KLINIČKI ZNAČAJ KVANTITATIVNOG ODREĐIVANJA SLOBODNIH LAKIH LANACA

IMUNOGLOBULINA

Danica Matišić

Monoklonski

imunoglobulin

Plazma stanica

Antitijelo

B limfocit

MONOKLONSKE GAMAPATIJE

Monoklonske gamapatije: mogu

biti benigne ili maligne-multipli

mijelom

Klinički simptomi: od asimtomatskog

neprogresivnog stadija do malignog

agresivnog multiplog mijeloma

Laboratorijska dijagnostika:

1. korak:

elf.prot. u serumu

ukup.prot.IgGAM,IF, β2m, kreatinin i Ca u

serumu,te BJP u serumu i urinu, SE,KKS,

punkcija sternalne ili bedrene kosti

KROHEM SKUPINAPododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologijuIMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković

Vizualni pregled

Bez promjena

Bence Jones protein?

Klinička sumnja iliprisutnost monoklonske

vrpce

Imunofiksacija i/ili imunoelektroforez

a

Elektroforeza proteina u mokraći

(100 x ukonc. uzorak)

Definicija M-P(određ. razreda

i tipa)

Negativ. nalaz

Prisutan BJ

protein

Denzitometrijska kvantifikacija M-P

Imunofiksacija i/ili imunoelektroforez

a

Opisni nalaz + klinička informacija

dajutumačenje nalaza

Elektroforeza serumskih proteina

DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA

Ako na elektroforetskoj slici, najmanje 100x ugušćenog urina, ne nalazimo suspektnu monoklonsku vrpcu nalaz BJP smatramo negativnim

Dr. Henry Bence Jones

Engleski liječnik i kemičar: rođen 31.12.1813.; umro 20.04.1873.

petak, 30. 10. 1845. - dr. MacIntyre i dr Watson

Dragi dr. Bence Jones!

Epruveta sadrži urin vrlo visoke specifične težine. Kod kuhanja nastaje jako zamućenje. Nakon dodatka dušične kiseline, uzorak se zapjeni, oboji crvenkasto i zatim postane bistar; ali hlađenjem poprima konzistenciju i izgled koji se uočava. Toplina ih oslobađa.Što je to?

dr. Bence Jones: The Lancet, 1847. (Dr. MacIntyer: 1850.)

eponim Bence-Jones protein koristi se tek nakon njegove smrti

1922.identificirani tip I i II BJP antiserumom imuniziranih kunića

1956.Ouchterlony tehnikom pokazano da se BJP ponašaju isto kao i mijelom-protein i označeni su kao i

2001.imunotest (poliklonska At): mjerenje slobodnih lakih lanaca u serumu

Kristali Bence-Jones proteina

Razumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti ključno za razvoj selektivne terapije lijekovima.

MicrogravitySpace is the laboratory of

the next millennium

Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru su jedinstveni

okoliš za istraživanja koja vode novim produktima i

tehnologijama.STS-80

STS-95

Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca - SLL

Razvoj reagensa za kvantitativno određivanje SLL,

kapa (κ) ili lambda (λ) tipa, povećao je njihovu kliničku

važnost Refer. interv.: SLL κ

Refer. interv.: SLL λ

Refer. interv. κ/λ

SERUM

3,30 – 19,40 5,71 – 26,3 0,26 – 1,65

URIN 1,35 – 24,19 0,24 – 6,66 2,04 – 10,37

KROHEM SKUPINAPododbor za laboratorijsku hematologiju i

morfologijuIMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-

KerekovićVizualni pregled

Bez promjena

Bence Jones protein?

Klinička sumnja iliprisutnost monoklonske

vrpce

Imunofiksacija i/ili imunoelektroforez

a

Elektroforeza proteina u mokraći

(100 x ukonc. uzorak)

Definicija M-P(određ. razreda

i tipa)

Negativ. nalaz

Prisutan BJ

protein

Denzitometrijska kvantifikacija M-P

Imunofiksacija i/ili imunoelektroforez

a

Opisni nalaz + klinička informacija

dajutumačenje nalaza

Elektroforeza serumskih proteina

DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA

Ako na elektroforetskoj

slici, najmanje 100x ugušćenog urina, ne nalazimo suspektnu monoklonsku vrpcu nalaz BJP smatramo

negativnim

FREELITE™ : SLLκ, SLLλ + κ/λ

Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca

serumska konc.SLL korelira samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov nalaz može biti neovisan biljeg

monoklonskih gamapatija

jedan posebno važan aspekt SLL je njihov kratak poluživot:

