Isolasi dan karakterisasi kolagen larut asam dari sisik ikan
laut dari Jepang dan Vietnam.Abstract Asam-larut kolagen (ASC)
berhasil diekstrak dari sisik kadal ikan (Sauridaspp.) Dan makarel
kuda (Trachurus japonicus) dari Jepang dan Vietnam dan mullet
abu-abu (Mugil cephalis), ikan terbang (Cypselurus melanurus) dan
yellowback seabream (Dentex tumifrons) dari Jepang. Hasil ASC
sekitar 0,43-1,5% (berdasarkan berat kering), tergantung pada
spesies. Profil SDS-PAGE menunjukkan bahwa ASCs adalah tipe I
kolagen, dan terdiri dari dua differentachains, anda2 a1, serta
abcomponent. ASC dari makarel kuda dari Vietnam mengandung tingkat
asam imino lebih tinggi daripada yang dari Jepang. ASC denaturasi
Suhu (Td) berkisar 26-29? C, tergantung pada jenis ikan dan imino
kandungan asam (p 0,4 M, terlepas dari jenis ikan. 1.
Pendahuluan
Kolagen adalah protein berserat konstituen kulit, tulang, tendon
dan jaringan ikat lainnya pada hewan darat. Ada 29 kolagen secara
genetik berbeda hadir dalam jaringan hewan. Antara mereka, tipe I
kolagen adalah yang paling melimpah, dan telah menemukan lebar
aplikasi dalam berbagai bidang, seperti produk makanan, biomedis
dan farmasi, dan industri kecantikan dan kosmetik (Sobral et al,
2001;. Duan, Zhang, Du, Yao, & Konno, 2009). Umumnya, sumber
utama kolagen komersial telah sapi dan babi. Namun, kekhawatiran
tentang sapi dan babi kesehatan, seperti munculnya bovine
spongiform encephalopathy dan penyakit kaki dan mulut, telah
menyebabkan penurunan memasok kolagen mamalia dalam beberapa tahun
terakhir (Kittiphattanabawon, Benjakul, Visessaguan, Nagai, &
Tanaka, 2005). Oleh karena itu, ikan kolagen adalah alternatif yang
realistis untuk kolagen mamalia (Nagai, Araki, & Suzuki, 2002;
Nomura, Sakai, Ishii, & Shirai, 1996). Spesies ikan laut dan
produk olahannya sangat bahan makanan penting di Jepang (Nagai dan
Suzuki, 2000a; Nagai dan Suzuki, 2000b). Ikan Lizard, makarel kuda,
mullet abu-abu, terbang ikan dan yellowback seabream adalah bahan
baku yang digunakan untuk producesurimiin Jepang (Shimizu, 1987;
Yamanaka & Tanaka, 2007). Makarel kuda juga digunakan untuk
mempersiapkan freshsashimi baku dansushi, yaitu makanan populer di
Jepang (Yamanaka & Tanaka,2007). Di Vietnam, ikan laut juga
memainkan peran penting dalampengembangan seafood sebagai produk
ekonomi. ikan Lizar dan makarel kuda yang bahan baku yang digunakan
untuk memproduksi ikan bola di Vietnam (CTU,
http://www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/aquafishdata. Diakses
31.01.13). Namun, selama pengolahan ikan, sejumlah besar produk
sampingan, seperti kulit, sisik dan tulang, yang menyumbang 50-70%
dari berat ikan, dibuang (Kittiphattanabawon et al., 2005).
Pemanfaatan limbah laut, termasuk timbangan, diperlukan dari sudut
pandang dari kedua lingkungan konservasi dan pengembangan
industri-industri baru. Kolagen dari sisik ikan mas (Cyprinus
carpio) (Duan et al., 2009), melihat goatfish emas (Parupeneus
heptacanthus) (Matmaroh, Benjakul, Prodpran, Encarnacion, &
Kishimura, 2011), sarden (Sardinop melanostictus), seabream merah
(Pagrus utama) dan Bass Jepang (Lateolabrax japonicus) (Nagai,
Izumi, & Ishii, 2004) dan redfish laut dalam (Sebastes
mentella) (Wang et al., 2008) telah diisolasi dan dikarakterisasi.
Dari literatur dapat diprediksi bahwa kolagen dari berbagai berbeda
jenis ikandalam komposisi molekul dan sifat fungsional. Namun,
tidak ada informasi yang ada pada kolagen skala komersial penting
spesies di Jepang dan Vietnam, seperti makarel kuda dan kadal ikan.
