarty
J. IBMTR 2007 Meeting
Education
Book
12
MobilizasyonMobilizasyon
babaşşararııssıızlzlığıığı
var: NE yapabilirim? var: NE yapabilirim?
MobilizasyonuMobilizasyonu
tekrarlatekrarla
YYüüksek volksek volüüm m aferezaferez
Maliyet artMaliyet artışış
ve ve MorbiditeMorbidite
artartışış
Alternatif ve/veya YAlternatif ve/veya Yüüksek doz ksek doz sitokinsitokin
YYüüksek doz Gksek doz G--CSFCSF
SCF, GMSCF, GM--CSF, ILCSF, IL--33
KemoKemo--mobilizasyonmobilizasyon
ToksisiteToksisite, FEN, maliyet art, FEN, maliyet artışıışı
AMD3100= AMD3100= PlerixifarPlerixifar
((MobozilMobozil); ); SDFSDF--1 alfa inhibit1 alfa inhibitöörrüü
BBüüyyüüme hormonu (GH)me hormonu (GH)
Kemik iliKemik iliğği i harvestharvest
Maliyet artMaliyet artışıışı
EngraftmanEngraftman
yavayavaşş
McCarty
J. IBMTR 2007 Meeting
Education
Book
Kök hücre dondurmadan ne kadar süre saklayabilirim?
Isı
-79C’nin
altına inmedikçe metabolik
saatin durdurulması imkansız
0-20C ‘de Na-K pompası
bozulmakta ve hücreler şişmeye başlamakta
Enzim aktiveleri bozulmakta
pH
değişiklikleri oluşmakta
Sonuçta hücre viabilitesi
bozulmakta
Donma ısısının üzerinde vericiden alıcıya kök hücre
transferi 72-96 saat içinde gerçekleştirilmelidir
Stockschlaeder
M, et al. Long
term
follow
up
of leukemic
patients
after
related
cryopreserved
bone marrow
transplantation. Br
J Haematol
1997; 96: 382–386
13
Kriyoprotektif
ajanlar
iki
tiptir
1-
İntrasellüler
ajanlar Gliserol Dimetilsulfoksid
(DMSO)
2-
Ekstrasellüler
ajan HES (Hidroksietil
starch)
KRKRİİYOPRYOPROTEKTAN AJANLAR OTEKTAN AJANLAR NELERDNELERDİİR?R?
Gorlin
J. Stem
cell
cryopreservation. J Infusional
Chemother
1996; 6: 23-27
14
Amaç:
Kök hücreleri maksimum canlılık oranı
ve fonksiyonel kapasite ile
tekrar resüsite
edebilecek şekilde dondurarak saklamaktır.
DMSO= Tek başına kullanıldığında en ideal kriyoprotektan
ajan
%5-10 DMSO etkin koruma sağlayabildiği gösterilmiştir
Suda yüksek derecede çözünürlük gösterebildiği ve hücre
membranlarını
geçebildiği için, hem hücre içi hem de hücre dışında
osmolaliteyi
yükselterek membran
boyunca yerleşen tuz gradientini dengeye getirir.
Kök hücre dondurma
Gorlin
J. Stem
cell
cryopreservation. J Infusional
Chemother
1996; 6: 23-27
Programlı
dondurma
•
Ürün ısısı
-20C’ye
ulaşana kadar 15-20 C/dk’da
hızlı
bir soğutma işlemine tabi
tutulur.•
Geçiş
fazı
sonrası
ideal soğutma hızı
1-
3C/dk’dır. •
-80C’ye
ulaşıldıktan sonra ürün daha
düşük ısılara, örneğin sıvı
azot veya azot buharı
içine direkt olarak kaldırılabilir
Kök
hücreleri
için
en uygun
ısı
nedir?
-80 °C ile
-
196
°C arasıdır.
Hangi koşullarda ne kadar süre saklanabilir?
-80 °C’nin
üzerinde
(deep
freeze) = 5 yıl
-150 °C’nin
üzerinde
(azot buhar fazı) = 10-15 yıl
-196 196 °°C C ‘‘de de (s(sııvvıı
nitrojen) = nitrojen) = sonsuzasonsuza
dekdek
saklasaklananabilbilirir
Kök
hücreleri
saklamak için
en uygun
ısı
nedir?
Hangi koşullarda ne kadar süre saklanabilir
Valeri
CR, Pivacek
LE: Transfusion
36:303-308:1996 ve Galme
A et al; Transfusion
36:794-797:1996.
15
Kök Hücre Transferini Nasıl Yapabilirim?
Dondurulmuş
hücreler nakil yapılacak merkeze özel
taşıma tankları
ile transfer edilmeli:
Ürünlerin saklandığı
tankların ısısıyla aynı
olmalı
Ürünler taşınırken ısı
farkına maruz kalmamalı
Şehirlerarası
ve uluslar arası
taşımalarda, dökülme, sızıntı
v.b
risklere karşı
ürünler sıvı
azot içerisinde değil buhar fazında
taşınmalı
Taşıma tankı
üzerinde ortamın ısısını
belirten bir gösterge olmalı
İçi %90 etil alkol ile yıkanmış
su banyosuna steril su konduktan sonra 37-40C kadar su ısıtılır
Kök hücre ürünü
hızlıca 37-40°C’de
çözülür
Bir miktar azot içeren kaplar ile transfer edilen ürün
torbaları
su banyosu içinde yumuşak masaj hareketleri ile
tamamen eritilir.
Ürün torbasının koruyucu kılıfı
yoksa ağız kısmının su
içine daldırılmamalıdır.
Kök Hücre Eritme işlemi nerde yapılır?
Kök Hücre infüzyonunda
nelere dikkat etmeliyim?
Banyodan çıkan torbalar steril bezlerle silindikten
sonra koruyucu kılıfından çıkarılarak 200m’lik
filtre içeren setlerle infüze
edilir.
Çözünme ile infüzyon
arasındaki süre 1 saati
geçmemelidir
İnfüzyon
süresi 10-15 dakikayı
geçmemelidir
Viyabilite
Nedir? Nasıl bakılır?
Viyabilite= Hücre canlılığı
1) Flörasan
mikroskobu
2) Akım sitometri
yöntemi
Tripan
Mavisi, Akridin-Oranje
ve
Propidyum
İyodit
Canlılık (%)= Canlı
hücre / Total
hücre x100
En az % 75 ve üzeri olmalıMNH
CanlıHücre
CanlıHücre
17
Kalite kontrolü
için neler yapılmalı?
1. Hücre
Miktarı:
A. Çekirdekli hücre miktarı
B. Eritrosit miktarı
C. Trombosit
miktarı
2. Hücre
morfolojisi (Yayma, formül)
3. Hücre canlılığı
(Viabilite)
4. Sterilite (Kültür)
5. Kök
Hücre miktarı
(Quantity):
A. CD34 hücre sayısı
B. Hematopoietik
progenitor hücre
kültür
6. Tümör hücre
kontaminasyonu