2-3 sata za kapu i 5–6 sati za lambdu; što je 150 x kraće vrijeme od 21 dana koliko je poluživot IgG

molekule

tako konc. slobodnih lakih lanaca omogućuje vrlo brzo procjenu učinka

kemoterapije: 92-128 dana brže nego konc. M Ig

bolesnici koji su prema nalazu intaktnog M Ig, u remisiji mogu još uvijek imati povišenu konc. SLL što indicira ostatnu bolest

koristeći isti argument, bolesnici čija konc SLL počinje rasti nakon

modernog intenzivnog tretmana ide u prilog relapsu bolesti

Kvantitativno određivanje slobodnih lakih lanaca - DOSADAŠNJA ISKUSTVA -

10-tak godina upotrebe testa za kvantitativno određivanje BJP promijenilo je pristup dokazivanju i praćenju monoklonskih

gamapatija

FLC test je ugrađen u: dijagnozu-skrining panel prognozu-testiranje

i praćenje bolesti

Učinak u kliničkoj praksi je bio značajan upravo zbog

-povećane osjetljiv. za praćenje bolesti uzrokovanih prolifer. PS-boljeg razlikovanja agresivnih od benignih premalignih bolesti

(MGUS)-bolja procjena hematoloških odgovora u monokl. bolest.lakih

lanaca kao i pojadnostavljenje testiranja bolesnika

Pojava testa je isto tako izmjenila pristup u laboratorijskom testiranju bolesnika

Elektroforeza proteina u mokraći

(100xkonc urin)

Negativ.

nalaz

Prisutan BJP

Imunofiksacija

DIJAGNOSTIČKI POSTUPNIK ZA DEFINIRANJE MONOKLONSKOG

PROTEINA

Vizualni regled

Bez romjena

Bence Jones P ?

Klinička sumnja iliprisutnost

monoklonske vrpce

Imunofiksacija

Defi(određ. razreda i

tipa)nicija M-P

Denzitometrij. kvanti. M-P

Opisni nalaz + klinička

informacija daju tumačenje

nalaza

Elektroforeza serumskih proteina

FREELITE™ : SLLκ, SLLλ +

κ/λ

J. A. Katzman - Mayo Clinic

DIJAGNOZA:

– FLC test uklanja potrebu ukoncen. 24-satnog urina kao i uopće obradu urina. Tako se preporučeni POSTUPNIK za def. “M” proteina treba sastojati od:

1. elektrof. prot. u serumu

2. IF seruma

3. FLC testa u serumu te

4. FLC test u urinu samo kod

sumnje na AL amiloidozu

Urin će se obrađivati diskontinuirano tj. kod raznih disproteinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je već monoklonski protein identificiran

KROHEM SKUPINAPododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologijuIMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković

FLC test je ugrađen u: DIJAGNOZU-skrining panel

nadalje su razmatrane opcije i uklanjanja IF iz POSTUPNIKA. Skrining panel sa elektrof. prot. u serumu i FLC

testom (uz selektivni izbor IF seruma i urina) je dostatan za dijagnozu multiplog mijeloma i Waldenström makroglobulinemije s malim padom

osjetljivosti (od 1%) u dijagnozi AL amiloidoze uz obaveznu procjenu odnosno odluku kliničara.

Elektroforeza proteina u serumu

FLC kapa i lambda i

kapa/lambda omjer

FREELITE:

nalaz abnormalan

SPE normalna

FREELITE:

nalaz normalan

SPE abnormalna

FREELITE:

nalaz normalan

SPE normalna

FREELITE:

nalaz abnormalan

SPE abnormalna

+

Prisutan BJP-MMLL

Prisutan intaktni monokl. Ig i/ili BJP

M-P negativanPrisutan intaktni

monoklonski Ig

FLC nalaz abnormalan

SPE normalna

FLC nalaz abnormalan

SPE abnormalna

K.V.M.

FLC nalaz normalan

SPE abnormalna

FLC test je ugrađen u: PROGNOZU -testiranje

FLC test u serumu je isto tako koristan biljeg za prognozu progresije MGUS u MM

MGUS je premaligna bolest sa brzinom progresije u MM od

1%/god. Brzina progresije kod bolesnika s normalnim omjerom FLC ϰ/λ i “M” Ig <15g/L je 0,1%/god. Stoga, ovakve bolesnike ne će trebati podvrgavati kompletnim kliničkim obradama (1x

na god) a ujedno će se moći veća briga pružiti rizičnim bolesnicima.

Biti će potrebno napraviti promjene i u laboratorijskoj obradi ovakvih bolesnika.

FLC test je ugrađen u: PRAĆENJE bolesti

koncentracija “uključenih” FLC ima važnu ulogu u praćenju bolesti. Ta uloga će biti jedino uskraćena kod bolesnika sa

nemjerljivim “M” prot. u serumu ili urinu.

Dugotrajno praćenje mjerenja konc. FLC u serumu pokazalo je da

se praćenje bolesti može voditi bez obrade uzorka urina.

(Skupljanje 24 satnog urina je: mukotrpno za bolesnike i uglavnom netočno)

B.K.1.

F.S.3

B.K.2.

IF BJP urin B. K. 3

B. K. 3

K. M.

IF BJP urin

M.LJ 1.

M.LJ. 2

Levinson S. Stanley S. Urine immunofixation electrophoresis remains important and is complementary to serum free light chain. Clinical Chemistry and laboratory medicine 2011: 49: 1801-1804.