Selain itu, suhu air laut juga dianggap mempengaruhiikan skala
kolagen properties.Jongjareonrak, Benjakul, Visessaguan, dan Tanaka
(2005) melaporkan efek lingkungan dan suhu tubuh pada sifat kolagen
kulit bigeye kakap. Namun, studi banding dari pengaruh suhu habitat
pada sifat kolagen dari sisik ikan kurang. Dengan demikian, tujuan
dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi asam-larut
kolagen (ASC) dari sisik ikan kadal dan makarel kuda tertangkap di
Jepang dan Vietnam dan mullet abu-abu, ikan terbang, dan seabream
yellowback dari Jepang. Pengaruh suhu lingkungan pada sifat skala
ikan juga dipelajari dengan menganalisis perbedaan antara ikan
kadal dan makarel kuda tertangkap di Jepang dan Vietnam.
2. Bahan dan metode2.1. Persiapan sisik ikan Sisik ikan kadal
(Sauridaspp.), Mullet abu-abu (Mugil cephalis) dan seabream
yellowback (Dentex tumifrons) dikumpulkan pada November 2011 di
Prefektur Miyazaki, Jepang. makarel kuda (Trachurus japonicus) dan
ikan terbang (Cypselurus melanurus) yang dikumpulkan pada Januari
2012 di Prefektur Nagasaki dan Prefektur Chiba, Jepang,
masing-masing. Sisik dari ikan kadal dan makarel kuda juga
dikumpulkan dari sebuah perusahaan makanan laut beku di bulan
Januari, 2012 di Nha Trang Kota dan Provinsi Kien Giang, Vietnam,
masing-masing. Timbangan yang diperoleh di Jepang diangkut ke
laboratorium kami di bawah kondisi es, dan sampel di Vietnam
dibekukan sebelum airfreighted dalam kondisi beku. Timbangan dicuci
dengan air suling dingin sebelum dipotong-potong kecil dengan
gunting, ditempatkan dalam kantong plastik dan kemudian disimpan
di? 20? C sampai digunakan. Waktu penyimpanan adalah 3 bulan atau
kurang. 2.2. Penentuan protein dan abu isiKadar air, abu dan
protein isi sisik ikan laut dianalisis sesuai dengan metode theAOAC
(2000). Konversi faktor 5.95 digunakan untuk menghitung kadar
protein (Wang et al., 2008).2.3. Ekstraksi kolagen dari sisik
ikanKolagen diekstrak mengikuti metode ofNagai dan Suzuki (2000a)
dengan sedikit modifikasi. Sisik ikan telah dihapus dari protein
non-kolagen dengan 0,1 M NaOH selama 6 jam pada sampel / Rasio
larutan NaOH dari 1: 8 (w / v). Solusi NaOH berubah setelah 3 jam
dan dicuci sepenuhnya dalam air suling dingin sampai pH netral
dicapai. Demineralisasi skala dicapai dengan memperlakukan dengan
0,5 M Na2EDTA (acid disodium ethylenediaminetetraacetic garam)
larutan (pH 7,5) pada rasio larutan sampel / EDTA 1:10 (w / v)
selama 24 jam, dan kemudian dicuci dengan air suling dingin.
Setelah pretreatment, timbangan diekstraksi dengan 0,5 M asam
asetat di sampel / rasio asam 1: 2.5 (w / v) selama 4 hari. Ekstrak
disentrifugasi pada 20,000g selama 1 jam menggunakan mesin
centrifuge (Suprema 21; Tomy Seiko Co, Ltd, Tokyo, Jepang).
Supernatan asin dengan menambahkan NaCl untuk mendapatkan
konsentrasi akhir 2,5 M di hadapan 0,05 M Tris (hidroksimetil)
aminomethane pada pH 7,0. Endapan yang dihasilkan dikumpulkan
dengan sentrifugasi pada 20,000gfor 30 menit. resultanpelet
dilarutkan dalam 0,5 M asam asetat, didialisis 0,1 M asam asetat
dan air suling dan kemudian liofilisasi. Semua prosedur persiapan
dilakukan pada bawah 4oC.2.4. Hasil diekstrak ASCHasil kolagen
ditentukan mengikuti metode Wang et al. (2008). Isi hidroksiprolin
dari diekstraksi solusi dan ikan skala ditentukan oleh HPLC.
Ekstrak hasil (YD) dihitung dengan menggunakan persamaan
berikut:
2.5. Analisis komposisi asam aminoDua puluh miligram ASC
dihidrolisis dalam 6 M HCl pada 110? C selama 22 jam di bawah
vakum. Hidrolisat dinetralkan dengan 6 M dan 0,6 M NaOH, dan
disaring melalui filter membran selulosa (0.45lm; Toyo Roshi
Kaisha, Ltd., Tokyo, Jepang). Filtrat adalah digunakan untuk
analisis asam amino menggunakan asam amino sistem analisis2.6.
Elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE)SDS-PAGE kolagen
dari sisik ditentukan sesuai dengan yang ofLaemmli metode (1970)
dengan sedikit modifikasi. Kolagen sampel dilarutkan dalam larutan
asam asetat 0,1 M dan kemudian dicampur dengan penyangga sampel
(0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, yang mengandung 10% (b / v) SDS dan 20% (v
/ v) gliserol) dengan adanya 10% (v / v) mercaptoethanol pada rasio
penyangga kolagen / sampel 1: 2 (v / v). Setiap sampel (10lg) telah
dimuat poliakrilamida yang gel (7,5%) dan dielektroforesis pada
arus konstan 20 mA. Setelah elektroforesis, gel itu tetap dengan
25% (v / v) metanol dan 5% (v / v) asam asetat selama 30 menit,
kemudian diwarnai dengan 0,1% (w / v) Coomassie biru R-250 di 30%
(v / v) metanol dan 10% (v / v) asam asetat dan destained dengan
30% (v / v) metanol dan 10% (v / v)asam asetat. Penanda berat
molekul tinggi (Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA) digunakan
untuk memperkirakan berat molekul protein.
2.7. Kelarutan kolagen Kelarutan kolagen diukur pada 0,1 M asam
asetat di berbagai Konsentrasi NaCl dan pH sesuai dengan metode
ofMontero, Jimenez-Colmenero, dan Borderias (1991) dengan sedikit
modifikasi. Sampel kolagen dilarutkan dalam 0,1 M asam asetat
dengan pengadukan lembut pada 4? C untuk mendapatkan konsentrasi
akhir 3 dan 6 mg / ml. Untuk mengetahui pengaruh konsentrasi NaCl
pada kelarutan kolagen, 5 ml kolagen solusi (6 mg / ml) dicampur
dengan 5 ml NaCl 0,1 M asam asetat pada berbagai konsentrasi (0,
0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 dan 1,2 M). Campuran diaduk perlahan selama
30 menit pada 4? C dan disentrifugasi pada 20,000gfor 30 menit pada
4 C. kadar protein dalam supernatan diukur dengan metode Lowry
(Lowry, Rosebrough, Farr, & Randall, 1951) menggunakan serum
albumin bovine sebagai standar protein. Kelarutan relatif dari
sampel kolagen L.T. Minh Thuy et al. / Food Chemistry 149 (2014)
264-270 265 dihitung dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa NaCl)
menggunakan persamaan berikut:
Untuk mengetahui pengaruh pH pada kelarutan kolagen, 8 ml
kolagen solusi (3 mg / ml) telah disesuaikan dengan baik 6 M HCl
atau NaOH 6 M untuk mendapatkan berbagai pH akhir dari 1-10, dan
volume akhir larutan diatur hingga 10 ml dengan air suling.
Campuran yang diaduk perlahan pada 4 C selama 30 menit, dilanjutkan
dengan sentrifugasi pada 20,000g selama 30 menit pada 4 C. Kadar
protein dalam supernatan diukur dengan metode Lowry (Lowry et al.,
1951) menggunakan serum bovine albumin sebagai standar protein.
Kelarutan relatif dihitung dibandingkan dengan yang diperoleh pada
pH memberikan kelarutan tertinggi menggunakan persamaan berikut
2.8. Penentuan suhu denaturasi kolagenSuhu denaturasi kolagen
dianalisis menggunakan termogram DSC (DSC) sesuai dengan metode of
Kittiphattanabawon et al. (2005). ASC dilarutkan dalam 0,1 M
larutan asam asetat pada rasio sampel / larutan 1:40 (w / v). Itu
campuran diizinkan untuk berdiri selama 2 hari pada 4? C.
diferensial yang pemindaian kalorimeter dikalibrasi menggunakan
indium sebagai standar. Sampel persis ditimbang ke panci aluminium
dan disegel. Panci aluminium dipindai pada rentang 20-50? C, dengan
tingkat pemanasan 1? C / menit dan menggunakan N2liquid sebagai
media pendingin. Sebuah disegel pan kosong digunakan sebagai
referensi. Suhu denaturasi (Td,? C) dan perubahan entalpi (DH, mJ /
mg) diperkirakan dari puncak transisi DSC kurva.2.9. Analisis
StatistikSemua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga dan data
yang dinyatakan sebagai berarti standar deviasi. perbedaan
antaratabel 1 Hasil panen ekstraksi kolagen larut asam dari sisik
ikan laut
. Data dinyatakan sebagai rata-rata standar deviasi (n = 3).
Superscripts yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan
perbedaan statistik (p