...I conclude that urine IFE remains important and is complementary

to serum FLC assay, although the best algorithms for use remains to

be elucidated. IFE BJP kapa IFE BJP lambda IFE BJP poliklonski

ključna komponenta interne

laboratorijske kontrole je izravan

kontakt biokemičara i kliničara o

slučaju koji je neuobičajene prirode

ili

ako postoji bilo kakav nesklad u

nalazu.

Kontrola kvalitete laboratorijske evaluacije

M-proteina

Nakon filtracije FLC se vežu na heteromerične receptore koji se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endocitoze, FLC budu hidrolizirani i vraćeni kao AK u cirkulaciju.

FLC su otrovni: zbog potencijalnih interakcija sa svim dijelovima nefrona; nefrotoksični potencijal FLC je ovisan o njihovoj fizikalno kemijskoj kompoziciji kao i utjecaju okoliša u kojem se nalaze. Ovi faktori određuju tip i težinu oštećenja bubrega

Laki lanci uzrokuju intracelularni oksidativni stres(NFκB,MCP1)

varijabilna domena lakog lanca daje interakciju s THP te konačni produkt odlaganja tih kompleksa je nastanak netopivih voštanih cilindara

C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to dateM. Cook: EuLITE trial: results of date

Paraproteinemijske bubrežne bolesti dijelimo na: primarne glomerularne i posljedične tubulo intersticijske bolesti. Odlaganje FLC je direktno odgovorno za patološke procese tubulo intersticijskog oštećenja.

Diseases associated with monoclonal FLC: AL Amyloidosis; Chronic lymphocytic leukaemia; Non-hodgkin

lymphoma

S. Kumar: AL Amyloidosis– role of FLC in risk estimationP.Hawkins: FLCs in the amyloidosis

Rezultati raznih studija su pokazalida kod primarne AL amiloidoze konc.FLC korelira sa stupnjem zahvaćenostinapadnutog organa i određivanje seprovodi: 1. za prognozu bolesti2. za praćenje bolesti3. preporuča se uz FLC određivati i troponin T kao i NT-ProBNP4. kvantitativno mjerenje FLC u kombinaciji sa IF seruma i urina je preporučeni protokol kod sumnje na AL amiloidozu u UK (imunohistokemijsko bojenje i dalje ostaje)

s FLC IF 24-satni urin

MM skrining Preporuka Nije nužno

AL skrining

Preporuka

Preporuka

Prognoza:MGUS,AL,MM,Plazmocitom

Preporuka Preporuka

AL, LCDD, ili oligosekretorni MM

Preporuka Preporuka(AL & LCDD)

MM teških lanaca

Nije nužno Nije nužno

MMLL Nije nužno Preporuka

G. Mead: Diseases associated with polyclonal FLC:Hepatitis C; Autoimune bolesti; Hodgkin limfom; AIDS –limfom;

C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date i M. Cook: EuLITE trial: results of date

hemofiltracija ovisi: o protoku krvi; permeabilnosti membrane; hidrostatskom tlaku na membrani; površini hemofiltera (albumin, IL-6, FLC, mioglobin, β2m, inulin, vitamin B12 -1,3kD-68kD)

-Pokusi in vitro i matematički modeli su pokazali da je uklanjanje FLC hemodijalizom ovisno o veličini pora dijalizacijske membrane: r >5 nm)

-Uskoro pojava posebnih membrana za dijalizu tzv. HCO-HD 1100 (high cutt-off haemodialysis) tvrtke Gambro i Ortho-Biotech

-razvijen je i poseban European Trial of Free Light Chain Removal by Extended Haemodialysis u nefropatiji uzrokovanoj cilindrima – tzv. EuLITE

- primarni učinak EuLITE triala omogućuje pauze dijaliziranja od 3 mjeseca

- 30 – 40% oboljelih od MM razvije tzv. mijelomski bubreg

- propadanje bubrežne funkcije popraćeno je s proupalnim stanjem i kao jedna od posljedica je i poliklonsko stvaranje lakih lanaca

-toksičnost monoklonskih FLC je dobro razjašnjena (npr. stvaranje cilindara s THP) za razliku od poliklonski sintetiziranih lakih lanaca

-u tijeku su mnoga ispitivanja koja pokušavaju razjasniti ulogu poliklonski sintetiziranih lakih lanaca u stanjima kroničnih bubrežnih bolesti (KBB)

-za sada je poznato da poliklonski sintetizirani FLC, za razliku od monoklonskih, ne aktiviraju epitel proksimalnih tubula ali u distalnim tubulima stvaraju cilindre s THP te tako postaju surogat za progresiju KBB

posljedica: razvijanje nefropatije te stvaranje ovisnosti o dijalizi te sklonost infekcijama koji otežavaju liječenje

C. A. Hutchison: Use of High cut-off haemodialysis for treatment of myeloma kidney: worldwide experience to date-M. Cook: EuLITE trial: results of date S. Stringer: Polyclonal FLC and chronic kidney disease

HVALA NA PAŽNJI